CN105586261A - 一种低阶煤降解菌的筛选方法及应用 - Google Patents

一种低阶煤降解菌的筛选方法及应用 Download PDF

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吕福新
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Abstract

本发明涉及微生物筛选和低阶煤降解，具体公开了一种低阶煤降解菌的筛选方法及应用。具体为采集样品于培养基上培养，筛选产漆酶活性高的菌株，发酵后接入低阶煤培养基进行堆腐进行二次筛选，筛选到可降解低阶煤的菌株。本发明提供的筛选方法可以处理大量的采集样品，通过产漆酶酶活的筛选后快速缩小目标范围，节约了筛选时间，且通过低阶煤利用试验的筛选可提高筛选的准确性，减少科研与生产之间的差异，大大减少了工作量，是一种简单高效的筛选方法。

Description

一种低阶煤降解菌的筛选方法及应用
技术领域
本发明涉及微生物筛选和低阶煤降解，具体地说，涉及一种低阶煤降解菌的筛选方法及应用。
背景技术
低阶煤主要包括褐煤、风化煤、泥炭等，其特点是煤化程度低，水分和灰分含量高，热值低，含有较多的腐植酸。微生物转化研究是煤炭加工利用的新领域，在我国尤为重要。我国有丰富的煤炭资源，褐煤、风化煤及泥炭的储量和产量很大，尤其适用于煤炭的生物转化。
煤是由植物演变而来，其中含有大量类木质素类的物质结构，这也是某些微生物能降解煤的关键所在，利用这些微生物对木质素与芳香族类化合物强降解能力及其所释放的酶对类木质素结构的攻击转化，将对煤的组成结构及燃烧特性等多方面产生影响。煤化阶段较短的煤属于低阶煤，其灰份含量较高，热值较低，较难利用。而这类煤的变质程度越低，其中含有的类木质素结构就越多，就越可能被微生物及其酶作用而降解，因此褐煤、风化煤、泥炭、石煤等低阶煤都可能被微生物降解。
目前，常用的低阶煤微生物降解菌的筛选主要以固体表面溶煤、细胞外液溶煤及细胞液溶煤的方法来筛选，如CN103724060A公开一种褐煤生物肥及其生产方法。通过对新疆阜康市和沙湾煤矿区域煤样样品中进行低阶煤降解菌的筛选，获得具有较强液化活性的菌株，经过进一步筛选、驯化选育，获得两DavidiellatassianaCGMCCNo.7440和灰平链霉菌(Streptomycesgriseoplanus)CGMCCNo.8194。通过对所获菌株进行形态特征及相应序列测定分析，初步确定了其分类地位和属性，利用获得两种菌种降解低阶煤，以褐煤和秸秆等农业下脚料作为辅料，制备获得降解褐煤生产生物有机肥。CN101823907A公开了一种从风化煤中分离出具有降解风化煤使腐植酸含量增加的高活性菌株，以风化煤为底物进行降解发酵，利用菌种在风化煤中的代谢活动，使腐植酸活性增加，通过微生物菌种分离步骤、菌种培养步骤、发酵步骤、复混步骤和包装步骤，生产制成高活性腐植酸菌肥。而梁宏斌等认为目前在煤降解菌种的选取上未有实质性进展，还没有找到效果显著且适应性强的廉价菌种目前已报道的菌种对煤的降解能力十分有限，并且菌种在生长过程中需要加入大量营养物质，这使得煤生物转化成本提高，制约了煤的微生物转化工业化进程(低阶煤的降解方法，梁宏斌等，黑龙江科学，2011年第2卷第4期)。
因此，本发明旨在提供一种通过筛选产木质素酶的活性，从而快速筛选低阶煤降解菌的方法。
木质素酶包括木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶及漆酶。微生物新陈代谢过程中分泌的胞外酶能够降解煤，目前发现参与降解的酶主要有过氧化酶、氧化物酶、漆酶、水解酶和酯酶等。但也有研究报道认为：漆酶在微生物溶煤过程中不起关键作用(漆酶对微生物溶煤作用的研究，崔志芳等，煤炭转化，第30卷第2期2007年4月)。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种低阶煤降解菌的筛选方法及应用。
为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
一种低阶煤降解菌的筛选方法，采集样品于培养基上培养，筛选产漆酶活性高的菌株，然后在低阶煤培养基中堆腐，进行二次筛选，筛选到可降解低阶煤的菌株。
此外，本发明所述方法为了使筛选得到的微生物能够适于实际应用，在培养基一次筛选之后增加了在低阶煤中的二次筛选，从而保证了筛选得到的低阶煤降解菌在实际应用中能够充分发挥其降解作用，弥补了现有技术中筛选到的微生物不一定能在实际应用中发挥作用的不足。
进一步地，所述菌株为真菌菌株或细菌菌株。本领域技术人员可根据所筛选的微生物菌落形态区分真菌菌株和细菌菌株。
进一步地，当所述菌株为真菌时，具体包括如下步骤：
1)采集样品，制备样品悬液，并于含羧甲基纤维素钠平板培养基上培养，分离纯化真菌菌株；
2)将纯化后的真菌菌株含愈创木酚的PDA培养基中进行培养，筛选出产漆酶活性高的细菌菌株和真菌菌株；
其中，所述含愈创木酚的PDA培养基为含0.04％(w/w)愈创木酚的PDA培养基。
所述PDA培养基为本领域常规配方，可自行配制或市售可得，如可购自杭州微生物试剂有限公司。
3)将步骤2)筛选得到真菌菌株接种至PDA液体培养基进行发酵培养，发酵后接入低阶煤培养基堆腐，筛选降解效果较高的真菌菌株。
所述PDA液体培养基为本领域常规配方，可自行配制或市售可得，如可购自杭州微生物试剂有限公司。
进一步地，所述步骤1)具体为：采集样品，制备样品悬液，并于含羧甲基纤维素钠平板培养基上28℃倒置培养72h，挑取不同形态的、生长良好的真菌单菌落反复划线，纯化分离真菌菌株。在该培养条件下能够更好的利于真菌培养。
所述含羧甲基纤维素钠平板培养基的配方为：CMC-Na15g，(NH4)2SO42g，MgSO40.03g，KH2PO41g，乳酸50g，水1L。
进一步地，所述步骤2)中的筛选方法具体为：将纯化后的真菌菌株接入含愈创木酚的PDA培养基中，根据菌落圈与变色圈的直径，计算变色系数(变色圈半径/菌落圈半径)，筛选出产漆酶活性高的真菌菌株；即变色系数大于1.2的真菌菌株。
所述步骤3)中的筛选方法具体为：堆腐7d后，取表面有明显微生物生长痕迹的低阶煤，溶解于0.1mol/LNaOH，过滤后烘干称滤渣重量，以未堆腐低阶煤为对照，根据低阶煤固体损失量筛选出可降解低阶煤的菌株。
举例说明，溶解腐殖酸的方法可为：取1-5g堆腐完成后混合均匀的低阶煤，加入0.1mol/LNaOH100-500ml，搅拌均匀后，使低阶煤中腐殖酸溶解。
进一步地，当所述菌株为细菌时，具体包括如下步骤：
1)采集样品，制备样品悬液，并于含羧甲基纤维素钠平板培养基上培养，分离纯化细菌菌株；
2)将纯化后的细菌菌株接入LB培养基中进行培养，筛选出产漆酶活性高的细菌菌株；
所述LB培养基为本领域常规配方，可自行配制或市售可得，如可购自杭州微生物试剂有限公司。
3)将步骤2)筛选得到的细菌菌株接种至NA液体培养基进行发酵培养，发酵后接入低阶煤培养基堆腐，筛选降解效果较高的菌株。
所述NA液体培养基为本领域常规配方，可自行配制或市售可得，如可购自杭州微生物试剂有限公司。
进一步地，所述步骤1)具体为：采集样品，制备样品悬液，并于含羧甲基纤维素钠平板培养基上35℃倒置培养48h，挑取不同形态的、生长良好的细菌单菌落反复划线，纯化分离真菌菌株。
所述含羧甲基纤维素钠平板培养基的配方为：CMC-Na15g，(NH4)2SO42g，MgSO40.03g，KH2PO41g，水1L。
进一步地，所述步骤2)中的筛选方法具体为：将纯化后的细菌菌株接入到LB培养基中，35℃恒温培养48h，将漆酶检测液滴于菌落周围，筛选可使检测液变色的菌株，筛选出产漆酶活性高的细菌菌株。
所述漆酶检测液为0.25g愈创木酚溶于15ml95％乙醇，或按此比例制备的漆酶检测液。
所述步骤3)中的筛选方法同真菌菌株步骤3)中的筛选方法。
进一步地，前述低阶煤培养基的配方为：低阶煤10-100份，无机氮源1-10份，磷酸二氢钾0.01-1份，水10-100份；所用低阶煤为泥炭、褐煤、风化煤中的一种或几种；所用无机氮源为硫酸铵、磷酸一铵、氯化铵、硝酸铵、硝酸钙、硝酸钠、硝酸钾等中的一种或几种。
进一步地，所述样品选自土壤样品、腐木样品、水样品、低阶煤等样品中的一种或几种。
作为优选，所述样品为腐木样品、低阶煤等样品中的一种或几种。
本发明的有益效果在于：
本发明提供的筛选方法可以处理大量的采集样品，通过产漆酶酶活的筛选后快速缩小目标范围，节约了筛选时间，且通过低阶煤利用试验的筛选可提高筛选的准确性，减少科研与生产之间的差异，大大减少了工作量，是一种简单高效的筛选方法。
附图说明
图1、图2为菌株在草炭中生长情况图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1真菌菌株的筛选
1)取草炭10g，加入到装有90ml无菌水和少量玻璃珠的三角瓶中，充分摇动30min，使得样品与无菌水混和均匀，制得样品悬液。
2)在无菌条件下吸取1ml的样品悬液加入到装有9ml无菌水的试管中，振荡均匀，制得10-2样品稀释液，并依次稀释制得10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的稀释液。
3)分别取10-4、10-5、10-6、10-7浓度梯度的各样品稀释液0.1ml涂布至相应制备好CMC-Na培养基平板上，28℃倒置培养72h。根据菌落形态特征挑取形状差异比较明显的菌落5株分别划线纯化，编号为CTF-1、CTF-2、CTF-3、CTF-4、CTF-5。
4)将各纯化菌株点接到含0.04％愈创木酚PDA培养基上，28℃倒置培养72h，测定各菌株变色系数。
表1各菌株在愈创木酚平板上的生长及显色反应
菌株编号 CTF-1 CTF-2 CTF-3 CTF-4 CTF-5
菌落圈直径d1/cm 1.25 2.36 1.59 0.76 0.97
变色圈直径d2/cm 1.58 2.44 1.71 0.89 1.22
变色系数 0.79 0.97 0.93 0.85 0.80
5)将漆酶活性高CTF-1、CTF-4、CTF-5于PDA液体培养基中，28℃、120r/min发酵培养72h，发酵后6000r/min离心，取菌体，拌入含10gNH4Cl的200g草炭中，草炭水分含量控制在50％，拌匀后放入500ml烧杯，于28℃恒温培养7d。
6)各堆腐处理分别取1g混合均匀的草炭，加入100ml0.1mol/LNaOH中，搅拌均匀，过滤烘干后称滤渣重量，以未堆腐草炭为对照，根据草炭固体损失量筛选出可降解低阶煤的菌株。
表2各处理过滤后滤渣重量
菌株编号 CTF-1 CTF-4 CTF-5 CK
滤渣重量/g 0.69 0.76 0.72 0.81
实施例2细菌菌株的筛选
1)取草炭10g，加入到装有90ml无菌水和少量玻璃珠的三角瓶中，充分摇动30min，使得样品与无菌水混和均匀，制得样品悬液。
2)在无菌条件下吸取1ml的样品悬液加入到装有9ml无菌水的试管中，振荡均匀，制得10-2样品稀释液，并依次稀释制得10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的稀释液。
3)分别取10-4、10-5、10-6、10-7浓度梯度的各样品稀释液0.1ml涂布至相应制备好的CMC-Na培养基平板上，35℃倒置培养48h。得到细菌菌株3株，划线纯化，编号为CTB-1、CTB-2、CTB-3。
4)将CTB-1、CTB-2、CTB-3分别点接到LB培养基上，35℃倒置培养48h，将漆酶检测液滴于菌落周围，检验变色反应。
表3菌株变色反应
菌株编号 CTB-1 CTB-2 CTB-3
变色反应 + - -
5)将CTB-1于LB液体培养基中，35℃、120r/min发酵培养48h，发酵后6000r/min离心，取菌体，拌入含10gNH4Cl的200g草炭中，草炭水分含量控制在50％，拌匀后放入500ml烧杯，于35℃恒温培养7d。
6)取1g混合均匀的堆腐草炭，加入100ml0.1mol/LNaOH中，搅拌均匀，过滤烘干后称滤渣重量，以未堆腐草炭为对照，根据草炭固体损失量筛选出可降解低阶煤的菌株。
菌株编号 CTB-1 CK
滤渣重量/g 0.75 0.82
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种低阶煤降解菌的筛选方法，其特征在于，采集样品于培养基上培养，筛选产漆酶活性高的菌株，发酵后接入低阶煤培养基进行堆腐进行二次筛选，筛选到可降解低阶煤的菌株。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述菌株为真菌菌株或细菌菌株。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，当所述菌株为真菌时，具体包括如下步骤：
1)采集样品，制备样品悬液，并于含羧甲基纤维素钠平板培养基上培养，分离纯化真菌菌株；
2)将纯化后的真菌菌株含愈创木酚的PDA培养基中进行培养，筛选出产漆酶活性高的细菌菌株和真菌菌株；
3)将步骤2)筛选得到真菌菌株接种至PDA液体培养基进行发酵培养，发酵后接入低阶煤培养基堆腐，筛选降解效果较高的真菌菌株。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤1)具体为：采集样品，制备样品悬液，并于含羧甲基纤维素钠平板培养基上28℃倒置培养72h，挑取不同形态的、生长良好的真菌单菌落反复划线，纯化分离真菌菌株。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中的筛选方法具体为：将纯化后的真菌菌株接入含愈创木酚的PDA培养基中，根据菌落圈与变色圈的直径，计算变色系数(变色圈半径/菌落圈半径)，筛选出产漆酶活性高的真菌菌株；
所述步骤3)中的筛选方法具体为：堆腐7d后，取表面有明显微生物生长痕迹的低阶煤，溶解于0.1mol/LNaOH，过滤后烘干称滤渣重量，以未堆腐低阶煤为对照，根据低阶煤固体损失量筛选出可降解低阶煤的菌株。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，当所述菌株为细菌时，具体包括如下步骤：
1)采集样品，制备样品悬液，并于含羧甲基纤维素钠平板培养基上培养，分离纯化细菌菌株；
2)将纯化后的细菌菌株接入LB培养基中进行培养，筛选出产漆酶活性高的细菌菌株；
3)将步骤2)筛选得到的细菌菌株接种至NA液体培养基进行发酵培养，发酵后接入低阶煤培养基堆腐，筛选降解效果较高的菌株。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤1)具体为：采集样品，制备样品悬液，并于含羧甲基纤维素钠平板培养基上35℃倒置培养48h，挑取不同形态的、生长良好的细菌单菌落反复划线，纯化分离真菌菌株。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中的筛选方法具体为：将纯化后的细菌菌株接入到LB培养基中，35℃恒温培养48h，将漆酶检测液滴于菌落周围，筛选可使检测液变色的菌株，筛选出产漆酶活性高的细菌菌株。
9.根据权利要求1-8任意一项所述的方法，其特征在于，所述低阶煤培养基的配方为：低阶煤10-100份，无机氮源1-10份，磷酸二氢钾0.01-1份，水10-100份；所用低阶煤为泥炭、褐煤、风化煤中的一种或几种；所用无机氮源为硫酸铵、磷酸一铵、氯化铵、硝酸铵、硝酸钙、硝酸钠、硝酸钾等中的一种或几种。
10.根据权利要求1-8任意一项所述的方法，其特征在于，所述样品选自土壤样品、腐木样品、水样品、低阶煤等样品中的一种或几种。
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