CN108226251A - 一种可抛式双酚a适配体生物传感器的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种可抛式双酚A适配体的生物传感器的制备方法，包括如下步骤：清洗PET薄膜(1)并在其上溅射一层纳米尺度的金膜(2)，裁剪成工作电极的尺寸，在所述金膜(2)上设置有透明胶带(3)，在所述透明胶带(3)上设置有圆形的通孔(4)，所述通孔(4)所在的区域为电极区，所述透明胶带(3)覆盖的区域为绝缘区，其余区域为导线区；对所述电极区的表面进行双酚A适配体修饰，得到双酚A适配体修饰的金纳米粒子电极，采用MCH溶液对所述电极区的表面进行钝化，采用亚甲基蓝(MB)滴涂在所述电极区的表面，得到修饰后的工作电极。本发明的可抛式双酚A适配体的生物传感器具有操作简单、分析速度快、成本低、适用于现场检测等优势。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物传感器，特别是涉及一种基于发卡状适配体和亚甲基蓝复合物的可抛式双酚A适配体的生物传感器的制备方法。
背景技术
双酚A(Bisphenol A，简称BPA)，化学名称为2,2-二(4-羟基苯基)丙烷，属于低毒性化学物质，作为一种十分重要的塑化剂材料，常用于玩具、奶瓶、饮水杯、食品包装材料等产品的生产中。其结构类似雄二醇和乙烯雌酚，因而具有和其他环境激素类似的效应，发挥拟雌激素作用，干扰生物体生殖、生长发育、神经系统、免疫系统等，甚至诱发癌症。世界各国都纷纷出台了相应的法律法规来禁止双酚A的应用。如2010年5月，法国国民议会议员投票一致赞成禁止对3岁以下儿童使用的食品容器使用双酚A的禁令。最新欧盟指令限制双酚A在玩具中的迁移量应小于0.04mg/L。因此，建立一种可以对痕量双酚A快速检测的简便方法具有重要的意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种结构简单、成本低、操作简便的可抛式双酚A适配体的生物传感器的制备方法。
一种可抛式双酚A适配体的生物传感器的制备方法，包括如下步骤：
步骤一、清洗PET薄膜，并在其上溅射一层纳米尺度的金膜；
步骤二、将溅射好的所述PET薄膜取出，裁剪成工作电极的尺寸；
步骤三、在所述金膜上设置有透明胶带，在所述透明胶带上设置有圆形的通孔，所述通孔所在的区域为电极区，所述透明胶带覆盖的区域为绝缘区，其余区域为导线区；
步骤四、对所述电极区的表面进行双酚A适配体修饰，得到双酚A适配体修饰的金纳米粒子电极；
步骤五、采用MCH溶液对所述电极区的表面进行钝化；
步骤六、采用MB滴涂在所述电极区的表面，对电极表面进行信号分子的组装，得到修饰后的工作电极。
本发明所述的可抛式双酚A适配体的生物传感器的制备方法，其中，所述金膜采用高真空离子溅射仪溅射，溅射时间为80s-100s，溅射电流为20-30mA，溅射真空度不低于6×10-3mbar，靶材距样品台的距离为9cm，溅射后的所述金膜的厚度为16-20nm。
本发明所述的可抛式双酚A适配体的生物传感器的制备方法，其中，所述双酚A适配体的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，步骤四具体包括如下方法：将含有0.05μMTCEP的浓度为1μM的双酚A适配体溶液100μL滴涂在所述电极区的表面，放置于4℃的冰箱内12h，用去离子水冲洗所述电极区的表面，氮气吹干。
本发明所述的可抛式双酚A适配体的生物传感器的制备方法，其中，步骤五具体包括如下步骤：取100μL浓度为1mM的MCH滴涂于所述电极区的表面，在室温下静置2h后用去离子水冲洗，氮气吹干。
本发明所述的可抛式双酚A适配体的生物传感器的制备方法，其中，步骤六具体包括如下步骤：将0.1mM的MB滴涂在所述电极区的表面，室温下静置2h，去离子水冲洗并氮气吹干，得到修饰后的工作电极。
本发明所述的可抛式双酚A适配体的生物传感器的制备方法，其中，步骤一中所述PET薄膜的清洗方法如下：先用无水乙醇超声清洗两次，去除表面的有机物，然后用去离子水清洗两次，60℃烘箱烘干。
本发明所述的可抛式双酚A适配体的生物传感器的制备方法，其中，步骤一中所述PET薄膜长为4.8cm，宽为4cm，步骤二中所述工作电极的长为4cm，宽为1.2cm，所述透明胶带的长为2.5cm，宽为1.2cm，所述通孔的直径为10mm，所述通孔的圆心距离所述PET薄膜的前端之间的距离为7mm。
溶液中痕量双酚A的测定方法，包括如下步骤：
标准工作溶液的配制：配制不同浓度的双酚A标准溶液，浓度分别为0.1μg/L,1μg/L,10μg/L,100μg/L,500μg/L,700μg/L,1000μg/L；
采用本发明所述的方法制备得到的可抛式双酚A适配体的生物传感器进行测定，测定前，将不同浓度的双酚A标准溶液滴涂在所述电极区的表面，室温下反应30min，然后用去离子水充分冲洗，氮气吹干；
电化学检测及线性曲线：将所述可抛式双酚A适配体的生物传感器作为工作电极，以铂电极为对电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，组成三电极体系，在pH值为7的0.5mM磷酸缓冲溶液中进行线性扫描伏安LSV测定，扫描速率为50mVs-1，扫描范围为-0.4V—+0.2V。
本发明可抛式双酚A适配体的生物传感器的制备方法与现有技术不同之处在于：
目前双酚A检测常用的方法有色谱法、分光光度法、免疫分析法和电化学法等，核酸适配体作为一种新型的识别元件，具有高灵敏度，高亲和力，和特异性，易合成，稳定性好等特性，相比于传统的电化学分析方法，基于适配体修饰的电化学传感器，具有更高的灵敏度，更好的选择性和抗干扰性等优点，突破传统电化学传感器的局限性，显著地提高传感器性能。
本发明可抛式双酚A适配体的生物传感器的制备方法得到的生物传感器是基于发卡状适配体-MB复合物测定双酚A的生物传感器，制作的基底采用的是成本低廉、柔韧性好的PET可抛式塑料薄膜，易于加工，无需特殊加工工具，采用真空离子溅射技术对电极表面进行纳米金的修饰，方法简单快速，可小批量制作，本发明的生物传感器具有操作简单、分析速度快、成本低、适用于现场检测等优势。
目前，基于发卡状适配体-MB复合物测定双酚A的生物传感器和在一次性塑料电极上构建的可抛式双酚A适配体传感器尚未见报道。
下面结合附图对本发明的可抛式双酚A适配体的生物传感器的制备方法作进一步说明。
附图说明
图1为本发明可抛式双酚A适配体的生物传感器的侧视结构示意图；
图2为本发明可抛式双酚A适配体的生物传感器的俯视结构示意图；
图3为本发明三电极系统的结构示意图；
图4为修饰适配体后的电极区表面；
图5为MCH钝化后的电极区表面；
图6为结合MB后的电极区表面；
图7为双酚A适配体电化学传感器检测双酚A机理图；
图8为不同浓度双酚A标准溶液处理的工作电极电化学响应曲线；
图9为双酚A标准曲线。
具体实施方式
实施例1
如图1～图3所示，本发明以PET薄膜1作为电极基底，在对电极进行清洗净化的基础上，通过离子溅射技术对此基底电极进行表面金属纳米材料气相沉淀来制备工作电极，然后对制备的工作电极依次进行双酚A适配体和亚甲基蓝修饰。
一种可抛式双酚A适配体的生物传感器的制备方法，包括如下步骤：
步骤一、清洗PET薄膜1，并在其上溅射一层纳米尺度的金膜2；
PET薄膜1的清洗方法如下：先用无水乙醇超声清洗两次，去除表面的有机物，然后用离子水清洗两次，60℃烘箱烘干。PET薄膜1长为4.8cm，宽为4cm，
金膜2采用高真空离子溅射仪(徕卡EM SCD500)溅射，溅射时间为80s-100s，溅射电流为20-30mA，溅射真空度不低于6×10-3mbar，靶材距样品台的距离为9cm，溅射后的金膜1的厚度为16-20nm。
步骤二、将溅射好的PET薄膜1取出，裁剪成工作电极的尺寸，工作电极长为4cm，宽为1.2cm，
步骤三、在金膜2上设置有透明胶带3(粘贴)，在透明胶带3上设置有圆形的通孔4，通孔4所在的区域为电极区，透明胶带3覆盖的区域为绝缘区，其余区域为导线区；透明胶带3的长为2.5cm，宽为1.2cm，通孔4的直径为10mm，通孔4的圆心距离PET薄膜1的前端之间的距离为7mm，以此构成制备适配体修饰电极的电极基底，
步骤四、将含有0.05μM Tris-(2-carboxyethyl)phosphine(TCEP)的浓度为1μM的双酚A适配体溶液(用pH值为8的Tris-HCl，PBS或Tris-EDTA等缓冲溶液均可)100μL滴涂在电极区的表面，放置于4℃的冰箱内12h，用去离子水冲洗电极区的表面，氮气吹干，得到双酚A适配体修饰的金纳米粒子电极，如图4所示；双酚A适配体的核苷酸序列如序列表中SEQID NO:1所示，具体为5′-HS-CCG GTG GGT GGTCAG GTG GGATAG CGT TCC GCG TAT GGC CCAGCG CAT CAC GGG TTC GCA CCA-3′。
步骤五、采用MCH(6-巯基己醇，CAS号1633-78-9)溶液对电极区的表面进行钝化：取100μL浓度为1mM的MCH滴涂于电极区的表面，在室温下静置2h后用去离子水冲洗，氮气吹干，如图5所示。
步骤六、将0.1mM的MB滴涂在电极区的表面，室温下静置2h，去离子水冲洗并氮气吹干，得到修饰后的工作电极，如图6所示。
实施例2
溶液中痕量双酚A的测定方法，包括如下步骤：
(1)制备可抛式双酚A适配体的生物传感器：
步骤一、清洗PET薄膜1，并在其上溅射一层纳米尺度的金膜2；
PET薄膜1的清洗方法如下：先用无水乙醇超声清洗两次，去除表面的有机物，然后用离子水清洗两次，60℃烘箱烘干。PET薄膜1长为4.8cm，宽为4cm，
金膜2采用高真空离子溅射仪(徕卡EM SCD500)溅射，溅射时间为100s，溅射电流为30mA，溅射真空度不低于6×10-3mbar，靶材距样品台的距离为9cm，溅射后的金膜1的厚度为16-20nm。
步骤二、将溅射好的PET薄膜1取出，裁剪成工作电极的尺寸，工作电极长为4cm，宽为1.2cm，
步骤三、在金膜2上设置有透明胶带3(粘贴)，在透明胶带3上设置有圆形的通孔4，通孔4所在的区域为电极区，透明胶带3覆盖的区域为绝缘区，其余区域为导线区；透明胶带3的长为2.5cm，宽为1.2cm，通孔4的直径为10mm，通孔4的圆心距离PET薄膜1的前端之间的距离为7mm，以此构成制备适配体修饰电极的电极基底，
步骤四、将含有0.05μM Tris-(2-carboxyethyl)phosphine(TCEP)的浓度为1μM的双酚A适配体溶液(用pH值为8的Tris-HCl，PBS或Tris-EDTA等缓冲溶液均可)100μL滴涂在电极区的表面，放置于4℃的冰箱内12h，用去离子水冲洗电极区的表面，氮气吹干，得到双酚A适配体修饰的金纳米粒子电极，如图4所示；双酚A适配体的核苷酸序列如序列表中SEQID NO:1所示，具体为5′-HS-CCG GTG GGT GGTCAG GTG GGATAG CGT TCC GCG TAT GGC CCAGCG CAT CAC GGG TTC GCA CCA-3′。
步骤五、采用MCH(6-巯基己醇，CAS号1633-78-9)溶液对电极区的表面进行钝化：取100μL浓度为1mM的MCH滴涂于电极区的表面，在室温下静置2h后用去离子水冲洗，氮气吹干，如图5所示。
步骤六、将0.1mM的MB滴涂在电极区的表面，室温下静置2h，去离子水冲洗并氮气吹干，得到修饰后的工作电极，如图6所示。
(2)标准工作溶液的配制：配制不同浓度的双酚A标准溶液，浓度分别为0.1μg/L,1μg/L,10μg/L,100μg/L,500μg/L,700μg/L,1000μg/L；
(3)采用本发明的方法制备得到的可抛式双酚A适配体的生物传感器进行测定，测定前，将不同浓度的双酚A标准溶液滴涂在电极区的表面，室温下反应30min，然后用去离子水充分冲洗，氮气吹干；
电化学检测及线性曲线：将可抛式双酚A适配体的生物传感器作为工作电极，以铂电极为对电极6，Ag/AgCl电极作为参比电极5，组成三电极体系，在pH值为7的0.5mM磷酸缓冲溶液中进行线性扫描伏安LSV测定，扫描速率为50mVs-1，扫描范围为-0.4V—+0.2V。
实施例3
溶液中痕量双酚A的测定方法，包括如下步骤：
(1)制备可抛式双酚A适配体的生物传感器：
步骤一、清洗PET薄膜1，并在其上溅射一层纳米尺度的金膜2；
PET薄膜1的清洗方法如下：先用无水乙醇超声清洗两次，去除表面的有机物，然后用离子水清洗两次，60℃烘箱烘干。PET薄膜1长为4.8cm，宽为4cm，
金膜2采用高真空离子溅射仪(徕卡EM SCD500)溅射，溅射时间为80s，溅射电流为20mA，溅射真空度不低于6×10-3mbar，靶材距样品台的距离为9cm，溅射后的金膜1的厚度为16-20nm。
步骤二、将溅射好的PET薄膜1取出，裁剪成工作电极的尺寸，工作电极长为4cm，宽为1.2cm，
步骤三、在金膜2上设置有透明胶带3(粘贴)，在透明胶带3上设置有圆形的通孔4，通孔4所在的区域为电极区，透明胶带3覆盖的区域为绝缘区，其余区域为导线区；透明胶带3的长为2.5cm，宽为1.2cm，通孔4的直径为10mm，通孔4的圆心距离PET薄膜1的前端之间的距离为7mm，以此构成制备适配体修饰电极的电极基底，
步骤四、将含有0.05μM Tris-(2-carboxyethyl)phosphine(TCEP)的浓度为1μM的双酚A适配体溶液(用pH值为8的Tris-HCl，PBS或Tris-EDTA等缓冲溶液均可)100μL滴涂在电极区的表面，放置于4℃的冰箱内12h，用去离子水冲洗电极区的表面，氮气吹干，得到双酚A适配体修饰的金纳米粒子电极，如图4所示；双酚A适配体的核苷酸序列如序列表中SEQID NO:1所示，具体为5′-HS-CCG GTG GGT GGTCAG GTG GGATAG CGT TCC GCG TAT GGC CCAGCG CAT CAC GGG TTC GCA CCA-3′。
步骤五、采用MCH(6-巯基己醇，CAS号1633-78-9)溶液对电极区的表面进行钝化：取100μL浓度为1mM的MCH滴涂于电极区的表面，在室温下静置2h后用去离子水冲洗，氮气吹干，如图5所示。
步骤六、将0.1mM的MB滴涂在电极区的表面，室温下静置2h，去离子水冲洗并氮气吹干，得到修饰后的工作电极，如图6所示。
(2)标准工作溶液的配制：配制不同浓度的双酚A标准溶液，浓度分别为0.1μg/L,1μg/L,10μg/L,100μg/L,500μg/L,700μg/L,1000μg/L；
(3)采用本发明的方法制备得到的可抛式双酚A适配体的生物传感器进行测定，测定前，将不同浓度的双酚A标准溶液滴涂在电极区的表面，室温下反应30min，然后用去离子水充分冲洗，氮气吹干；
电化学检测及线性曲线：将可抛式双酚A适配体的生物传感器作为工作电极，以铂电极为对电极6，Ag/AgCl电极作为参比电极5，组成三电极体系，在pH值为7的0.5mM磷酸缓冲溶液中进行线性扫描伏安LSV测定，扫描速率为50mVs-1，扫描范围为-0.4V—+0.2V。
得到如图8所示的线性扫描伏安曲线，其峰电流的大小与双酚A溶液的浓度呈线性关系，标准曲线如图9所示。双酚A浓度在0.1ppb-1000ppb范围内呈线性关系。
在本发明中进行了以下优化：
通孔4直径：对5mm、8mm、10mm、12mm等不同的通孔4直径进行了优化，发现随着通孔4尺寸的增大，电极响应信号增强，但是当通孔4尺寸大于10mm后，仪器的噪音也响应增大，且峰型变差。所以最终选用了10mm通孔4作为最佳的电极尺寸。
MB浓度：对0.01、0.02、0.05、0.07、0.1、0.5、1mM等不同浓度的MB进行了优化，结果显示随着MB浓度的升高，响应信号增强，当浓度达到0.1mM时随着浓度的再次升高，响应信号不在增强，所以我们选择0.1mM的MB浓度作为最佳的浓度。
本发明传感器的传感机理：
如图7所示，显示了基于发卡状适配体-MB复合物的生物传感器的工作原理。首先，通过经典的Au-S将硫醇化的适配体固定在Au-PET电极的表面。然后用MCH钝化电极以避免其他物质的非特异性吸附。随后，将MB分子插入BPA中形成ssDNA-MB复合物。据报道，MB能够嵌入DNA的茎杆结构中，并且随着GC碱基含量的增加，MB的结合数量会增加。BPA适配体是一种含有63个碱基的具有茎环结构的发夹状DNA，其GC含量为66.7％，这更有利于MB嵌插。因此单链DNA的这种二级结构能够绑定MB并形成复合物。而当BPA加入溶液中时，适配体优先与BPA结合，并同时打开二级结构，释放插入的MB，从而导致MB分子电化学信号的降低。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 中国检验检疫科学研究院
<120> 一种可抛式双酚A适配体的生物传感器的制备方法
<130> 181
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccggtgggtg gtcaggtggg atagcgttcc gcgtatggcc cagcgcatca cgggttcgca 60
cca 63
Claims (8)
1.一种可抛式双酚A适配体的生物传感器的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤一、清洗PET薄膜(1)，并在其上溅射一层纳米尺度的金膜(2)；
步骤二、将溅射好的所述PET薄膜(1)取出，裁剪成工作电极的尺寸；
步骤三、在所述金膜(2)上设置有透明胶带(3)，在所述透明胶带(3)上设置有圆形的通孔(4)，所述通孔(4)所在的区域为电极区，所述透明胶带(3)覆盖的区域为绝缘区，其余区域为导线区；
步骤四、对所述电极区的表面进行双酚A适配体修饰，得到双酚A适配体修饰的金纳米粒子电极；
步骤五、采用MCH溶液对所述电极区的表面进行钝化；
步骤六、采用MB滴涂在所述电极区的表面，形成适配体-MB复合物，得到修饰后的工作电极。
2.根据权利要求1所述的可抛式双酚A适配体的生物传感器的制备方法，其特征在于：所述金膜(2)采用高真空离子溅射仪溅射，溅射时间为80s-100s，溅射电流为20-30mA，溅射真空度不低于6×10-3mbar，靶材距样品台的距离为9cm，溅射后的所述金膜(1)的厚度为16-20nm。
3.根据权利要求2所述的可抛式双酚A适配体的生物传感器的制备方法，其特征在于：所述双酚A适配体的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，步骤四具体包括如下方法：将含有0.05μM TCEP的浓度为1μM的双酚A适配体溶液100μL滴涂在所述电极区的表面，放置于4℃的冰箱内12h，用去离子水冲洗所述电极区的表面，氮气吹干。
4.根据权利要求3所述的可抛式双酚A适配体的生物传感器的制备方法，其特征在于：步骤五具体包括如下步骤：取100μL浓度为1mM的MCH滴涂于所述电极区的表面，在室温下静置2h后用去离子水冲洗，氮气吹干。
5.根据权利要求4所述的可抛式双酚A适配体的生物传感器的制备方法，其特征在于：步骤六具体包括如下步骤：将0.1mM的MB滴涂在所述电极区的表面，室温下静置2h，去离子水冲洗并氮气吹干，得到修饰后的工作电极。
6.根据权利要求5所述的可抛式双酚A适配体的生物传感器的制备方法，其特征在于：步骤一中所述PET薄膜(1)的清洗方法如下：先用无水乙醇超声清洗两次，去除表面的有机物，然后用离子水清洗两次，60℃烘箱烘干。
7.根据权利要求6所述的可抛式双酚A适配体的生物传感器的制备方法，其特征在于：步骤一中所述PET薄膜(1)长为4.8cm，宽为4cm，步骤二中所述工作电极的长为4cm，宽为1.2cm，所述透明胶带(3)的长为2.5cm，宽为1.2cm，所述通孔(4)的直径为10mm，所述通孔(4)的圆心距离所述PET薄膜(1)的前端之间的距离为7mm。
8.溶液中痕量双酚A的测定方法，其特征在于：包括如下步骤：
标准工作溶液的配制：配制不同浓度的双酚A标准溶液，浓度分别为0.1μg/L,1μg/L,10μg/L,100μg/L,500μg/L,700μg/L,1000μg/L；
采用权利要求1所述的方法制备得到的可抛式双酚A适配体的生物传感器进行测定，测定前，将不同浓度的双酚A标准溶液滴涂在所述电极区的表面，室温下反应30min，然后用去离子水充分冲洗，氮气吹干；
电化学检测及线性曲线：将所述可抛式双酚A适配体的生物传感器作为工作电极，以铂电极为对电极(6)，Ag/AgCl电极作为参比电极(5)，组成三电极体系，在pH值为7.0的0.5mM磷酸缓冲溶液中进行线性扫描伏安LSV测定，扫描速率为50mVs-1，扫描范围为-0.4V—+0.2V。
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