CN108260357A

CN108260357A - 用于通过选择性减少免疫调节m2单核细胞治疗癌症及增强治疗性免疫力的方法和组合物

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Publication number: CN108260357A
Application number: CN201680033742.1A
Authority: CN
Inventors: 大卫·W·安德鲁斯; 道格拉斯·C·霍普尔
Original assignee: Thomas Jefferson University
Current assignee: Thomas Jefferson University
Priority date: 2015-04-10
Filing date: 2016-04-11
Publication date: 2018-07-06
Also published as: US20180235996A1; EP3280806A4; MX2021012272A; JP7428397B2; AU2016246134A1; WO2016164916A1; AU2016246134B2; US20200197435A1; JP2018515598A; US20220072025A1; AU2022206776A1; US20180271894A1; US20170056430A1; MX2017012982A; US10265339B2; JP2024028529A; CA2982205A1; US10543226B2; US10206942B2; JP6957035B2

Abstract

本公开提供了包含能够靶向M2细胞中的IGF‑1R表达的核酸的药物组合物。本公开还提供了用于通过靶向这些细胞中IGF‑1R的表达而选择性降低M2细胞的方法。本公开进一步提供了用于通过靶向患者的M2细胞中IGF‑1R的表达而治疗癌症并增强治疗的方法。当对其需要的受试者全身给予时，本发明的药物组合物是有效的。药物组合物的给予方便性有利于治疗并增强患者依从性。

Description

用于通过选择性减少免疫调节M2单核细胞治疗癌症及增强治疗性免疫力的方法和组合物

技术领域

本公开涉及通过用针对胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)的反义核酸靶向这些细胞以选择性降低M2细胞而治疗癌症并增强治疗性免疫力的方法和组合物。

相关申请的引证

本申请为了所有目的以其全部内容并入2015年4月10日提交的美国临时申请序列号62/145,758。

电子提交的文本文件的描述

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背景技术

单核细胞是源自骨髓中的骨髓祖细胞的一种白细胞。它们由此进入外周血流中，并随后迁移到组织中。在组织中，在暴露于局部生长因子、促炎性细胞因子和微生物化合物之后，单核细胞分化成巨噬细胞和树突状细胞。源自单核细胞前体的巨噬细胞会经历特异性分化成经典型极化的(M1)巨噬细胞和非经典型活化的(M2)巨噬细胞。通常，巨噬细胞在免疫系统中起三个主要作用。这些作用是吞噬作用、抗原呈递和细胞因子呈递。此外，某些类型的癌症(如例如，乳腺癌、星形细胞瘤、头颈鳞状细胞癌、II型乳头状肾细胞癌、肺癌、胰腺癌、胆囊癌、直肠癌、神经胶质瘤，经典型霍奇金淋巴瘤、卵巢癌和结肠直肠癌)在肿瘤内表现出升高的M2样巨噬细胞水平和外周中循环的类似M2单核细胞。尽管癌症疗法进展，但是这些癌症的预后仍然较差，并且使用常规治疗如例如化学疗法、外部束放射和短程放射疗法治疗这些癌症的尝试已经导致无进展生存期和总生存期的仅微小的改善。因此，本领域内仍需要获得用于这种癌症的新且改进的疗法。

发明内容

在一些方面中，本公开提供了包含有效量的胰岛素样生长因子1受体反义寡脱氧核苷酸(IGF-1R AS ODN)的药物组合物，其中将药物组合物给予在他们的循环、肿瘤微环境中具有M2细胞，或具有使未分化的单核细胞向M2细胞极化的血清的受试者，降低受试者中M2细胞的数量。

在其它方面中，本公开提供了用于选择性消除受试者中M2细胞的方法，包括向受试者全身给予有效量的药物组合物。

在其他实施方式中，本公开提供了通过降低M2细胞的数量而治疗癌症的方法，包括向患有癌症的受试者全身给予有效量的药物组合物。

在其他实施方式中，本公开提供了用于增强受试者的免疫响应的方法，包括向受试者全身给予有效量的药物组合物。

附图说明

图1描绘了患有神经胶质瘤的患者外周中CD163+细胞的表达。该单核细胞的子集由肿瘤的存在引发，并且这个亚群由于其血管生成和免疫抑制性质而支持肿瘤生长和侵袭。神经胶质瘤等级与携带M2单核细胞标记的细胞的积累和活性相关。肿瘤中这种M2样CD163+巨噬细胞的群体和循环外周中的相似M2单核细胞的存在也破坏了任何促炎性抗肿瘤疫苗策略。a.描绘了反映WHO III级星形细胞瘤中CD14+细胞增加的流式细胞术。b.根据WHO等级比较CD163+细胞的水平的图示。与正常受试者或WHO II级星形细胞瘤相比，III级和IV级肿瘤显示出显著不同的PMBC中的单核细胞％。

图2描绘了根据细胞类型(图2a)和免疫型(图2b)的针对胰岛素样生长因子1受体(IFG-1R AS ODN)的标记的反义核酸的吸收。源自肿瘤的巨噬细胞(CD14+)和胶质瘤患者中匹配的血液样品急性吸收针对胰岛素样生长因子1型受体(IGF-1R AS ODN)的反义。

图3描绘了具有胰岛素样生长因子1受体(IFG-1R)表达的细胞的流式细胞术。极化成M2细胞的正常外周单核细胞体，与诱导为M1极化的巨噬细胞相比过表达IGF-1R。此外，IGF-1R AS ODN以剂量依赖性的方式选择性地诱导M2亚群体中的细胞死亡。图3a详细描绘了IGF-1R AS ODN选择性靶向M2巨噬细胞的去除，使得在这些细胞占优势的情况下，可以消除它们的肿瘤促进作用并且可以拯救治疗性Th1免疫力。空心圆表示分化的、未刺激的细胞，实心圆表示分化和刺激的细胞。图3b描绘了根据巨噬细胞极化的用IGF-1R AS ODN处理后单核细胞亚群分布的差异。

图4描绘了在整个治疗过程中患者中肿瘤相关的CD163+细胞的定量。通过Aperio量化法测定5400x场的平均值和SD。提供了四个时间点，第一次手术、第一次复发、第二次复发和尸体解剖以及y轴上的Aperio CD163+细胞。图4显示了本文公开的方法对于标准治疗失败的患者在降低CD163+细胞方面是有效的。

图5显示了6个连续的多形性成胶质细胞瘤样本中IGF-1R的免疫组织化学。所有肿瘤均证实IGF-1R免疫反应性，表明在肿瘤微环境中存在一种或多种表达IGF-1R的细胞，并识别IGF-1R作为癌症治疗的靶标。

图6描绘了IGF-1R AS ODN的两个不同序列批次的质谱。a-c：DWA序列的Avecia批量生产；d-f：NOBEL序列的Girindus批量生产；a，d：冻干粉末形式的AS ODN的稳定性；b，e：无菌盐水中的制剂；c，f：无菌盐水中的制剂。IMV118批次号GAI-08-060-S3-B1的稳定性结果表明，最小的降解产物为～300Da，而因此测量的光谱质量满足5709±300Da的要求，以及由批量发布至今的可接受的储存稳定性。Avecia序列(DWA)显示出超过九年期间的稳定性。

图7显示，在CNS中植入GL261后，在全身(腹腔内)接受一剂量的NOBEL(SEQ ID NO:1)之后至少14天，在动物中循环CD68+CD163+细胞减少。NOBEL是由起始甲硫氨酸密码子下游六个核苷酸开始的18-聚体的硫代磷酸寡脱氧核苷酸IGF1-R反义寡脱氧核苷酸(ASODN)。NOBEL是使用完善的方法在装备有封闭的化学柱反应器的合成仪中使用流通技术通过固相有机合成法制造的。固体载体上的每个合成循环序列由多个步骤组成，其按序进行直到建立全长寡核苷酸。然后将NOBEL冻干，用包装于具有螺旋盖HDPE容器中，并随后真空热密封于5mL的Mylar袋内，储存于-80℃下。使用前，将冻干粉末溶于盐水中直到得到100mg/mL的溶液。将获得的溶液通过0.22μm膜过滤器无菌过滤。将1mL等分装入USP 1型玻璃小瓶中，并用合适的橡胶塞和铝盖密封之后储存于-80℃下。

对于该实验，将白细胞用生物素化的抗小鼠CD163(Biorbyt)染色，洗涤并加入二级链霉亲和素-APC。两次洗涤和固定后，将细胞透化并用抗小鼠CD68-PE细胞内染色，随后用perm-缓冲液和最终PBS洗涤进行两次洗涤以封闭膜。使样品经过Millipore Guava流式细胞仪，并使用FlowJo分析。在处死后采集的样品显示出在腹腔内给予NOBEL之后WBC群体的显著变化。a.PBS腹腔内注射对照；b.NOBEL腹腔内注射。

图8显示了在肿瘤发展之前单独给予NOBEL(SEQ ID NO:1)在延迟GL261细胞赘生发生方面是有效的。20％和50％的C57和Tbet敲除的小鼠，与分别腹腔内接受载体(PBS)的60和100％的C57和Tbet敲除的动物相比，分别在腹腔注射NOBEL之后肿瘤发展。使用对数秩检验评价显著性(*＝p<0.05)。

图9显示了胞嘧啶-硫代磷酸-鸟苷-DNA活化在B细胞和浆细胞样树突状细胞(DC)上表达的TLR9。

图10显示了抗原呈递细胞吸收AS ODN，并表达增加的共刺激分子，并在AS ODN治疗前后在PBMC中表达各水平的CD80/83/86；mDC，髓样树突状细胞；pDC，浆细胞样树突状细胞。

图11显示了由降低的中值荧光强度测定的，NOBEL(SEQ ID NO:1)活化源自单核细胞的树突状细胞(DC)。未成熟的DC吞没大量荧光蛋白，导致更高的荧光强度(由较大的条描绘)。成熟的DC(活化的)下调内吞作用，而因此吸收较少的荧光蛋白并具有低荧光强度(由较小的条描绘)。用IGF-1R AS ODN处理源自单核细胞的树突状细胞显示出显著的剂量依赖性成熟反应。

图12显示了CpG基序，5'G*G基序和硫代磷酸键都向树突状细胞提供了额外的成熟刺激。a：未成熟的DC是高度内吞的并会吞噬大量的荧光蛋白(上图)，导致更高的荧光强度。b：源自单核细胞的DC在各种IGF-1R/AS ODN(1μg/ml)存在下温育24小时。LPS处理的DC(1μg/ml)用作成熟的阳性对照。未成熟的DC吞噬大量的荧光蛋白，导致更高的荧光强度(由较大的条描绘)。成熟的DC(活化的)下调内吞作用，而因此吸收较少的荧光蛋白并具有低荧光强度(由较小的条描绘)。IGF-1R/AS ODN中包含的CpG基序也向DC提供成熟刺激(参见对照和LNA DC)。硫代磷酸键向DC提供了额外的成熟刺激(参见NOBEL DC)。5'G*G基序向DC提供了第三种成熟刺激(参见DWA PT DC)。测试的寡聚体包括SEQ ID NO:1(NOBEL)、SEQ ID NO:11(IDT1220硫代磷酸AS ODN(IDT1220))、SEQ ID NO:15(DWA硫代磷酸AS ODN(DWA PT))、SEQ ID NO:16(DWA锁核酸AS ODN(LNA))和SEQ ID NO:17(DWA磷酸二酯AS ODN(DWA对照))。

图13显示了a.在37℃下DWA序列在5'侧保持发夹环二级结构(阴影插图)，可能影响与靶向的mRNA序列的碱基配对。b.在37℃下NOBEL(SEQ ID NO:1)序列在CpG基序的5'侧对于在18℃下具有MP的两个可替换的二级结构没有发夹环(阴影插图)，允许更大的靶向碱基配对以及CpG的可能性。

图14显示了GL261中的NOBEL(SEQ ID NO:1)滴定。将细胞用生长培养基以每孔20k接种于96孔板中，并温育4小时(37℃，5％CO₂加湿)；去除生长培养基，并向每孔中加入具有期望的AS ODN浓度的无血清Opti-MEM(100μL)。将细胞返回培养基24小时。a.NOBEL滴定对GL261细胞中的IGF-1R表达的影响。拷贝数IGF-1R相对于微量滴定板中每孔的最终mg(或每20k细胞的mg)。接种细胞。采用ANOVA分析确定显著性(*＝P<0.05；**＝P<0.001)。b.收获细胞，用对小鼠IGF-1R特异性的抗体染色，并用流式细胞仪分析。绘制中位荧光强度相对于最终AS ODN浓度(每20k细胞的mg)。在每个孔用1mg Nobel AS ODN处理的GL261细胞中，IGF-1R表达显著降低(P<0.001)，以及每孔用0.1mg Nobel AS ODN处理的细胞中，IGF-1R表达显著降低(P<0.05)。

图15显示了定量RT-PCR以评价己糖激酶同种型2mRNA的下游下调的结果。人脑胶质瘤细胞系U118的NOBEL(SEQ ID NO:1)处理的细胞中L13、IGF-1R和HexII基因的表达呈线性相关。显示了在用不同浓度的NOBEL处理的单个培养物中检测到的相对于IGF-1R拷贝数绘制的管家基因(housekeeping gene)L13(▼)和己糖激酶2[HEX](■)的特异性mRNA拷贝数。实线代表L13和IGF-1R之间的最佳拟合线性回归线，而虚线代表Hex-II和IGF-1R之间的最佳拟合线性回归线，其中r²表示线性度(1.0之中)而P表示斜率的显著性。

图16显示了AS ODN处理后两周用10⁶个GL261细胞注射的C57/B6小鼠中的累积肿瘤生长。AS ODN组中的所有小鼠用10⁶个NOBEL(SEQ ID NO:1)处理的GL261(过夜AS ODN处理，20mg/5×10⁶GL261)注射于侧腹中一次，并在用WT GL261在相对的侧腹中处理后两周进行挑战；AS ODN/GL261混合组中的小鼠在注射前立即用与未处理的GL261细胞混合的NOBEL(20mg/5×10⁶GL261)侧腹注射一次，并在用WT GL261在相对的侧腹中处理后两周进行挑战。处理后挑战(WT GL261)发展出肿瘤。

图17显示了在给予部位的GL261细胞和NOBEL(SEQ ID NO:1)的组合阻止了皮下模型中的肿瘤形成。

图18显示了NOBEL(SEQ ID NO:1)诱导放射敏化作用。

图19a-19d描绘了安全评估研究。a.试验中患者总体生存期；b.相对于手术之间的间隔的整体生存期；c.具有两个生存组的方案生存期。9例患者死于疾病进展，而1例死于脑内出血，2例死于败血症。对于较长(N＝4)和较短(N＝8)生存期组(对数秩＝0.0025)，总体方案生存期分别为48.2周和9.2周。c.排除非疾病进展的死亡原因，对于较长(N＝4)和较短的组(N＝5)(对数秩＝0.0049)，中位生存期分别为48.2周和10周；d.排除一个异常值(长组)，线性回归揭示了方案生存期与入选时的淋巴细胞计数之间的高度相关性(R²＝0.8，p＝0.0028)。

图20a-20e描绘了解剖肿瘤的放射照相反应。a.短暂生存组的实例。TJ12：A-D；TJ10：E-H；A，E：术前T1-钆增强的轴向图像；G：T1-钆增强的冠状图像；C：术前的轴向FLAIR图像；B，D，F，H：各自的术后3个月的图像；b.较长生存组的实例。TJ06：A-D；TJ09：E-H。A，E：术前T1-钆增强的轴向图像；C，F：术前的轴向FLAIR图像；B，D，F，H：各自的术后3个月的图像；c.肿瘤中的相对脑血容量相对于短生存组中的表观扩散系数之间的关系；d.较长生存组；表观扩散系数(ADC)和相对脑血容量(rCBV)之间存在高度相关性(R²＝0.96，p＝0.0005)；e.较长生存组(N＝3)中的细胞因子反应的总结；f.CD113+细胞随其在患者TJ06中随时间相关于rCBV和ADC而损失的实例；以及活化的一氧化氮合成酶(充血剂)的测定，反映为随它们与rCBV相关的血清硝酸盐水平(Greiss测定)。

图21a-21c显示了移植的室和病理标本的检查。a.来自TJ09的室移植体的显微照片复合；左列：PBS室；右列：疫苗室；上排：膜外表面的H&E染色；下排：外表面膜的CD163+免疫染色；b.CD163(红色)的免疫荧光染色；a.初始切除处患者TJ14肿瘤中的CD163+TAM；b.接种前复发患者的TJ14肿瘤中的CD163+TAM；CD163+TAMs增加；c.第二次复发患者TJ14肿瘤中的CD163+TAM；观察到肿瘤微环境中的TAM损失，而发现CD163TAM仅与血管关联；d，e，f.各自的更高放大倍数；c.根据治疗阶段的CD163+TAM的Aperio免疫染色定量(左侧两图)；在两个I期试验中也注意到类似的水平，但在未诊断、未治疗的经受尸体解剖患者中水平显著更低(右图)。

图22a-22e描绘了在后处理期间诱导接种后免疫效应细胞迁移和细胞因子/趋化因子迁移的连续测量；较长生存组(患者TJ03、TJ14、TJ06、TJ09)；短生存组的实例(所有其他短生存组的患者TJ13，见图25)。行：a.绝对CD4和CD8计数，与PBMC中WBC的相对量相比；b.CCL21和CXCL12的水平；c.相对T细胞和巨噬细胞计数的关系；d.CD14+CD16-巨噬细胞与CCR2和MCP-1(CCL2)的相对比例的关系；e.接种疫苗后的推测的Th-1细胞因子反应。

图23a-23b描绘了在第14天a.推测的Th-1细胞因子；b.Th-2相关的细胞因子，在PMA/离子霉素刺激后，各生存组的细胞因子水平(pg/ml)的总结。比较平均值(Tukey)和非配对t检验。显著性p<0.05。TJ03作为异常值被排除，因为其值始终在95％CI之外。

图24a-24d描绘了解剖肿瘤的放射照相反应。a和c：轴向钆增强的T-1W图像；图a和b：患者TJ06和图4c和d，患者TJ07；b和d：在同一轴向配准的延迟PET/CT图像。在图b中注意到左颞叶皮质带的包含与右颞叶相比缺乏正常增加的新陈代谢的低辐射区(photoenia)；前外侧颞叶中小面积的代谢增加。在a(图a)中的大部分增强解释为炎症。在d中注意到增加的代谢与图c中解释为疾病进展的增强的相应体积独特相关。

图25显示了各个源(pg/mL)(C-p，PBS室；C-v，疫苗室；血清；SN，自体肿瘤细胞上清液)的平均细胞因子水平的比较。与C-p和血清相比，CCL21在疫苗室中显著升高。CCL20在C-v和C-p中相对血清显著升高；CCL19在C-v中相对C-p或血清显著升高。HSP-70相对于血清显著升高；CCL2相对于血清显著升高；CXCL12是在血清中相对在C-p中显著升高的唯一细胞因子。*p<0.035，**p<0.025，***p<0.015，p<0.004，p<0.0002，p<0.0001。

图26a-26d描绘了移植的室和病理标本的检查。a.左图：初次诊断相对与接种疫苗之前复发的免疫阳性细胞/400x场CD163TAM的数量的平均值的比较；右图：匹配对的比较，平均差增加19.2％，p<0.0001；b.左图：接种疫苗前复发相对于尸检的CD163TAM数量的平均值比较；右图：匹配对的比较，平均差降低-26.35％，p<0.0001；c.来自原始试验和当前试验的石蜡样品相对于来自未诊断和未治疗胶质母细胞瘤的6个尸检样本中CD163TAM的回顾性比较；d.初次诊断、接种前复发和尸体解剖获得的石蜡切片中的IGF-1R+细胞的评价。

图27a.各个生存组的免疫阳性细胞/400x场检测CD163细胞数量的平均值的比较；左图：诊断时，长相比短，p<0.0002；右图：在诱导疫苗接种前的肿瘤切除术，长相比短，p<0.0127；b.外周和肿瘤相关的巨噬细胞之间的关系的线性回归(R²＝0.96，p＝0.004)。

图28描绘了短生存组(分别为患者TJ01、TJ02、TJ07、TJ08、TJ10、TJ11和TJ12)的后续治疗期间诱导疫苗接种后免疫效应细胞变化和细胞因子/趋化因子变化的连续测量。行：a.相比于PBMC中WBC的相对量的绝对CD4和CD8计数；b.CCL21和CXCL12水平；c.相对T-细胞与巨噬细胞计数的关系；d.CD14+CD16-巨噬细胞的相对比例与CCR2和MCP-1(CCL2)的关系；e.疫苗接种后推测的Th-1细胞因子反应。

图29a.表明绝大多数IGF-1R AS ODN吸收随着单核细胞和嗜中性粒细胞发生；b.尽管在M1和M2细胞中IGF-1R AS ODN的吸收相似，但IGF-1R AS ODN浓度的增加仅靶向具有随着IGF-1R上调的M2CD163+细胞的选择性消除；c.CD163+细胞的凋亡细胞死亡率与IGF-1RAS ODN浓度直接相关。

图30描绘了通过在癌症患者血清中温育正常单核细胞而向M2细胞极化单核细胞。a.PBS对照相对于CD163+巨噬细胞的IGF-1R AS ODN(NOBEL，250μg)处理的平均值的比较；b.匹配对的分析显示了M2细胞群体的显著降低。

图31显示通过用不同癌症患者的血清处理使单核细胞向M2CD163+表型极化，示出CD163以及PDL-1的上调；在这两种情况下，用AS ODN的处理通过选择性靶向该细胞群体而同时降低CD163和PDL-1。a.PBS对照相比于表达PDL-1的CD163+巨噬细胞的IGF-1R AS ODN(NOBEL，250μg)处理的平均值的比较；b.匹配对的分析表明了这种细胞群体中随着PDL-1显著降低而反映的高度显著降低。

图32显示通过用IL-10处理而向M2极化的单核细胞比通过用LPS/IFNγ处理而向M1极化的单核细胞产生显著更多的谷氨酰胺(gln)，而因此更有可能促进肿瘤细胞的生长。正常人单核细胞通过分别用LPS/IFNγ和MCSF或IL10处理，体外向M1和M2极化。a.谷氨酰胺在不同时间点积累于培养基中的水平；b.显示了在温育24小时时评估价的细胞内谷氨酰胺水平。

图33显示了正常个体和星形细胞瘤患者之间循环CD163+单核细胞的差异。图A：具有～6％的CD14+单核细胞在其循环中，具有中等水平的CD163的正常个体。在癌症患者中观察到两种变化，更高的单核细胞数量且单核细胞具有更高水平的CD163。其他细胞(红色框)完全没有CD163。图B：由于感染等，正常个体可能具有宽范围的单核细胞(图B，对CD11b+CD14阳性的细胞)，但这些在恶性星形细胞瘤患者中升高。图C中的直方图表明，来自癌症患者的单核细胞对其CD14单核细胞比对照细胞具有更高的CD163水平(红色直方图)。

图34显示肿瘤浸润的M2单核细胞，野生型IDH1状态和通过MRI的钆增强在间变性星形细胞瘤患者中定义了与预后不良相关的更具侵袭性的肿瘤。将福尔马林固定的石蜡包埋组织对于IDHR1突变R132H(A)和CD163(B)染色。对于非增强型AIII(IDH1R132H突变体III级)(C)和增强型AIII-G(IDH1野生型III型，具有多形性成胶质细胞瘤特征)(D)肿瘤显示了FLAIR的代表性图像(C和D，左图)和钆增强T1加权的轴向MRI(C和D，右图)。基于上述这三个参数(A-D)，特别是类似于更具攻击性的GBM的AIII和AIII-G(E，F和G)，将患者分组。在38例随机选择的MRI增强和非增强的AA型患者中的存在(R132H+)或不存在(R132H-)IDH1突变的结果显示在图E中，其中n.d.表示没有检测到。使用自动细胞计数系统对切除的肿瘤标本中的CD163⁺细胞含量计数，并在图F中显示为由增强而分离的AA样本。盒须图表示第75，55和25位百分位数，而最大和最小数据值由上下须线代表。通过曼-惠特尼检验评价组间差异的统计学显著性(***，p<0.001)。基于其肿瘤侵袭性隔离的患者的Kaplan-Meier生存期曲线显示于图G中。组之间的统计学显著的生存期差异(**)通过对数秩(p＝0.0019)和威尔科克森检验(p＝0.0088)测定。结果表明，IDH R132H突变体III级星形细胞瘤很少与钆增强，并且肿瘤组织中CD163+M2细胞的积累与血管完整性的损失有关。

图35显示，在AIII和AIII-G患者中循环单核细胞的数量升高，并表达M2标记CD163的增加水平。来自18名随机选择的间变性星形细胞瘤(AA)患者(即，由WHO组织学标准形态学表征为III级的星形细胞瘤患者)和24名正常供体的PBMC用对于CD11b、CD14和CD163特异性的抗体进行染色，并通过流式细胞术进行评价。使用正向散射(FSC)和侧向散射(SSC)分布建立活细胞门，而单核细胞定义为表达CD11b和CD14的活细胞(图A)。来自正常供体和AA供体的PBMC中活体门的代表性轮廓图和CD11b和CD14阳性的分析显示于图A中，其中轴表呈为对数标度，而数字表示门控细胞的频率。图B是显示通过流式细胞术确定的来自12名患有AIII的患者、患有AIII-G的6名患者和24名正常个体的PBMC中的CD11b⁺CD14⁺单核细胞的频率的总结图。通过学生t-检验(**，p<0.01)评价正常个体和AA患者亚群之间的细胞百分比差异的统计学显著性。CD11b+CD14+门控单核细胞的CD163染色的中值荧光强度(MFI)由图C中的AIII，AIII-G和正常血液样本的代表性直方图重叠。轴以对数标度表示。来自不同供体组的PBMC样品中门控单核细胞亚群的CD163染色的MFI提供于图D中。

图36表明，在星形细胞瘤外来体上结合共有抗原的AIII和AIII-G患者血清中存在的抗体在同种型分布上是不同的。将从三个星形细胞瘤患者原发肿瘤细胞系中分离的外来体涂覆于96孔板上，并与初始手术前收集的患者血清(13名AIII，8名AIII-G)和正常对照的血清(4)一起温育。用荧光偶联的完整IgG(图A)或IgG同种型特异性的次级抗体(图B)和测定为MFI的抗体结合程度检测结合的抗体。

图37表明，通常与Th1和Th2免疫相关的可溶性因子在AIII和AIII-G患者的血清中分别都升高。

图38表明，编码白细胞表型标记、细胞因子和趋化因子受体以及其配体的基因的PBMC中的表达水平在AIII和AIII-G患者之间是不同的。来自17个未选择的AA患者的PBMC中单核细胞表型标记(A)、白细胞介素(B)、白细胞介素受体(C)、CC趋化因子(D)和受体(E)以及CXC趋化因子(F)和受体(G))的基因拷贝数通过高通量定量RT-PCR进行评价，并归一化为每个样品中存在的看家基因L13a的拷贝数。

图39表明，通过PBMC中选择免疫相关基因的表达可以准确地区分AIII和AIII-G患者亚群。判别分析首先用于识别最佳分开AIII和AIII-G患者PBMC的基因表达数据(图A)。然后使用主组分分析确定这些基因，CCL3，CCR4，CCR5，CCR7，CXCL7，IL-15，IL-32，IL-15R，IL-21R，IL-23R，IL-31RA和CD163中哪些可以最有效地区分两个病人组(图B)。

具体实施方式

本公开第一次显示M1和M2细胞之间的关键区别是M2亚群比M1亚群产生更高水平的胰岛素样生长因子1型受体(IGF-1R)。这表明IGF-1R在M2细胞的极化和生存中起关键作用。实际上，本公开表明，尽管M1和M2细胞均可以大量吸收针对IGF-1R的反义核酸(IGF-1RAS ODN)，但是IGF-1R AS ODN会以剂量依赖性方式诱导相对M1细胞的来自癌症患者的M2细胞的选择性降低。更重要的是，本公开表明M2细胞的选择性降低会导致这些患者的癌症消退。因此，本说明书首次提供了通过全身给予IGF-1R AS ODN而选择性降低患者中M2细胞的数量以治疗某些癌症的可行且有效的机制。

另外，在患有某些类型的癌症，包括但不限于神经胶质瘤、星形细胞瘤、乳腺癌、头颈鳞状细胞癌、II型乳头状细胞癌、肺癌、胰腺癌、胆囊癌、直肠癌、经典霍奇金淋巴瘤、卵巢癌和结肠直肠癌的患者中，M2细胞会导致肿瘤环境免疫调节至2型免疫，其抑制1型免疫并使免疫治疗策略失效。M2细胞从而减弱治疗性抗肿瘤免疫的诱导。因此，鉴于这些患者中存在的M2细胞，寻求改善Th1免疫的治疗失败或降低功效。本公开第一次显示，降低M2亚群体也会促进癌症患者的1型免疫。本公开表明，通过靶向和中和M2细胞群体，在癌症患者中会恢复产生1型，保护性抗肿瘤免疫的能力，从而有助于使用免疫治疗策略的治疗。

甚至更重要的是，本公开显示通过给予IGF-1R AS ODN选择性降低M2细胞会提供用于延缓癌症的发作甚至预防受试者癌症的机制。因此，使用IGF-1R AS ODN选择性降低M2细胞为癌症的治疗和预防以及增强癌症患者中治疗性免疫力提供了新而有意义的免疫治疗方法。因此，本公开提供了关于免疫系统的新信息，并支持涉及靶向消除与患有各种癌症的患者的不良预后相关的M2细胞的治疗性干预。

因此，本公开提供了包含能够靶向M2细胞中的IGF-1R表达的核酸的药物组合物。本公开还提供了用于通过靶向这些细胞中IGF-1R的表达而选择性降低M2细胞的方法。本公开进一步提供了用于通过靶向患者中M2细胞中IGF-1R的表达而治疗癌症的方法。重要的是，当对对其需要的受试者全身给予时，本发明的药物组合物是有效的。药物组合物的易于给予有利于治疗并增强患者依从性。

本文所用的术语“选择性”是指影响M2细胞但不影响M1细胞的效应。或者，这可以是指与M1细胞相比在更大程度上影响M2细胞的效应。例如，M2细胞数量的选择性降低不影响M1细胞的数量，或与M1细胞数量的减少相比，会导致M2细胞数量的降低。

术语“靶向IGF-1R表达”或“靶向IGF-1R的表达”是指给予具有设计为结合于IGF-1R的序列的核酸。

本文所用的术语“M2细胞”包括存在于受试者的肿瘤内的M2巨噬细胞和/或在受试者外周中循环的M2单核细胞。

本文所用的术语“M1细胞”包括在受试者的组织内存在的M1巨噬细胞和/或在受试者周围循环的M1单核细胞。

除非上下文另有明确要求，如本文所使用的术语如“一个”，“一种”和“该”包括单数和复数的指示物。

如本文所使用的术语“约”，当在数值之前时是指值加或减10％的范围。例如，“约100”涵盖90和110。

在一些实施方式中，本公开提供了包含有效量的靶向M2细胞中的IGF-1R表达的核酸的药物组合物，其中向患有癌症的患者给予药物组合物会导致M2细胞的降低。

在某些实施方式中，本公开提供了包含有效量的能够靶向M2细胞中的IGF-1R表达的核酸的药物组合物，其中向患有癌症的患者给予药物组合物会导致M2细胞内IGF-1R的表达下调。在其它实施方式中，本公开提供了包含有效量的能够靶向M2细胞中的IGF-1R表达的核酸的药物组合物，其中向患有癌症的患者给予药物组合物会导致M2细胞中IGF-1R以外的基因的表达的下调。

在一些实施方式中，核酸下调细胞中IGF-1R通路下游的基因的表达。在某些方面中，下游基因是己糖激酶(Hex II)。在一些实施方式中，核酸下调细胞中管家基因的表达。在某些方面中，管家基因是L13。

在一些实施方式中，核酸是天然存在的核酸。在其他实施方式中，核酸是非天然存在的核酸。在某些方面中，核酸是重组产生的。在一些实施方式中，核酸在微生物中重组产生。在一些方面中，核酸在细菌中重组产生。在其它实施方式中，核酸在哺乳动物细胞系中重组产生。在其它实施方式中，核酸在昆虫细胞系中重组产生。

在某些方面中，核酸是化学合成的。在某些实施方式中，核酸是通过固相有机合成制造的。在一些方面中，核酸的合成在配备有使用通流技术的封闭化学柱反应器的合成器中进行。在一些实施方式中，固体载体上的每个合成循环序列由多个步骤组成，其依次进行直到获得全长核酸。在某些实施方式中，核酸以液体形式储存。在其它实施方式中，将核酸在储存之前冻干。在一些方面中，将冻干的核酸在使用前溶解于水中。在其它实施方式中，将冻干的核酸在使用前溶于有机溶剂中。在另一个实施方式中，将冻干的核酸配制成药物组合物。在一些方面中，药物组合物是液体药物组合物。在其它方面中，药物组合物是固体药物组合物。

在一些实施方式中，核酸是RNA。在其它实施方式中，核酸是DNA。在还有的其它实施方式中，核酸是RNAi分子。在进一步的实施方式中，核酸是寡核苷酸。

在某些实施方式中，核酸是反义寡聚物。在一些方面中，核酸是反义寡脱氧核苷酸(AS ODN)。反义寡聚物通过以Watson和Crick碱基配对规则结合至靶向的mRNA互补序列而在分子水平上起作用。当互补螺旋之间发生杂交时，靶mRNA的翻译受到主动和/或被动机制的抑制。在被动机制中，mRNA和外源核苷酸序列之间的杂交导致阻止核糖体复合物读取信息的双链体形成。在主动机制中，杂交促进RnaseH的结合，其破坏RNA，但是会保持AS ODN完整，与另一个互补的mRNA靶杂交。该机制中的一种或两种会抑制有助于或维持恶性表型的蛋白的翻译。作为治疗药物，它们是更加选择性的，而因此比常规药物更有效而毒性更小。一种或多种硫代磷酸修饰的存在通过赋予核酸酶抗性而稳定低聚物，并由此提高其半衰期。

在一些实施方式中，核酸包含修饰的磷酸酯主链。在某些方面中，磷酸酯骨架修饰使核酸对核酸酶降解更具抗性。在某些实施方式中，修饰是锁核酸修饰。在其它实施方式中，修饰是硫代磷酸键。在某些方面中，核酸含有一个或多个硫代磷酸键。在某些实施方式中，硫代磷酸键使核酸对核酸酶切割更具抗性。在一些实施方式中，核酸可以部分是硫代磷酸连接的。例如、至多约1％、至多约3％、至多约5％、至多约10％、至多约20％、至多约30％、至多约40％、至多约50％、至多约60％、至多约70％、至多约80％、至多约90％、至多约95％、或至多约99％的核酸可以是硫代磷酸连接的。在一些实施方式中，核酸是完全硫代磷酸连接的。在其它实施方式中，硫代磷酸键可以与磷酸二酯键键交替。在某些实施方式中，核酸具有至少一个末端硫代磷酸单磷酸酯。

在一些实施方式中，核酸包含一个或多个CpG基序。在其它实施方式中，核酸不包含CpG基序。在某些方面中，一个或多个CpG基序是甲基化的。在其它方面中，一个或多个CpG基序是未甲基化的。在某些实施方式中，当向受试者给予核酸时，一个或多个未甲基化的CpG基序引发先天免疫响应。在一些方面中，先天免疫响应是通过未甲基化的含CpG的核酸与Toll-样受体(TLR)的结合介导的。在某些方面中，TLR是TLR9。在其他方面中，TLR与未甲基化的含CpG的核酸的结合导致TLR9激活。在某些方面中，活化的TLR9在B细胞上表达。在其他方面中，活化的TLR在浆细胞样树突状细胞上表达。在某些方面中，通过B细胞分泌细胞因子可以测定TLR9的活化。在一方面中，细胞因子是IL-6。在另一方面中，细胞因子是IL-10。在其他方面中，TLR9的活化可以通过浆细胞样树突状细胞分泌的细胞因子测量。在一方面中，细胞因子是IFNα。在另一方面中，细胞因子是IFNβ。在另一方面中，细胞因子是TNFα。

在某些实施方式中，核酸包含至少一个末端修饰或“封盖”。封盖可以是5'和/或3'-封盖结构。术语“封盖”或“封端”包括在寡核苷酸的任一末端(相对于末端核糖核苷酸)的化学修饰，并且包括在5'末端的最后两个核苷酸与3'末端的最后两个核苷酸之间的连接上的修饰。封盖结构可以增加核酸对外切核酸酶的抗性，而不损害与靶序列或细胞机制的分子相互作用。这些修饰可以基于它们在体外或体内增加的效力而选择。封盖可以存在于5'末端(5'封盖)或3'末端(3'封盖)处，或可以存在于两端。在某些实施方式中，5'-和/或3'-封盖独立地选自硫代磷酸单磷酸酯、无碱基残基(部分)、硫代磷酸键、4'-硫代核苷酸、碳环核苷酸、二硫代磷酸键、反向核苷酸或反向无碱基部分(2'-3'或3'-3')，二硫代磷酸单磷酸酯和甲基膦酸酯部分。硫代磷酸或二硫代磷酸键当是封盖结构的一部分时，通常位于5'端的两个末端核苷酸和3'端的两个末端核苷酸之间。

在某些实施方式中，核酸靶向细胞中特异性基因的表达。在一些实施方式中，核酸靶向细胞中一种或多种生长因子的表达。在一些实施方式中，生长因子是胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)。IGF-1R是与胰岛素受体共享70％同源性的酪氨酸激酶细胞表面受体。当被其配体(IGF-I，IGF-II和胰岛素)激活时，其会调节广泛的细胞功能，包括增殖、转化和细胞存活。IGF-1R不是正常生长的绝对要求，但对于可能发生于恶性组织中的锚定独立性的条件下的生长是必要的。IGF-1R在肿瘤中的作用的综述提供于Baserga et al.,Vitaminsand Hormones,53:65-98(1997)中，通过引证以其全部内容结合于本文中。

在某些实施方式中，核酸是针对生长因子或生长因子受体如例如IGF-1R的DNA或RNA的寡核苷酸。

在某些实施方式中，细胞是哺乳动物细胞。在其他实施方式中，细胞是免疫系统的细胞，包括但不限于单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、白细胞、天然杀伤(NK)细胞、淋巴细胞、T细胞、B细胞、树突状细胞、肥大细胞和巨噬细胞。

在某些实施方式中，细胞是巨噬细胞。在某些方面中，巨噬细胞是M2巨噬细胞。在某些方面中，M2巨噬细胞表达一种或多种细胞表面标记，包括但不限于CD11b、CD14、CD15、CD23、CD64、CD68、CD163、CD204、CD206和/或其它在本领域内已知的M2巨噬细胞标记。

在其它实施方式中，细胞是单核细胞。在某些方面中，单核细胞是M2单核细胞。在某些方面中，M2单核细胞表达一种或多种细胞表面标记，包括但不限于CD11b、CD14、CD15、CD23、CD64、CD68、CD163、CD204、CD206和/或其它本领域通常已知的M2单核细胞标记。

在某些实施方式中，核酸在任何细胞中下调IGF-1R表达。在其它实施方式中，核酸下调M2细胞中的IGF-1R表达。在某些实施方式中，相比于未用核酸处理的M2细胞，M2细胞中的IGF-1R表达下调至少约1％、至少约2％、至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、或至少约95％。通过定量RT-PCR可以测定M2细胞中的IGF-1R表达。

在某些方面中，M2细胞中的IGF-1R表达在向受试者给予核酸之后约10分钟、约20分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约6小时、约12小时、约24小时、约48小时或约72小时下调。

在一些实施方式中，在接受一剂量的核酸之后，M2细胞中的IGF-1R表达在受试者中保持下调至少约1天、至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天、至少约14天、至少约3周、至少约4周、至少约5周、或至少约6周。

在一些方面中，与M1细胞相比，M2细胞中IGF-1R的表达的下调会导致受试者中M2细胞的选择性下降。在某些方面中，与M1细胞相比，靶向M2细胞中IGF-1R的表达会导致受试者中M2细胞的选择性降低。

在某些实施方式中，与需要用靶向M2细胞中IGF-1R的表达的核酸治疗的受试者，例如，治疗前的受试者相比，受试者中的M2细胞降低至少约2％、至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、或至少约95％。在一些实施方式中，受试者中的M2细胞减少至少约40％。在其他方面中，M2细胞群体被消除。例如，在给予本发明的药物组合物之后，M2细胞群体可以是药物组合物给予前的群体的约1％、约2％、约5％或约10％。受试者中的M2细胞可以使用FACS测定。在某些方面中，治疗后M2细胞被消除；即通过FACS不可检测。

在某些方面中，在给予后约10分钟、约20分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约6小时、约12小时、约24小时、约48小时、或约72小时内观察到M2细胞的降低。

在一些实施方式中，在接受一剂量的核酸后，受试者中M2细胞的降低持续至少约1天、至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天、至少约14天至少约3周、至少约4周、至少约5周、或至少约6周。

在一些实施方式中，靶向IGF-1R的表达会阻止未分化的单核细胞极化为M2细胞。在其它实施方式中，靶向M2细胞中IGF-1R的表达会导致M2细胞失去其M2表型和功能特性，或经受细胞死亡。在某些实施方式中，细胞死亡是坏死。在其他实施方式中，细胞死亡是细胞凋亡。为了本发明的目的，细胞凋亡定义为程序性细胞死亡，并包括但不限于原发性和转移性肿瘤的消退。细胞凋亡是程序性细胞死亡，其是在各种生理学和病理学过程中起关键作用的广泛现象。相比之下，坏死是意外的细胞死亡，是细胞对各种有害条件和有毒物质的反应。在其它实施方式中，靶向M2细胞中IGF-1R的表达会导致M2细胞经受细胞周期停滞。

在某些实施方式中，本发明的核酸是针对IGF-1R的反义脱氧核苷酸(IGF-1R ASODN)。IGF-1R的全长编码序列显示于SEQ ID NO:19。在某些方面中，核酸与IGF-1R AS ODN可以具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约98％、或100％的同一性。同一性百分比可以使用www.ebi.ac.uk/Tools/ msa/clustalw2/可获得的比对程序ClustalW2使用默认参数计算。

在某些实施方式中，核酸包含与IGF-1R信号序列互补的核苷酸序列，包括RNA或DNA。IGF-1R的信号序列是30个氨基酸的序列。在其它实施方式中，核酸包含与IGF-1R信号序列的部分互补的核苷酸序列，包括RNA或DNA。在一些实施方式中，核酸包含与IGF-1R的密码子1-309互补的核苷酸序列，包括RNA或DNA。在其它实施方式中，核酸包含与IGF-1R密码子1-309的部分互补的核苷酸序列，包括RNA或DNA。

在某些实施方式中，核酸的长度为至少约5个核苷酸、至少约10个核苷酸、至少约15个核苷酸、至少约20个核苷酸、至少约25个核苷酸、至少约30个核苷酸、至少约35个核苷酸、至少约40个核苷酸、至少约45个核苷酸、或至少约50个核苷酸。在一些实施方式中，核酸的长度为约15个核苷酸至约22个核苷酸。在某些方面中，核酸的长度约为18个核苷酸。

在某些实施方式中，核酸在18℃形成二级结构，但在约37℃下不形成二级结构。在其它实施方式中，核酸在约18℃或约37℃下不形成二级结构。在其它实施方式中，核酸在任何温度下不形成二级结构。在其它实施方式中，核酸在37℃下不形成二级结构。在具体实施方式中，二级结构是发夹环结构。

在一些方面中，核酸包含SEQ ID NO:1-14中的任一种或其片段。在某些实施方式中，核酸可以与SEQ ID NO:1-14中的任一种或其片段具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约98％、或100％的同一性。

在一些方面中，核酸由SEQ ID NO:1-14中的任一种组成。在某些方面中，核酸是SEQ ID NO:1。SEQ ID NO:1被称为NOBEL。NOBEL是具有硫代磷酸骨架和与IGF-1R基因中的密码子2至7互补的序列的18聚体寡脱氧核苷酸。因此，NOBEL是针对IGF-1R的反义寡核苷酸(IGF-1R AS ODN)。作为5'端的IGF-1R基因的互补序列衍生的NOBEL序列是：

5′-TCCTCCGGAGCCAGACTT-3′。

NOBEL具有稳定的保质期，并且由于其硫代磷酸骨架而耐核酸酶降解。NOBEL的给予可以以与本领域普通技术人员已知的寡脱氧核苷酸的引入相关的任何标准方法提供。有利地，本文公开的包括NOBEL的AS ODN可以实现极少/无毒性的给予。基于小鼠测试(尾静脉给予40μg)，即使约2g/kg(比例缩放的)的水平也未显示出毒性问题。NOBEL可以根据本领域普通技术人员已知的常规方法与步骤制成。

本文公开的药物组合物除了药用载体或稀释剂之外还含有核酸；例如，组合物可以含有盐水(0.9％氯化钠)。

人受试者中核酸的剂量可以为约0.025g/kg、约0.05g/kg、约0.1g/kg、约0.15g/kg或约0.2g/kg。在某些方面中，核酸作为冻干粉末提供，并在给予前重新悬浮。当重新悬浮时，核酸的浓度可以为约50mg/mL、约100mg/mL、约200mg/mL、约500mg/mL、约1000mg/mL或这些量之间的范围。

在某些实施方式中，受试者是动物。在其他方面中，受试者是人。在一些实施方式中，受试者患有疾病。在某些方面中，疾病是癌症。在某些实施方式中，癌症包括但不限于乳腺癌、星形细胞瘤、头颈鳞状细胞癌、II型乳头状肾细胞癌、肺癌、胰腺癌、胆囊癌、直肠癌、神经胶质瘤、经典霍奇金病淋巴瘤、卵巢癌和结肠直肠癌。在某些方面中，癌症是神经胶质瘤。在具体方面中，患者患有恶性神经胶质瘤。在具体方面中，恶性神经胶质瘤是复发性恶性神经胶质瘤。

在某些实施方式中，核酸治疗的候选人的受试者通过测定他们的血液中循环单核细胞的水平而确定。在一些实施方式中，与健康受试者相比，候选人具有升高的循环单核细胞数量。如本文所用，术语“健康受试者”是指不患有癌症或任何其它疾病并且不需要用本发明的核酸治疗的受试者。在一些方面中，循环的单核细胞包括但不限于CD11b+、CD14+、CD15+、CD23+、CD64+、CD68+、CD163+、CD204+、或CD206+单核细胞。在某些方面中，一种或多种循环单核细胞的水平相比于健康受试者升高至少约1.3倍、至少约1.5倍、至少约1.8倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约60倍、至少约70倍、至少约80倍、至少约90倍、或至少约100倍。在具体实施方式中，与健康受试者相比，一种或多种循环单核细胞的水平升高约2倍。受试者中循环单核细胞的水平可以使用荧光激活细胞分选法(FACS)测定。

在某些方面中，与健康受试者相比，受试者具有升高的循环CD14+单核细胞数量。在某些方面中，循环的CD14+单核细胞的水平与健康受试者相比升高至少约1.3倍、至少约1.5倍、至少约1.8倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍至少约5倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约60倍、至少约70倍、至少约80倍、至少约90倍、或至少约100倍。在具体实施方式中，与健康受试者相比，循环CD14+单核细胞的水平升高约2倍。

在某些实施方式中，循环CD14+单核细胞与健康受试者相比具有升高的CD163水平。在一些方面中，循环CD14+单核细胞上的CD163水平与健康受试者相比升高至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约20倍至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约60倍、至少约70倍、至少约80倍、至少约90倍或至少约100倍。在具体实施方式中，与健康受试者相比，循环CD14+单核细胞上的CD163水平升高约2倍。

在其他实施方式中，用核酸治疗的候选人的受试者具有使未分化单核细胞向M2细胞极化的血清。在某些方面中，受试者血清与未分化单核细胞的温育会诱导单核细胞上的一种或多种的细胞表面标记，包括但不限于CD11b、CD14、CD15、CD23、CD64、CD68、CD163、CD204和/或CD206的表达。在其他方面中，与未用受试者血清温育的单核细胞相比，受试者血清与未分化单核细胞的温育增加单核细胞上的一种或多种细胞表面标记的表达。在某些方面中，细胞表面标记包括但不限于CD11b、CD14、CD15、CD23、CD64、CD68、CD163、CD204和/或CD206。在一些方面中，一种或多种表面标记的水平相比于未与受试者血清温育的未分化的单核细胞升高至少约1.3倍、至少约1.5倍、至少约1.8倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约60倍、至少约70倍、至少约80倍、至少约90倍或至少约100倍。在具体实施方式中，与未与受试者血清温育的未分化单核细胞相比，一种或多种表面标记的水平升高约2倍。受试者血清极化的单核细胞可以使用FACS测定。

在其他实施方式中，通过对受试者进行肿瘤活检而确定核酸治疗的候选人。在一些实施方式中，对来自受试者的肿瘤测定单核细胞的存在。在某些方面中，单核细胞包括但不限于CD11b+、CD14+、CD15+、CD23+、CD64+、CD68+、CD163+、CD204+或CD206+单核细胞。肿瘤中单核细胞的存在可以使用免疫组织化学测定。

在某些实施方式中，用核酸治疗的候选人显示出受试者总体外周血单核细胞(PBMC)的大于约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、或约50％的CD163+M2细胞。在某些方面中，受试者显示出受试者总PBMC的大于约20％的CD163+M2细胞。

在某些实施方式中，核酸治疗的候选人患有WHO II级、WHO III级或WHO IV级肿瘤。在某些方面中，受试者患有WHO II级肿瘤。在某些方面中，肿瘤是星形细胞瘤。在某些实施方式中，肿瘤选自II级星形细胞瘤，AIII(IDH1R132H突变体III级星形细胞瘤)、AIII-G(IDH1野生型III型，具有胶质母细胞瘤多形性成星形细胞瘤特征)或IV级星形细胞瘤。在某些方面中，IV级星形细胞瘤是多形性成胶质细胞瘤。

在一些实施方式中，通过测量特定的组细胞因子的水平确定用核酸治疗的候选人。在一些实施方式中，与健康受试者相比，受试者具有升高的这些细胞因子水平。在其他实施方式中，通过检测存在于肿瘤中的特异性微RNA(miRNA)确定受试者。在具体实施方式中，与健康受试者相比，受试者具有升高的这些miRNA的水平。

在一些实施方式中，核酸诱导患者中癌症的消退。在其它实施方式中，核酸诱导患者中癌症的减少。在其它实施方式中，核酸诱导患者中癌症的消除。

在一些实施方式中，核酸诱导患者中神经胶质瘤肿瘤的消退。在其他实施方式中，核酸诱导患者中胶质瘤肿瘤的减少。在其它实施方式中，核酸诱导患者中胶质瘤肿瘤的消除。

在某些实施方式中，核酸配制成药物组合物。在一些方面中，药物组合物配制为液体形式。在其它方面中，药物组合物配制为固体形式。在某些方面中，药物组合物配制用于口服给予。在某些实施方式中，药物组合物为胶囊形式。在其它实施方式中，药物组合物为片剂的形式。在某些方面中，片剂是快速释放片剂。在其他方面，片剂是缓释片剂。在其它方面中，药物组合物配制用于腹腔给予。在另一方面，药物组合物配制用于静脉内给予。在进一步的方面中，药物组合物配制用于肌内给予。

在某些实施方式中，药物组合物引入到扩散室内，并将扩散室手术植入受试者的腹直肌鞘(rectus sheath)内治疗有效的时间(参见，例如，美国专利号6,541,036，通过引证以其全部内容结合于本文中)。

如讨论的，本公开显示了M2细胞(而不是M1细胞)大量吸收针对IGF-1R的反义核酸(IGF-1R AS ODN)，并且IGF-1R AS ODN会以剂量依赖性方式诱导来自癌症患者的M2细胞相对于M1细胞的选择性降低。更重要的，本公开显示了M2细胞的选择性降低会导致这些患者的癌症消退。

因此，在某些实施方式中提供了用于选择性消除患有癌症的患者中的M2细胞的方法，包括向患者给予有效量的药物组合物。

在其它实施方式中提供了通过靶向M2细胞中IGF-1R的表达而治疗癌症的方法，包括向患有癌症的患者给予有效量的药物组合物。

在某些实施方式中，治疗癌症的方法进一步包括组合疗法。在一些实施方式中，组合疗法包括放射疗法。在其它实施方式中，组合疗法包括化学疗法。在某些方面中，在给予药物组合物之后，向患者给予放射疗法或化学疗法。在某些实施方式中，在给予药物组合物后至少约1小时、至少约2小时、至少约3小时、至少约6小时、至少约12小时、至少约24小时、至少约48小时、至少约72小时、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天、至少约14天、至少约3周、至少约4周、至少约5周或至少约6周给予患者放射治疗或化学疗法。

在某些方面中，在给予放射治疗或化学疗法之后，向患者给予药物组合物。在某些实施方式中，在给予放射治疗或化疗之后至少约1小时、至少约2小时、至少约3小时、至少约6小时、至少约12小时、至少约24小时、至少约48小时、至少约72小时、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天、至少约14天、至少约3周、至少约4周、至少约5周或至少约6周将药物组合物给予患者。

在某些实施方式中，放射疗法包括但不限于内部源放射治疗、外部束放射治疗和全身放射性同位素放射治疗。在某些方面中，放射治疗是外部束放射治疗。在一些实施方式中，外部束放射治疗包括但不限于γ放射治疗、X-射线治疗、调强放射治疗(IMRT)和图像引导放射治疗(IGRT)。在某些实施方式中，外部束放射治疗是γ放射治疗。

在某些实施方式中，AS ODN可以在手术前给予；例如，在手术前以降低肿瘤负担。例如，AS ODN可以在手术前至多达24小时、至多达36小时、至多达48小时或至多达72小时给予。在具体方面中，药物组合物可以在手术前约48至约72小时给予。通常，在这种情况下，给予是通过静脉内推注。

如讨论的，在患有某些癌症，包括但不限于神经胶质瘤、星形细胞瘤、乳腺癌、头颈鳞状细胞癌、II型乳头状肾细胞癌、肺癌、胰腺癌、胆囊癌、直肠癌、经典霍奇金淋巴瘤、卵巢癌和结肠直肠癌的患者中，M2细胞会导致肿瘤环境免疫调节至2型免疫，这会抑制1型免疫。由此，M2细胞会减弱治疗性抗肿瘤免疫的诱导作用。例如，以下表1总结了归因于可能至少部分地由神经胶质瘤中的M2细胞引起的神经胶质瘤的可能的免疫调节。

表1神经胶质瘤的免疫调节能力

用本发明的核酸治疗这样的癌症患者将消除或改变M2细胞，这将对肿瘤生长以及促进免疫响应具有直接抑制性后果。此外，在某些实施方式中将会优选用核酸和疫苗接种的组合治疗这些患者而促进免疫。因此，在某些实施方式中，有利的是提供治疗方法，其中单独或与另外的药物组合提供核酸，用于选择性靶向M2细胞。通过消除这些细胞，减轻和减少肿瘤的生产和促进，并进一步修饰免疫调节因子。

因此，在某些实施方式中提供了通过靶向M2细胞中IGF-1R的表达而增强患有癌症的患者中的免疫响应的方法，包括向患有癌症的患者给予有效量的药物组合物。

组合疗法

M2细胞的降低可以与抗肿瘤免疫响应的刺激一起完成，在本文中称为疫苗接种疗法。在某些实施方式中，疫苗接种疗法包括将在体外或离体温育的肿瘤细胞置于补充有促凋亡剂的培养基中例如3至48小时的时间段，用缓冲液洗涤肿瘤细胞而消除任何微量的促细胞凋亡剂，随后将细胞转移到扩散室中，然后将其植入受试者(参见，例如，美国专利号6,541,036，通过引证以其全部内容结合于本文中)。在某些实施方式中，扩散室包含源自通过本发明的药物组合物诱导消退的肿瘤相同类型的肿瘤细胞。在其他实施方式中，放置于扩散室中的肿瘤细胞是与诱导消退的肿瘤不同的类型。

在某些实施方式中，在将本发明的药物组合物全身给予于受试者之前，将扩散室植入受试者。在其它实施方式中，在全身给予药物组合物之后，将扩散室植入受试者。在还有的其它实施方式中，植入受试者的扩散室也含有药物组合物。在一些方面中，包含药物组合物和如上的体外或离体处理的自体肿瘤细胞的扩散室植入受试者中。在其他方面中，包含药物组合物和如上体外或离体处理的来自受试者的肿瘤细胞的扩散室植入受试者中。在某些实施方式中，与仅单独给予药物组合物的受试者相比，将扩散室植入受试者中会进一步降低受试者中M2细胞的数量。

在一些实施方式中，将室植入受试者的腹部。在某些实施方式中，将扩散室手术植入受试者的腹直肌鞘中治疗有效时间。

在一些方面中，在给予疫苗接种疗法后将药物组合物给予于受试者。在某些方面中，在给予药物组合物之后至少约1小时、至少约2小时、至少约3小时、至少约6小时、至少约12小时、至少约24小时、至少约48小时、至少约72小时、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天、至少约14天、至少约3周、至少约4周、至少约5周、或至少约6周向受试者给予药物组合物。在某些实施方式中，在疫苗接种疗法给予之后至少约48小时将疫苗接种疗法给予于受试者。

在某些方面中，在给予药物组合物之后，将疫苗接种疗法给予于受试者。在某些实施方式中，在给予药物组合物之后至少约1小时、至少约2小时、至少约3小时、至少约6小时、至少约12小时、至少约24小时、至少约48小时、至少约72小时、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天、至少约14天、至少约3周、至少约4周、至少约5周、或至少约6周将疫苗接种疗法给予于受试者。在某些实施方式中，在给予药物组合物后至少约48小时将疫苗接种疗法给予于受试者。

在一些实施方式中，用于增强免疫响应的方法包括在疫苗接种疗法后给予第二药物组合物。在某些实施方式中，在给予疫苗接种疗法后至少约1小时、至少约2小时、至少约3小时、至少约6小时、至少约12小时、至少约24小时、至少约48小时、至少约72小时、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天、至少约14天、至少约3周、至少约4周、至少约5周或至少约6周将第二药物组合物给予于受试者。

在其它实施方式中，在给予第二药物组合物之后，向受试者给予疫苗接种疗法。在某些实施方式中，在给予第二药物组合物之后至少约1小时、至少约2小时、至少约3小时、至少约6小时、至少约12小时、至少约24小时、至少约48小时、至少约72小时、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天、至少约14天、至少约3周、至少约4周、至少约5周或至少约6周将疫苗接种疗法给予于受试者。

在某些实施方式中，药物组合物和第二药物组合物是相同的。在其它实施方式中，药物组合物和第二药物组合物是不同的。

通常，在植入之前辐照肿瘤细胞；例如，可以以约1Gy、约2Gy、约4Gy、约5Gy、约6Gy、约10Gy、或至多达15Gy的量用γ辐照处理细胞。在某些实施方式中，细胞可以辐照至少一次、至少两次、至少三次、至少四次、或至少五次。

在某些实施方式中提供了用于通过靶向M2细胞中IGF-1R的表达而预防或延缓受试者中的癌症的方法，包括向受试者给予有效量的药物组合物。在一些实施方式中，受试者是动物。在其他实施方式中，受试者是人。在某些方面中，人由于持续暴露于增加癌症风险的一种或多种致癌物而易患癌症。在某些方面中，这些致癌物质包括但不限于香烟、烟草和石棉。在其他方面中，人在遗传上是易患癌症的。

在某些实施方式中，提供了用于通过靶向M2中IGF-1R的表达而治疗，预防或延缓受试者的疾病，包括但不限于阿尔茨海默病、炎性肠病、2型糖尿病中的胰岛素抵抗和牛皮癣的方法，包括向受试者给予有效量的药物组合物。

实施例

实施例1：多形性成胶质细胞瘤中IGF-1R的免疫组织化学

原始放大倍数200×(图A，B，C，D)，400×(图E)。为了评估多形性成胶质细胞瘤中IGF-1R表达的相关性，用抗-IGF-1Rα(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)对18个连续的成胶质细胞瘤病例进行染色。在常规福尔马林固定石蜡包埋的切片上进行IGF-1Rα的免疫组织化学(图5)。使用靶标修复溶液(Target Retrieval Solution)(#1699，DakoCorporation，Carpinteria，CA)增强切片的蒸汽热诱导的表位修复，随后自动免疫染色(Dako自动染色器，型号LV-1，Dako Corporation)或以1:500稀释的IGF-1Rα(Santa CruzBiotechnology，Santa Cruz，CA)。使用兔二级抗体MACH 3兔HRP试剂盒(Biocare Medical)和AB溶液(发色溶液中的3,3'-二氨基联苯胺，Dako Corporation)进行检测。所有肿瘤均显示出IGF-1R免疫反应性。

实施例2：NOBEL的药物、制剂和稳定性

如上所述，NOBEL是具有硫代磷酸骨架的18聚体寡脱氧核苷酸，并作为以起始甲硫氨酸密码子下游的六个核苷酸开始的针对胰岛素样生长因子1型受体的反义(IGF-1R ASODN)。游离酸的分子量为5708.71道尔顿。钠盐的分子量为6082.40道尔顿。作为5'端的IGF-1R基因的互补序列得出的NOBEL序列是：5'-TCCTCCGGAGCCAGACTT-3'。

NOBEL是通过固相有机合成，在配备有封闭化学柱反应器的合成器中使用完善的方法，使用通流技术制造。固体载体上的每个合成循环序列由多个步骤组成，这些步骤依次进行直到全长寡核苷酸构建。作为冻干粉末的药物包装于具有螺旋盖的HDPE容器中，并随后真空热密封于5mL Mylar袋内，储存于-80℃下。

将由新药品组成药物产品溶解于盐水中直到获得100mg/mL的溶液。所获得的溶液通过0.22μm膜过滤器无菌过滤。将1mL等分填充到USP 1型玻璃小瓶中，并用合适的橡胶塞和铝盖密封之后在-80℃下储存。这种制剂在无菌生理盐水中重构时在两种独立的制剂中已经证明在九年(最后的测试日期)中是稳定的(图6)。

实施例3：小鼠中的毒性的临床前评估

本研究的目的是评估当通过静脉内注射至小鼠作为单一剂量给予时，试验品NOBEL的毒性；在给药后，给药后观察动物约48小时(第3天中间处死)或14天(第15天终点处死)，以评估效果的可逆性、持久性、或延迟发生。本研究根据良好实验室规范(GoodLaboratory Practice)进行，并符合食品和药物管理局(Food and Drug Administration)制定的标准。将雄性和雌性Cr1:CD1(ICR)小鼠分配到各组，并且如下表所示给予剂量。动物以100μL的体积通过用载体/稀释剂[0.9％氯化钠注射液，USP(无菌盐水)]或NOBEL(作为以无菌盐水中100mg/mL提供)在尾静脉中静脉内注射给药一次(参见表2)。

表2小鼠中的NOBEL给药方案

^a组1只接受载体/稀释剂(无菌盐水)。

^b在剂量给予后约48小时处死指定为中间处死的动物(10只动物/性别/组)。在给予后14天，处死指定为终点处死的动物(5只动物/性别/组)。

毒性评估是基于死亡率、临床观察、体重、食物摄取以及临床和解剖病理学。在给药阶段的第3或15天，所有动物均存活至其预定的尸体解剖。没有发生测试品相关的临床观察或食物摄取的变化。没有观察到对体重的统计学显著的影响。然而，给予0.04mg/鼠的雄性在给药期的第15天发生体重的稍微降低(对照组的93.8％)。这种趋势早在这些雄性的给药阶段的第8天观察到，并且认为是与试验品相关但不是不利的，因为没有发生身体状况或水合状态的临床变化。在给予0.01mg/鼠的雄性中或在雌性中，没有观察到与试验品相关的体重影响。

NOBEL给予对临床病理测试结果无影响。在中间处死的动物中，给予0.01mg/鼠的雌性中的肺重量，给予0.01或0.04mg/鼠的雄性中的睾丸重量，和给予0.04mg/鼠的雄性中的胸腺重量更高。在终点处死的动物中，给予0.01或0.04mg/鼠的雄性中的脑重量和给予0.04mg/鼠的雌性中的肺重量更高。这些器官重量变化没有任何相关的显微镜观察。试验品依赖性是未知的。无论如何，重量差异都不能认为是不利的。宏观或微观观察都不认为是试验品相关的。

总之，以0、0.01或0.04mg/鼠的剂量水平作为向雄性和雌性小鼠单次静脉内注射给予的NOBEL耐受良好，并与任何临床观察、食物摄取变化、临床病理学变化，或宏观或微观变化无关。其次，体重方面的试验制品相关变化和脑&肺重量的增加与试验制品的不确定关系并不认为是不利的。因此，未观察到的不良反应水平认为是0.04mg/鼠。

实施例4：M2(CD163+)巨噬细胞的选择性降低

NOBEL选择性降低人和小鼠中的CD163+细胞。来自患有恶性神经胶质瘤以及各种其他癌症，包括但不限于星形细胞瘤、乳腺癌、头颈鳞状细胞癌、II型乳头状肾细胞癌、肺癌、胰腺癌、胆囊癌、直肠癌、经典霍奇金淋巴瘤、卵巢癌和结肠直肠癌的患者的血清将单核细胞分化为以低微摩尔浓度吸收NOBEL的CD163+表型，导致该表型的降低。

在C57B/6小鼠模型中，在侧腹肿瘤接种后二十天腹腔内反义给予导致肿瘤诱导的CD163细胞降低至少14天(参见图7)。将GL261细胞植入C57BL/6和Tbet-/-小鼠的侧腹，随后在大约20天后，动物作为全身性腹膜内注射接受PBS或单独的4mg NOBEL(图8)。不能建立抗肿瘤1型免疫并排斥GL261肿瘤的Tbet-/-小鼠包括在内，以区分对1型和2型免疫的平衡和M2细胞降低的影响。在这两种情况下，在检测到可触诊的肿瘤之前给予单次剂量的单独的NOBEL延迟肿瘤形成显著的时间。也促进了长期生存，其中80％的C57小鼠和50％的Tbet敲除小鼠未能生长肿瘤(图8)。在不存在完整的免疫系统的情况下，将NOBEL与GL261细胞混合对肿瘤生长几乎没有影响(Morin-Brureau et al,Cancer Immunol.Immunother.,64:447-457(2015))而NOBEL与GL261细胞的混合在Tbet小鼠中植入也不干预肿瘤生长。这里的重要结论是IGF-R1AS ODN对GL261诱导肿瘤免疫的作用与一段时间后作用于肿瘤生长的那些不同。一种需要作为抗原的肿瘤和作为免疫兴奋剂的NOBEL的共同给予，而另一种具有独立于对抗原反应的全身作用。参与促进肿瘤生长的M2细胞和可能的其他细胞的降低，即使当受体动物不能建立治疗型1响应时，也都显然足以防止肿瘤生长。数据表明M2细胞从肿瘤微环境的损失会导致肿瘤细胞不能成长。

实施例5：向神经胶质瘤患者给予IGR-1R AS ODN

根据目前的研究，我们确定了以下给药方案中给予于复发性神经胶质瘤组的神经胶质瘤的合适剂量：0.025g/kg、0.05g/kg、0.1g/kg、0.15g/kg和0.2g/kg。

接受上述剂量之一的患者是患有复发性神经胶质瘤并在手术前48至72小时接受逐渐增加的IGF-1R的术前静脉内输液的患者。取决于M2细胞群体的定量，可以进一步给予第二次输液。这种给药方案也适用于其他癌症，包括但不限于星形细胞瘤、乳腺癌、头颈鳞状细胞癌、II型乳头状肾细胞癌、肺癌、胰腺癌、胆囊癌、直肠癌、经典霍奇金淋巴瘤、卵巢癌和结肠直肠癌。

实施例6：不同的IGF-1R AS ODN序列

不同的IGF-1R反义序列在NOBEL序列(5'-TCCTCCGGAGCCAGACTT-3'(SEQ ID NO:1))的一些或全部多模式效应中都是生物活性的。18聚体NOBEL序列具有IGF-1R受体下调活性以及TLR激动剂活性，并在小鼠中的进一步实验表明两种活性对于体内抗肿瘤免疫活性都是必需的。尽管AS ODN分子具有抗肿瘤活性，但是，尽管也具有CpG基序，互补义序列却没有抗肿瘤活性。调查了IGF-1R外显子的整个开放阅读框都(4104个碱基对)，并识别出10个另外的CpG基序，包括IDT1220(SEQ ID NO:2-11)(表3)。此外，还识别了不包含CpG基序的若干另外的IGF-1R反义序列(SEQ ID NO:12-14)(表3)。

表3IGF-1R AS ODN制剂的潜在的其它下游序列

实施例7：通过NOBEL激活Toll样受体9

对入侵病原体的免疫响应中的前线防御涉及病原体结构与一系列受体的相互作用，受体包括激活先天免疫系统的toll样受体(TLR)。免疫系统的这个手段会识别由各种病原体，包括细菌、病毒、真菌和寄生虫产生的一般类别的分子，其均为入侵病原体存活所必需的。这些与病原体相关的分子模式，或PAMPS，被免疫效应细胞，特别是树突状细胞中表达的病原体相关受体或PRR识别。由于与1991年由Nusslein-Volhard首次表征的果蝇中表征的toll蛋白的同源性，这些PRR命名为toll样受体。Stein et al.,Cell 65:725-35(1991)。TLR的激活作用在引导随后的适应性免疫响应的类型上是重要的。目前有10个已知的人TLR且TLR9是特别感兴趣的。TLR9结合包括细菌和病毒特有的非甲基化胞嘧啶-鸟苷序列的DNA的片段。如果暴露于免疫系统，人CpG二核苷酸总是甲基化的，使得自身人DNA变得耐受。未甲基化的CpG基序，特别是当嵌入有利的旁侧核苷酸六聚体序列时，会引起强大的先天免疫响应(图9)。当与反义基因翻译沉默药物水平相比时，在低1000倍的浓度下也会观察到响应。

发现NOBEL序列激活浆细胞样DC和B细胞。进行采用PBMC的体外AS ODN吸收实验，并测定免疫细胞亚群的激活。AS ODN的最高吸收发生于内吞抗原呈递细胞：单核细胞、树突状细胞(DC)和B细胞中，而在T细胞或NK细胞中观察到可忽略的吸收。AS ODN处理的浆细胞样树突状细胞(pDC)和B细胞增加T细胞活化中重要的共刺激分子的表达(CD80，83和86)。尽管观察到AS ODN吸收的最高水平，但CD80，83和86的表达水平在单核细胞和骨髓树突状细胞中未改变(图10)。

实施例8：NOBEL处理后的树突状细胞活化和成熟

用NOBEL处理源自单核细胞的树突状细胞显示出显著的剂量依赖性成熟反应(图11)。通过在rGM-CSF和rIL-4中温育CD14+PBMC 4天获得未成熟的DC。将未成熟的DC用NOBEL处理36小时。将聚I:C用作DC成熟的阳性对照。收获处理的DC，用荧光蛋白温育，并用流式细胞仪分析。高内吞能力是未成熟DC的标志，其在成熟信号时会迅速且显著地降低。NOBEL处理会以剂量依赖的方式降低DC的内吞能力。

实施例9：最佳AS ODN序列

作为筛选更多IGF-1R AS ODN序列的指南，根据Watson-Crick碱基配对规则，靶向的mRNA转录物的5'末端的序列具有与mRNA序列结合的最大可能性。这种生物活性归因于与在体温下更可能形成稳定的5'发夹环的DWA序列不同的，在体温下具有产生线性分子的更高的可能性的序列(图13)。如上所述，生物活性可归因于包括对靶向的mRNA序列以及从分子的5'末端可接近的并理想地在体温下是线性分子的未甲基化CpG二核苷酸的可接近性。尽管有这些准则，但是DWA序列虽然没有IGF-1R下调的能力，却在DC成熟时表现更好(图12)。不同的IGF-1R AS ODNs的生物活性总结于下表4中。

表4：不同IGF-1R AS ODN的生物活性总结。

实施例10：IGF-1R的下调：NOBEL的生物特异性和生物活性的总结

设计了两种试验评估AS ODN序列的生物特异性：

a.评估IGF-1R mRNA的下调的定量RT-PCR——该试验设计为确认细胞的IGF-1R转录的mRNA和AS ODN之间的Watson-Crick碱基配对。GL261小鼠细胞获自NCI-FrederickDTP，DCTD肿瘤库(Tumor Bank Repository)(Frederick，Maryland)且处于补充有10％FBS，4Mm L-谷氨酰胺(Fisher)，50μg/mL庆大霉素(GIBCO)和0.05Mm 2-ME(Sigma)的RPMI中。如图14所示，在用每孔1mg的Nobel AS-ODN处理的GL261细胞中(P<0.001)以及用每孔0.1mg的Nobel AS ODN处理的细胞中(P<0.05)IGF-1R表达显著降低。

b.评估己糖激酶同种型2mRNA的下游下调的定量RT-PCR—IGF-1在癌细胞中诱导己糖激酶RNA表达。据预测，由于通过AS-ODN处理的IGF-1R下调所致的由IGF-1的IGF-1R活化降低会导致己糖激酶表达的相似降低。如图15所示，IGF-1R mRNA的降低与己糖激酶II的下调高度相关就是这种情况。IGF-1R拷贝数降低90％对应于己糖激酶II拷贝数降低90％。还预期了管家基因的下调，在这种情况下观察到L13降低75％，因为IGF-1R的抑制减慢体外生长动力学和代谢。

实施例11：IGF-1R AS ODN的生物活性：评估NOBEL序列对肿瘤挑战的疫苗能力的小鼠侧腹模型

C57/BL6小鼠获自Jackson Laboratory(Bar Harbor，ME)和Taconic Farms，Inc.，并使用8至10周龄。在含有异氟烷的室中麻醉小鼠，并使用1mL BD Falcon注射器和21G BD针(Fisher)用100μL PBS中的10⁶个GL261侧腹注射。AS ODN GL261细胞制剂注射于左侧腹，而野生型GL261细胞在两周后注射于右侧腹。每周至少检查两次小鼠肿瘤发育。应注意，对于这些研究，GL261细胞已知在置于同源小鼠的侧腹中时是免疫刺激，使得约50％的这种动物预期会在没有干预的情况下发展抗肿瘤细胞免疫力。如图16所示，用AS-ODN处理的GL261细胞的预治疗将WT GL261肿瘤生长从对照小鼠的53％降低至13％，而用GL261AS ODN混合物(4mg NOBEL/10⁶个GL261)预治疗则降低WT GL261肿瘤至0％。感兴趣的是，当将GL261和NOBEL注射到小鼠的相对侧腹时，疫苗的功效丧失(图17)。这些数据表明，虽然AS ODN处理的GL261和反义分子有助于抗肿瘤反应，但最有效的疫苗涉及用IGF-1R AS ODN同时注射自体肿瘤细胞。还有兴趣的是，在CpG基序周围复发的NOBEL有义序列在刺激抗肿瘤免疫上是无效的，这表明CpG基序的生物学效力与IGF-1R AS ODN的生物活性相关，超过了单独的CpG基序。

实施例12：NOBEL能够放射增敏

将U118细胞在存在或不存在NOBEL(4mg/10⁷个细胞)的条件下温育24小时。将细胞在Click-iTedu试剂(终浓度为10μM)的存在下收获，辐照并返回温育(含有或不含新的NOBEL)。温育72小时后，根据厂商的方案培育培养物。如图18所示，NOBEL AS ODN导致了U118人神经胶质母细胞瘤细胞在1至15Gy的整个放射剂量范围内的放射敏感性，其中等效应平台超过5Gy。

实施例13：星形细胞瘤的治疗

WHO IV级星形细胞瘤(胶质母细胞瘤)是统一致命性的原发性颅内恶性肿瘤，中值生存期为18个月。将12名被判定为良好的手术候选人的诊断患有复发性胶质母细胞瘤的患者选入治疗。所有患者均在标准疗法，包括手术，替莫唑胺化疗和适形放疗中失败。入组患者及其疾病疗程的总结包括于表5中。所有患者用40mg/天的皮下依诺肝素的3个月疗程治疗。

表5

¹体恤再治疗；*包括填充有磷酸盐缓冲盐水的对照室的修正方案；S：手术；RT：放射治疗；TMZ：替莫唑胺化疗；Bev：贝伐单抗化疗；IDH-1：异柠檬酸脱氢酶-1

由在手术中除去的自体肿瘤细胞构成的组合产物随后用IGF-1R As ODN处理过夜，之后加入到半透室中并辐照。疫苗产品使用具有序列5'-TCCTCCGGAGCCAGACTT-3'的18聚体IGF-1R AS ODN，其为先前序列下游的一个移码；并且，基于其免疫刺激性质，向每个室(C-v)中加入2μg外源反义。方案也修改为包括含有PBS的室(C-p)。在腹直肌鞘中植入多达10个室。将在疫苗制备的接种阶段期间获得的自体肿瘤细胞上清液和植入的室的内容物快速冷冻用于探索性研究目的。

研究目标包括在90分钟和240分钟评估安全性和放射学反应，包括肿瘤相对脑血容量(rCBV)、表观扩散系数(ADC)和使用¹⁸氟脱氧葡萄糖双时间图像采集的PET/CT。探索性目标包括利用多重分析(Luminex)系列评估血清、室内流体和细胞培养物中的外周血单核细胞(PBMC)和趋化因子/细胞因子。

免疫学评估

手术前一周进行血浆白细胞计数，用于免疫参数的基线评估。如前所述，也在术后获得血液¹。通过离心分离血清和细胞部分，而细胞用红细胞溶胞缓冲液处理且白细胞如血清样品通过流式细胞术定量或储存于-80℃的DMSO中。如前所述，使用EasyCyte 8HT(Millipore)和对人CD4、CD8、CD11b、CD14、CD16、CD20、CD45、CD56、CD80、CD83、CD86(均来自BD Biosciences)和CD163(R&D Systems)特异性的荧光结合的mAb进行流式细胞术。使用FlowJo软件(Tree Star Inc，Ashland，OR)进行收集后的分析。使用Luminex珠阵列(来自Millipore的人细胞因子/趋化因子组I，II和III)定量可溶性细胞因子。为了评估治疗前和手术后的T细胞多功能性，将来自患者和正常对照的PBMC在体外用佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)和离子霉素(Sigma Aldrich)刺激，而释放到培养物中的细胞因子和趋化因子通过Luminex定量。通过IGF-1R、CD163、CD14、CD206、CD204、CD3、CD4和CD8的免疫组织化学评估肿瘤组织切片。在可能的情况下，使用免疫阳性细胞的Aperio定量。否则由有经验的神经病理学家(LEK)使用0(无染色)至6(强扩散染色)的顺序量表定性评估免疫染色。

手术前和手术后2天的血清中细胞因子/趋化因子水平，移植室的含量以及来自过夜肿瘤细胞培养物(SN)的上清液均由Luminex定量。来自配对的疫苗和对照室的膜包埋于石蜡中用于免疫组织病理学检查。

安全评估和临床疗程

在记录的54例严重不良事件中，只有一例SAE与涉及用于血浆白细胞清除法的来自股骨头的血栓的方案有关。试验中DVT的发生率为8.3％。九名患者死于肿瘤进展，而三名患者死于其他原因，包括颅内出血和败血症(光滑念珠菌(candida glabrata)，肺炎克雷伯菌(klebsiella pneumonia))。进行了5次尸检。所有患者均在术后期间戒除类固醇，或按临床指示维持每日剂量。中值总生存期为91.4周，并与初次手术与复发手术之间的间隔高度相关。复发肿瘤手术和自体细胞疫苗接种后，48.2和10周的两个显著不同的方案生存组别确定为较长的和短的生存组。(图19a-c)。排除一个异常值(TJ03)，我们记录了方案存活和入组时淋巴细胞减少程度之间的显著相关性(图19d)。初步诊断和方案入组时的值比较表明，标准治疗后平均淋巴细胞计数显著下降(65％)(8个可用的配对样本，p＝0.012，配对t检验)。疫苗接种后，入组时的淋巴细胞计数与最终可用的淋巴细胞计数之间无显著差异(数据未显示)。

射线照相响应

对解剖肿瘤响应计分，并在图20a和b中注明实例。标准MRI解剖学的改进与生存期不相关，但其它成像标准却相关。四个较长的生存组中的三个(TJ03，TJ06和TJ09)具有与表观扩散系数的增加高度相关的rCBV的矛盾的增加(ADC，见图20c)。这被认为是矛盾的，因为尽管灌注数据表明疾病进展，但这些患者却具有反映肿瘤内细胞损失的ADC值。在TJ06的情况下，在继续进行至尸体解剖的第二次疫苗接种中注意到了CD163+巨噬细胞群体的显著而持续的减少(图20d，见下文)。在其中两例中，观察到与炎症一致的PET/CT标准，证实了这些发现(图24)。总结性的细胞因子图证实了这三名患者的促炎过程(图20e)。

移植室和病理样本的检查

移植室在结构上完好无损，并不含台盼蓝排除的活细胞。来自室的膜的组织学分析表明，CD15+嗜中性粒细胞和CD163+巨噬细胞覆盖于C-p和C-v室的膜外表面，但在C-v上显著增加(图3a)。室的内容物反映了包封的细胞的产物和来自周围环境的因子的向内扩散，而对照的C-p室是后者的对照。与C-p相比，C-v中升高的趋化因子包括CCL21、CCL20和CCL19，所有这些都也显著增加超过血清水平。与C-p相比，CXCL12在C-v和血清中升高(图25和表6)。另外，注意到与血清相比的Cv中HSP-70和颗粒酶B的显著升高(分别为3826pg/mL对比327pg/mL，p＝0.0015和37pg/mL对比12pg/mL，p＝0.01)。这些结果证明了本文公开的方法可以诱导增强抗癌作用的促炎免疫响应。

表6：源自五个研究对象中的每个中的三个来源的细胞因子的匹配对分析。

来自通过尸检的手术干预的石蜡切片可用于免疫组织化学。在所有可评估的病例中都注意到了接种疫苗时肿瘤浸润性CD163+巨噬细胞数量相对于尸体解剖时显著降低的初始诊断的明显增加(图21b和26)。

IGF-1R表达细胞的水平在整个来自初始诊断到复发手术的肿瘤组织中都较高，但在尸检中显著降低。染色对于通过Aperio的免疫阳性细胞定量过于分散，因此使用了定性量表。疫苗接种前和疫苗接种后的水平的比较显示出IGF-1R阳性细胞显著降低(图21c和26)。

对比生存组，我们注意到在初始诊断(3.7％v。51.5％，p.0075)和疫苗接种(26％v。53.9％，p＝0.0402)时的CD163+TAM在长生存组中比短生存组中的水平显著更低(图27)。TAM的水平与短生存组中的循环M2细胞高度相关(图S4b)。在整个所有序列受试者样品中几乎没有观察到CD3，CD4或CD8细胞(数据未显示)。

收集的样品中的趋化因子/细胞因子含量

据假设，C-v中的细胞因子/趋化因子的任何显著增加可能反映它们在肿瘤微环境(TME)或血清中的存在升高。为了进一步了解这个问题，探讨了细胞减灭手术是否会降低这些细胞因子的血清水平。排除两个异常值，在所有研究的血清细胞因子/趋化因子中，术后第2天血清CCL21显著降低(表6)，这佐证了TME的CCL21生产。感兴趣的是，在较长生存期受试者中，T细胞的疫苗接种后水平与CCL21和CXCL12的水平都密切相关(图4)。相反，我们注意到短生存组的T细胞，单核细胞或细胞因子之间没有相关的模式(图28)。

SNL和C-v二者均较高的CCL2在接种疫苗后的血清中也显著升高，表明该趋化因子的源不同于TME。CCL2的平均术后血清水平在短生存组中与长生存组相比也显著更高(3812pg/mL相比1978pg/mL，p<.0078)。

在初次接种疫苗和再次接种疫苗后，较长的生存期受试者表现出T细胞，单核细胞和促炎趋化因子/细胞因子的循环水平之间的协调变化。已经观察到T细胞和巨噬细胞之间以及循环CD14+CD16-巨噬细胞的CD163+亚组和趋化因子CCL2之间的反向关系。参见显示某些细胞因子的表7。在四个受试者中的三个中，CD163+细胞和CCR2+细胞的循环水平也直接相关(R²＝0.68，p＝0.043)。在疫苗接种后的时期内在较长生存组中，显著更高的CD4/CD8比率是明显的。

表7：手术前后细胞因子的匹配对：

体外T细胞激活

在第7天和第14天获得的PBMC样品用PMA/离子霉素非特异性刺激，并对上清液评估趋化因子/细胞因子水平。在排除一个大量淋巴细胞减少的异常值(TJ03)之后，在第14天对于经典Th-1和Th-2反应相关的6个假定细胞因子观察到两个生存组中的显著差异(图5和表8)。

表8：手术前后的PMA/离子霉素刺激，不包括TJ11。手术的影响对于较长生存组相比相对于较短生存组较小。*显著性p<0.05。

实施例14：向M2细胞极化的单核细胞过表达IGF-1R

与诱导向M1极化的巨噬细胞相比，通过IL-4和IL-13的经典M2分化诱导向M2极化的未成熟未分化人单核细胞会过表达IGF-1R。此外，用IGF-1R AS ODN的治疗会选择性阻断极化的M2细胞的出现以及现有M2细胞的存活(图29)。这些观察结果代表了关于免疫系统的新信息，并佐证了涉及与各种癌症患者的预后不良相关的M2细胞的靶向消除的治疗性干预。图29a显示了绝大多数的IGF-1R AS ODN吸收发生于单核细胞和嗜中性粒细胞。尽管在M1和M2极化的巨噬细胞中IGF-1R AS ODN的吸收相似，但IGF-1R AS ODN浓度的增加靶向了仅仅通过上调IGF-1R的M2CD163+细胞的选择性消除(图29b)。CD163+细胞凋亡的细胞死亡率与IGF-1R AS ODN的浓度直接相关(图29c)。

实施例15：通过在癌症患者血清中温育正常单核细胞使单核细胞向M2极化

进行患有不同类型癌症的患者的分析而观察其血清是否能够CD163+分化。如图30所示，由与来自头颈鳞状细胞癌(N＝2)、非小细胞肺癌(N＝2)和前列腺癌(N＝5)的血清共温育的未分化单核细胞观察到了CD163+巨噬细胞分化。在所有情况下，用IGF-1R AS ODN治疗都会降低这种细胞群体。这提供了存在于患有多种癌症的患者血清中的因子会诱导单核细胞向差异性表达CD163和/或各种包括CD204和CD206的其它表型标记的M2的极化的确认。

实施例16：通过用来自患有不同癌症的患者的血清处理而向M2CD163+表型极化的单核细胞显示出CD163和PDL-1两者的上调

图31表明通过用来自患有不同的癌症患者的血清处理而向M2CD163+表型极化的单核细胞显示出CD163以及PDL-1两者的上调；在这两种情况下，用AS ODN的处理通过选择性靶向该细胞群体而降低了CD163和PDL-1。图31A显示了PBS对照相比表达PDL-1的CD163+巨噬细胞的IGF-1R AS ODN(NOBEL，250μg)处理的平均值的比较。图31B表明，匹配对的分析揭示了反映为PDL-1的显著降低的该细胞群体的高度显著性降低。去除过表达PDL-1的细胞群，会从抑制源释放出细胞毒性T细胞，并由此在这些癌症患者中恢复1型免疫。

实施例17：正常个体和星形细胞瘤患者之间的循环CD163+单核细胞的差异

研究了正常个体和星形细胞瘤患者之间的循环CD163+单核细胞的差异。正常个体在其循环中显示～6％的CD14+单核细胞，具有中等水平的CD163(图33A)。在癌症患者中观察到两个变化，单核细胞数量更高和单核细胞具有更高水平的CD163(图33A)。其他细胞(红色框)完全没有CD163。由于感染等，正常个体可能具有宽范围的单核细胞(图33B，CD11b+CD14阳性的细胞)，但这些会在患有恶性星形细胞瘤的患者中升高。图33C中的直方图表明，患者单核细胞在其CD14单核细胞上具有比对照细胞各种更高水平的CD163(红色直方图)。

实施例18：肿瘤浸润的M2单核细胞和野生型异柠檬酸脱氢酶(IDH1)状态与间变性星形细胞瘤患者的不良预后和通过MRI的钆增强相关。

肿瘤浸润的M2单核细胞，野生型IDH1状态和在间变性星形细胞瘤患者中通过MRI的钆增强定义了与不良预后相关的更具侵袭性的肿瘤。将福尔马林固定的石蜡包埋组织对于IDHR1突变R132H(A)和CD163(B)染色。FLAIR(C和D，左图)和钆增强的T1加权轴向MRI(C和D，右图)的代表性图像显示非增强的AIII(IDH1R132H突变体III级)(C)和增强的AIII-G(IDH1野生型III型，具有多形性成胶质细胞瘤特性)(D)肿瘤。基于上述三个参数将患者分成组(A-D)，特别是类似于更具侵袭性的GBM的AIII和AIII-G(E，F和G)。在38例随机选择的MRI增强和非增强AA型患者中存在(R132H+)或不存在(R132H-)IDH1突变的结果显示于图E中，其中n.d.表示没有检测到。使用自动细胞计数系统对切除的肿瘤样本中的CD163⁺细胞含量计数，并提供给通过图F中的增强而分离的AA样本。盒须图指示75，55和25位百分位数，而最大和最小数据值由上下须线代表。通过曼-惠特尼检验评估组间差异的统计学显著性(***，p<0.001)。基于其肿瘤侵袭性分离的患者的Kaplan-Meier生存期曲线提呈于图G中。组间的统计学显著生存期差异(**)通过对数秩(p＝0.0019)和Wilcoxon检验(p＝0.0088)确定。结果表明，IDH R132H突变体III级星形细胞瘤用钆几乎没有增强，并且如预期的，CD163⁺M2细胞在肿瘤组织中的累积与血管完整性的丧失有关。

实施例19：循环的单核细胞数量在AIII和AIII-G患者中升高，并表达水平增加的M2标记CD163。

将来自18个随机选择的WHO III级星形细胞瘤患者和24个正常供体的PBMC用对CD11b，CD14和CD163特异性的抗体染色，并通过流式细胞术评估。使用正向散射(FSC)和侧向散射(SSC)分布建立活细胞门，而单核细胞定义为表达CD11b和CD14的活细胞(图35A)。图35A中显示了活门的代表性轮廓图和来自正常和AA供体的PBMC中的CD11b和CD14阳性分析，其中轴以对数标度表示，而数字表示门控细胞的频率。图35B是显示来自12名患有AIII的患者、6名患有AIII-G的患者和24名正常个体的PBMC中通过流式细胞术确测定的CD11b⁺CD14⁺单核细胞的频率的总结图。通过学生t检验(**，p<0.01)评估正常个体和AA患者亚群之间细胞百分比差异的统计学显著性。CD11b+CD14+门控单核细胞的CD163染色的中值荧光强度(MFI)由图35C中AIII、AIII-G和正常血液样本的代表性直方图重叠。轴以对数标度表示。图35D显示了来自不同供体组的PBMC样品中门控单核细胞亚群的CD163染色的MFI。统计显著性通过ANOVA，接着杜凯氏后检验评估(**，p<0.05)。虽然CD11b⁺CD14⁺单核细胞在所有测试患者的循环中以相似的升高水平存在，但来自患有与GBM(多形性成胶质细胞瘤；AIII-G)极为相似的AIII肿瘤的患者的循环的细胞比来自患有较不恶性的AIII肿瘤的患者和正常受试者的那些表达水平逐渐更高的CD163(图35，C和D)。如预期的，由于循环单核细胞的增加，与正常个体相比，III级星形细胞瘤患者的血液中CD3⁺和CD20⁺淋巴细胞的频率降低。

实施例20：在星形细胞瘤外泌体上结合共有抗原的AIII和AIII-G患者血清中存在的抗体在同种型分布上不同。

将从三个星形细胞瘤患者原发肿瘤细胞系中分离的外泌体涂覆于96孔板上，并用初始手术前收集的患者血清(13个AIII，8个AIII-G)和正常对照血清(4)温育。用荧光结合的完整IgG(图36A)或IgG同种型特异性的二级抗体(图36B)和作为MFI测定的抗体结合程度检测结合抗体。如实施例18所述，数据提呈为盒须图中的个体受试者的值。图36A中的星号和条形指示与通过ANOVA接着Dunnett检验测定的正常对照值显著不同的值(p<0.05)。在图36B中，由**(p＝0.004)标注通过ANOVA和杜凯氏后检验在统计学上与正常对照和AIII患者值有显著差异的来自AIII-G患者的值的组。如图36A所示，具有与这些外泌体的反应性的IgG抗体无论其预后类别，也存在于来自大多数III级星形细胞瘤患者的血清中。然而，当使用同种型特异性抗体进行检测时，我们观察到与较长存活的AIII患者相比，在AIII-G中Th2相关的IgG2同种型的外泌体结合抗体显著升高(图36B)。IgG1的水平在后者患者中倾向于略有升高，而AIII-G患者中IgG4水平略有升高，但这些之间的差异无统计学显著性。

实施例21：通常与Th1和Th2免疫相关的可溶性因子分别在AIII和AIII-G患者的血清中升高

通过Luminex对于可溶性因子水平评估基于钆增强MRI分离为AIII(n＝17)和AIII-G(n＝13)亚群的AA患者的血清。单个样本的浓度如实施例18所述在盒须图中呈现。两组之间差异的统计学显著性通过学生t检验评估****，p≤0.001；**，p≤0.01；*，p≤0.05。在患有具有GBM特征的AIII肿瘤的患者中，Th2细胞因子IL-10和CCL4的血清浓度显著提高，而IL-9和Th1-相关的IL-12P40、CXCL10和FLT3L在其余的AIII患者中显著提高(图37)。

实施例22：编码白细胞表型标记、细胞因子和趋化因子受体及它们的配体的基因的PBMC的表达水平在AIII和AIII-G患者之间不同。

单核细胞表型标记(图38A)、白细胞介素(图38B)、白细胞介素受体(图38C)、CC趋化因子(图38D)和受体(图38E)以及CXC趋化因子(图38F)和受体(图38G)的基因在来自17名未选择的AA患者的PBMC中的拷贝数通过高通量定量RT-PCR评估，并归一化为每个样品中存在的管家基因L13a的拷贝数。对归一化的拷贝数进行LDA，并在左侧图中显示，其中每个点表示来自各个患者的数据。代表各个AIII和AIII-G患者的分析结果的点分别标成蓝色和红色。每个组的多变量平均值表示为代表平均值的95％置信区间的类似颜色的圆/椭圆的中心处的+。在两个患者组中测试的每个基因的平均拷贝数分别在所附的右图中显示为具有分别对应于高相对低表达水平的红色和绿色的热图和按照相关比例尺显示的检测到的基因拷贝数的范围。灰色框表示不能产生可检测的产物的反应。

线性判别分析(LDA)用于确定每个标记类别的表达分离的程度和表征两个患者组。图38A显示了具有描绘为热图的相应基因表达水平的单核细胞表型标记CD11b、CD14、CD15、CD68、CD163、CD204和CD206的LDA的结果。通过与常规AIII肿瘤比较，观察到来自患有AIII-G的患者的PBMC样品中CD15、CD163和CD206特异性的mRNA的表达水平的中至强的升高(分别为8，3，5倍)，但在后者中CD11b和CD204转录水平轻度升高(1.9倍)。单核细胞表型基因表达水平的LDA分析准确地将测试的17例中的14例分配到两个患者组中的一个中。与流式细胞仪数据一致，CD163证明是最具辨别性的表型mRNA标记。对于28个白细胞介素基因进行的类似的LDA正确地将100％的患者分类为它们的合适的组，且尽管仅1型相关的细胞因子IL-15和IL-32在AIII和AIII-G样品之间显著不同的事实(p＝0.0111和p＝0.0152)，两者在后者中都较低(图38B)。其他基因不表达或表达水平没有显著差异。分析PBMC中22个白细胞介素受体基因mRNA的特征也在AIII和AIII-G患者之间作出明确区分(图38C)。在差异表达的情况下，与AIII PBMC相比，大部分这些基因的转录物在AIII-G中都较低。具体地，IL-23R和IL31RA在AIII样品中以显著更高的水平表达(分别为p＝0.0055和p＝0.0360)。在PBMC中以足够的水平表达的21个CCL基因中的15个的mRNA水平的LDA对于此分析也区分了两个患者组(图38D)。在AIII样品中对于CCI3、CCL8、CCL13、CCL21、CCL23和CCL28基因，以及在AIII-G样品中对于CCL2、CCL11和CCL14基因，都检测到表达升高的趋势。然而，对于可用的样品，仅对于CCL3mRNA获得统计学显著性差异，其AIII-G PBMC相比在AIII中以较高水平存在。CCR基因表达数据的LDA也明确区分了患者(图38E)。对于大多数CCR mRNA，除了在AIII-G样品中稍高的CCR4之外，在常规AIII样品中存在更高表达的趋势，但仅CCR1和CCR5两个基因显著过表达(分别p＝0.0206和p＝0.0003)。尽管CXCL基因表达数据在mRNA水平上没有统计学显著的差异，但其LDA却将所检测的17个病例中的15个表征为属于不同患者组(图38F)。仅对CXCL7检测到接近显著性的差异(p＝0.0673)，其在来自AIII-G患者的PBMC中上调。在常规AIII PBMC中检测到较高水平的CXCL2、CXCL10和CXCL16转录，但与AIII-G样品却没有显著性差异。基于CXC趋化因子受体的表达，对于LDA获得了相当的结果，其中17个AA病例中14个病例被准确分成亚组(图38G)。发现CXCR1、CXCR3、CXCR4、CXCR6和CX3CR1转录都在在AIII-G中过表达，但仅CXCR3和CXCR6具有显著性水平(分别p＝0.0111和p＝0.0206)。患有常规AIII肿瘤患者的PBMC中仅仅CXCR7mRNA水平较高，但对于所分析的样本数量并未达到统计学显著差异。

实施例23：通过PBMC中选择免疫相关基因的表达可以准确地区分AIII和AIII-G患者亚群。

首先使用判别分析识别如实施例22中而获得的最佳分别AIII和AIII-G患者PBMC的基因表达数据(图39A)。然后使用主成分分析确定这些基因CCL3、CCR4、CCR5、CCR7、CXCL7、IL-15、IL-32、IL-15R、IL-21R、IL-23R、IL-31RA和CD163中哪种在区分两个病人组时是最有效的(图39B)。判别和主成分图都使用每个单个AIII和AIII-G PBMC样品的基因特异性表达分布(分别由蓝色和红色的点表示)生成。(A)中的绿色虚线和(B)中的绿色向量分别代表正则和分量空间中的基因转录的方向。对来自PBMC的具有可检测信号的所有93个基因的mRNA水平进行LDA而识别最可靠地由AIII-G患者描述AIII的基因(图39A)。选择表9中详述的十二种基因用于PCA分析(图39B)。由第一主分量解释的总方差为37％，而第二主分量解释了总方差的近20％。基于PCA，评价M2标记CD163、促炎细胞因子IL-32和1型细胞因子受体IL-21R和IL-23R在PBMC中的表达水平，足以在患有不同类别的AIII肿瘤的患者之间获得明确的区分

表9：通过判别分析选择的PBMC-表达基因的功能特征。

通过引证并入

本文引用的所有专利和出版物通过引证以其全部内容并入本文中。

本文所讨论的出版物仅仅为了其在本申请的申请日之前的公开提供。本文中的任何内容都不应被解释为承认本公开不具有由于先前的公开将这种出版物提前的权利。

序列表

<110> 托马斯杰弗逊大学（Thomas Jefferson University）

大卫·W·安德鲁斯（Andrews, David W.）

<120> 用于通过选择性减少免疫调节M2单核细胞治疗癌症及增强治疗性免疫力的方法和组合物

<130> IMVX-002/01WO

<150> US 62/145,758

<151> 2015-04-10

<160> 19

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> CDS

<223> NOBEL 硫代磷酸 AS ODN（NOBEL phosphorothioate AS ODN）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(18)

<223> 可以通过硫代磷酸连接基连接（May be joined by a phosphorothioatelinkage）

<400> 1

tcctccggag ccagactt 18

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> CDS

<223> 重组胰岛素样生长因子受体 (IGF-1R)（Recombinant Insulin-like GrowthFactor Receptor (IGF-1R)）

反义寡脱氧核苷酸 (AS-ODN)（antisense oligodeoxynucleotide (AS-ODN)）

<400> 2

ttctccactc gtcggcc 17

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> CDS

反义寡脱氧核苷酸 (AS-ODN)（antisense oligodeoxynucleotide (AS-ODN)）

<400> 3

acaggccgtg tcgttgtc 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> CDS

反义寡脱氧核苷酸 (AS-ODN)（antisense oligodeoxynucleotide (AS-ODN)）

<400> 4

gcactcgccg tcgtggat 18

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> CDS

反义寡脱氧核苷酸 (AS-ODN)（antisense oligodeoxynucleotide (AS-ODN)）

<400> 5

cggatatggt cgttctcc 18

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> CDS

反义寡脱氧核苷酸 (AS-ODN)（antisense oligodeoxynucleotide (AS-ODN)）

<400> 6

tctcagcctc gtggttgc 18

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> CDS

反义寡脱氧核苷酸 (AS-ODN)（antisense oligodeoxynucleotide (AS-ODN)）

<400> 7

ttgcggcctc gttcactg 18

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> CDS

反义寡脱氧核苷酸 (AS-ODN)（antisense oligodeoxynucleotide (AS-ODN)）

<400> 8

aagcttcgtt gagaaact 18

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> CDS

反义寡脱氧核苷酸 (AS-ODN)（antisense oligodeoxynucleotide (AS-ODN)）

<400> 9

ggacttgctc gttggaca 18

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> CDS

反义寡脱氧核苷酸 (AS-ODN)（antisense oligodeoxynucleotide (AS-ODN)）

<400> 10

ggctgtctct cgtcgaag 18

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> CDS

<223> IDT1220 硫代磷酸 AS ODN（IDT1220 phosphorothioate AS ODN）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(20)

<400> 11

cagatttctc cactcgtcgg 20

<210> 12

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> CDS

反义寡脱氧核苷酸 (AS-ODN)（antisense oligodeoxynucleotide (AS-ODN)）

<400> 12

ccggagccag acttcat 17

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> CDS

反义寡脱氧核苷酸 (AS-ODN)（antisense oligodeoxynucleotide (AS-ODN)）

<400> 13

ctgctcctcc tctaggatga 20

<210> 14

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> CDS

反义寡脱氧核苷酸 (AS-ODN)（antisense oligodeoxynucleotide (AS-ODN)）

<400> 14

ccctcctccg gagcc 15

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> CDS

<223> DWA 硫代磷酸 AS ODN（DWA phosphorothioate AS ODN）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(18)

<400> 15

ggaccctcct ccggagcc 18

<210> 16

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> CDS

<223> DWA 锁核酸 AS ODN（DWA locked nucleic acid AS ODN）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(6)

<223> 可以通过锁核酸连接基连接（May be joined by a locked nucleic acidlinkage）

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(13)

<223> 可以通过磷酸二酯连接基连接（May be joined by a phosphodiesterlinkage）

<220>

<221> misc_feature

<222> (13)..(18)

<400> 16

ggaccctcct ccggagcc 18

<210> 17

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> CDS

<223> DWA 磷酸二酯 AS ODN（DWA phosphodiester AS ODN）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(18)

<400> 17

ggaccctcct ccggagcc 18

<210> 18

<211> 927

<212> RNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 18

cuuuguuuuc uuuucuuccu cacagaccuu cgggcaagga ccuucacaag ggaugcagua 60

caugcucugg cugccguugc ggaugaagcc cgaggggcac uccugcaugc acucgccguc 120

guggaucaca aaccccucgg agucgcugcu cucggcgcug aggauguugg cgcagaaguc 180

acgguccaca cagcgccagc ccucaaaccu guagguguug ggcgggcagg caggcacaca 240

gacaccggca uaguaguagu ggcggcaagc uacacaggcc gugucguugu caggcgcgcu 300

gcagcugccc aggcacucgg gguggcagca cucauuguuc ucggugcacg cccgcuuccc 360

acacgugcuu gggcacauuu ucuggcagcg guuugugguc cagcagcggu aguuguacuc 420

auuguugaug guggucuucu cacacaucgg cuucuccucc auggucccug gacacagguc 480

cccacauucc uuugggggcu uauuccccac aauguaguua uuggacaccg cauccaggau 540

cagggaccag uccacagugg agagguaaca gaggucagca uuuuucacaa uccugauggc 600

cccccgagua auguuccuca gguuguaaag cccaauaucc uugagauugg ucaucucgaa 660

gaugaccagg gcguaguugu agaagaguuu ccagccgcgg augaccguga gguuggggaa 720

gaggucuccg aggcucucga ggccagccac ucggaacagc agcaaguacu cgguaaugac 780

cgugagcuug gggaagcggu agcugcggua guccucggcc uuggagauga gcaggaugug 840

gagguagccc ucgaucaccg ugcaguucuc caggcgcuuc agcugcugau agucguugcg 900

gaugucgaug ccuggcccgc agauuuc 927

<210> 19

<211> 4104

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 19

atgaagtctg gctccggagg agggtccccg acctcgctgt gggggctcct gtttctctcc 60

gccgcgctct cgctctggcc gacgagtgga gaaatctgcg ggccaggcat cgacatccgc 120

aacgactatc agcagctgaa gcgcctggag aactgcacgg tgatcgaggg ctacctccac 180

atcctgctca tctccaaggc cgaggactac cgcagctacc gcttccccaa gctcacggtc 240

attaccgagt acttgctgct gttccgagtg gctggcctcg agagcctcgg agacctcttc 300

cccaacctca cggtcatccg cggctggaaa ctcttctaca actacgccct ggtcatcttc 360

gagatgacca atctcaagga tattgggctt tacaacctga ggaacattac tcggggggcc 420

atcaggattg agaaaaatgc tgacctctgt tacctctcca ctgtggactg gtccctgatc 480

ctggatgcgg tgtccaataa ctacattgtg gggaataagc ccccaaagga atgtggggac 540

ctgtgtccag ggaccatgga ggagaagccg atgtgtgaga agaccaccat caacaatgag 600

tacaactacc gctgctggac cacaaaccgc tgccagaaaa tgtgcccaag cacgtgtggg 660

aagcgggcgt gcaccgagaa caatgagtgc tgccaccccg agtgcctggg cagctgcagc 720

gcgcctgaca acgacacggc ctgtgtagct tgccgccact actactatgc cggtgtctgt 780

gtgcctgcct gcccgcccaa cacctacagg tttgagggct ggcgctgtgt ggaccgtgac 840

ttctgcgcca acatcctcag cgccgagagc agcgactccg aggggtttgt gatccacgac 900

ggcgagtgca tgcaggagtg cccctcgggc ttcatccgca acggcagcca gagcatgtac 960

tgcatccctt gtgaaggtcc ttgcccgaag gtctgtgagg aagaaaagaa aacaaagacc 1020

attgattctg ttacttctgc tcagatgctc caaggatgca ccatcttcaa gggcaatttg 1080

ctcattaaca tccgacgggg gaataacatt gcttcagagc tggagaactt catggggctc 1140

atcgaggtgg tgacgggcta cgtgaagatc cgccattctc atgccttggt ctccttgtcc 1200

ttcctaaaaa accttcgcct catcctagga gaggagcagc tagaagggaa ttactccttc 1260

tacgtcctcg acaaccagaa cttgcagcaa ctgtgggact gggaccaccg caacctgacc 1320

atcaaagcag ggaaaatgta ctttgctttc aatcccaaat tatgtgtttc cgaaatttac 1380

cgcatggagg aagtgacggg gactaaaggg cgccaaagca aaggggacat aaacaccagg 1440

aacaacgggg agagagcctc ctgtgaaagt gacgtcctgc atttcacctc caccaccacg 1500

tcgaagaatc gcatcatcat aacctggcac cggtaccggc cccctgacta cagggatctc 1560

atcagcttca ccgtttacta caaggaagca ccctttaaga atgtcacaga gtatgatggg 1620

caggatgcct gcggctccaa cagctggaac atggtggacg tggacctccc gcccaacaag 1680

gacgtggagc ccggcatctt actacatggg ctgaagccct ggactcagta cgccgtttac 1740

gtcaaggctg tgaccctcac catggtggag aacgaccata tccgtggggc caagagtgag 1800

atcttgtaca ttcgcaccaa tgcttcagtt ccttccattc ccttggacgt tctttcagca 1860

tcgaactcct cttctcagtt aatcgtgaag tggaaccctc cctctctgcc caacggcaac 1920

ctgagttact acattgtgcg ctggcagcgg cagcctcagg acggctacct ttaccggcac 1980

aattactgct ccaaagacaa aatccccatc aggaagtatg ccgacggcac catcgacatt 2040

gaggaggtca cagagaaccc caagactgag gtgtgtggtg gggagaaagg gccttgctgc 2100

gcctgcccca aaactgaagc cgagaagcag gccgagaagg aggaggctga ataccgcaaa 2160

gtctttgaga atttcctgca caactccatc ttcgtgccca gacctgaaag gaagcggaga 2220

gatgtcatgc aagtggccaa caccaccatg tccagccgaa gcaggaacac cacggccgca 2280

gacacctaca acatcaccga cccggaagag ctggagacag agtacccttt ctttgagagc 2340

agagtggata acaaggagag aactgtcatt tctaaccttc ggcctttcac attgtaccgc 2400

atcgatatcc acagctgcaa ccacgaggct gagaagctgg gctgcagcgc ctccaacttc 2460

gtctttgcaa ggactatgcc cgcagaagga gcagatgaca ttcctgggcc agtgacctgg 2520

gagccaaggc ctgaaaactc catcttttta aagtggccgg aacctgagaa tcccaatgga 2580

ttgattctaa tgtatgaaat aaaatacgga tcacaagttg aggatcagcg agaatgtgtg 2640

tccagacagg aatacaggaa gtatggaggg gccaagctaa accggctaaa cccggggaac 2700

tacacagccc ggattcaggc cacatctctc tctgggaatg ggtcgtggac agatcctgtg 2760

ttcttctatg tccaggccaa aacaggatat gaaaacttca tccatctgat catcgctctg 2820

cccgtcgctg tcctgttgat cgtgggaggg ttggtgatta tgctgtacgt cttccataga 2880

aagagaaata acagcaggct ggggaatgga gtgctgtatg cctctgtgaa cccggagtac 2940

ttcagcgctg ctgatgtgta cgttcctgat gagtgggagg tggctcggga gaagatcacc 3000

atgagccggg aacttgggca ggggtcgttt gggatggtct atgaaggagt tgccaagggt 3060

gtggtgaaag atgaacctga aaccagagtg gccattaaaa cagtgaacga ggccgcaagc 3120

atgcgtgaga ggattgagtt tctcaacgaa gcttctgtga tgaaggagtt caattgtcac 3180

catgtggtgc gattgctggg tgtggtgtcc caaggccagc caacactggt catcatggaa 3240

ctgatgacac ggggcgatct caaaagttat ctccggtctc tgaggccaga aatggagaat 3300

aatccagtcc tagcacctcc aagcctgagc aagatgattc agatggccgg agagattgca 3360

gacggcatgg catacctcaa cgccaataag ttcgtccaca gagaccttgc tgcccggaat 3420

tgcatggtag ccgaagattt cacagtcaaa atcggagatt ttggtatgac gcgagatatc 3480

tatgagacag actattaccg gaaaggaggg aaagggctgc tgcccgtgcg ctggatgtct 3540

cctgagtccc tcaaggatgg agtcttcacc acttactcgg acgtctggtc cttcggggtc 3600

gtcctctggg agatcgccac actggccgag cagccctacc agggcttgtc caacgagcaa 3660

gtccttcgct tcgtcatgga gggcggcctt ctggacaagc cagacaactg tcctgacatg 3720

ctgtttgaac tgatgcgcat gtgctggcag tataacccca agatgaggcc ttccttcctg 3780

gagatcatca gcagcatcaa agaggagatg gagcctggct tccgggaggt ctccttctac 3840

tacagcgagg agaacaagct gcccgagccg gaggagctgg acctggagcc agagaacatg 3900

gagagcgtcc ccctggaccc ctcggcctcc tcgtcctccc tgccactgcc cgacagacac 3960

tcaggacaca aggccgagaa cggccccggc cctggggtgc tggtcctccg cgccagcttc 4020

gacgagagac agccttacgc ccacatgaac gggggccgca agaacgagcg ggccttgccg 4080

ctgccccagt cttcgacctg ctga 4104

Claims

1.一种药物组合物，包含有效量的胰岛素样生长因子1受体反义寡脱氧核苷酸(IGF-1RAS ODN)，其中将所述药物组合物在他们的循环中给予具有M2细胞的受试者、肿瘤微环境中的M2细胞或使未分化单核细胞向M2细胞极化的血清来降低所述受试者中M2细胞的数量。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，如通过FACS测量的，所述受试者中的所述M2细胞在向所述受试者给予所述药物组合物之后约24小时降低至少约40％。

3.根据权利要求1-2中任一项所述的药物组合物，其中，所述药物组合物的给予不影响所述受试者中M1细胞的数量。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的药物组合物，其中，所述IGF-1R AS ODN包含一个或多个硫代磷酸键。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的药物组合物，其中，所述IGF-1R AS ODN与SEQ IDNO:1-14中的任一种具有至少约75％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约98％的同一性。

6.根据权利要求1-4中任一项所述的药物组合物，其中，所述AS ODN由SEQ ID NO:1-14中的任一种组成。

7.根据权利要求1-4中任一项所述的药物组合物，其中，所述AS ODN是SEQ ID NO:1。

8.根据权利要求6所述的药物组合物，其中将SEQ ID NO:1-14中的任一种以约0.025g/kg至约0.2g/kg范围内的剂量给予所述受试者。

9.根据权利要求7所述的药物组合物，其中将SEQ ID NO:1以约0.025g/kg至约0.2g/kg范围内的剂量给予所述受试者。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的药物组合物，其中，所述药物组合物在所述受试者中恢复1型免疫力。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的药物组合物，其中，所述IGF-1R AS ODN在约37℃下不形成发夹环结构。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的药物组合物，其中，所述M2细胞是表达选自由CD11b、CD14、CD15、CD23、CD64、CD68、CD163、CD204和CD206组成的组中的一种或多种细胞表面标记的M2巨噬细胞。

13.根据权利要求1-11中任一项所述的药物组合物，其中，所述M2细胞是表达选自由CD11b、CD14、CD15、CD23、CD64、CD68、CD163、CD204和CD206组成的组中的一种或多种细胞表面标记的M2单核细胞。

14.根据权利要求12或13所述的药物组合物，其中，所述细胞表面标记是CD163。

15.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，所述受试者在他们的循环中具有M2细胞。

16.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，所述受试者在所述肿瘤微环境中包含M2细胞。

17.根据权利要求1-16中任一项所述的药物组合物，其中，所述受试者患有癌症。

18.根据权利要求17所述的药物组合物，其中，所述癌症选自由神经胶质瘤、星形细胞瘤、乳腺癌、头颈鳞状细胞癌、II型乳头状肾细胞癌、肺癌、胰腺癌、胆囊癌、直肠癌、经典霍奇金淋巴瘤、卵巢癌和结肠直肠癌组成的组。

19.根据权利要求18所述的药物组合物，其中，所述癌症是神经胶质瘤。

20.根据权利要求19所述的药物组合物，其中，所述药物组合物诱导所述受试者中神经胶质瘤肿瘤的消退。

21.根据权利要求20所述的药物组合物，其中，所述药物组合物导致所述受试者中神经胶质瘤肿瘤产生的减少。

22.根据权利要求21所述的药物组合物，其中，所述药物组合物导致所述受试者中神经胶质瘤肿瘤产生的消除。

23.根据权利要求18所述的药物组合物，其中，所述癌症是星形细胞瘤。

24.根据权利要求23所述的药物组合物，其中，所述星形细胞瘤选自由II级星形细胞瘤、III级星形细胞瘤和IV级星形细胞瘤组成的组。

25.根据权利要求24所述的药物组合物，其中，所述III级星形细胞瘤是AIII或AIII-G。

26.根据权利要求24所述的药物组合物，其中，所述IV级星形细胞瘤是多形性成胶质细胞瘤。

27.根据权利要求1-26中任一项所述的药物组合物，其中，所述药物组合物配制用于口服、腹膜内或静脉内给予。

28.一种用于选择性消除受试者中M2细胞的方法，包括向所述受试者全身给予有效量的权利要求1-27中任一项所述的药物组合物。

29.一种通过减少M2细胞的数量治疗癌症的方法，包括向患有所述癌症的受试者全身给予有效量的权利要求1-27中任一项所述的药物组合物。

30.根据权利要求29所述的方法，进一步包括放射治疗，其中所述放射治疗在所述药物组合物的给予之后给予所述受试者。

31.根据权利要求30所述的方法，其中，所述放射治疗选自由内源放射治疗、外部束放射治疗和全身放射性同位素放射治疗组成的组。

32.根据权利要求31所述的方法，其中，所述放射治疗是外部束放射治疗。

33.根据权利要求32所述的方法，其中，所述外部束放射治疗选自由γ放射治疗、X-射线治疗、调强放射治疗(IMRT)和影像引导放射治疗(IGRT)组成的组。

34.根据权利要求33所述的方法，其中，所述外部束放射治疗是γ放射治疗。

35.一种用于增强受试者的免疫应答的方法，包括向所述受试者全身给予有效量的权利要求1-27中任一项所述的药物组合物。

36.根据权利要求35所述的方法，进一步包括疫苗接种治疗，其中所述疫苗接种治疗在所述药物组合物给予后至少约48小时向所述受试者给予。

37.根据权利要求28-36中任一项所述的方法，其中，所述药物组合物通过腹膜内注射给予所述受试者。

38.根据权利要求28-36中任一项所述的方法，其中，所述药物组合物通过静脉内注射给予所述受试者。

39.根据权利要求28-36中任一项所述的方法，其中，所述药物组合物以口服剂型给予所述受试者。