CN108251317B - 一株扣囊复膜孢酵母及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物发酵技术领域，具体属于微生物腐熟技术领域，特别涉及一株产酶种类多、产酶活性高、耐酸性好、使酒糟升温快、高温持久、彻底腐熟酒糟的菌株，并涉及该菌株的应用。所述菌株为扣囊复膜孢酵母(Saccharomycopsis fibuligera)Y‑1，保藏编号为CGMCC No.15255。该菌株产α‑淀粉酶活是目前已知最高酶活(7425.4U/g)的2.56倍，同时还具有产生糖化酶、纤维素酶(CMC酶)、纤维素酶(FPA酶)、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、脂肪酶以及漆酶其他7种酶的能力，产酶种类多且酶活性高，应用于速腐菌剂可直接快速彻底腐熟酒糟。

Description

一株扣囊复膜孢酵母及其应用
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体属于微生物腐熟技术领域，特别涉及一株产酶种类多、产酶活性高、耐酸性好、使酒糟升温快、高温持久、彻底腐熟酒糟的扣囊复膜孢酵母，并涉及该菌株的应用。
背景技术
酒糟是白酒生产过程以高粱、小麦、玉米、大米、黑麦等为原料通过加入酒曲、糖化酶等发酵剂，经蒸煮、糖化发酵、蒸馏等工序后的残留固形物，其成分复杂，水分含量高，酸度大，若任其排放不及时处理就会腐败变质，严重污染环境。
目前很多大型白酒企业选择二次利用酒糟，即建设蒸汽车间，利用酒糟燃烧产生热能作为白酒生产所需消耗的热力的来源，这也是大规模酒糟处理较好的技术选择，处理彻底，又可作为能源利用。但是需要解决酒糟燃烧产生的二次污染问题，即酒糟灰。
据统计，2015年中国规模以上的白酒企业1563家，形成的干白酒糟年产量达到400万t以上。目前白酒糟的再利用除了上述燃烧产能外，主要是动物饲料研究、酒糟中纤维素资源的乙醇发酵研究以及酒糟中附加值更高的功能性成分物质的研究。但这些应用的利用率低，附加成本高，并且不适合大规模应用。
酒糟富含粗蛋白、粗淀粉、粗脂肪、粗纤维、氨基酸、多种维生素以及氮、磷、钙等多种促进生长类物质，同时酒糟中含有长期高温驯化的耐高温菌种，如芽孢杆菌、放线菌等益生菌，这大大提升了酒糟的利用价值。酒糟灰虽然为酒糟燃烧的二次污染物，但是其pH为7.4左右，富含磷、钾，也可作为有机肥的生产原料。因此将酒糟和酒糟灰按照一定比例混合再用功能微生物菌剂发酵制备酒糟生物有机肥，既实现了资源利用，变废为宝，又解决了环保问题。
但是酒糟作为有机肥原材料的前提是能够被彻底腐熟，而目前市场在售的多为以细菌为主的酒糟腐熟剂且起温速度较慢、发酵时间较长，并且现有酒糟腐熟剂相关专利公开的菌种也多为细菌，且腐熟菌种特点及功能公开极少。
新鲜酒糟含水量高(65％左右)且酸度大(pH值3.5左右)，其含水量高、酸度大的特点使腐熟菌难以生长和繁殖，这就导致绝大部分腐熟剂升温较慢，水分不易散失，因此现有专利大多数研究者会将酒糟摊开通风、晾晒数日以降低其含水量，同时加入生石灰降低其酸度后进行发酵，这大大增加了时间及原材料成本。
现有专利酒糟腐熟剂多数由芽孢杆菌、乳酸菌、链霉菌等组成，而这些菌为好氧菌，在堆积状态下由于缺氧无法生存，需要频繁翻堆，这大大增加了人力和机械成本，另外腐熟时间过长会造成脱氨使氮素损失从而降低肥效且以细菌为主的腐熟剂产生的有机肥有氨味和腥臭味，这也是目前市场上大多数酒糟腐熟剂的弊端。
酒糟营养虽然丰富但是大部分都是大分子物质，不能直接被植物吸收利用，这就需要腐熟功能酶将其进行分解为易被植物吸收利用的小分子物质，酒糟中大分子物质主要为粗蛋白、粗淀粉、粗脂肪、纤维素及木质素等，而分解以上物质所需酶为：蛋白酶、α-淀粉酶、糖化酶、脂肪酶、纤维素酶及漆酶等腐熟功能酶；酒糟中大分子营养物质若不能被分解，酒糟不能制作成优质有机肥，因此腐熟酒糟腐熟剂菌种产酶功能至关重要。
中国专利CN 105296378 A公开了一种酒糟快速腐熟的菌种及其应用，菌种保藏号为CGMCC No.8268，命名：莫海威芽孢杆菌(Bacillus mojavensis)，4～5天，温度升到60～65℃，用生石灰将酒糟pH调节到6～6.5之间；中国专利CN 104151042 B公开了一种酒糟有机肥及其生产方法，所述的腐熟菌剂的主要构成为保藏编号为CGMCC No.8143的解淀粉芽孢杆菌和保藏编号为CGMCCNo.8268的莫海威芽孢杆菌；发酵周期为20～25天。
上述专利中公开的酒糟腐熟菌剂所含主要菌种为好氧菌，发酵温度低、发酵周期长，且以上专利中均未公开所述腐熟剂菌株耐酸碱、产酶性能等。
曹建兰、王晓丹、龙茜萍、周鸿翔、袁颉、邱树毅等发表了“两步发酵法制备固态白酒丢糟生物有机肥”(酿酒科技2014年第2期总第236期)公开了一组发酵白酒糟菌株：其中烟曲霉(Aspergillus fumigatus)CICC2343，乳酸菌(Lactobacillus plantarum)GIMCC AS1.3，白腐菌(Phanerochaete chrysosporium)CICC40299，巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)CICC20732以及黑曲霉等，该文献技术主要是在实验室阶段进行酒糟腐熟实验，先接种烟曲霉，6-7天后再接种其他4株菌，对发酵过程中酒糟pH、有效磷、有机质、全氮含量及性能进行测定分析，证明接种功能微生物对酒糟进行二次发酵生产有机肥方法可行，该文献未公开研究腐熟菌种的产酶功能及腐熟温度等。
中国专利CN200710064203公开了一种肥料发酵剂及其制备方法与应用，该肥料发酵剂的原材料配方包括：发酵工业废渣10-80份，秸秆5-30份，饼粕5-30份，麸皮和米糠10-30份，尿素1.5-2份，NaCl和/或葡萄糖0.5-1份，以及褐球固氮菌(Azotobacterchroococcum)，巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)，地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)和扣囊复膜孢酵母(Saccharomycopsis fibuligera)中的1-5株菌各1-30份，该专利所公开的扣囊复膜孢酵母(Saccharomycopsis fibuligera)功能为快速解除土壤板结，具有利用物质范围广，生长快和易腐熟的特点，但该专利并未公开菌种耐酸性、产酶种类丰富及酶活高的特性，而产酶丰富及活性高的特性是保证腐熟的重要指标。
中国专利CN 104909854 A公开了一种酱香白酒糟有机肥及其制备方法，所述腐熟菌剂由芽孢杆菌、酵母菌、放线菌和醋酸杆菌复合而成，有机肥的发酵原料包括以下成分：酱香白酒糟80-90份，菜籽饼5-10份，骨粉4-8份，秸秆3-4份，锯木粉3-4份，玉米棒芯5-10，鸡蛋壳2-4份，生石灰1-2份，腐熟菌剂0.1-0.2份，餐厨垃圾2-4份，该有机肥重金属含量少、养分足。
上述专利文献和技术文献中公开的菌种耐酸度低，需要对酒糟进行降酸预处理才可正常腐熟发酵，起温较慢，且均未公开产酶性能，但是菌种的产酶功能直接关系到对酒糟营养物质的降解和酒糟的腐熟程度，进而关系到农作物能否利用以酒糟为主要原料的有机肥进行生长。
综上，虽然公开的白酒酒糟腐熟菌较多，但是菌种的耐酸性不高，升温时间较长，高温期短，影响彻底腐熟；好氧细菌居多，频繁堆翻，发酵时间长，造成脱氨失氮且氨臭味较重，工序复杂，增加了原材料、机械、人力成本，更重要的是上述专利酒糟腐熟菌未公开所用菌种功能特性，更没有公开腐熟菌的产酶功能，而产酶功能是腐熟酒糟的关键。
因此如果能找到一种既能适应酒糟高酸、高湿环境又能迅速升温并且产酶种类多，产酶活性高可直接将酒糟丰富的大分子物质分解为可被植物直接吸收的小分子物质的腐熟菌种，将是酒糟腐熟领域迫切的需要。
扣囊复膜孢酵母(Saccharomycopsis fibuligera)属于酵母目(Saccharomycetales)，复膜孢酵母科(Saccharomycopsidaceae)，复膜孢酵母属(Saccharomycopsis)。该菌酶系丰富，能够分泌α-淀粉酶、糖化酶、酸性蛋白酶等多种酶，因此非常适合应用于发酵行业；
中国专利CN 107189952 A公开了一种具有淀粉酶活力的扣囊复膜孢酵母CICC33077及其在芝麻香型白酒中高温大曲中的应用。所述菌株菌丝体发达、淀粉酶活力高，在麸皮培养基中培养4天，淀粉酶活力能够达到7425.7U/g，并将该菌株制备成菌剂应用于芝麻香型中高温大曲的生产中。
中国专利CN 107475030 A公开了一种纯种的小曲的生产工艺，属于运用真菌等微生物进行生物酿酒技术领域，该纯种小曲采用纯种根霉麸曲与纯种酵母麸曲和纯种扣囊复膜孢酵母麸曲混合制成，所述扣囊复膜孢酵母高产酯和淀粉酶活，应用于酿酒具有香气纯正、品质优良等优点。
中国专利CN 103749967 A公开了一种甘薯渣发酵饲料及其制备方法，涉及动物饲料领域。该专利发酵剂组成为：枯草芽孢杆菌、扣囊复膜孢酵母、绿色木霉和植物乳杆菌菌，其中扣囊复膜孢酵母增加了饲料蛋白的含量。
以上专利所述扣囊复膜孢酵母应用于酿酒或饲料发酵行业，没有公开在酒糟腐熟领域中的应用；并且以上专利所用扣囊复膜孢酵母除了α-淀粉酶活力、蛋白酶活性外均没有公开是否产其他酶及酶活力大小。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一株产酶种类多、产酶活性高、耐酸、迅速升温、高温持久、彻底腐熟酒糟的扣囊复膜孢酵母(Saccharomycopsis fibuligera)Y-1；该菌株已于2018年1月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏编号为CGMCC No.15255。
所述扣囊复膜孢酵母菌株具有解淀粉、解蛋白、解脂肪、解纤维素以及解木质素能力，同时具有较好的适应酒糟高湿高酸环境能力；
所述扣囊复膜孢酵母Y-1在pH值2.5-6.5范围内均可生长，最适pH值为3.0-5.0，具有较高的低pH耐受性；
所述扣囊复膜孢酵母Y-1产酶种类多且酶活性高，其中产糖化酶达55247.00U/g，α-淀粉酶达19030.00U/g，CMC酶达659.38U/g，FPA酶达到285.20U/g，中性蛋白酶达1178.67U/g，酸性蛋白酶达986.20U/g，脂肪酶达8.4 0U/g，漆酶达8.64U/g，具有如此丰富酶系且酶活高的扣囊复膜孢酵母Y-1可充分将酒糟中如粗淀粉、粗脂肪、粗蛋白、粗纤维、木质纤维素等丰富的大分子物质分解成利于农作物能够吸收的小分子，提高酒糟腐熟效率。
本发明同时提供上述菌株的发酵方法，包括如下步骤：
菌种活化：用接种环挑取扣囊复膜孢酵母划线至PDA平板培养基，30℃培养48h；
一级种子液制备：用接种环挑取活化的扣囊复膜孢酵母接种于YPD液体培养基，30℃200rpm震荡培养24h，得一级种子液；
二级种子液制备：将一级种子液按接种量1％(v/v)再次接种至YPD液体培养基，30℃180rpm震荡培养36h，得二级种子液；
固态发酵：
拌料:按照固体发酵培养基A配方，先用500mL自来水将葡萄糖、蛋白胨、(NH4)2SO4、NaH2PO4、MgSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O、MnSO4·H2O、CaCl2·2H2O溶解，然后与其它原料混匀，最终料水比为1:0.8，分装至灭菌袋，于121℃灭菌45min，冷却至35℃，备用；
装盘、接种、发酵：
将灭菌后的固体发酵培养基A装入灭菌曲盘至1cm厚，按体积质量比10％的接种量接种二级种子液；底层用灭菌的报纸覆盖，上层用灭菌的麻包覆盖，移入曲房；于温度30℃、湿度65％培养60h。
所述固体发酵培养基A质量组成为：麸皮160g，玉米粉480g，豆粕320g，葡萄糖10g，(NH4)2SO4 9g,NaH2PO4 9g，蛋白胨10g，MgSO4·7H2O 2.4g，ZnSO4·7H2O 0.4g，MnSO4·H2O0.02g，CaCl2·2H2O 0.12g，料水比1:0.8。
本发明同时提供一种扣囊复膜孢酵母固态发酵菌剂，所述扣囊复膜孢酵母Y-1固态发酵菌剂，菌活量可达到7.8×1011cfu/g,远大于目前已知最高菌活量。
本发明同时提供一种速腐菌剂，所述速腐菌剂的制备方法，包括如下步骤：
将扣囊复膜孢酵母Y-1以及米曲霉、黑曲霉、白腐菌分别固态发酵制备单菌菌剂，菌活量分别可达：7.8×1011cfu/g、3.6×109cfu/g、4.4×109cfu/g和5.2×109cfu/g；
按重量份数计，扣囊复膜孢酵母Y-1菌剂30-60份、米曲霉菌剂10-20份、黑曲霉菌剂10-20份、白腐菌菌剂10-30份，以轻质碳酸钙100-200份，草碳粉400-500份为稀释载体进行混合、粉碎过40目筛即得速腐菌剂。
本发明所述速腐菌剂菌活量为78.90×108cfu/g，纤维素酶活74.6U/g，蛋白酶活95.2U/g，显著优于国家腐熟菌剂标准；经试验，本发明速腐菌剂在室温下贮存6个月，菌活量为75.26×108cfu/g，存活率高达95.39％，贮存9个月，菌活量为70.05×108cfu/g，存活率高达88.78％，贮存1年后，菌活量仍为64.31×108cfu/g，存活率为81.51％，表明本发明速腐菌剂稳定性较高，保质期较长；
本发明同时提供速腐菌剂在酒糟腐熟中的应用；
在本发明的一些具体实施方案中，所述速腐菌剂的用量为：每吨酒糟接入速腐菌剂3kg；
本发明同时提供一种酒糟生物有机肥。
本发明同时提供一种酒糟生物有机肥的制备方法，包括如下步骤：
将腐熟酒糟添加1‰生化黄腐酸钾，混匀，用半湿物料粉碎机进一步粉碎、3-4mm滚筒筛，过筛后添加5％胶胨样类芽孢杆菌(菌活量：109cfu/g)、5％巨大芽孢杆菌菌粉(菌活量：1010cfu/g)以及5‰解淀粉芽孢杆菌菌粉(菌活量：1011cfu/g)，即得酒糟生物有机肥；
所述腐熟酒糟的方法，包括如下步骤：
将酒糟、酒糟灰按照重量比3:1掺混，添加1‰的尿素，每吨酒糟接入3kg本发明速腐菌剂，混匀堆垛，酒糟堆体长宽高：40m×1.8m×1.5m；
酒糟堆垛进入80℃以上高温期每隔一天堆翻一次，第3d达最高温度89.8℃，发酵至第14天温度不再高于80℃，进入中高温期，每周堆翻一次，发酵至第22天堆垛温度降至70℃以下，进入降温阶段；发酵至45天，酒糟堆垛温度低于25℃不再起温，酒糟质地松散，呈深褐色，含水率21.2％，pH 8.16，C/N为14.13，种子发芽指数为86.34％，即得腐熟酒糟。
所述酒糟生物有机肥富含具有解磷、解钾功能的胶胨样类芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌同时富含具有生防功能的解淀粉芽孢杆菌及保藏菌种扣囊复膜孢酵母Y-1，有效菌活达2.99亿/g，有机质达60.12％，pH 7.90，水分12.36％，未检出蛔虫卵和粪大肠菌群，重金属显著低于国家标准，因此本发明酒糟生物有机肥质量显著优于国家生物有机肥标准，既有肥效又有药效，不仅可促进果蔬生长又能防控病害，显著提高果蔬品质。
有益效果
本发明公开的扣囊复膜孢酵母产α-淀粉酶活是目前已知最高酶活(7425.4U/g)的2.56倍，同时本发明公开的扣囊复膜孢酵母其还具有产生糖化酶、纤维素酶(CMC酶)、纤维素酶(FPA酶)、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、脂肪酶以及漆酶其他7种酶的能力，产酶种类多且酶活性高；
本发明所述扣囊复膜孢酵母是一种兼性菌，在有氧和无氧的条件下均可正常生长繁殖且生长力旺盛；该菌适应新鲜酒糟的高湿环境，无需晾晒或者用其他原材料调节水分；最适pH为3-5，完全适应新鲜酒糟的酸性环境，无需调节酒糟的pH，产酶种类多且酶活性高，其中产糖化酶达55247.00U/g，α-淀粉酶达19030.00U/g，CMC酶达659.38U/g，FPA酶达到285.20U/g，中性蛋白酶1178.67U/g，酸性蛋白酶986.20U/g，脂肪酶8.40U/g，漆酶8.64U/g，可充分降解酒糟中丰富的大分子物质，利于农作物吸收；
本发明所述速腐菌剂是以真菌为主要组成的腐熟剂，发酵过程较以细菌为主的腐熟剂无氨臭味，不会造成脱氨失氮，肥效高；本发明速腐菌剂可使酒糟迅速升温，同时激活酒糟中原有的经长期驯化的耐高温菌种共同发挥作用，第二天(19h)即能达到80.3℃，进入高温期，第3d达最高温度89.8℃，接近90℃高温；发酵过程中80℃以上高温期维持13d，70℃以上中高温期维持21d，高温时间长，彻底杀死病原微生物以及虫卵，达到堆肥无害化标准；发酵至45天，酒糟质地松散，呈深褐色，含水率21.2％，pH 8.16，C/N为14.13，种子发芽指数为86.34％，说明本发明速腐菌剂可直接快速彻底腐熟酒糟；
本发明速腐菌剂中的功能腐熟菌不仅将酒糟中的粗蛋白、粗淀粉、粗脂肪、粗纤维等难分解大分子物质降解为可被植物直接吸收利用的小分子营养物质，同时代谢生成多种维生素、植物激素、活性酶等物质，在各种农作物及果蔬生长发育过程发挥着重要的促进和调节作用。
将本发明酒糟生物有机肥施用于大荔冬枣，坏果率最低，仅为3.44％，最大单果重达30.80g/个，平均单果重最大，达25.12g/个，显著高于施用其他肥料的平均单果重且比对照组CK(不施用任何肥料)平均单果重提高8.79％；单株产量最高，达10.69kg/株，比对照组CK提高17.34％；
施用本发明酒糟生物有机肥的冬枣Vc含量较CK组增加11.98％；可溶性糖含量较CK增加23.07％；可溶性蛋白含量显著高于对照组CK，较对照组CK增加了16.55％；可溶性固形物含量较高，较对照组CK增加了13.21％；有机酸含量较对照组CK降低11.34％，大大提升了大荔冬枣的营养保健价值及口感；施用本发明酒糟生物有机肥可显著提高大荔冬枣枣果大小、产量和品质；
附图说明
图1-Y-1在PDA上的菌落形态图；
图2-Y-1在YPD上的菌落形态图；
图3-Y-1细胞形态图；
图4-Y-1子囊孢子图；
图5-Y-1与相关菌株的ITS区序列系统进化树；
图6酒糟腐熟过程中温度变化图；
图7酒糟腐熟过程中含水率变化图；
图8酒糟腐熟过程中pH值变化图；
图9酒糟腐熟过程中总有机碳含量变化图；
图10酒糟腐熟过程中全氮含量变化图；
图11酒糟腐熟过程中碳氮比变化图；
图12腐熟不同时期酒糟对种子发芽指数的影响示意图。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
实施例1酵母菌Y-1的分离纯化、筛选与鉴定
1)分离、纯化：精确称取10g取自四川省宜宾市五粮液集团自然堆积发酵的白酒糟样品，加到含有100mL冷却无菌水的带玻璃珠灭菌三角瓶中，200r/min摇床震荡混匀30min，静置5min吸取上清液1mL，依次梯度稀释得到10-1-10-5浓度，选取10-1、10-2、10-3、10-4、10-5的稀释浓度，用移液器分别吸取各个梯度悬浮液100μL，用涂布器均匀涂布到加有硫酸链霉素的YPD平板中，培养基中硫酸链霉菌终浓度为30μg/mL，以无菌水对照，将平板倒置于培养箱，30℃培养7天，每个处理设置水平重复3组，根据微生物菌落的形状、大小、表面结构、边缘结构、质地、味道、颜色等方面的特征，分离获得5株酵母菌，将这5株酵母菌在YPD培养基上反复纯化后得到纯菌种，编号为Y-1、Y-2、Y-3、Y-4、Y-5；
所述YPD培养基质量组成为：葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母粉10g，琼脂20g，蒸馏水1L,pH值自然；
2)初筛：筛选腐熟功能指标较好的菌种，即可有效分解淀粉、蛋白、脂肪、纤维素以及木质纤维素等菌种；将Y-1、Y-2、Y-3、Y-4、Y-5分别点接至解淀粉培养基、解蛋白培养基、解脂肪培养基、解纤维素以及解木质素培养基上，不接菌的平板为空白对照，每个菌每个腐熟功能指标3个重复，放置于30℃培养5天，解淀粉和解纤维素平板分别用卢哥氏碘液和刚果红染色后观察菌落周围是否有透明圈，解脂肪平板直接观察菌落周围有无晕圈，解蛋白平板直接观察菌落周围有无透明圈，解木质素平板直接观察是否有苯胺蓝降解圈判断菌株是否具有相应的分解功能同时记录菌落直径(d)及透明圈或晕圈直径(D)，计算比值D/d，筛选同时具有解淀粉、解蛋白、解脂肪、解纤维素能力和解木质素的菌株，即可产α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶和漆酶等多种腐熟功能相关酶的菌株，最终初筛获得同时具有可产生多种腐熟相关酶菌株Y-1、Y-3和Y-5；
表1：不同菌株的腐熟功能定性检测结果
Figure BDA0001613431410000081
注：*：弱阳性-：阴性
可以看出Y-1、Y-3、Y-5能同时产生多种腐熟功能酶，因此将这3株菌进行下一步的复筛；
所述解淀粉培养基平板的制备方法为：土豆200g，切成1cm3小块，煮沸30min，用3层纱布过滤，滤液补加蒸馏水至1L，葡萄糖20g，可溶性淀粉10g，琼脂粉20g，pH值自然；
接种30℃培养5天后，加入卢哥氏碘液(原液稀释50倍)将培养基覆盖，在菌落周围出现不变蓝色水解圈为阳性。
所述解蛋白培养基平板的制备方法为：牛肉膏3g,NaCl 5g,干酪素2g,CaCl20.1g,琼脂粉20g，蒸馏水1L，pH值7.6-8.0；
接种30℃培养5天后，直接观察，菌落周围出现透明圈为阳性；
所述解脂肪培养基平板的制备方法为：蛋白胨10.0g、NaCl 5.0g、CaCl2·2H2O0.1g，pH值7.4、蒸馏水1L、琼脂粉20.0g；121℃灭菌30min，冷却至40-50℃，分别加入单独灭菌的Tween40、Tween60、Tween80至吐温终浓度为1％，摇匀倒平板。
接种30℃培养5天后，如能解脂肪，则至少有一种平板的菌落周围形成不透明的晕圈。晕圈由菌体利用Tween形成的特征性的皂化结晶组成；
所述解纤维素培养基平板的制备方法为：羧甲基纤维素钠3g，硫酸铵1.2g，K2HPO40.6g，MgSO4·7H2O 0.15g，蛋白胨0.3g，琼脂粉6g，pH值自然，蒸馏水300mL；
接种30℃培养5天后，用0.2％刚果红染色10-30min分钟，再用1％NaCl水溶液漂洗10min。观察透明圈的有无来判断菌株是否具有解纤维能力。
所述解木质素培养基平板的制备方法为：酵母粉10g，葡萄糖20g，琼脂粉20g，pH值自然，蒸馏水1L，灭菌冷却至50℃左右，加入单独灭菌的浓度为1％的苯胺蓝，每100mL培养基加1mL母液即可。
接种30℃培养5天后，观察是否出现苯胺蓝降解圈判断菌株是否具有解木质素能力；
3)复筛：将初筛得到的Y-1、Y-3和Y-5划线于PDA平板培养基进行活化，再分别用接种环挑取一环接种至装有100mL灭菌的复筛培养基的三角瓶中，置于30℃摇床，180r/min振荡培养，每株菌24瓶，标签编号，其中对照组CK不接菌，处理组分别为培养不同时间(8h、16h、24h、32h、40h、48h、56h、64h)的菌液，每株菌不同培养时间做三个重复，菌液取出后立即放入4℃冰箱贮存，同时测定不同时间段菌悬液菌活量。最终筛选得到能够同时产生α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶和漆酶等多种腐熟功能相关酶，且适应鲜酒糟酸性环境，同时充分利用鲜酒糟营养进行生长的酵母菌Y-1，斜面菌种保藏，备用。
所述复筛培养基制作方法为：称取5g鲜酒糟加到含有200mL无菌水的带玻璃珠的三角瓶中，200r/min摇床震荡混匀30min，用4层纱布进行过滤，得酒糟滤液，将酒糟滤液分装到500mL三角瓶中，100mL/瓶，不调pH，121℃灭菌30min；
所述PDA平板培养基制作方法为：土豆200g，切成1cm3小块，煮沸30min，用3层纱布过滤，滤液补加蒸馏水至1L，葡萄糖20g，琼脂粉20g，pH值自然；
表2不同酵母菌株利用酒糟营养的生长能力(菌活量)
Figure BDA0001613431410000091
Figure BDA0001613431410000101
可以看出，Y-1比Y-3及Y-5在酒糟滤液中的生长能力强，说明其能充分利用酒糟养分进行生长，更适合进行酒糟发酵；
4)Y-1菌种鉴定
根据形态学、生理生化及遗传性特征对酵母菌Y-1进行鉴定，具体步骤如下：
(1)形态学水平鉴定
将Y-1划线至PDA和YPD两种培养基上，30℃培养48h，对其进行菌落形态、气味及细胞形态的观察，将活化好的Y-1用接种环挑取一环接种至产孢培养基中，30℃150rpm震荡培养4天，镜检观察其产生的子囊孢子；如附图1所示：Y-1在PDA培养基养48h，菌落灰白色，圆形，中央凸起，表面粗糙呈绒毛状，有酯香；如附图2所示：在YPD培养基培养48h，菌落白棕色，圆形，中央凸起，同圆心明显；酯香味较PDA淡；如附图3所示：Y-1细胞形态为椭圆形、近圆形、卵形，有类似霉菌的菌丝体形成；如附图4所示：产孢培养及中Y-1子囊呈长方形或卵圆形，每个子囊含1-4个子囊孢子；
所述产孢培养基质量组成为：酵母浸膏1g，醋酸钾10g，葡萄糖0.5g，蒸馏水1L，pH值自然；
(2)生理生化特性
在糖发酵测试中，Y-1能利用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖，不能利用乳糖、半乳糖、淀粉、纤维二糖、棉籽糖、海藻糖等；在同化反应及其他特征测试中，Y-1能同化葡萄糖、纤维二糖、赤藓糖醇、麦芽糖、琥珀酸、可溶性淀粉、棉籽糖、海藻糖、蔗糖，不同化核糖醇、柠檬酸、甘露醇、D-阿拉伯糖、半乳糖、核糖、鼠李糖、乳糖、木糖等，对放线菌素酮有抗性，不产淀粉类物质，不能水解尿素将，耐受50％葡萄糖，不耐受60％葡萄糖，将Y-1与S.fibuligera的生理生化特征《YEASTS：Characteriditics and Identification》比较，初步确认酵母菌Y-1为扣囊复膜孢酵母(Saccharomycopsis fibuligera)。
表3酵母菌Y-1主要生理生化特性试验结果
Figure BDA0001613431410000102
Figure BDA0001613431410000111
注：“+”：代表阳性；“-”代表阴性
(3)遗传特性
基因提取：将酵母菌Y-1接种于YPD液体培养基中，30℃震荡培养3天，至培养液中出现浑浊菌体，将菌体加到离心管(1.5mL)，严格按照抽提基因组试剂盒流程提取基因组；
以提取的DNA基因组为模板，采用ITS1/ITS4为引物(ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)进行PCR扩增ITS序列片段，PCR反应条件：95℃5min，95℃30s，56℃30s，72℃40S，30个循环，72℃终延伸10min。电泳后切胶回收PCR产物(切胶回收步骤严格按照全式金胶回收试剂盒方法操作)，连接pEASYT3载体，紧接着利用热击转化法转化Top感受态，蓝白斑筛选挑取白斑菌落加入至加Amp的LB培养基中，37℃200rpm培养8-12h。采用T7/SP6引物进行阳性克隆的检测，将阳性克隆菌液送至北京六合华大基因科技股份有限公司进行测序，将所获得的序列拼接校对后，应用GeneBank数据库进行Blast比对分析，Clustal X2.0软件进行同源性分析，MEGA7.0软件中的Neighbor-Joining方法构建系统发育树确定菌种种属。
所述YPD液体培养基质量组成：葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母粉10g，蒸馏水1L，pH值自然；
如附图5酵母菌Y-1的ITS基因序列系统进化树分析可知，Y-1与Saccharomycopsisfibuligera KJJ81聚在一个分支中，相似性达100％，进一步鉴定酵母Y-1为扣囊复膜孢酵母(Saccharomycopsis fibuligera)。
综上所述，根据形态学水平鉴定、生理生化特性鉴定及遗传特性综合分析，最后确定酵母菌Y-1为扣囊复膜孢酵母(Saccharomycopsis fibuligera)。
实施例2扣囊复膜孢酵母Y-1低pH值耐受性试验
(1)方法：挑取适量扣囊复膜孢酵母Y-1菌体接入YPD液体培养基，30℃180rpm震荡培养48h得种子液，将种子液按0.5％的接种比例接入装有不同pH值(1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5)的灭菌YPD液体培养基的三角瓶中,每个pH值三个重复，不接菌的为空白对照，30℃、180r/min振荡培养48h,观察每种pH下三角瓶中菌液是否浑浊以及浑浊度，同时测定浑浊菌液的菌活量；
(2)试验结果：除了pH值1.0、1.5、2.0以及CK组菌液依然澄清外，其他不同pH(2.5-6.5)的YPD液体培养基均浑浊，说明扣囊复膜孢酵母Y-1在pH值2.5-6.5范围内均可生长，不同pH菌悬液涂布YPD平板，pH值2.5时，菌活量均可达106cfu/mL，pH值3.0-5.0范围内，菌活量均可达108cfu/mL，pH值5.5-6.5范围内，菌活量均可达107cfu/mL，以上实验结果可知，扣囊复膜孢酵母Y-1在pH值2.5-6.5范围内均可生长，最适pH值为3.0-5.0，具有较高的低pH耐受性，而鲜酒糟pH值3.5左右，为Y-1最适pH，因此可得出Y-1能很好适应酒糟的酸性环境，更好的腐熟酒糟。
实施例3扣囊复膜孢酵母Y-1固态发酵
(1)菌种活化：用接种环挑取适量扣囊复膜孢酵母Y-1划线至PDA平板培养基，30℃培养48h；
(2)一级种子液制备：用接种环挑取适量活化的扣囊复膜孢酵母Y-1接种于YPD液体培养基，30℃200rpm震荡培养24h，得一级种子液；
(3)二级种子液制备：将一级种子液按接种量1％(v/v)再次接种至YPD液体培养基，30℃180rpm震荡培养36h，得二级种子液；
(4)固态发酵研究：
①拌料:按照固体发酵培养基A配方，先用500mL自来水将葡萄糖、蛋白胨、(NH4)2SO4、NaH2PO4、MgSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O、MnSO4·H2O、CaCl2·2H2O等溶解，然后与其它原料混匀，最终料水比为1:0.8，分装至灭菌袋，于121℃灭菌45min，冷却至35℃，备用；
②装盘、接种、发酵：将长50cm，宽30cm深5cm的曲盘121℃灭菌45min，将步骤①灭菌后的固体发酵培养基A装入曲盘至1cm厚，按体积质量比10％的接种量接种二级种子液；底层用灭菌的报纸覆盖，上层用灭菌的麻包覆盖，移入曲房；于温度30℃、湿度65％培养60h移至烘干房，于35℃晾干至水分低于5％后粉碎过40目筛即得Y-1菌剂。
(5)Y-1菌剂菌活量测定：精确称取10g Y-1菌剂，加到含有100mL冷却无菌水的带玻璃珠灭菌三角瓶中，200rpm摇床震荡混匀30min，静置5min吸取上清液1mL，依次梯度稀释得到10-3-10-10浓度，选取10-8、10-9、10-10的稀释浓度，用移液器分别吸取各个梯度悬浮液100μL，用涂布器均匀涂布到PDA培养基平板中，以无菌水对照，将平板倒置于培养箱，30℃培养48h，每个处理设置水平重复3组；
结果：最终测定扣囊复膜孢酵母Y-1菌剂的菌活量为7.8×1011cfu/g，菌活量远远高于现有技术所公开的菌活量；
所述固体发酵培养基A质量组成为：麸皮160g，玉米粉480g，豆粕320g，葡萄糖10g，(NH4)2SO4 9g,NaH2PO4 9g，蛋白胨10g，MgSO4·7H2O 2.4g，ZnSO4·7H2O 0.4g，MnSO4·H2O0.02g，CaCl2·2H2O 0.12g，料水比1:0.8；
实施例4扣囊复膜孢酵母Y-1产酶活性研究
扣囊复膜孢酵母Y-1产纤维素酶(CMC酶)、纤维素酶(FPA酶)、糖化酶、α-淀粉酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、脂肪酶活性以及漆酶活性研究，具体如下：
1.扣囊复膜孢酵母Y-1产纤维素酶(CMC酶和FPA酶)活性测定
根据《NY2321-2013微生物肥料产品检验规程》方法检测Y-1产纤维素酶(CMC酶)活性，酶活定义：在50℃和pH 5.0条件下，1g(mL)样品1min降解羧甲基纤维素钠(CMC)产生1μg葡萄糖所需的酶量，定义为1个酶活力单位，以U/g表示。根据《QB 2583-2003纤维素酶制剂》方法检测Y-1产纤维素酶(FPA酶)活性，酶活定义：在50℃和pH 5.0条件下，1g样品1min降解滤纸产生1μg葡萄糖所需的酶量，定义为1个酶活力单位，以U/g表示。
(1)粗酶液的制备
称取5.0g(精确至0.001g)扣囊复膜孢酵母Y-1菌剂样品，加入装有50mL pH 5.0的柠檬酸缓冲液且带有玻璃珠的150mL锥形瓶中，在振荡器上200r/min振荡30min，吸取适量悬液以3000×g离心力离心5min；离心后的上清液即为粗酶液；
(2)纤维素酶活力测定-CMC法
将粗酶液放入50℃恒温水浴中，预热5min。吸取1.5mL 0.51％羧甲基纤维素钠(CMC)溶液放入20mL具塞刻度试管中，加入1.5mL DNS溶液，在50℃水浴中预热5min。加入0.5mL待测酶液，充分摇匀，在50℃水浴中反应30min后立即取出，即为空白管。吸取1.5mL0.51％羧甲基纤维素钠(CMC)溶液放入20mL具塞刻度试管中，50℃水浴中预热5min。加入0.5mL待测酶液，充分摇匀，在50℃水浴中反应30min后立即取出，加入1.5mL DNS溶液，混合均匀，即为试样管。将试样管和空白管同时沸水浴5min，取出后快速冷却，用蒸馏水定容至20.0mL，充分摇匀。在分光光度计540nm波长下，以空白管溶液调节仪器零点，并测定试样管溶液的吸光度。
(3)纤维素酶活力测定-FPA法
将滤纸剪成1cm*1cm的小纸片，备用。取25mL具塞试管，加入50mg滤纸、1.5mL缓冲液和0.5mL粗酶液为试验组，加入发粗酶液为失活酶液为对照组，50℃水浴30min，加入1.5mL DN S溶液沸水浴5min，取出后快速冷却，用蒸馏水定容至20.0mL，在分光光度计540nm波长下，以空白管溶液调节仪器零点，并测定试样管溶液的吸光度。
2.扣囊复膜孢酵母Y-1产中性和酸性蛋白酶活性测定
根据《NY2321-2013微生物肥料产品检验规程》方法检测Y-1产蛋白酶活性，酶活定义：在40℃和pH 7.5条件下，1g样品1min水解酪素产生1μg酪氨酸所需的酶量，定义为1个酶活力单位，以U/g表示。
(1)粗酶液制备方法
称取5.0g(精确至0.001g)扣囊复膜孢酵母Y-1菌剂样品，加入装有50mL pH7.5磷酸缓冲液或者pH3.6的醋酸缓冲液且带有玻璃珠的150mL锥形瓶中，在振荡器上200r/min振荡30min，吸取适量悬液以3000×g离心力离心5min，离心后的上清液即为粗酶液。
(2)蛋白酶活的测定-福林酚法
将酪素溶液放入40℃水浴中，预热5min。吸取1.0mL粗酶液放入10mL离心管中，加入2.0mL三氯乙酸，摇匀，于40℃水浴中反应30min，再加1.0mL酪素溶液，摇匀后于3000×g离心5min。取1.0mL上清液加入试管中，再依次加入5.0mL碳酸钠溶液、1.0mL福林试剂使用液，置于40℃水浴中显色20min后取出，即为对照组。吸取1.0mL待测酶液放入10mL离心管中，置于40℃水浴中2min。加入1.0mL预热后的酪素溶液，摇匀，于40℃水浴中反应30min，取出后立即加入2.mL三氯乙酸，摇匀，于3000×g离心5min。取1.0mL上清液加入试管中，再依次加入5.0mL碳酸钠溶液、1.0mL福林试剂使用液，置于40℃水浴中显色20min后取出，即为实验组。在分光光度计680nm波长下，以空白管溶液调节仪器零点，测定试样管溶液的吸光度。
3.扣囊复膜孢酵母Y-1产α-淀粉酶活性测定
根据《QB/T1803-1993工业酶制剂通用试验方法》方法检测Y-1产α-淀粉酶活性，酶活定义：在温度为40℃，pH5.6的环境下，每min水解可溶性淀粉产生1mg麦芽糖所需的酶量定义为1酶活力单位(U)；
(1)粗酶液制备
称取5.0g(精确至0.001g)扣囊复膜孢酵母Y-1菌剂样品，加入装有50mLpH 5.6的柠檬酸缓冲液且带有玻璃珠的150mL锥形瓶中，在振荡器上200r/min振荡30min，吸取适量悬液以3000×g离心力离心5min；离心后的上清液即为粗酶液；
(2)α-淀粉酶活的测定
将粗酶液适当稀释后倒入三角瓶，于40℃的温度下水浴5min，另外取浓度为1％的淀粉溶液4.5mL放入10mL离心管中，40℃水浴5min，取稀释后的酶液0.5mL加入盛有已预热的淀粉溶液中，晃动混匀后于40℃水浴锅中放置20min。对照组以灭活酶液代替酶液。然后取反应液1mL倒入试管中，随后加入1.5mLDNS溶液，并迅速煮沸5min，冷却后，定容至20mL并混匀。以对照组调零，测OD540。
4.扣囊复膜孢酵母Y-1产糖化酶活性测定
根据《QB/T1803-1993工业酶制剂通用试验方法》方法检测Y-1产糖化酶活性，酶活定义为：在40℃、pH4.6的条件下，每min水解可溶性淀粉产生1μg葡萄糖所需的酶量，即为一个酶活力单位，以U/g表示。
(1)粗酶液的制备
称取5.0g(精确至0.001g)扣囊复膜孢酵母Y-1菌剂样品加入装有50mL pH 4.6醋酸缓冲液且带有玻璃珠的150mL锥形瓶中，在振荡器上200r/min振荡30min，吸取适量悬液以3000×g离心力离5min；离心后的上清液即为粗酶液；
(2)糖化酶活测定
取干净10mL离心管，加入pH4.6的醋酸缓冲液2mL，粗酶液1mL为试验组，加入灭活粗酶液为对照组，40℃预热5min，加入2％淀粉溶液5mL，40℃水浴20min，然后取反应液1mL于试管中，随后加入1.5mL DNS溶液，并迅速煮沸5min，冷却后，定容至20mL并混匀，测OD540；
5.扣囊复膜孢酵母Y-1产脂肪酶活性测定
根据《GB/T 23535-2009脂肪酶制剂》方法检测Y-1产纤维素酶(FPA酶)活性,酶活定义为：在40℃条件下，每克样品每分钟水解油脂产生1μmol脂肪酸所需酶量定义为1个活力单位(U)
(1)粗酶液制备：同蛋白酶方法中粗酶液制备方法
(2)脂肪酶活测定(指示剂滴定法)
取100mL三角瓶，加入PVA乳化液底物4mL、磷酸盐缓冲液5mL为试验组，加入PVA乳化液底物4mL、磷酸盐缓冲液5mL和15mL的95％乙醇设为对照组，40℃预热5min，加入粗酶液1mL，40℃反应15min，然后试验组加入15mL的95％乙醇，对照组和试验组三角瓶中各加酚酞指示剂2滴，用氢氧化钠溶液滴定，直至溶液变微红色保持30s不褪色为终点，记录消耗氢氧化钠标准液的体积。
6.扣囊复膜孢酵母Y-1产漆酶活性测定
(1)粗酶液制备：
称取5.0g(精确至0.001g)扣囊复膜孢酵母Y-1菌剂样品加入装有50mL pH的4.5醋酸-醋酸钠缓冲液且带有玻璃珠的150mL锥形瓶中，在振荡器上200r/min振荡30min，吸取适量悬液以3000×g离心力离心5min；离心后的上清液即为粗酶液。
(2)漆酶活测定
室温下，在试管中添加0.5mmol/L ABTS 2mL，加入2mL酶液启动反应，以灭活菌液为空白对照，测定波长在420nm处最初3min内吸光值的增加。
7.扣囊复膜孢酵母Y-1产酶活性试验结果
综上，扣囊复膜孢酵母Y-1产生各种酶见表4
表4扣囊复膜孢酵母Y-1产生8种酶酶活
Figure BDA0001613431410000161
由表4可知，扣囊复膜孢酵母Y-1产酶种类多且酶活性高，其中产糖化酶达55247.00U/g，α-淀粉酶达19030.00U/g，CMC酶达659.38U/g，FPA酶达到285.20U/g，中性蛋白酶1178.67U/g，酸性蛋白酶986.20U/g，脂肪酶8.4 0U/g，漆酶8.64U/g，具有如此丰富酶系且酶活高的扣囊复膜孢酵母Y-1可充分将酒糟中如粗淀粉、粗脂肪、粗蛋白、粗纤维、木质纤维素等丰富的大分子物质分解成利于农作物吸收的小分子，提高酒糟腐熟效率。
实施例5速腐菌剂的制备
速腐菌剂的制备，包括如下步骤：
扣囊复膜孢酵母Y-1菌剂的制备
将扣囊复膜孢酵母Y-1斜面菌种用接种环接种至YPD液体培养基，30℃200rpm震荡培养24h为一级种子液；将一级种子液按接种量1％(v/v)再次接种至YPD液体培养基，30℃180rpm震荡培养36h为二级种子液；按体积质量比10％的接种量接种二级种子液至固体发酵培养基A，于温度30℃静置培养60h，35℃干燥至水分低于5％后进行粉碎过40目筛即得Y-1菌剂,其中扣囊复膜孢酵母活菌含量可达7.8×1011cfu/g。
米曲霉菌剂的制备
将米曲霉(Aspergillus oryzae)斜面菌种用接种针接种到PDA液体培养基中，28℃200rpm震荡培养48h，按体积质量比5％接种量接种至固体发酵培养基B中，28℃培养3d，37℃干燥至水分低于5％后进行粉碎过40目筛即得米曲霉菌剂，其中米曲霉活菌含量可达3.6×109cfu/g；
所述PDA液体培养基质量组成为：土豆浸提液1L，葡萄糖20g，pH值自然；
所述固体发酵培养基B质量组成为：麸皮100g，豆饼粉9g，(NH4)2SO4 1g，料水比1.1:1，pH值自然；
黑曲霉菌剂的制备
将黑曲霉(Aspergillus niger)斜面菌种用接种针接种到PDA液体培养基中，28℃200rpm震荡培养48h，按体积质量比5％接种量接种至固体发酵培养基C中，28℃培养4d，37℃干燥至水分低于5％后进行粉碎过40目筛即得黑曲霉菌剂，其中黑曲霉活菌含量可达4.4×109cfu/g；
所述固体发酵培养基C质量组成为：麸皮100g，玉米粉10g，豆粕5g，CaCl2 0.4g，MnSO4·H2O 0.04g，KH2PO4 0.2g，蒸馏水110mL，pH值自然；
白腐菌菌剂的制备
将白腐菌(Phanerochaete chrysosporium)用接种针接种到PDA培养基斜面，33℃培养7-10d，待斜面长满孢子后，刮取孢子制成浓度为2.0×107个/mL的孢子悬液，吸取100mL孢子悬液接种到1kg固体培养基D中，33℃培养8d，40℃干燥至水分低于5％后用粉碎机进行粉碎，过40目筛即得白腐菌菌剂，其中白腐菌活菌含量可达5.2×109cfu/g；
所述固体发酵培养基D质量组成为：秸秆粉250g，稻草粉250g，淀粉1g，(NH4)2SO41g，吐温80 1mL，料水比1:0.9，pH值自然；
速腐菌剂的复配
按重量份数计，扣囊复膜孢酵母Y-1菌剂30-60份、米曲霉菌剂10-20份、黑曲霉菌剂10-20份、白腐菌菌剂10-30份，以轻质碳酸钙100-200份，草碳粉400-500份为稀释载体进行混合、粉碎过40目筛即得速腐菌剂。
速腐菌剂技术指标的检测
依据《农用微生物菌剂》GB 20287-2006和《微生物肥料产品检验规程》NY/T2321-2013对本发明所述速腐菌剂进行技术指标的检测，结果如下：
表5本发明所述速腐菌剂技术指标检测结果
Figure BDA0001613431410000171
Figure BDA0001613431410000181
本发明速腐菌剂菌活量为78.90×108cfu/g，纤维素酶活74.6U/g，蛋白酶活95.2U/g，均高于国家标准；经试验，本发明速腐菌剂在室温下贮存6个月，菌活量为75.26×108cfu/g，存活率高达95.39％，贮存9个月，菌活量为70.05×108cfu/g，存活率高达88.78％，贮存1年后，菌活量仍为64.31×108cfu/g，存活率为81.51％，表明本发明速腐菌剂稳定性较高，保质期较长；
综上可知，本发明所述速腐菌剂显著优于国家腐熟菌剂标准，可用于酒糟的快速腐熟。
实施例6腐熟酒糟试验：
1.腐熟酒糟过程
将酒糟、酒糟灰按照重量比3:1混匀，添加1‰的尿素得酒糟混合物,将实施例5中制备的速腐菌剂以3kg/吨的接种量接种于酒糟混合物，混匀后堆垛，酒糟堆体长宽高40m×1.8m×1.5m，设为试验组Y，同时设置两个对照堆体CK和CK1，CK为原料、规模相同但不接任何腐熟剂的空白对照堆体，CK1为原料、规模相同接种腐熟剂为市售白酒酒糟腐熟剂堆体；
堆垛进入高温期每隔一天堆翻一次，中高温期每周堆翻一次。堆垛每隔4米在东、西、南、北以及中间部位各插一只温度计每天上午9:00和下午16:00对试验组Y和对照组CK、CK1进行温度监控，取平均值作为酒糟堆垛温度。定期5点取样进行水分、pH、有机碳、碳氮比及发芽指数的测定，观察酒糟堆垛物理性状等；
2.酒糟腐熟试验结果比较：
2.1酒糟堆垛的物理性状变化：
试验组Y、对照组CK和对照组CK1发酵结束后体积都有所下降，其中试验组Y堆体体积下降约29.36％，对照组CK1下降约21.58％，对照组CK体积下降最少；试验组Y酒糟发酵结束后颜色深褐色，质地松散，对照组CK1酒糟颜色为褐色，CK酒糟颜色依然为黄褐色；在堆肥初期，试验组和对照组堆体酒精味和酸味严重，但是随着酒糟腐熟进程，试验组Y堆体酒精味和酸味最先减轻并消失，对照组CK1其次，对照组CK味道一直存在且产生大量的蝇蛆；说明不接种腐熟剂CK组酒糟不能自然腐熟且腐败味道严重，接种本发明速腐菌剂的试验组Y酒糟腐熟较接种市售腐熟剂的CK1腐熟更彻底；
2.2酒糟腐熟过程中温度的变化：
如附图6所示，试验组Y的酒糟堆垛第二天(19h)即能达到80.3℃，进入高温期，高温期每隔一天堆翻一次，第3d达最高温度89.8℃，接近90℃高温；发酵至第14天温度不再高于80℃，进入中高温期；中高温期每周堆翻一次，发酵至第22天堆垛温度降至70℃以下，进入降温阶段，发酵至45天，温度低于25℃不再起温发酵结束；整个发酵过程中80℃以上高温期维持13d，70℃以上中高温期维持21d，高温时间长，彻底杀死病原微生物以及虫卵，达到堆肥无害化标准；对照组CK1堆体升温缓慢，第22d达到最高温度77.8℃，较试验组最高温度低12℃。整个发酵周期没有达到80℃以上高温，70℃以上维持10d；试验组Y发酵45d即可腐熟完成，较对照组CK1提前20d；而对照组CK基本不起温，水分散失缓慢，无法腐熟；上述结果表明只有接种腐熟剂才可以将酒糟腐熟，而相对于市售白酒酒糟腐熟剂，接种本发明速腐菌剂酒糟腐熟时堆垛升温速度快，进入高温期的时间短仅需19h，维持高温期的时间长，彻底杀灭病原微生物及虫卵，充分降解酒糟有机物及其他养分，彻底腐熟酒糟；
2.3酒糟腐熟过程中含水率的变化：
如附图7所示，试验组Y和对照组CK1堆体含水率处均呈下降趋势，在高温期含水率下降最快，试验组Y发酵结束时，试验组Y和两个对照组CK、CK1的水分含量分别为21.2％、53.1％、27.9％，由于对照组CK基本不升温，水分散失很慢，有腐败的味道，说明不加腐熟剂酒糟不能自然腐熟且易腐败；与市售酒糟腐熟剂CK1相比试验组Y酒糟堆体水分散失较快，能有效缩短水分挥发时间，加快了酒糟的腐熟；
2.4酒糟腐熟过程中pH值变化：
如附图8所示，试验组Y和对照组CK1酒糟堆体pH值均均呈现先下降后上升，再下降至稳定趋势，对照组CK由于不起温，几乎无微生物分解作用，水分散失缓慢，pH无明显变化；至发酵结束后试验组Y和对照组CK1的pH均稳定在较高水平，差异不大，分别为8.16和8.01，符合国家国家规定的有机肥酸碱度范围5.5-8.5的标准；
2.5酒糟腐熟过程中总有机炭含量变化:
总有机碳含量的变化在一定程度上反映了酒糟的腐熟程度，堆肥过程一方面是在微生物作用下将有机物降解成矿物质养分、CO2、H2O和热量等，并随着CO2和H2O的散失使得有机物含量降低；另一方面有机物的矿化过程中伴随着腐殖化将有机物转化成稳定的腐殖质，使得堆体中有机质趋于稳定。如附图9所示，发酵结束后，试验组Y、对照组CK1的有机碳含量分别为33.48％、40.92％，比初始有机碳含量(50.09％)分别降低了16.61％、9.17％，而对照组CK有机碳48.27％与原酒糟初始含量差异不大。可知，本发明速腐菌剂对酒糟总有机物的降解作用显著高于对照组CK1市售腐熟剂，说明本发明速腐菌剂菌种能充分降解酒糟有机物，彻底腐熟酒糟。
2.6酒糟腐熟过程中全氮含量变化:
如附图10所示，最终试验组Y全氮含量为2.37％，比初始全氮含量(2.06％)高0.31％，对照组Y1全氮含量为2.27％，比初始全氮含量(2.06％)高0.21％，而对照组CK全氮含量略低于初始全氮含量；试验组Y和对照组CK1全氮含量变化趋势一致，但含氮量始终高于对照组CK1。进一步说明，本发明速腐菌剂菌种对降解酒糟有机物的降解更充分，更彻底。
2.7酒糟腐熟过程中碳氮比变化：
碳氮比是影响堆肥腐熟效果的重要因素，一般认为堆体的碳氮比<20时堆肥腐熟。如附图11所示，堆体起始碳氮比为24.31，试验组Y碳氮比逐渐下降，对照组CK1出现先上升后下降趋势，腐熟结束后试验组Y、对照组CK1和CK碳氮比分别为14.13、18.02和24.50，因此试验组Y和对照组CK1基本腐熟，而试验组Y碳氮比比对照组CK1下降更快，说明接种本发明速腐菌剂比市售腐熟剂腐熟酒糟效率更高；
2.8腐熟过程中不同时期酒糟处理种子的发芽指数：
种子发芽指数是评价植物耐受毒性最方便可靠的腐熟度参数之一，通常植物能够忍耐的毒性水平为50％，当GI>80％时就可以基本判断腐熟度完成；如附图12所示：发酵结束后试验组Y酒糟处理的种子其GI达86.34％，对照组CK1酒糟处理的种子其GI达82.23％，酒糟均达到完全腐熟。对照组CK酒糟处理的种子其GI仅为30.46％，酒糟未腐熟；以上试验结果说明，接种本发明速腐菌剂能够明显加速酒糟腐熟进程，提高酒糟腐熟效率；
2.9腐熟结束后酒糟堆垛中扣囊复膜孢酵母Y-1的检测
酒糟发酵过程中，大量白色菌丝体生长；发酵结束后，每隔10米，分别于腐熟后的酒糟堆垛取表层酒糟、0.75米深处酒糟以及底层酒糟各500g，将酒糟样品充分混匀，检测其中扣囊复膜孢酵母Y-1浓度，检测结果表明腐熟后的酒糟中扣囊复膜孢酵母Y-1的浓度仍可达1.06×106cfu/g；
酒糟腐熟实验结果
本发明所述速腐菌剂是以真菌为主要组成的腐熟剂，发酵过程较以细菌为主的腐熟剂无氨臭味，不会造成脱氨失氮，肥效高；本发明速腐菌剂可使酒糟迅速升温，同时激活酒糟中原有的经长期驯化的耐高温菌种共同发挥作用，第二天(19h)即能达到80.3℃，进入高温期，第3d达最高温度89.8℃，接近90℃高温；发酵过程中80℃以上高温期维持13d，70℃以上中高温期维持21d，高温时间长，彻底杀死病原微生物以及虫卵，达到堆肥无害化标准；发酵至45天，酒糟质地松散，呈深褐色，含水率21.2％，pH 8.16，C/N为14.13，种子发芽指数为86.34％，说明本发明速腐菌剂可直接快速彻底腐熟酒糟；
本发明速腐菌剂功能腐熟菌不仅可将酒糟中的粗蛋白、粗淀粉、粗脂肪、粗纤维等难分解的大分子物质降解为可被植物直接吸收利用的小分子营养物质，同时代谢生成多种维生素、植物激素、活性酶等物质，在各种农作物及果蔬生长发育过程发挥着重要的促进和调节作用。
实施例7本发明酒糟生物有机肥的制备及应用
1.酒糟生物有机肥的制备
1.1制备方法：
将实施例6中腐熟完全的酒糟添加1‰生化黄腐酸钾混匀后用半湿物料粉碎机进一步粉碎、3-4mm滚筒筛，过筛后添加5％胶胨样类芽孢杆菌(菌活量：109cfu/g)、5％巨大芽孢杆菌菌粉(菌活量：1010cfu/g)以及5‰解淀粉芽孢杆菌菌粉(菌活量：1011cfu/g)，即得酒糟生物有机肥；
1.2本发明酒糟有机肥检测
根据NY 884《生物有机肥》检测标准和NY/T2321-2013《微生物肥料产品检验规程》对本发明酒糟生物有机肥进行检测，检测结果如下：
表6本发明酒糟生物有机肥技术指标
Figure BDA0001613431410000211
Figure BDA0001613431410000221
表7本发明酒糟生物有机肥5种重金属限量技术要求
检测项目 技术指标 实测值 单项判定
总砷(As)(以干基计) ≤15 3.41 符合
总镉(Cd)(以干基计) ≤3 0.11 符合
总铅(Pb)(以干基计) ≤50 8.87 符合
总铬(Cr)(以干基计) ≤150 6.90 符合
总汞(Hg)(以干基计) ≤2 0.46 符合
备注：单位mg/kg
本发明所述酒糟生物有机肥富含具有解磷、解钾功能的胶胨样类芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌同时富含具有生防功能的解淀粉芽孢杆菌菌粉及保藏菌种扣囊复膜孢酵母Y-1等，有效菌活达2.99亿/g，有机质达60.12％，pH 7.90，水分12.36％，未检出蛔虫卵死亡率和粪大肠菌群，重金属显著低于国家标准，因此本发明酒糟生物有机肥质量显著优于国家生物有机肥标准，既有肥效又有药效，不仅可促进果蔬生长又能防控病害，显著提高果蔬品质；
2.本发明酒糟生物有机肥对大荔冬枣的田间应用试验
2.1试验地点为：陕西渭南市大荔县木美土里冬枣试验冷棚
2.2试验树种：长势整齐的六年生大荔冬枣，每个处理2行，每行18棵，每个试验处理共36棵枣树；
2.3试验方法：
处理组I：施用本发明酒糟生物有机肥；
处理组II：施用市售生物有机肥；
处理组III：施用传统有机肥；
处理组IV：施用复合肥；
对照组CK：不施用任何肥料；
分五次施肥，除萌芽期追施尿素0.5kg/棵，果实膨大期追施磷酸二铵0.5kg和硫酸钾0.2kg外，秋施基肥、花期施肥、坐果期追肥等3个阶段均施用以上处理所述肥料3kg/棵，于树冠垂直投影处开圆形沟施肥，沟深约20-30cm。肥料与根系周围土壤混合均匀后填埋。其他管理同常规措施；
2.4不同处理对大荔冬枣果实品质的影响：
2.4.1不同处理对大荔冬枣果实外观品质及产量的影响：
在大荔冬枣果实脆熟期，随机选取10株，采摘枣果后称重，计算单株产量；随机选定冬枣果实300个，100个/组，观察果实外观性状后测定纵横经、果形指数、单果重等；其中利用游标卡尺测定果实纵横径；产量及单果重用电子天平测定；结果见表8：
表8不同施肥处理对大荔冬枣果实外观品质及产量的影响
Figure BDA0001613431410000231
注：同一列中不同小写字母表示差异达到显著水平(P<0.05)
由表8可知，施用本发明酒糟生物有机肥的冬枣纵径最大，其次为施用复合肥处理组，对照组CK冬枣纵径最小；施用本发明酒糟生物有机肥的冬枣横径显著大于施用其他肥料组及对照组CK冬枣横径；施用本发明酒糟生物有机肥的冬枣果形指数为1.07，其次为施用传统有机肥，其他三个处理果形指数差异不大；施用本发明酒糟生物有机肥的冬枣单果重最大，达30.80g/个；平均单果重最大，达25.12g/个，比处理组II、III、IV平均单果重分别高8.70％、8.32％、4.62％，比对照组CK提高8.79％；坏果率表现为施用本发明酒糟生物有机肥的冬枣坏果率显著低于其他处理组；施用本发明酒糟生物有机肥的冬枣单株产量最高，达10.69kg/株，比对照组CK提高17.34％；说明施用本发明酒糟生物有机肥能够显著提高大荔冬枣外观品质及产量。
2.4.2不同处理对大荔冬枣果实内在品质的影响：
果实品质测定，包括果实中Vc含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、有机酸含量、可溶性固形物含量等指标；采用2-6二氯酚靛酚法测定Vc含量，蒽酮法测定可溶性糖含量，考马斯亮蓝法测定可溶性蛋白含量，NaOH滴定法测定有机酸含量，手持测糖仪测定可溶性固形物含量，结果见表9:
表9不同施肥处理对大荔冬枣果实内在品质的影响
Figure BDA0001613431410000241
注：同一列中不同小写字母表示差异达到显著水平(P<0.05)
由表8可知，Vc含量表现为：施用本发明酒糟生物有机肥的冬枣较CK增加11.98％，与施用市售生物有机肥的冬枣Vc含量差异不大，但显著高于施用传统有机肥和复合肥的冬枣；可溶性糖含量表现为：对照组CK显著低于其他处理组，施用本发明酒糟生物有机肥的冬枣可溶性糖含量较CK增加23.07％，其次为处理组II、处理组IV、处理组III；施用本发明酒糟生物有机肥和复合肥的冬枣可溶性蛋白含量显著高于对照组CK，分别较对照组CK增加了16.55％和16.18％；可溶性固形物表现为：施用本发明酒糟生物有机肥和传统有机肥含量较高，分别较对照组CK增加了13.21％和13.16％；施用本发明酒糟生物有机肥的冬枣有机酸含量较对照组CK降低11.34％，施用传统有机肥的冬枣有机酸含量最高；以上结果表明施用本发明酒糟生物有机肥可显著提高大荔冬枣的Vc含量、可溶性蛋白含量、可溶性糖含量及可溶性固形物含量，显著降低有机酸含量，大大提升了冬枣的营养保健价值及口感，总体提升了冬枣的内在品质；
综上，施用本发明酒糟生物有机肥可显著提高大荔冬枣枣果大小、产量和品质；
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，上述各实施方式还可以做出组合和改进，也可施用于其他果蔬及农作物，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 陕西枫丹百丽生物科技有限公司
<120> 一株扣囊复膜孢酵母及其应用
<130> 2018
<141> 2018-03-30
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 655
<212> DNA
<213> 扣囊复膜孢酵母Y-1(Saccharomycopsis fibuligeraCGMCC No.15255)
<400> 1
tccgtaggtg aacctgcgga aggatcatta atgttatttg tttttagacc tgcgcttaac 60
tgcgcggttt aataaactct tatacacagt gtttttgttt gcgaatttgg tttagtttgt 120
tggttttcat tcgaaaggat gaagattgat tgctaaatct tattcagctt tttaaactca 180
gatctctttt taagagaaat gtattttttt aattacaact agtcgatttt acaaactaaa 240
agtttaaaac tttcagcaac ggatctcttg gttctcgcat cgatgaagaa cgcagcgaat 300
tgcgataagt aatgtgaatt gcagattttc gtgaatcatc gaatctttga acgcatattg 360
cgctctatag tattctatag agcatgcctg tttgagcgtc atttctctct taaacctttg 420
ggtttagtat tgaaggttgt gttagcttct gctaactcct ttgaaatgac ttggcaattg 480
attgagtttt ccatatattt gcttaaggat ttaatattag gttctaccaa cttattaaat 540
acccttttgc gaaggactta ctcgtgtatc aaggccttat aactttgtca ttaattttga 600
cctcaaatca ggtaaggata cccgctgaac ttaagcatat caataagcgg aggaa 655

Claims (7)

1.一株菌株，其特征在于，所述菌株为扣囊复膜孢酵母(Saccharomycopsisfibuligera)Y-1，保藏编号为CGMCC No.15255。
2.权利要求1所述菌株在酒糟腐熟中的应用。
3.权利要求1所述菌株的发酵方法，包括如下步骤：
菌种活化：用接种环挑取扣囊复膜孢酵母划线至PDA平板培养基，30℃培养48h；
一级种子液制备：用接种环挑取活化的扣囊复膜孢酵母接种于YPD液体培养基，30℃200rpm震荡培养24h，得一级种子液；
二级种子液制备：将一级种子液按接种量1％(v/v)再次接种至YPD液体培养基，30℃180rpm震荡培养36h，得二级种子液；
固态发酵：
拌料：按照固体发酵培养基A配方，先用500mL自来水将葡萄糖、蛋白胨、(NH4)2SO4、NaH2PO4、MgSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O、MnSO4·H2O、CaCl2·2H2O溶解，然后与其它原料混匀，最终料水比为1：0.8，分装至灭菌袋，于121℃灭菌45min，冷却至35℃，备用；
装盘、接种、发酵：
将灭菌后的固体发酵培养基A装入灭菌曲盘至1cm厚，按体积质量比10％的接种量接种二级种子液；底层用灭菌的报纸覆盖，上层用灭菌的麻包覆盖，移入曲房；于温度30℃、湿度65％培养60h；
所述固体发酵培养基A质量组成为：麸皮160g，玉米粉480g，豆粕320g，葡萄糖10g，(NH4)2SO4 9g,NaH2PO4 9g，蛋白胨10g，MgSO4·7H2O 2.4g，ZnSO4·7H2O 0.4g，MnSO4·H2O0.02g，CaCl2·2H2O 0.12g，料水比1：0.8。
4.一种扣囊复膜孢酵母菌剂，其特征在于，所述菌剂由权利要求1所述菌株制备。
5.根据权利要求4所述的扣囊复膜孢酵母菌剂，其特征在于，所述菌剂为固态发酵菌剂，菌活量达到7.8×1011cfu/g。
6.权利要求4或5所述扣囊复膜孢酵母菌剂的制备方法，包括如下步骤：
菌种活化：用接种环挑取扣囊复膜孢酵母划线至PDA平板培养基，30℃培养48h；
一级种子液制备：用接种环挑取活化的扣囊复膜孢酵母接种于YPD液体培养基，30℃200rpm震荡培养24h，得一级种子液；
二级种子液制备：将一级种子液按接种量1％(v/v)再次接种至YPD液体培养基，30℃180rpm震荡培养36h，得二级种子液；
固态发酵：
拌料：按照固体发酵培养基A配方，先用500mL自来水将葡萄糖、蛋白胨、(NH4)2SO4、NaH2PO4、MgSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O、MnSO4·H2O、CaCl2·2H2O溶解，然后与其它原料混匀，最终料水比为1：0.8，分装至灭菌袋，于121℃灭菌45min，冷却至35℃，备用；
装盘、接种、发酵：
将灭菌后的固体发酵培养基A装入灭菌曲盘至1cm厚，按体积质量比10％的接种量接种二级种子液；底层用灭菌的报纸覆盖，上层用灭菌的麻包覆盖，移入曲房；于温度30℃、湿度65％培养60h移至烘干房，于35℃晾干至水分低于5％后粉碎过40目筛即得所述菌剂；
所述固体发酵培养基A质量组成为：麸皮160g，玉米粉480g，豆粕320g，葡萄糖10g，(NH4)2SO4 9g,NaH2PO4 9g，蛋白胨10g，MgSO4·7H2O 2.4g，ZnSO4·7H2O 0.4g，MnSO4·H2O0.02g，CaCl2·2H2O 0.12g，料水比1：0.8。
7.权利要求4或5所述菌剂在酒糟腐熟中的应用。
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