CN108250260A

CN108250260A - 16α-[18F]氟-17β-雌二醇的自动化合成方法

Info

Publication number: CN108250260A
Application number: CN201810178806.8A
Authority: CN
Inventors: 唐刚华; 刘少玉; 汤睿昆
Original assignee: GUANGZHOU HTA ISOTOPE MEDICAL CO Ltd
Current assignee: GUANGZHOU HTA ISOTOPE MEDICAL CO Ltd
Priority date: 2018-03-05
Filing date: 2018-03-05
Publication date: 2018-07-06
Anticipated expiration: 2038-03-05
Also published as: CN108250260B

Abstract

本发明提供了一种16α‑[¹⁸F]氟‑17β‑雌二醇（¹⁸F‑FES）的自动化合成方法，包括在自动化合成模块的同一反应瓶中进行的前体3‑O‑(甲氧甲基)‑16,17‑O‑磺酰基‑16‑表雌二醇（MMSE）的[¹⁸F]亲核氟化反应、不经过分离的[¹⁸F]氟化中间体与含醇酸性溶液发生水解反应、以及通过固相柱代替制备液相分离纯化后得到产品¹⁸F‑FES。该自动化合成方法，采用常规的FDG合成模块即可实现16α‑[¹⁸F]氟‑17β‑雌二醇的自动化生产，总合成时间短，放射化学产率高。

Description

16α-[18F]氟-17β-雌二醇的自动化合成方法

技术领域

本发明涉及制备雌激素受体PET显像剂的技术领域，尤其是涉及16α-[¹⁸F]氟-17β-雌二醇的自动化合成方法。

背景技术

乳腺癌是女性中最常见的侵袭性癌症，在世界范围内，现已成为仅次于肺癌的女性癌症死亡第二大原因。在临床实践中，体外检测雌激素受体（Estrogen Receptor，ER）通常用于预测肿瘤对激素治疗和病人预后的反应，而正电子发射断层扫描(PET)作为一种无创性检测手段能够提供病变区域相关的功能性成像信息。

作为ER受体PET显像剂的一种，16α-[¹⁸F]氟-17β-雌二醇（简称为¹⁸F-FES）能够选择性的与ER高亲和力地结合，因此¹⁸F-FES PET可反映乳腺癌组织中ER表达水平、分布、密度变化及活动状态等生理功能信息，这些信息对于乳腺癌治疗方案的选择及预后评估等具有非常重要的意义。

现有的¹⁸F-FES合成方法中，最终产品通常使用制备液相或者多次固相萃取进行分离纯化，其步骤复杂耗时，不利于实现自动化，阻碍了¹⁸F-FES的临床推广和使用。

因此，很有必要开发一种高效且广泛适用的¹⁸F-FES自动化合成方法，以满足¹⁸F-FES在乳腺癌诊疗领域日益增长的需求量。

发明内容

为了解决现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种“一锅两步”式的16α-[¹⁸F]氟-17β-雌二醇的自动化合成方法，通过在同一反应瓶中进行前体3-O-(甲氧甲基)-16,17-O-磺酰基-16-表雌二醇（MMSE）的亲核氟化反应和[¹⁸F]氟化中间体的酸性水解反应，随后通过简单的单次固相萃取后得到最终产品。该合成过程快速高效，转化率高，副产物少。

为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

16α-[¹⁸F]氟-17β-雌二醇的自动化合成方法，包括在自动化合成模块的同一反应瓶中进行的前体3-O-(甲氧甲基)-16,17-O-磺酰基-16-表雌二醇的[¹⁸F]亲核氟化反应，不经过分离的[¹⁸F]氟化中间体与含醇酸性溶液发生水解反应，以及通过固相柱分离纯化得到产品16α-[¹⁸F]氟-17β-雌二醇。

进一步地，该16α-[¹⁸F]氟-17β-雌二醇的自动化合成方法具体包括以下步骤：

（1）通过阴离子交换柱捕获加速器传来的¹⁸F^-离子；

（2）使用K_2.2.2/K₂CO₃溶液将将¹⁸F^-离子洗脱至反应瓶；

（3）将反应瓶加热至90-100℃，在氮气流的真空条件下蒸干溶剂，得到无水K_2.2.2/K¹⁸F复合物；

（4）采用氮气保护，将前体3-O-(甲氧甲基)-16,17-O-磺酰基-16-表雌二醇的乙腈溶液转移至反应瓶中，在密闭条件下加热至110-120℃，进行氟化反应；

（5）待氟化反应结束后，将反应瓶降温至60-70℃，将稀硫酸甲醇溶液转移至反应瓶中，在密闭条件下加热至110-120℃，进行水解反应；

（6）待水解反应结束后，将稀释后的反应液进行小柱固相萃取，得到纯化的16α-[¹⁸F]氟-17β-雌二醇产物。

前体化合物MMSE为3-O-(甲氧甲基)-16,17-O-磺酰基-16-表雌二醇的简称，K_2.2.2为氨基聚醚Kryptofix 2.2.2的简称，均为市售产品。

进一步地，所述氟化反应的加热时间为10-15min，所述水解反应的加热时间为20-25min。

进一步地，所述氟化反应的加热时间为10min，所述水解反应的加热时间为20min。

进一步地，所述固相萃取为单次采用C18柱和SCX柱进行萃取；在采用C18柱进行萃取时，分别采用水和乙醇进行洗脱。

进一步地，在所述氟化反应中，前体MMSE与无水K_2.2.2/K¹⁸F复合物的质量比为1:8~1:10。

进一步地，所述K_2.2.2/K₂CO₃溶液为0.1mL的3.0 mg K₂CO₃水溶液，与0.9 mL 的15mg K_2.2.2乙腈溶液的混合溶液。

进一步地，所述稀硫酸甲醇溶液中，2M稀硫酸溶液与甲醇的体积比为1:3~1:6。

进一步地，所述稀硫酸甲醇溶液为将0.1 mL 的2M H₂SO₄溶解在0.3 mL的甲醇中得到的混合溶液。

进一步地，所述自动化合成方法的总放射合成时间为45min，衰变校正后放射化学产率45±4%，放射化学纯度大于98%。

在前体化合物MMSE的[¹⁸F]氟化反应过程中，[¹⁸F]氟化中间体的标记率与前体的质量呈正相关，但随着前体用量的增加，比活度也随之降低。故在该合成方法中，经过优化，采用了前体MMSE与无水K_2.2.2/K¹⁸F复合物的质量比为1:8~1:10，在该条件下氟化反应得到的[¹⁸F]氟化中间体标记率为65±5%。

现有的¹⁸F-FES的合成方法中，在氟化反应后需要将反应液转移到硅胶柱中，通过淋洗得到中间体，还需要除去溶剂再进行水解反应。水解反应一般采用加入盐酸的乙腈溶液，在反应完成后再进行中和，之后进行固相萃取得到产品。氟化反应后水解反应前的处理过程繁琐复杂。

同时，在这些的经典的¹⁸F-FES合成方法中，这些方法所涉及的¹⁸F-FES 分离纯化和放化纯度检测，均采用等度洗脱HPLC法。有些方法采用两步反应结合小柱分离纯化法制备了¹⁸F-FES，但仍用等梯度HPLC分析法检测¹⁸F-FES。

研究人员曾尝试采用梯度HPLC分析法，虽能分离¹⁸F标记中间体和¹⁸F-FES，但两者保留时间相近，且不能分离最终水解非放射性产物和¹⁸F-FES。等梯度HPLC法不能分离¹⁸F标记中间体、¹⁸F-FES和最终水解非放射性产物。因此，现有的等梯度HPLC分离纯化¹⁸F-FES，不能有效分离¹⁸F标记中间体、¹⁸F-FES和最终水解非放射性产物。

经典的¹⁸F-FES合成方法采用多次蒸干盐酸水解法不能完全水解[¹⁸F]氟化中间体，因而必须采用HPLC分离纯化。而本发明采用的水解法却能完全水解[¹⁸F]氟化中间体，因而可用小柱分离纯化法制备¹⁸F-FES。

本发明使用C18小柱捕集¹⁸F-FES，并用大量水洗涤小柱，可有效除去K_2.2.2和杂质，按药典方法检测K_2.2.2和残余有机溶剂以及进行异常毒性实验，其检测结果符合药典要求。其制备过程省去了多次蒸干盐酸水解和使用制备液相或者多次固相萃取进行分离纯化的步骤，具有省时高效的优点。

本发明通过在同一反应瓶中进行氟化反应和水解反应。在氟化反应结束后的水解反应过程中，研究人员发现，加入一定体积的甲醇后，不仅可以提高水解反应转化率，还可以有效减少水解反应过程中副产物生成。用稀硫酸甲醇溶液的水解反应，可以完全水解[¹⁸F]氟化中间体，进而才可以通过简单的固相萃取方法纯化得到高放射化学纯度的产品。而其他反应条件不能完全水解，故需要制备液相进行纯化。

通过使用0.1 mL 的2M H₂SO₄与0.3 mL的甲醇组成的稀硫酸甲醇溶液，对[¹⁸F]氟化中间体进行酸性水解，其水解反应转化率高、副产物少，从而利于采用简单的固相萃取方法对产品进行纯化，避免了使用复杂的制备液相系统，可以大幅度的缩短了放化合成时间，简化了放化合成步骤。

采用本发明的¹⁸F-FES的全自动合成方法，¹⁸F-FES的总放射合成时间为45min，衰变校正后放射化学产率45±4% (n＝10)，放射化学纯度大于98%。

基于上述的技术方案，本发明取得的技术效果为：

（1）本发明提供的16α-[¹⁸F]氟-17β-雌二醇的自动化合成方法，所有的反应均在同一反应瓶中进行，尤其是[¹⁸F]氟化中间体无需分离直接在含醇弱酸性条件下进行水解反应，而且省去了使用制备液相或多次固相萃取的分离纯化步骤。这种“一锅两步”式的合成方法自动化程度高、方法更简单。

（2）本发明的16α-[¹⁸F]氟-17β-雌二醇的自动化合成方法，无需昂贵复杂的多功能合成模块，采用常规的FDG合成模块即可实现16α-[¹⁸F]氟-17β-雌二醇的自动化生产，且总合成时间短，放射化学产率高。

（3）本发明在水解反应中，采用0.1 mL 的2M H₂SO₄与0.3 mL的甲醇组成的稀硫酸甲醇溶液，对[¹⁸F]氟化中间体进行酸性水解，其水解反应转化率高、副产物少，从而利于采用简单的固相萃取方法对产品进行纯化。

附图说明

图1为本发明的¹⁸F-FES的合成路线图。

图2为本发明的¹⁸F-FES的自动化合成模块流程图。

图3为本发明的¹⁸F-FES的注射液与标准品FES的混合样品的HPLC色谱图。

图4为本发明的¹⁸F-FES粗品的HPLC色谱图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将结合具体的实施例对本发明进行更全面的描述。本发明给出了的较佳实施方式。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式。相反地，提供这些实施方式的目的是使对本发明的公开内容理解的更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是旨在于限制本发明。

实施例1

16α-[¹⁸F]氟-17β-雌二醇的自动化合成

为了简化描述，以下16α-[¹⁸F]氟-17β-雌二醇简称为¹⁸F-FES。

1.1 试剂与材料

试剂：

氨基聚醚Kryptofix 2.2.2（简称K_2.2.2），

前体3-O-(甲氧甲基)-16,17-O-磺酰基-16-表雌二醇（简称MMSE）

标准品16α-氟-17β-雌二醇，

以上三种试剂购自德国ABX公司；

无水乙腈（MeCN），碳酸钾（K₂CO₃），三氟乙酸（TEA）

以上三种试剂购自美国Sigma-Aldrich 公司；

其余试剂均为分析纯试剂，未经特别指出，均未进一步纯化。

仪器：

IBA CYCLONE 10/5 回旋加速器，比利时IBA公司；

Sunvic [¹⁸F]FDG自动化合成模块，北京善为正子医药技术有限公司。

Sep-Pak light QMA 小柱，Sep-Pak plus C18 小柱，SCX小柱，购自美国Waters公司；

Sep-Pak light QMA 小柱依次用NaHCO₃的8.4%水溶液和水进行冲洗预处理；Sep-Pakplus C18 小柱依次用乙醇和水冲洗预处理。

1.2 合成¹⁸F-FES

图1给出了本实施例的¹⁸F-FES的合成路线，图2给出了本实施例的¹⁸F-FES的自动化合成模块流程图，结合参考图1和图2，本实施例的¹⁸F-FES采用“一锅两步”式的方法自动化合成得到，包括前体MMSE的[¹⁸F]氟化反应，以及[¹⁸F]中间体的酸性水解反应。

具体包括如下步骤：

（1）IBA CYCLONE 10/5 回旋加速器通过¹⁸O(p, n)¹⁸F核反应生产得到¹⁸F^-离子，由加速器传送过来的¹⁸F^-离子被捕获至Sep-Pak light QMA 小柱，[¹⁸O]水被回收至回收瓶。

（2）使用1号瓶中的1.0mL的K_2.2.2/K₂CO₃溶液将Sep-Pak light QMA 小柱的¹⁸F^-离子洗脱至反应瓶；

其中， K_2.2.2/K₂CO₃溶液为0.1mL的3.0 mg K₂CO₃水溶液，与0.9 mL 的15 mg K_2.2.2乙腈溶液的混合溶液。

（3）将反应瓶加热至95℃，并通入80 mL/min的氮气流，于真空条件下蒸干溶剂，得到无水K_2.2.2/K¹⁸F复合物。

（4）采用氮气保护，将2号瓶中的1.0mL前体MMSE的乙腈溶液转移至反应瓶中，在密闭条件下加热至110℃，进行氟化反应10min。

（5）待氟化反应结束后，将反应瓶降温至65℃，将0.4mL稀硫酸甲醇溶液转移至反应瓶中，在密闭条件下加热至110℃，进行水解反应20min；

其中，稀硫酸甲醇溶液将0.1 mL 的2M H₂SO₄溶解在0.3 mL的甲醇中得到的混合溶液。

（6）待水解反应结束后，将4号瓶中的10mL的水加入反应瓶中，将稀释后的反应液过Sep-Pak plus C18 小柱后进入废液瓶。

（7）采用氮气保护，将5号瓶中的20mL的水加入反应瓶中，洗脱Sep-Pak plus C18小柱后进入废液瓶。

（8）将6号瓶中的2.0mL的乙醇对Sep-Pak plus C18 小柱进行洗脱，并过SCX小柱与0.22μm的无菌滤膜，最后进入已预先装有20 mL 的0.01%抗坏血酸水溶液的产品瓶中，得到¹⁸F-FES注射液。

实施例2

¹⁸F-FES注射液的质量控制

1.1 色谱检测

使用HPLC对¹⁸F-FES注射液的化学纯度和放射化学纯度进行检测，并通过最终产品与标准品共进样的方式鉴定¹⁸F-FES。

仪器：安捷伦1200分析型高效液相色谱仪，分别配备Agilent interface 35900E的紫外检测器和Bioscan放射性检测器；

色谱柱：Agilent ZORBAX SB C18；

检测波长：280nm；

梯度流动相条件：

0-8 min，乙腈/水（2/98，v/v，0.1% TFA）；

8-20 min，乙腈/水（10/90，v/v，0.1% TFA）；

20-28 min，乙腈/水（20/80，v/v， 0.1% TFA）；

流速：1 mL·min⁻¹

1.2 理化测试

目测产品溶液的澄清度和颜色；并使用精密pH试纸测定¹⁸F-FES注射液的pH值。

1.3 稳定性测试

通过分析型HPLC测定¹⁸F-FES注射液6 h内的放射化学纯度，检验其稳定性。

1.4 无菌检查、细菌内毒素检查和异常毒性检查

按《中华人民共和国药典》（2015年版）所述方法执行。

1.5 质量控制结果

图3为本实施例的¹⁸F-FES的注射液与标准品FES的混合样品的HPLC色谱图，如图3所示，产品¹⁸F-FES的保留时间为16.2 min，标准品FES的保留时间为15.7 min，保留时间差别为两种检测器之间的距离。保留时间符合标准。

经过检测分析，¹⁸F-FES注射液的放射化学纯度大于98%，而且¹⁸F-FES注射液室温下稳定性良好，6小时内¹⁸F-FES的放射化学纯度无明显下降（＞95 %）。

无菌实验结果和细菌内毒素实验均为阴性；异常毒性实验结果正常，所有实验动物无死亡现象发生，各组织器官正常。

此外，¹⁸F-FES注射液的K_2.2.2和溶剂残留量符合国家药典要求，可直接用于临床研究与使用，详见表1的¹⁸F-FES注射液的质量控制结果。

表1 ¹⁸F-FES注射液的质量控制结果

检测项目	方法	结果
			外观	目测法	无色透明
pH值	pH 试纸	5～6
			放射化学纯度	液相色谱	>98%
甲醇含量^*	气相色谱	<0.01%
			乙腈含量^*	气相色谱	<0.02%
K_2.2.2含量	薄层色谱	<50 µg/mL

* 《中华人民共和国药典》（2015年版）四部通则 0861 残留溶剂测定法

实施例 3

几种主要的¹⁸F-FES放射合成方法的研究对比

经过研究对比发现，在实施例提供的¹⁸F-FES方法中，通过采用快速高效的“一锅两步”式的自动化合成¹⁸F-FES的方法，将总放射合成时间缩短至45min，提高了生产效率，而且衰变校正后放射化学产率45±4% (n＝10)，放射化学纯度大于98%。具体对比结果详见表2的几种主要的¹⁸F-FES放射合成方法比较。

合成方法1~合成方法3的数据来源于以下文献：

合成方法1：Mori T, Kasamatsu S, Mosdzianowski C, Welch MJ, Yonekura Y, andFujibayashi Y. Automatic synthesis of 16α-[¹⁸F]fluoro-17β-estradiol using acassette-type [¹⁸F]fluoro- deoxyglucose synthesizer[J]. Nuclear Medicine andBiology 2006;33:281-6.

合成方法2：Oh S J, Chi D Y, Mosdzianowski C, et al. The automaticproduction of 16alpha-[¹⁸F]fluoroestradiol using a conventional [¹⁸F]FDGmodule with a disposable cassette system[J]. Applied Radiation & Isotopes,2007, 65(6):676-81.

合成方法3：王明伟, 张勇平, 章英剑,等. 乳腺癌雌激素受体分子影像探针16-[¹⁸F]氟-17β-雌二醇的自动化合成[J]. 核技术, 2009, 32(11):839-844.

表2 几种主要的¹⁸F-FES放射合成方法比较

项目	合成方法1	合成方法2	合成方法3	实施例1
					合成模块	Tracerlab MX_FDG	TracerLab MX_FDG	Explora FDG₄	Sunvic FDG
水解方式	单次水解	多次水解	单次水解	单次水解
					纯化方式	液相纯化	液相纯化	两次固相纯化	单次固相纯化
放化收率¹	42.4±3.2%	45.3±2.8%	35%	45%±4%
					放化纯度	99%	98.7±0.8%	95%	98%
比活度²	111	57.7±3.8	-	41.2±2.6
					合成时间	88.2±6.4min	75.8±5.2 min.	70 min	45 min

1 校正后的放射化学收率

2 单位为GBq/μmol

由表2可以得知，在该实施例提供的¹⁸F-FES方法中，通过采用快速高效的“一锅两步”式的自动化合成¹⁸F-FES的方法，将总放射合成时间缩短至45min，提高了生产效率，而且衰变校正后放射化学产率45±4% (n＝10)，放射化学纯度大于98%。

研究发现，在前体化合物MMSE的[¹⁸F]氟化反应过程中，[¹⁸F]氟化中间体的标记率与前体的质量呈正相关，但随着前体用量的增加，比活度会随之降低。本实施例中，为保证良好比活度的前提下，通过使用质量为2 mg的前体MMSE密封加热110℃反应10 min，该氟化反应条件得到的标记率为65±5%。

在随后的水解反应过程中，通过加入一定体积的甲醇后，不仅可以提高水解反应转化率，还可以有效减少水解反应过程中副产物生成。

在反应条件的考察中，使用HPLC对水解过程进行了监测。HPLC分析结果表明[¹⁸F]，氟化中间体在2M稀硫酸甲醇溶液中加热至110℃反应20 min后，水解反应基本结束，如图4¹⁸F-FES粗品的HPLC色谱图所示。

水解反应结束后，粗产品经串联固相柱纯化（Al₂O₃柱与C18柱）得到¹⁸F-FES。[¹⁸F]氟化中间体水解对于¹⁸F-FES纯化方式的选择起着决定性作用。

本实施例提供的¹⁸F-FES方法，水解反应转化率高、副产物少，利于采用简单的固相萃取方法对产品进行纯化，从而避免了使用复杂的制备液相系统，进而可以大幅度的缩短了放化合成时间，简化了放化合成步骤。

以上内容仅仅为本发明的结构所作的举例和说明，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些显而易见的替换形式均属于本发明的保护范围。

Claims

1.16α-[¹⁸F]氟-17β-雌二醇的自动化合成方法，其特征在于，包括在自动化合成模块的同一反应瓶中进行的前体3-O-(甲氧甲基)-16,17-O-磺酰基-16-表雌二醇的[¹⁸F]亲核氟化反应，不经过分离的[¹⁸F]氟化中间体与含醇酸性溶液发生水解反应，以及通过固相柱分离纯化得到产品。

2.根据权利要求1所述的16α-[¹⁸F]氟-17β-雌二醇的自动化合成方法，其特征在于，该方法具体包括以下步骤：

（1）通过阴离子交换柱捕获加速器传来的¹⁸F^-离子；

（2）使用K_2.2.2/K₂CO₃溶液将将¹⁸F^-离子洗脱至反应瓶；

3.根据权利要求2所述的16α-[¹⁸F]氟-17β-雌二醇的自动化合成方法，其特征在于，所述氟化反应的加热时间为10-15min，所述水解反应的加热时间为20-25min。

4.根据权利要求3所述的16α-[¹⁸F]氟-17β-雌二醇的自动化合成方法，其特征在于，所述氟化反应的加热时间为10min，所述水解反应的加热时间为20min。

5.根据权利要求4所述的16α-[¹⁸F]氟-17β-雌二醇的自动化合成方法，其特征在于，所述固相萃取为单次采用C18柱和SCX柱进行萃取；在采用C18柱进行萃取时，分别采用水和乙醇进行洗脱。

6.根据权利要求5所述的16α-[¹⁸F]氟-17β-雌二醇的自动化合成方法，其特征在于，在所述氟化反应中，前体3-O-(甲氧甲基)-16,17-O-磺酰基-16-表雌二醇与无水K_2.2.2/K¹⁸F复合物的质量比为1:8~1:10。

7.根据权利要求6所述的16α-[¹⁸F]氟-17β-雌二醇的自动化合成方法，其特征在于，所述K_2.2.2/K₂CO₃溶液为0.1mL的3.0 mg K₂CO₃水溶液，与0.9 mL 的15 mg K_2.2.2乙腈溶液的混合溶液。

8.根据权利要求2所述的16α-[¹⁸F]氟-17β-雌二醇的自动化合成方法，其特征在于，所述稀硫酸甲醇溶液中，2M稀硫酸溶液与甲醇的体积比为1:3~1:6。

9.根据权利要求8所述的16α-[¹⁸F]氟-17β-雌二醇的自动化合成方法，其特征在于，所述稀硫酸甲醇溶液为将0.1 mL 的2M H₂SO₄溶解在0.3 mL的甲醇中得到的混合溶液。

10.根据权利要求1或2任一所述的16α-[¹⁸F]氟-17β-雌二醇的自动化合成方法，其特征在于，所述自动化合成方法的总放射合成时间为45min。