CN108226251B - 一种可抛式双酚a适配体生物传感器的制备方法 - Google Patents
一种可抛式双酚a适配体生物传感器的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108226251B CN108226251B CN201810044511.1A CN201810044511A CN108226251B CN 108226251 B CN108226251 B CN 108226251B CN 201810044511 A CN201810044511 A CN 201810044511A CN 108226251 B CN108226251 B CN 108226251B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- bisphenol
- electrode
- aptamer
- pet film
- area
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- IISBACLAFKSPIT-UHFFFAOYSA-N bisphenol A Chemical compound C=1C=C(O)C=CC=1C(C)(C)C1=CC=C(O)C=C1 IISBACLAFKSPIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 150
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 title claims abstract description 64
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 229920002799 BoPET Polymers 0.000 claims abstract description 41
- 238000004544 sputter deposition Methods 0.000 claims abstract description 28
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims abstract description 26
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims abstract description 26
- 239000002390 adhesive tape Substances 0.000 claims abstract description 25
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 25
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims abstract description 22
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims abstract description 8
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims abstract description 8
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 claims abstract description 6
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims abstract description 6
- 150000002343 gold Chemical class 0.000 claims abstract description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 38
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 24
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 20
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 20
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 19
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 17
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 15
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 12
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 10
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 claims description 9
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229910021607 Silver chloride Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 4
- 238000000835 electrochemical detection Methods 0.000 claims description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 4
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 claims description 4
- HKZLPVFGJNLROG-UHFFFAOYSA-M silver monochloride Chemical compound [Cl-].[Ag+] HKZLPVFGJNLROG-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- 238000004832 voltammetry Methods 0.000 claims description 4
- 239000012224 working solution Substances 0.000 claims description 4
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- RBTBFTRPCNLSDE-UHFFFAOYSA-N 3,7-bis(dimethylamino)phenothiazin-5-ium Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC2=[S+]C3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 RBTBFTRPCNLSDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 4
- 238000009413 insulation Methods 0.000 abstract description 4
- 229960000907 methylthioninium chloride Drugs 0.000 abstract description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 2
- UGZAJZLUKVKCBM-UHFFFAOYSA-N 6-sulfanylhexan-1-ol Chemical compound OCCCCCCS UGZAJZLUKVKCBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N TCEP Chemical compound OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- VLEIUWBSEKKKFX-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O VLEIUWBSEKKKFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 229920000139 polyethylene terephthalate Polymers 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- CBMYJHIOYJEBSB-YSZCXEEOSA-N 5alpha-androstane-3beta,17beta-diol Chemical compound C1[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CC[C@H]21 CBMYJHIOYJEBSB-YSZCXEEOSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- RGLYKWWBQGJZGM-ISLYRVAYSA-N diethylstilbestrol Chemical compound C=1C=C(O)C=CC=1C(/CC)=C(\CC)C1=CC=C(O)C=C1 RGLYKWWBQGJZGM-ISLYRVAYSA-N 0.000 description 1
- 229960000452 diethylstilbestrol Drugs 0.000 description 1
- 230000035622 drinking Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000000840 electrochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000002848 electrochemical method Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 229940011871 estrogen Drugs 0.000 description 1
- 239000000262 estrogen Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000005003 food packaging material Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 description 1
- 230000002687 intercalation Effects 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 238000002161 passivation Methods 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 239000002985 plastic film Substances 0.000 description 1
- 229920006255 plastic film Polymers 0.000 description 1
- 239000004014 plasticizer Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007740 vapor deposition Methods 0.000 description 1
- 238000001075 voltammogram Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/28—Electrolytic cell components
- G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
- G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/416—Systems
- G01N27/48—Systems using polarography, i.e. measuring changes in current under a slowly-varying voltage
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Electrochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种可抛式双酚A适配体的生物传感器的制备方法，包括如下步骤：清洗PET薄膜(1)并在其上溅射一层纳米尺度的金膜(2)，裁剪成工作电极的尺寸，在所述金膜(2)上设置有透明胶带(3)，在所述透明胶带(3)上设置有圆形的通孔(4)，所述通孔(4)所在的区域为电极区，所述透明胶带(3)覆盖的区域为绝缘区，其余区域为导线区；对所述电极区的表面进行双酚A适配体修饰，得到双酚A适配体修饰的金纳米粒子电极，采用MCH溶液对所述电极区的表面进行钝化，采用亚甲基蓝(MB)滴涂在所述电极区的表面，得到修饰后的工作电极。本发明的可抛式双酚A适配体的生物传感器具有操作简单、分析速度快、成本低、适用于现场检测等优势。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物传感器，特别是涉及一种基于发卡状适配体和亚甲基蓝复合物的可抛式双酚A适配体的生物传感器的制备方法。
背景技术
双酚A(Bisphenol A，简称BPA)，化学名称为2,2-二(4-羟基苯基)丙烷，属于低毒性化学物质，作为一种十分重要的塑化剂材料，常用于玩具、奶瓶、饮水杯、食品包装材料等产品的生产中。其结构类似雄二醇和乙烯雌酚，因而具有和其他环境激素类似的效应，发挥拟雌激素作用，干扰生物体生殖、生长发育、神经系统、免疫系统等，甚至诱发癌症。世界各国都纷纷出台了相应的法律法规来禁止双酚A的应用。如2010年5月，法国国民议会议员投票一致赞成禁止对3岁以下儿童使用的食品容器使用双酚A的禁令。最新欧盟指令限制双酚A在玩具中的迁移量应小于0.04mg/L。因此，建立一种可以对痕量双酚A快速检测的简便方法具有重要的意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种结构简单、成本低、操作简便的可抛式双酚A适配体的生物传感器的制备方法。
一种可抛式双酚A适配体的生物传感器的制备方法，包括如下步骤：
步骤一、清洗PET薄膜，并在其上溅射一层纳米尺度的金膜；
步骤二、将溅射好的所述PET薄膜取出，裁剪成工作电极的尺寸；
步骤三、在所述金膜上设置有透明胶带，在所述透明胶带上设置有圆形的通孔，所述通孔所在的区域为电极区，所述透明胶带覆盖的区域为绝缘区，其余区域为导线区；
步骤四、对所述电极区的表面进行双酚A适配体修饰，得到双酚A适配体修饰的金纳米粒子电极；
步骤五、采用MCH溶液对所述电极区的表面进行钝化；
步骤六、采用MB滴涂在所述电极区的表面，对电极表面进行信号分子的组装，得到修饰后的工作电极。
本发明所述的可抛式双酚A适配体的生物传感器的制备方法，其中，所述金膜采用高真空离子溅射仪溅射，溅射时间为80s-100s，溅射电流为20-30mA，溅射真空度不低于6×10-3mbar，靶材距样品台的距离为9cm，溅射后的所述金膜的厚度为16-20nm。
本发明所述的可抛式双酚A适配体的生物传感器的制备方法，其中，所述双酚A适配体的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，步骤四具体包括如下方法：将含有0.05μMTCEP的浓度为1μM的双酚A适配体溶液100μL滴涂在所述电极区的表面，放置于4℃的冰箱内12h，用去离子水冲洗所述电极区的表面，氮气吹干。
本发明所述的可抛式双酚A适配体的生物传感器的制备方法，其中，步骤五具体包括如下步骤：取100μL浓度为1mM的MCH滴涂于所述电极区的表面，在室温下静置2h后用去离子水冲洗，氮气吹干。
本发明所述的可抛式双酚A适配体的生物传感器的制备方法，其中，步骤六具体包括如下步骤：将0.1mM的MB滴涂在所述电极区的表面，室温下静置2h，去离子水冲洗并氮气吹干，得到修饰后的工作电极。
本发明所述的可抛式双酚A适配体的生物传感器的制备方法，其中，步骤一中所述PET薄膜的清洗方法如下：先用无水乙醇超声清洗两次，去除表面的有机物，然后用去离子水清洗两次，60℃烘箱烘干。
本发明所述的可抛式双酚A适配体的生物传感器的制备方法，其中，步骤一中所述PET薄膜长为4.8cm，宽为4cm，步骤二中所述工作电极的长为4cm，宽为1.2cm，所述透明胶带的长为2.5cm，宽为1.2cm，所述通孔的直径为10mm，所述通孔的圆心距离所述PET薄膜的前端之间的距离为7mm。
溶液中痕量双酚A的测定方法，包括如下步骤：
标准工作溶液的配制：配制不同浓度的双酚A标准溶液，浓度分别为0.1μg/L,1μg/L,10μg/L,100μg/L,500μg/L,700μg/L,1000μg/L；
采用本发明所述的方法制备得到的可抛式双酚A适配体的生物传感器进行测定，测定前，将不同浓度的双酚A标准溶液滴涂在所述电极区的表面，室温下反应30min，然后用去离子水充分冲洗，氮气吹干；
电化学检测及线性曲线：将所述可抛式双酚A适配体的生物传感器作为工作电极，以铂电极为对电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，组成三电极体系，在pH值为7的0.5mM磷酸缓冲溶液中进行线性扫描伏安LSV测定，扫描速率为50mVs-1，扫描范围为-0.4V—+0.2V。
本发明可抛式双酚A适配体的生物传感器的制备方法与现有技术不同之处在于：
目前双酚A检测常用的方法有色谱法、分光光度法、免疫分析法和电化学法等，核酸适配体作为一种新型的识别元件，具有高灵敏度，高亲和力，和特异性，易合成，稳定性好等特性，相比于传统的电化学分析方法，基于适配体修饰的电化学传感器，具有更高的灵敏度，更好的选择性和抗干扰性等优点，突破传统电化学传感器的局限性，显著地提高传感器性能。
本发明可抛式双酚A适配体的生物传感器的制备方法得到的生物传感器是基于发卡状适配体-MB复合物测定双酚A的生物传感器，制作的基底采用的是成本低廉、柔韧性好的PET可抛式塑料薄膜，易于加工，无需特殊加工工具，采用真空离子溅射技术对电极表面进行纳米金的修饰，方法简单快速，可小批量制作，本发明的生物传感器具有操作简单、分析速度快、成本低、适用于现场检测等优势。
目前，基于发卡状适配体-MB复合物测定双酚A的生物传感器和在一次性塑料电极上构建的可抛式双酚A适配体传感器尚未见报道。
下面结合附图对本发明的可抛式双酚A适配体的生物传感器的制备方法作进一步说明。
附图说明
图1为本发明可抛式双酚A适配体的生物传感器的侧视结构示意图；
图2为本发明可抛式双酚A适配体的生物传感器的俯视结构示意图；
图3为本发明三电极系统的结构示意图；
图4为修饰适配体后的电极区表面；
图5为MCH钝化后的电极区表面；
图6为结合MB后的电极区表面；
图7为双酚A适配体电化学传感器检测双酚A机理图；
图8为不同浓度双酚A标准溶液处理的工作电极电化学响应曲线；
图9为双酚A标准曲线。
具体实施方式
实施例1
如图1～图3所示，本发明以PET薄膜1作为电极基底，在对电极进行清洗净化的基础上，通过离子溅射技术对此基底电极进行表面金属纳米材料气相沉淀来制备工作电极，然后对制备的工作电极依次进行双酚A适配体和亚甲基蓝修饰。
一种可抛式双酚A适配体的生物传感器的制备方法，包括如下步骤：
步骤一、清洗PET薄膜1，并在其上溅射一层纳米尺度的金膜2；
PET薄膜1的清洗方法如下：先用无水乙醇超声清洗两次，去除表面的有机物，然后用离子水清洗两次，60℃烘箱烘干。PET薄膜1长为4.8cm，宽为4cm，
金膜2采用高真空离子溅射仪(徕卡EM SCD500)溅射，溅射时间为80s-100s，溅射电流为20-30mA，溅射真空度不低于6×10-3mbar，靶材距样品台的距离为9cm，溅射后的金膜2的厚度为16-20nm。
步骤二、将溅射好的PET薄膜1取出，裁剪成工作电极的尺寸，工作电极长为4cm，宽为1.2cm，
步骤三、在金膜2上设置有透明胶带3(粘贴)，在透明胶带3上设置有圆形的通孔4，通孔4所在的区域为电极区，透明胶带3覆盖的区域为绝缘区，其余区域为导线区；透明胶带3的长为2.5cm，宽为1.2cm，通孔4的直径为10mm，通孔4的圆心距离PET薄膜1的前端之间的距离为7mm，以此构成制备适配体修饰电极的电极基底，
步骤四、将含有0.05μM Tris-(2-carboxyethyl)phosphine(TCEP)的浓度为1μM的双酚A适配体溶液(用pH值为8的Tris-HCl，PBS或Tris-EDTA等缓冲溶液均可)100μL滴涂在电极区的表面，放置于4℃的冰箱内12h，用去离子水冲洗电极区的表面，氮气吹干，得到双酚A适配体修饰的金纳米粒子电极，如图4所示；双酚A适配体的核苷酸序列如序列表中SEQID NO:1所示，具体为5′-HS-CCG GTG GGT GGTCAG GTG GGATAG CGT TCC GCGTAT GGC CCAGCG CAT CAC GGG TTC GCA CCA-3′。
步骤五、采用MCH(6-巯基己醇，CAS号1633-78-9)溶液对电极区的表面进行钝化：取100μL浓度为1mM的MCH滴涂于电极区的表面，在室温下静置2h后用去离子水冲洗，氮气吹干，如图5所示。
步骤六、将0.1mM的MB滴涂在电极区的表面，室温下静置2h，去离子水冲洗并氮气吹干，得到修饰后的工作电极，如图6所示。
实施例2
溶液中痕量双酚A的测定方法，包括如下步骤：
(1)制备可抛式双酚A适配体的生物传感器：
步骤一、清洗PET薄膜1，并在其上溅射一层纳米尺度的金膜2；
PET薄膜1的清洗方法如下：先用无水乙醇超声清洗两次，去除表面的有机物，然后用离子水清洗两次，60℃烘箱烘干。PET薄膜1长为4.8cm，宽为4cm，
金膜2采用高真空离子溅射仪(徕卡EM SCD500)溅射，溅射时间为100s，溅射电流为30mA，溅射真空度不低于6×10-3mbar，靶材距样品台的距离为9cm，溅射后的金膜2的厚度为16-20nm。
步骤二、将溅射好的PET薄膜1取出，裁剪成工作电极的尺寸，工作电极长为4cm，宽为1.2cm，
步骤三、在金膜2上设置有透明胶带3(粘贴)，在透明胶带3上设置有圆形的通孔4，通孔4所在的区域为电极区，透明胶带3覆盖的区域为绝缘区，其余区域为导线区；透明胶带3的长为2.5cm，宽为1.2cm，通孔4的直径为10mm，通孔4的圆心距离PET薄膜1的前端之间的距离为7mm，以此构成制备适配体修饰电极的电极基底，
步骤四、将含有0.05μM Tris-(2-carboxyethyl)phosphine(TCEP)的浓度为1μM的双酚A适配体溶液(用pH值为8的Tris-HCl，PBS或Tris-EDTA等缓冲溶液均可)100μL滴涂在电极区的表面，放置于4℃的冰箱内12h，用去离子水冲洗电极区的表面，氮气吹干，得到双酚A适配体修饰的金纳米粒子电极，如图4所示；双酚A适配体的核苷酸序列如序列表中SEQID NO:1所示，具体为5′-HS-CCG GTG GGT GGTCAG GTG GGATAG CGT TCC GCGTAT GGC CCAGCG CAT CAC GGG TTC GCA CCA-3′。
步骤五、采用MCH(6-巯基己醇，CAS号1633-78-9)溶液对电极区的表面进行钝化：取100μL浓度为1mM的MCH滴涂于电极区的表面，在室温下静置2h后用去离子水冲洗，氮气吹干，如图5所示。
步骤六、将0.1mM的MB滴涂在电极区的表面，室温下静置2h，去离子水冲洗并氮气吹干，得到修饰后的工作电极，如图6所示。
(2)标准工作溶液的配制：配制不同浓度的双酚A标准溶液，浓度分别为0.1μg/L,1μg/L,10μg/L,100μg/L,500μg/L,700μg/L,1000μg/L；
(3)采用本发明的方法制备得到的可抛式双酚A适配体的生物传感器进行测定，测定前，将不同浓度的双酚A标准溶液滴涂在电极区的表面，室温下反应30min，然后用去离子水充分冲洗，氮气吹干；
电化学检测及线性曲线：将可抛式双酚A适配体的生物传感器作为工作电极，以铂电极为对电极6，Ag/AgCl电极作为参比电极5，组成三电极体系，在pH值为7的0.5mM磷酸缓冲溶液中进行线性扫描伏安LSV测定，扫描速率为50mVs-1，扫描范围为-0.4V—+0.2V。
实施例3
溶液中痕量双酚A的测定方法，包括如下步骤：
(1)制备可抛式双酚A适配体的生物传感器：
步骤一、清洗PET薄膜1，并在其上溅射一层纳米尺度的金膜2；
PET薄膜1的清洗方法如下：先用无水乙醇超声清洗两次，去除表面的有机物，然后用离子水清洗两次，60℃烘箱烘干。PET薄膜1长为4.8cm，宽为4cm，
金膜2采用高真空离子溅射仪(徕卡EM SCD500)溅射，溅射时间为80s，溅射电流为20mA，溅射真空度不低于6×10-3mbar，靶材距样品台的距离为9cm，溅射后的金膜2的厚度为16-20nm。
步骤二、将溅射好的PET薄膜1取出，裁剪成工作电极的尺寸，工作电极长为4cm，宽为1.2cm，
步骤三、在金膜2上设置有透明胶带3(粘贴)，在透明胶带3上设置有圆形的通孔4，通孔4所在的区域为电极区，透明胶带3覆盖的区域为绝缘区，其余区域为导线区；透明胶带3的长为2.5cm，宽为1.2cm，通孔4的直径为10mm，通孔4的圆心距离PET薄膜1的前端之间的距离为7mm，以此构成制备适配体修饰电极的电极基底，
步骤四、将含有0.05μM Tris-(2-carboxyethyl)phosphine(TCEP)的浓度为1μM的双酚A适配体溶液(用pH值为8的Tris-HCl，PBS或Tris-EDTA等缓冲溶液均可)100μL滴涂在电极区的表面，放置于4℃的冰箱内12h，用去离子水冲洗电极区的表面，氮气吹干，得到双酚A适配体修饰的金纳米粒子电极，如图4所示；双酚A适配体的核苷酸序列如序列表中SEQID NO:1所示，具体为5′-HS-CCG GTG GGT GGTCAG GTG GGATAG CGT TCC GCGTAT GGC CCAGCG CAT CAC GGG TTC GCA CCA-3′。
步骤五、采用MCH(6-巯基己醇，CAS号1633-78-9)溶液对电极区的表面进行钝化：取100μL浓度为1mM的MCH滴涂于电极区的表面，在室温下静置2h后用去离子水冲洗，氮气吹干，如图5所示。
步骤六、将0.1mM的MB滴涂在电极区的表面，室温下静置2h，去离子水冲洗并氮气吹干，得到修饰后的工作电极，如图6所示。
(2)标准工作溶液的配制：配制不同浓度的双酚A标准溶液，浓度分别为0.1μg/L,1μg/L,10μg/L,100μg/L,500μg/L,700μg/L,1000μg/L；
(3)采用本发明的方法制备得到的可抛式双酚A适配体的生物传感器进行测定，测定前，将不同浓度的双酚A标准溶液滴涂在电极区的表面，室温下反应30min，然后用去离子水充分冲洗，氮气吹干；
电化学检测及线性曲线：将可抛式双酚A适配体的生物传感器作为工作电极，以铂电极为对电极6，Ag/AgCl电极作为参比电极5，组成三电极体系，在pH值为7的0.5mM磷酸缓冲溶液中进行线性扫描伏安LSV测定，扫描速率为50mVs-1，扫描范围为-0.4V—+0.2V。
得到如图8所示的线性扫描伏安曲线，其峰电流的大小与双酚A溶液的浓度呈线性关系，标准曲线如图9所示。双酚A浓度在0.1ppb-1000ppb范围内呈线性关系。
在本发明中进行了以下优化：
通孔4直径：对5mm、8mm、10mm、12mm等不同的通孔4直径进行了优化，发现随着通孔4尺寸的增大，电极响应信号增强，但是当通孔4尺寸大于10mm后，仪器的噪音也响应增大，且峰型变差。所以最终选用了10mm通孔4作为最佳的电极尺寸。
MB浓度：对0.01、0.02、0.05、0.07、0.1、0.5、1mM等不同浓度的MB进行了优化，结果显示随着MB浓度的升高，响应信号增强，当浓度达到0.1mM时随着浓度的再次升高，响应信号不在增强，所以我们选择0.1mM的MB浓度作为最佳的浓度。
本发明传感器的传感机理：
如图7所示，显示了基于发卡状适配体-MB复合物的生物传感器的工作原理。首先，通过经典的Au-S将硫醇化的适配体固定在Au-PET电极的表面。然后用MCH钝化电极以避免其他物质的非特异性吸附。随后，将MB分子插入BPA中形成ssDNA-MB复合物。据报道，MB能够嵌入DNA的茎杆结构中，并且随着GC碱基含量的增加，MB的结合数量会增加。BPA适配体是一种含有63个碱基的具有茎环结构的发夹状DNA，其GC含量为66.7％，这更有利于MB嵌插。因此单链DNA的这种二级结构能够绑定MB并形成复合物。而当BPA加入溶液中时，适配体优先与BPA结合，并同时打开二级结构，释放插入的MB，从而导致MB分子电化学信号的降低。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 中国检验检疫科学研究院
<120> 一种可抛式双酚A适配体的生物传感器的制备方法
<130> 181
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccggtgggtg gtcaggtggg atagcgttcc gcgtatggcc cagcgcatca cgggttcgca 60
cca 63
Claims (4)
1.一种可抛式双酚A适配体的生物传感器的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤一、清洗PET薄膜(1)，并在其上溅射一层纳米尺度的金膜(2)；所述金膜(2)采用高真空离子溅射仪溅射，溅射时间为80s-100s，溅射电流为20-30mA，溅射真空度不低于6×10-3mbar，靶材距样品台的距离为9cm，溅射后的所述金膜(2)的厚度为16-20nm；
步骤二、将溅射好的所述PET薄膜(1)取出，裁剪成工作电极的尺寸；
步骤三、在所述金膜(2)上设置有透明胶带(3)，在所述透明胶带(3)上设置有圆形的通孔(4)，所述通孔(4)所在的区域为电极区，所述透明胶带(3)覆盖的区域为绝缘区，其余区域为导线区；
步骤四、对所述电极区的表面进行双酚A适配体修饰，得到双酚A适配体修饰的金纳米粒子电极：所述双酚A适配体的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，将含有0.05μMTCEP的浓度为1μM的双酚A适配体溶液100μL滴涂在所述电极区的表面，放置于4℃的冰箱内12h，用去离子水冲洗所述电极区的表面，氮气吹干；
步骤五、采用MCH溶液对所述电极区的表面进行钝化：取100μL浓度为1mM的MCH滴涂于所述电极区的表面，在室温下静置2h后用去离子水冲洗，氮气吹干；
步骤六、形成适配体-MB复合物：将0.1mM的MB滴涂在所述电极区的表面，室温下静置2h，去离子水冲洗并氮气吹干，得到修饰后的工作电极。
2.根据权利要求1所述的可抛式双酚A适配体的生物传感器的制备方法，其特征在于：步骤一中所述PET薄膜(1)的清洗方法如下：先用无水乙醇超声清洗两次，去除表面的有机物，然后用离子水清洗两次，60℃烘箱烘干。
3.根据权利要求2所述的可抛式双酚A适配体的生物传感器的制备方法，其特征在于：步骤一中所述PET薄膜(1)长为4.8cm，宽为4cm，步骤二中所述工作电极的长为4cm，宽为1.2cm，所述透明胶带(3)的长为2.5cm，宽为1.2cm，所述通孔(4)的直径为10mm，所述通孔(4)的圆心距离所述PET薄膜(1)的前端之间的距离为7mm。
4.一种溶液中痕量双酚A的测定方法，其特征在于：包括如下步骤：
标准工作溶液的配制：配制不同浓度的双酚A标准溶液，浓度分别为0.1μg/L,1μg/L,10μg/L,100μg/L,500μg/L,700μg/L,1000μg/L；
采用权利要求1所述的方法制备得到的可抛式双酚A适配体的生物传感器进行测定，测定前，将不同浓度的双酚A标准溶液滴涂在所述电极区的表面，室温下反应30min，然后用去离子水充分冲洗，氮气吹干；
电化学检测及线性曲线：将所述可抛式双酚A适配体的生物传感器作为工作电极，以铂电极为对电极(6)，Ag/AgCl电极作为参比电极(5)，组成三电极体系，在pH值为7.0的0.5mM磷酸缓冲溶液中进行线性扫描伏安LSV测定，扫描速率为50mVs-1，扫描范围为-0.4V—+0.2V。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810044511.1A CN108226251B (zh) | 2018-01-17 | 2018-01-17 | 一种可抛式双酚a适配体生物传感器的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810044511.1A CN108226251B (zh) | 2018-01-17 | 2018-01-17 | 一种可抛式双酚a适配体生物传感器的制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN108226251A CN108226251A (zh) | 2018-06-29 |
| CN108226251B true CN108226251B (zh) | 2020-01-21 |
Family
ID=62641343
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201810044511.1A Expired - Fee Related CN108226251B (zh) | 2018-01-17 | 2018-01-17 | 一种可抛式双酚a适配体生物传感器的制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN108226251B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110376250B (zh) * | 2019-07-02 | 2022-03-18 | 伊犁师范大学 | 一种金属纳米粒配体修饰的集成电路和制备方法 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20120095111A (ko) * | 2011-02-18 | 2012-08-28 | 부산대학교 산학협력단 | 페놀성 환경호르몬 검출용 마이크로칩 및 이를 이용한 환경호르몬 검출방법 |
| CN102608177B (zh) * | 2012-03-02 | 2013-09-18 | 北京航空航天大学 | 基于离子通道和适配体制备生物传感器检测凝血酶的方法 |
| CN103966594B (zh) * | 2014-05-07 | 2016-12-28 | 哈尔滨工业大学 | 一种金表面聚苯胺/磺化石墨烯复合薄膜的制备方法 |
| WO2017026901A1 (en) * | 2015-08-10 | 2017-02-16 | Jadranka Travas-Sejdic | Electrochemical polynucleotide sensors |
| CN105466991B (zh) * | 2015-12-30 | 2019-01-04 | 中国检验检疫科学研究院 | 双酚a可抛式纸基传感器及其制备方法和应用 |
| CN105784810B (zh) * | 2016-04-20 | 2018-04-03 | 华东交通大学 | 一种非标记型核酸适配体传感器及对双酚a的检测方法 |
| CN106706748B (zh) * | 2016-12-16 | 2018-10-23 | 北京化工大学 | 检测孔雀石绿的适配体电化学生物传感器及其制备方法 |
| CN106841339A (zh) * | 2017-02-03 | 2017-06-13 | 吉林大学 | 一种用于检测双酚a的适配体传感器及其制备方法 |
-
2018
- 2018-01-17 CN CN201810044511.1A patent/CN108226251B/zh not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN108226251A (zh) | 2018-06-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Yu et al. | A disposable electrochemical aptasensor using single-stranded DNA–methylene blue complex as signal-amplification platform for sensitive sensing of bisphenol A | |
| Xia et al. | Label-free and sensitive strategy for microRNAs detection based on the formation of boronate ester bonds and the dual-amplification of gold nanoparticles | |
| Castillo et al. | Impedimetric DNA aptasensor for sensitive detection of ochratoxin A in food | |
| He et al. | Construction of electrochemical aptasensors with Ag (I) metal− organic frameworks toward high-efficient detection of ultra-trace penicillin | |
| CN109870497B (zh) | 一种检测黄曲霉毒素b1电化学适配体传感器的制备方法 | |
| Liu et al. | Al2O3 sol–gel derived amperometric biosensor for glucose | |
| CN101832965B (zh) | 基于磁性碳纳米管和壳聚糖/二氧化硅凝胶的漆酶生物传感器及其制备方法和应用 | |
| Qing et al. | Differential pulse voltammetric ochratoxin A assay based on the use of an aptamer and hybridization chain reaction | |
| CN113201580B (zh) | 一种环金属铱配合物敏化NiO阴极光电化学生物传感器的制备方法 | |
| CN110186975B (zh) | 用于食源性微生物检测的微液滴电化学传感器及制备方法 | |
| Wang et al. | A novel label-free and signal-on electrochemical aptasensor based on the autonomous assembly of hemin/G-quadruplex and direct electron transfer of hemin | |
| CN108226251B (zh) | 一种可抛式双酚a适配体生物传感器的制备方法 | |
| CN112505119A (zh) | 检测黄曲霉素b1的电化学传感器、检测方法和制备 | |
| Li et al. | A renewable amperometric immunosensor for phytohormone β-indole acetic acid assay | |
| CN114624223A (zh) | 一种基于嵌入特异性核酸酶dna水凝胶的表面增强拉曼光谱传感器检测链霉素的方法 | |
| Huang et al. | Recent progresses on biosensors for Escherichia coli detection | |
| CN113311038B (zh) | 一种dna生物传感器的分子识别部分、其制备和应用 | |
| Lu et al. | Ultrasensitive detection of patulin based on a Ag+-driven one-step dual signal amplification | |
| CN111060569A (zh) | 一种检测阿尔茨海默症标志物的电化学适配体传感器、其制备方法及应用 | |
| CN111024791B (zh) | 检测赭曲霉毒素a的电化学传感器和方法 | |
| Shams et al. | Application of biosensors in food quality control | |
| US20140212870A1 (en) | FET Sensors With Subtractive Probes for Indirect Detection and Methods | |
| CN113960136B (zh) | 一种动态范围可调的伏马菌素b1电化学传感器的制备方法及其应用 | |
| CN103235025B (zh) | 一种电流型核酸适体传感器及制备方法 | |
| CN111398388B (zh) | 一种基于检测核酸hly与乙偶姻的双功能传感器检测单增李斯特菌的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20200121 |