CN108251351A - 一种椎间盘细胞自噬作用的诱导物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及细胞自噬领域，更具体涉及一种诱导椎间盘细胞自噬的诱导物。本发明提供的椎间盘细胞自噬作用的诱导物包括雷帕霉素、氯化锂和硫酸镍。本发明提供的诱导物对椎间盘细胞自噬诱导成功率高，诱导效果稳定，且与传统诱导剂相比，诱导的自噬水平显著提高，极大地提高了本领域技术人员的实验成功率，节省了实验时间。

Description

一种椎间盘细胞自噬作用的诱导物
技术领域
本发明涉及细胞自噬领域，更具体涉及一种诱导椎间盘细胞自噬的诱导物。
背景技术
下腰痛是骨科常见疾患，有研究者统计，一生中有半数以上的人会罹患下腰痛。严重下腰痛可使患者失去工作能力，对社会和家庭造成严重负担。40％以上的下腰痛是由椎间盘退变引起，但是椎间盘退变的确切发病机制尚不明确。关于椎间盘退变机制的研究，以往多集中于形态学和生物化学的改变，认为由于生物力学异常导致椎间盘结构发生改变，或营养功能障碍引起细胞代谢失调，从而最终导致椎间盘发生退行性变。但有学者提出，这些改变都是由椎间盘内细胞的数量和功能发生改变介导的。椎间盘细胞通过分泌细胞外基质(ECM)及其调控因子，调控椎间盘内环境稳态，维持椎间盘正常功能，因此椎间盘内细胞的状态直接影响椎间盘的功能。近年来，一些研究指出，细胞自噬也参与椎间盘退变的发病过程。
自噬是一种存在于胞内的分解代谢途径。机体细胞在体内面临各种压力(Stress)应激，如异常生物力学刺激、营养障碍、生长因子缺乏等。当应激超过细胞承受能力时，细胞启动凋亡机制清除受损细胞；但是应激不足以致死时，细胞启动自噬机制，通过降解胞内受损细胞器，使细胞得以存活。因此，自噬是维持细胞正常功能的一个重要机制。自噬调控异常可导致各类疾病的发生。现已证实，自噬异常上调使得肿瘤细胞在早期营养缺乏环境中得以存活，肿瘤耐药性也可能与自噬引起的细胞耐受有关；在神经系统中，研究发现自噬调控异常可导致Alzheimer，Parkinson，Huntington等疾病发生，敲除自噬相关基因可导致神经发生退行性变；自噬异常还可引起糖尿病等代谢性疾病，以及骨性关节炎等骨科疾病。
相继有研究发现，在不同的椎间盘退变动物模型中有自噬升高的现象；还有研究发现，在体外培养的大鼠椎间盘纤维环(AnnulusFibrosus,AF)和髓核细胞(NucleusPulposus,NP)中，证实营养缺乏(椎间盘退变的诱因之一)可诱导自噬上调，退变的另外诱因之一压力同样可诱导自噬升高。本发明申请人进一步研究发现，如果抑制椎间盘细胞的自噬水平，其细胞凋亡率明显升高。总结现有的自噬研究结果可知，自噬是椎间盘应对退变的一种保护机制，即上调自噬可以治疗或延缓椎间盘退变，其机制是通过抑制细胞凋亡。
雷帕霉素(Rapamycin)是大环内酯类药物，起初是作为抗真菌药物应用。随后发现其可以阻断T淋巴细胞由G1期至S期进程成为肾移植术后一种新型免疫抑制剂。雷帕霉素不只局限于对免疫细胞有作用，它还通过抑制mTOR信号通路，导和促进细胞自噬的发生。最近二十年自噬研究成为热点问题，雷帕霉素作为自噬激活剂再次成为焦点药物。本发明申请人在研究自噬对椎间盘退变的影响时发现，单独使用雷帕霉素对椎间盘细胞的自噬诱导效果并不理想且诱导效果不稳定，使得本领域的研究进展严重受阻。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的在于提供一种对椎间盘细胞自噬诱导效果好，诱导成功率高，诱导效果稳定的诱导物，该诱导物是含有雷帕霉素的组合物。
本发明提供一种椎间盘细胞自噬作用的诱导物，该诱导物包括雷帕霉素、氯化锂和硫酸镍。
进一步地，所述的雷帕霉素的终浓度为50-400nM；
优选地，所述的雷帕霉素的终浓度为50-300nM；
优选地，所述的雷帕霉素的终浓度为50-200nM；
更优选地，所述的雷帕霉素的终浓度为50-150nM。
进一步地，所述的氯化锂的终浓度为5-50mM；
优选地，所述的氯化锂的终浓度为5-40mM；
优选地，所述的氯化锂的终浓度为5-30mM；
更优选地，所述的氯化锂的终浓度为5-20mM。
进一步地，所述的硫酸镍的终浓度为100-1000μM；
优选地，所述的硫酸镍的终浓度为200-600μM；
优选地，所述的硫酸镍的终浓度为250-400μM。
本发明提供了该诱导物在诱导椎间盘细胞自噬作用的应用。
本发明还提供了该诱导物在制备治疗椎间盘退行药物中的用途。
本发明的有益效果在于：
1、本发明提供的诱导物对椎间盘细胞自噬诱导成功率高，诱导效果稳定，极大地提高了本领域技术人员的实验成功率，节省了实验时间。
2、本发明提供的的诱导物诱导效果好，与传统诱导剂相比，诱导的自噬水平显著提高。
附图说明
图1Western Blotting法检测LC3Ⅱ型/LC3Ⅰ型蛋白的相对表达量的变化。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明的优点和特点作进一步的描述，但这些实施例仅是示例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员可在不偏离本发明范围的条件下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些改动均是本发明的保护范围。
实施例1
一种椎间盘细胞自噬作用的诱导物，该诱导物为终浓度为50nM的雷帕霉素、50mM的氯化锂和100μM的硫酸镍。
实施例2
一种椎间盘细胞自噬作用的诱导物，该诱导物为终浓度为400nM的雷帕霉素、5mM的氯化锂和1000μM的硫酸镍。
实施例3
一种椎间盘细胞自噬作用的诱导物，该诱导物为终浓度为150nM的雷帕霉素、15mM的氯化锂和250μM的硫酸镍。
实施例4
一种椎间盘细胞自噬作用的诱导物，该诱导物为终浓度为100nM的雷帕霉素、10mM的氯化锂和300μM的硫酸镍。
对比例1
一种椎间盘细胞自噬作用的诱导物，该诱导物为终浓度为100nM的雷帕霉素和300μM的硫酸镍。
对比例2
一种椎间盘细胞自噬作用的诱导物，该诱导物为终浓度为100nM的雷帕霉素和10mM的氯化锂。
对比例3
一种椎间盘细胞自噬作用的诱导物，该诱导物为终浓度为10mM的氯化锂和300μM的硫酸镍。
对比例4
一种椎间盘细胞自噬作用的诱导物，该诱导物为终浓度为100nM的雷帕霉素。
实验例
1、人椎间盘髓核细胞培养
本实验所用细胞为人最键盘髓核细胞(购自英纽瑞生物，货号为INV-HN0094)，使用含10％胎牛血清的HAM-F-12培养基(美国GIBCO公司)，在37℃，5％CO2培养箱中进行细胞培养，当细胞接近90％融合时，用质量分数为0.25％的胰蛋白酶消化并按1∶2进行髓核细胞传代，继续在37℃，5％CO2培养箱中培养，选取生长状态良好且处于对数生长期的细胞备用。
将处于对数生长期的人椎间盘髓核细胞按4×104/孔的密度接种24孔板，过夜贴壁培养后，移除原培养液，加入新鲜配制的分别含实施例1-4及对比例1-3所述终浓度的诱导物的培养液继续培养，同时以不加诱导物的培养液培养的细胞作为阴性对照组。继续培养12h后终止培养。
2、Western-blot：
细胞终止培养后，离心收集悬浮的细胞，RIPA裂解液裂解细胞，收集细胞总蛋白，Western Blotting法检测LC3Ⅰ型LC3Ⅱ型蛋白的表达量的变化：常规电泳、转印，脱脂牛奶封闭后，加LC3抗体(1：1000)4℃孵育过夜。碱性磷酸酶标记二抗(1：3000)，室温孵育2h，碱性磷酸酶染色5min，胶片曝光显影，结果用Quality One分析。以阳性条带与内对照光密度比值作为阳性条带的相对表达值。Western-blot实验结果见图1。由图1结果可知，本发明提供的诱导物，诱导自噬的效果显著优于对比例。
微管相关蛋白1轻链3(LC3/Atg8)是自噬体膜上的标记蛋白。细胞内存在两种形式的LC3蛋白，LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ。细胞内新合成的LC3其C端被Atg4蛋白酶剪切，成为胞质可溶形式的LC3-Ⅰ。当自噬体形成后，LC3-Ⅰ经剪切和泛素化加工修饰.与自噬体膜表面的磷脂酰乙醇胺(PE)偶联，成为膜结合形式的LC3-Ⅱ并定位于自噬体内膜和外膜。与其他一些定位于自噬体膜上的Atg蛋白不同(仅在自噬过程的某一阶段发挥作用)，LC3-Ⅱ始终稳定地保留在自噬体膜上直到与溶酶体融合，因此被用来作为自噬体的标记分子。LC3-II/I比值的大小可估计自噬水平的高低。
蛋白质印迹技术是一种比较普遍使用的检测蛋白质表达的方法。SDS-PAGE电泳中，LC3-I表观分子量为18kD，LC3-Ⅱ的表观分子量为16kD。自噬发生后，通过Westemblot可以检测到LC3-Ⅱ蛋白的表达水平上调。

Claims (10)

1.一种椎间盘细胞自噬作用的诱导物，其特征在于，该诱导物包括雷帕霉素、氯化锂和硫酸镍。
2.如权利要求1所述的诱导物，其特征在于，所述的雷帕霉素的终浓度为50-400nM。
3.如权利要求1所述的诱导物，其特征在于，所述的雷帕霉素的终浓度为50-300nM。
4.如权利要求1所述的诱导物，其特征在于，所述的雷帕霉素的终浓度为50-150nM。
5.如权利要求1-4任一项所述的诱导物，其特征在于，所述的氯化锂的终浓度为5-50mM。
6.如权利要求5所述的诱导物，其特征在于，所述的氯化锂的终浓度为5-30mM。
7.如权利要求1-4任一项所述的诱导物，其特征在于，所述的硫酸镍的终浓度为100-1000μM。
8.如权利要求7所述的诱导物，其特征在于，所述的硫酸镍的终浓度为200-600μM。
9.如权利要求7所述的诱导物，其特征在于，所述的硫酸镍的终浓度为250-400μM。
10.权利要求1-9任一项所述的诱导物在制备治疗椎间盘退行药物中的用途。
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