CN108220251A - 一种重组传染性脓疱溶瘤病毒及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种ORFV溶瘤病毒及其制备方法和应用，本发明的重组传染性脓疱溶瘤病毒的制备方法，包括以下步骤：(1)overlap PCR扩增权利要求7所述蛋白的基因p53；(2)连接到pSPV‑EGFP载体，插入p53基因得到重组质粒p53‑pSPV‑EGFP，随后再插入ORFV132基因的左右侧，构建穿梭质粒ORFV132LF‑p53‑pSPV‑EGFP‑ORFV132RF；(3)将其转化宿主菌TOP10，获得阳性重组菌，(4)转染OFTu细胞后荧光鉴定p53和EGFP的融合表达；制得纯化的重组传染性脓疱溶瘤病毒。(5)制得的重组传染性脓疱溶瘤病毒能够在OFTu和多种肿瘤细胞中复制增殖，并有效抑制多种肿瘤细胞生长。本发明在显微镜中即可观察，易于操作，方便快捷，大大缩短了筛选时间。

Description

一种重组传染性脓疱溶瘤病毒及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种重组传染性脓疱溶瘤病毒及其制备方法与应用。
背景技术
溶瘤病毒是一类能特异性感染和杀伤肿瘤细胞的病毒。近几十年来，溶瘤病毒治疗引起了广泛关注，相关研究取得了巨大进展。目前研究最深入的溶瘤病毒包括腺病毒、I型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus,HSV)、痘苗病毒等，它们特异性识别并感染肿瘤细胞，最终导致细胞溶胀而摧毁肿瘤细胞，但无法在正常机体细胞内复制而不具有杀伤作用，理论上具有更高的抗肿瘤效应和更低的副作用。溶瘤病毒具备靶向感染并杀伤肿瘤细胞的能力，基于不同病毒对肿瘤细胞的易感性存在差异，不同的病毒颗粒可作为纳米级药物用于不同肿瘤的治疗。选择性感染肿瘤细胞是病毒的固有属性，适当的改造病毒的衣壳结构可增强病毒对肿瘤细胞的易感性。通过插入或缺失特定基因改造病毒基因组使得病毒能够携带外源治疗分子进入肿瘤细胞从而杀伤肿瘤细胞，并且减弱其对正常细胞的影响。通过体内外试验研究携带增强免疫反应和或促凋亡等基因的溶瘤疫苗能够有效的杀伤肿瘤细胞。多种溶瘤病毒疫苗已经用于肿瘤治疗，其安全性和有效性也得到很好的鉴定。安进(Amgen)的Imlygic(talimogene laherparepvec；T-VEC)是第一个被美国FDA批准的溶瘤病毒疗法。该药物是经过基因改造的HSV1，用于治疗病灶在皮肤和淋巴结，没能通过手术完全清除的黑色素瘤。
羊口疮又称为羊传染性脓疱病，是由羊传染性脓疱病毒(Orf virus,ORFV)引起的急性、皮肤倾向性传染病，其感染对象主要是绵羊和山羊，也可传染人，是一种典型的人兽共患病。羊传染性脓疱病毒(ORFV)是痘病毒科副痘病毒属的主要成员之一，呈砖形或卵圆形，表面呈绳索状纵横交错排列，结构复杂，有核心、侧体和包膜。随着对其分子生物学和免疫学特性研究的逐渐深入，越来越多的证据表明，ORFV有可能成为一种理想的溶瘤病毒载体。与其他痘病毒或腺病毒载体相比，ORFV具有的以下独特的生物学特性使其更适于研制溶瘤病毒：一、ORFV基因在细胞浆中复制转录，不整合到宿主基因组中，安全性高；二、宿主范围比较有限，引起的损伤具有皮肤局限性、快速痊愈，毒性低，未见病毒系统性传播证据；三、快速介导机体的体液和适应性免疫反应，非感染性宿主尤为明显；四、免疫后不产生中和性血清抗体，短期内支持多次免疫接种，即使在抗体存在的情况下仍可介导载体特异的免疫反应；五、可通过靶向敲除病毒的毒力基因从而构建病毒的减毒株；六、作为病毒疫苗载体的基因兼容性大，可复制和表达外源性基因；七、ORFV感染后引起免疫调节分子的分泌，包括粒细胞刺激因子(CSF)、干扰素(IFN)、IL-2、肿瘤坏死因子(TNF-)等。因此，ORFV可能是一种非常理想的溶瘤病毒载体。ORFV基因组长度为138kb，GC含量丰富，推测含有132个基因。其中基因组的两端基因相对不保守，分别为ORF001-ORF008，ORF112-ORF134。这些基因常常与宿主的免疫逃避，免疫调节和病毒的毒力相关。我们实验室前期研究结果表明，通过RNA测序分析，在用ORFV感染人皮肤成纤维细胞HFF-18h后，ORFV132基因的转染水平明显上升。目前关于ORFV132基因的功能研究的报道相对较少，ORFV132编码血管内皮生长因子VEGF-B，介导VEGF-B受体2信号通路，还有研究表明ORFV132与细胞周期有关。总之，ORFV132与炎症的发生发展密切相关。从改造溶瘤病毒的思路出发，选择了敲除ORFV132基因，使得羊口疮病毒的毒力下降，对人类更安全。因此本发明决定敲除ORFV132基因来构建高度减毒株。同时也有研究发现，ORFV132基因的位置非常适合插入外来抗原。最近，有很多关于羊传染性脓疱病毒作为病毒载体成功表达外来抗原的报道：ORFV重组病毒体ORFV D1701表达伪狂犬病病毒(PRV)糖蛋白gC和gD，可用于预防猪的PRV感染，重组病毒体表达典型猪热病病毒蛋白(CSFV)使猪产生免疫，流行性腹泻病毒(PEDV)；兔出血热病毒蛋白(RHDV)；H5血细胞凝集素等等，从而发挥保护性免疫应答作用。这些研究表明ORFV有望成为一种理想的病毒疫苗递送系统。因此，可以将p53这一外来抗原插入到ORFV132基因的位置，以ORFV作为疫苗递送载体，进而发挥p53的功能。
p53是一种重要的抑癌基因，它发挥着多种生物学功能，如调控细胞周期、诱导细胞凋亡、抑制肿瘤血管形成、DNA损伤修复、控制衰老和新陈代谢等。因p53在肿瘤治疗方面有着不可替代的作用，基于p53的抗癌药物开发和治疗的研究始终是生命科学前沿的热点。但是，p53既不是细胞表面蛋白，也不是酶，所以近来用于靶向分子治疗的抗体和低分子量的酶抑制剂都不是p53抗癌药物的最佳选择。而因羊传染性脓疱病毒作为载体的独特优势，使得p53作为一种抗癌疫苗成为可能，为肿瘤预防治疗提供新的干预方法。
羊传染性脓疱病毒株NA1/11是本课题组前期在吉林省农安县患羊口疮病羊身上分离出来的弱毒株。本发明旨在敲除NA1/11的ORFV132基因，使其致病性减弱，构建高度减毒的NA1/11缺陷株。与此同时，在该位置上插入外源基因p53，为构建重组病毒溶瘤载体疫苗奠定基础。目前还没有关于在羊传染性脓疱病毒基因组中插入广谱抑癌基因p53的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种将溶瘤病毒的溶瘤作用和p53的抗肿瘤效应联合起来 产生高效抗癌效果的重组传染性脓疱溶瘤病毒及其制备方法与应用。
为达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：本发明提供了一种新型重组传染性脓疱溶瘤病毒，所述的重组溶瘤病毒为携带P53-EGFP融合蛋白基因的溶瘤病毒。
进一步地，所述融合蛋白具有如下氨基酸序列：
(1)由SEQ ID No.7所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
(2)与序列SEQ ID No.7限定的氨基酸序列同源性在80％至100％编码相同功能蛋白质的氨基酸序列。
(3)SEQ ID No.7所示的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸具有同等活性的由(1)衍生的蛋白。
本发明的一种核酸分子，其编码权利要求1或2所述的融合蛋白。
进一步地，其核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。
本发明所述的重组传染性脓疱溶瘤病毒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)overlap PCR扩增权利要求7所述蛋白的基因p53；
(2)连接到pSPV-EGFP载体，插入p53基因成为重组质粒得到重组质粒p53-pSPV-EGFP，随后再插入ORFV132基因的左右侧，构建穿梭质粒ORFV132LF-p53-pSPV-EGFP-ORFV132RF；利用同源重组的技术将p53和EGFP基因插入到病毒基因组132的位置，从而将ORFV132基因敲除；
(3)将其转化宿主菌TOP10，获得阳性重组菌；
(4)转染OFTu细胞后荧光鉴定p53和EGFP的融合表达；筛选重组羊传染性脓疱病毒缺陷株NA1/11Δ132-GFP和NA1/11Δ132-p53-GFP。；经过6-8轮筛选后，制得纯化的重组传染性脓疱溶瘤病毒。
进一步地，
在步骤(2)中，ORFV132LF-p53-pSPV-EGFP-ORFV132RF的PCR和双酶切：重组质粒条带在6500bp处，PCR扩增条带在700bp处，酶切后两个条带分别在5600bp和700bp；预测的ORFV132LF-p53-pSPV-EGFP-ORFV132RF为6392bp，ORFV132RF为676bp，双酶切后两个条带大小分别为5649bp和676bp；经测序，发现质粒ORFV132LF-p53-pSPV-EGFP-ORFV132RF构建成功。
进一步地，
在步骤(1)中，利用Primer Premier 5软件设计PCR引物：
上游引物Hp53-Fw:具有SEQID NO.1的核苷酸序列；
下游引物Hp53-Rv具有SEQID NO.2的核苷酸序列。
进一步地，
在步骤(2)中，构建重组质粒ORFV132LF-p53-pSPV-EGFP的上下游引物:
上游引物NA1/11-ORFV132L-Fw具有SEQID NO.3的核苷酸序列；
下游引物NA1/11-ORFV132L-Rv具有SEQID NO.4的核苷酸序列；
进一步地，在步骤(2)中，
构建穿梭质粒ORFV132LF-p53-pSPV-EGFP-ORFV132RF的上下游引物:
上游引物NA1/11-ORFV132R-Fw具有SEQID NO.5的核苷酸序列；
下游引物NA1/11-ORFV132R-Rv具有SEQID NO.6的核苷酸序列。
本发明所述的的重组传染性脓疱溶瘤病毒的试剂盒及其在靶向杀伤肿瘤细胞的应用。
有益效果：本发明重组病毒体的传统筛选方法是利用Neo/glu筛选，而本发明则采用EGFP筛选，在显微镜中即可观察，易于操作，方便快捷，大大缩短了筛选时间。
与现有技术相比，本发明具有如下优点:
(1)将重组的羊传染性脓疱病毒缺陷株为载体，插入p53基因，使得ORFV进一步成为溶瘤病毒成为可能。
(2)本发明使用的野生ORFV株为NA1/11弱毒株，再敲除ORFV132基因，成为高度减毒的重组ORFV，离重组羊传染性脓疱病毒作为疫苗递送载体更近一步；
(3)在132基因的位置插入了外源的p53基因，可以利用ORFV强大而独特的免疫调节功能充分发挥p53的作用，对构建溶瘤疫苗有重大意义。缺陷株的构建为进一步制备重组ORFV载体疫苗奠定基础。同时，插入的外源基因p53有多种生物学功能，如抑制细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡等。在本发明中，p53可以借助重组ORFV的优势发挥其生物学功能，为p53诱导凋亡治疗肿瘤提供了一些思路，有助于开发对肿瘤有潜在治疗价值的药物或疫苗。
(4)本发明成功构建出穿梭质粒，经转染及同源重组后筛选出羊传染性脓疱病毒缺陷株NA1/11Δ132-GFP和NA1/11Δ132-p53-GFP。该缺陷株感染OFTu细胞病变程度为：NA1/11>NA1/11Δ132-GFP>NA1/11Δ132-p53-GFP.而感染OFTu细胞后体外生长复制能力与野生株NA1/11无明显差异。因NA1/11为弱毒株且ORFV132基因为主要的致病基因，故敲除ORFV132基因，并在该位置上插入p53基因，成功构建出高度减毒的重组羊传染性脓疱病毒，有望成为一种潜在的溶瘤病毒载体，为构建溶瘤疫苗奠定基础。
附图说明
图1为本发明PCR扩增目的基因p53、ORFV132LF、ORFV132RF图；
图2为本发明的重组质粒p53-pSPV-EGFP的PCR和酶切鉴定图；
图3为本发明的重组质粒ORFV132LF-p53-pSPV-EGFP的PCR和酶切鉴定图；
图4为本发明的重组质粒ORFV132LF-p53-pSPV-EGFP-ORFV132RF的PCR和酶切鉴定图；
图5为本发明的转染OFTu细胞后荧光鉴定p53和EGFP表达图；
图6为本发明的Westernblot鉴定质粒转染后p53和EGFP表达图；
图7为本发明的NA1/11Δ132-GFP和NA1/11Δ132-p53-GFP荧光筛选结果图；
图8为本发明的PCR验证重组羊传染性脓疱病毒体的图谱；
图9为本发明的OFTu细胞经三种病毒株NA1/11，NA1/11Δ132-GFP，NA1/11Δ132-p53-GFP感染后，荧光显微镜观察GFP的表达图；图9A展示了正常的OFTu细胞；图9B是NA1/11感染OFTu细胞后，细胞形态由长梭形变为扁圆形，没有GFP的表达；图9C是NA1/11Δ132-GFP感染OFTu细胞后，细胞形态由长梭形变为扁圆形，GFP表达且大部分定位于细胞质；图9D是NA1/11Δ132-p53-GFP感染OFTu细胞后，细胞形态由长梭形变为扁圆形，GFP表达且大部分定位于细胞核；
图10为本发明的OFTu细胞经NA1/11，NA1/11Δ132-GFP，NA1/11Δ132-p53-GFP刺激后p53和EGFP蛋白表达图；
图11为本发明的NA1/11Δ132-p53-GFP感染OFTu细胞后不同时间点的p53蛋白动态表达图；
图12为本发明的ORFV086在三种病毒中的表达情况图；
图13为本发明的三种病毒感染OFTu后细胞生长曲线分析图；
图14为本发明的三种病毒感染OFTu及多种肿瘤细胞后生长曲线分析图；
图15为本发明的三种病毒对多种结直肠癌细胞增殖活性的影响图谱；
图16为本发明的重组羊传染性脓疱病毒株构建示意图。(1)-(3)为穿梭质粒构建示意图。空载为pSPV-EGFP，然后插入p53基因成为重组质粒p53-pSPV-EGFP。随后再插入ORFV132基因的左右侧，构建穿梭质粒ORFV132LF-p53-pSPV-EGFP-ORFV132RF。利用同源重组的技术将p53和EGFP基因插入到病毒基因组132的位置，从而将ORFV132基因敲除。
具体实施方式
通过以下实施例进一步详细说明本发明，但应注意本发明的范围并不受这些实施例的任何限制。
本发明的一种重组传染性脓疱溶瘤病毒，其为融合蛋白，所述融合蛋白包括P53蛋白和EGFP蛋白。
所述融合蛋白具有如下氨基酸序列：
(1)由SEQ ID No.7所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
(2)与序列SEQ ID No.7限定的氨基酸序列同源性在80％至100％编码相同功能蛋白质的氨基酸序列。
(3)SEQ ID No.7所示的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸具有同等活性的由(1)衍生的蛋白。
本发明的一种核酸分子，其编码权利要求1或2所述的融合蛋白。
其核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。
本发明所述的重组传染性脓疱溶瘤病毒的制备方法，包括以下步骤：
(1)overlap PCR扩增权利要求7所述蛋白的基因p53；
(2)连接到pSPV-EGFP载体，插入p53基因成为重组质粒得到重组质粒p53-pSPV-EGFP，随后再插入ORFV132基因的左右侧，构建穿梭质粒ORFV132LF-p53-pSPV-EGFP-ORFV132RF；利用同源重组的技术将p53和EGFP基因插入到病毒基因组132的位置，从而将ORFV132基因敲除；ORFV132LF-p53-pSPV-EGFP-ORFV132RF的PCR和双酶切：重组质粒条带在6500bp处，PCR扩增条带在700bp处，酶切后两个条带分别在5600bp和700bp；预测的ORFV132LF-p53-pSPV-EGFP-ORFV132RF为6392bp，ORFV132RF为676bp，双酶切后两个条带大小分别为5649bp和676bp；经测序，发现质粒ORFV132LF-p53-pSPV-EGFP-ORFV132RF构建成功。
利用Primer Premier 5软件设计PCR引物：
上游引物Hp53-Fw:具有SEQID NO.1的核苷酸序列；
下游引物Hp53-Rv具有SEQID NO.2的核苷酸序列。
构建重组质粒ORFV132LF-p53-pSPV-EGFP的上下游引物:
上游引物NA1/11-ORFV132L-Fw具有SEQID NO.3的核苷酸序列；
下游引物NA1/11-ORFV132L-Rv具有SEQID NO.4的核苷酸序列；
构建穿梭质粒ORFV132LF-p53-pSPV-EGFP-ORFV132RF
的上下游引物:
上游引物NA1/11-ORFV132R-Fw具有SEQID NO.5的核苷酸序列；
下游引物NA1/11-ORFV132R-Rv具有SEQID NO.6的核苷酸序列。
(3)将其转化宿主菌TOP10，获得阳性重组菌。
(4)转染OFTu细胞后荧光鉴定p53和EGFP的融合表达；筛选重组羊传染性脓疱病毒缺陷株NA1/11Δ132-GFP和NA1/11Δ132-p53-GFP；经过6-8轮筛选后，制得纯化的重组传染性脓疱溶瘤病毒。
本发明所述的的重组传染性脓疱溶瘤病毒的试剂盒及其在靶向杀伤肿瘤细胞的应用。
实施例1
构建重组质粒p53-pSPV-EGFP
(1)目的基因p53的扩增及鉴定
根据无缝克隆试剂盒的要求，以p53为模板，利用Primer Premier5软件设计PCR引物(下划线部分为酶切位点)：
Hp53-Fw:
5’-CAGTGACGCCTCGAGGAATTCATGGAGGAGCCGCAGTCAGA-3’(EcoRⅠ)；SEQ ID No.1
Hp53-Rv:
5’-GCTCACCATGGTGGCGAATTCGTCTGAGTCAGGCCCTTCTGTCTT-3’(EcoRⅠ)。SEQ IDNo.2
根据以下体系进行PCR反应(50μL)如表1所示：
表1
反应条件：
PCR产物进行琼脂糖电泳鉴定，并割胶回收。
(2)pSPV-EGFP酶切及割胶回收如表2所示：
表2
按上述体系于37℃酶切2h，割胶回收。
(3)目的基因与载体连接
按照无缝克隆试剂盒的标准操作步骤将目的基因与载体连接，体系(10μl)如表3所示：
表3
注：当插入目的片段与载体的摩尔比为2:1时，融合效率最高。故最佳用量为：pSPV-EGFP割胶回收：[0.01x 3737bp(载体长度)]ng＝37.27ngP53割胶回收：[0.02x1179bp(插入片段长度)]ng＝23.58ng；阳性反应对照体系如表4所示：
表4
连接产物转化感受态大肠杆菌TOP10，转化约24h后，可见大小适中的单克隆菌落。取3个摇菌管，加入5mL LB培养基和5μL氨苄霉素，挑单克隆于摇菌管中，将摇菌管置于摇床培养过夜。按常规方法提取重组质粒，并进行PCR、双酶切和测序鉴定。
实施例2
构建重组质粒ORFV132LF-p53-pSPV-EGFP
构建重组质粒ORFV132LF-p53-pSPV-EGFP的方法同1。其中上下游引物分别为(下划线部分为酶切位点)：
NA1/11-ORFV132L-Fw：5’-AGTAGGCCTGCGCGCAAGCTTCGTCTTCTCCCGCTGGATAAA-3’(HindⅢ)SEQ ID No.3
NA1/11-ORFV132L-Rv：5’-GACCTGCAGGCATGCAAGCTTGCCTCACCCTTAAAAGTTGG-3’(HindⅢ)SEQ ID No.4；
实施例3
构建穿梭质粒ORFV132LF-p53-pSPV-EGFP-ORFV132RF和ORFV132LF-pSPV-EGFP-ORFV132RF
构建穿梭质粒ORFV132LF-p53-pSPV-EGFP-ORFV132RF的方法同1。其中上下游引物分别为(下划线部分为酶切位点)：
NA1/11-ORFV132R-Fw：5’-CGCATGCATCCGCGGAGATCTCAACTTTTTATGGACCGCAG-3’(BglⅡ)SEQ ID No.5；
NA1/11-ORFV132R-Rv：5’-TATAGGGAGACCGGCAGATCTGCGGGATGCTGGTCTAATCAC TA-3’(BGLⅡ)SEQ ID No.6；
另外穿梭质粒ORFV132LF-pSPV-EGFP-ORFV132RF根据ORFV132LF-p53-pSPV-EGFP-ORFV132RF经EcoRⅠ酶切后即可得到。
构建穿梭质粒的示意图如下图16中的(1)-(3)，穿梭质粒构建完成后测序鉴定。重组羊传染性脓疱病毒株建示意图如图16所示：
(1)-(3)为穿梭质粒构建示意图。
空载为pSPV-EGFP，然后插入p53基因成为重组质粒p53-pSPV-EGFP。随后再插入ORFV132基因的左右侧，构建穿梭质粒ORFV132LF-p53-pSPV-EGFP-ORFV132RF。利用同源重组的技术将p53和EGFP基因插入到病毒基因组132的位置，从而将ORFV132基因敲除。
实施例4
转染OFTu细胞及同源重组
复苏OFTu细胞，加入到含有培养基(10％MEM)的培养皿(10cm2)中，摇匀后于孵箱(37℃，5％CO2)中培养。细胞计数，按5x 105/孔的数量加入到六孔板中。待OFTu细胞长到70-80％的融合度时即可转染(转染六孔板中的四个孔)。
转染前2h，每孔加入NA1/11(MOI＝1)感染OFTu细胞。取8个EP管，在每个EP管中各加入100μL opti-MEM，然后在4个EP管中的opti-MEM内分别加入2μg质粒pSPV-EGFP、p53-pSPV-EGFP、ORFV132LF-p53-pSPV-EGFP-ORFV132RF和ORFV132LF-pSPV-EGFP-ORFV132RF，充分混匀，放置5min。将4管含质粒的opti-MEN分别与4管opti-MEM充分混匀，放置15min。吸掉六孔板中的培养基，再加入1mL opti-MEM。将EP管中含质粒的液体一滴一滴缓慢加入六孔板中，3h后加入1mL的有血清培养基，6h后换液。转染24h后于荧光显微镜中观察是否有绿色荧光，从而初步判断p53是否表达。48h后收样，先去掉培养基，用PBS洗一遍，再加入100μL1x SDS-Loading buffer充分裂解，用细胞刮子刮细胞，然后收于EP管中，煮样15min，14000rpm离心后于-20℃保存用于后续Westernblot检测鉴定p53的表达。
实施例5
筛选重组羊传染性脓疱病毒缺陷株NA1/11Δ132-GFP和NA1/11Δ132-p53-GFP。
(1)96孔板初步筛选
1)按上述方法转染，质粒分别为ORFV132LF-pSPV-EGFP-ORFV132RF和ORFV132LF-p53-pSPV-EGFP-ORFV132RF。
2)48h后收集细胞上清(病毒液)。
3)反复冻融3次后，800rpm离心5min。
4)加病毒的前一天按10000个OFTu细胞/孔的量铺96孔板。
5)取100μL上清加入含有900μL的EP管中，从10-1-10-11进行梯度稀释。
6)96孔板的1-10列的前7个孔加已经稀释好的病毒液100μL，第12列和第8行各加100μL的有血清培养基作空白对照。
7)48h后，在荧光显微镜下观察拍照，用小枪头刮取稀释倍数比较高的强荧光细胞于装有150μL培养基的EP管中，反复冻融3次后进行下一轮筛选。
(2)六孔板进行噬菌斑筛选
1)铺OFTu细胞于六孔板中，每孔细胞数为3x 105。
2)将经过3-4轮筛选的病毒液反复冻融3次后，800rpm离心5min，按10-1-10-5梯度稀释，加入到六孔板中即达到梯度稀释的效果。
3)2h后，去除培养上清，每孔加入2mL含有5％FBS和0.5％低熔点琼脂糖的MEM培养基。
4)48h后，在荧光显微镜下观察，有绿色荧光处用Marker笔做标记，中枪头挑取单克隆，置于含有150μL的EP管中-80℃保存，用于下一轮筛选。
5)经过6-8轮筛选后，即可得到纯化的重组病毒。
6)将经过筛选后的病毒加入六孔板中进行扩大培养，提取病毒DNA并进行PCR验证。
实施例6
NA1/11Δ132-GFP和NA1/11Δ132-p53-GFP感染OFTu细胞后观察GFP、p53和ORFV086表达情况
(1)培养并浓缩病毒
1)75cm2培养瓶培养30瓶OFTu细胞，每十瓶各加入病毒液NA1/11，NA1/11Δ132-GFP和NA1/11Δ132-p53-GFP 500μL；
2)5d后，用细胞刮子刮取细胞，收集于50mL离心管中，37℃反复冻融3次；
3)4000rpm离心10min；
4)取上清，14000rpm离心1h；
5)弃上清，用5mLPBS重悬；
6)14000rpm离心1h；
7)7mL PBS重悬，分装于7个EP管中，每个EP管1mL,-80℃重悬；
(2)测定病毒滴度
1)铺3个96孔板，每孔10000个OFTu；
2)第二天取100μL反复冻融后的病毒上清于装有900μLMEM的EP管中，进行梯度稀释(10-1-10-11)；
3)3个96孔板的1-10列的前7个孔加已经稀释好的病毒液(NA1/11,NA1/11Δ132-GFP和NA1/11Δ132-p53-GFP各100μL，第12列和第8行各加100μL的有血清培养基作空白对照；
4)7d后显微镜观察每列细胞的病变数，根据半数致死量(TCID50)来计算病毒的滴度。
(3)比较三种病毒感染后的细胞病变程度及观察GFP、p53和ORFV086的表达。
1)铺4个六孔板的OFTu细胞，每孔细胞数为3x 105；
2)按MOI＝1，用三种病毒(NA1/11,NA1/11Δ132-GFP和NA1/11Δ132-p53-GFP分别感染OFTu细胞，48h后在荧光显微镜下拍照观察GFP表达情况，另一个孔作为阴性对照；
3)拍照后用150μL 1x SDS loading buffer收样，Western blot检测GFP、p53和ORFV086的表达；
实施例7
NA1/11,NA1/11Δ132-GFP和NA1/11Δ132-p53-GFP感染OFTu细胞后体外复制生长能力测定；
1)铺3个六孔板的OFTu细胞，每孔细胞数为3x 105；
2)按MOI＝1，用三种病毒(NA1/11,NA1/11Δ132-GFP和NA1/11Δ132-p53-GFP。)分别感染OFTu细胞，1h后给细胞换液；
3)分别在1h，24h，36h，48h，72h，96h收样；
4)根据各个时间点收样来测病毒的TCID50(方法同上)，从而比较三种病毒的体外复制能力是否有差别。
实施例8
观察NA1/11,NA1/11Δ132-GFP和NA1/11Δ132-p53-GFP对肿瘤细胞生长和增殖的影响
(1)病毒在肿瘤细胞中的复制增殖能力的检测(TCID50)
1)于6孔板中铺加各种肿瘤细胞8x105个/孔，每种细胞铺7个孔；
2)铺细胞24小时后，分别加入三种病毒(MOI＝1)刺激肿瘤细胞；
3)2小时后细胞换液后，收集一个孔的各肿瘤细胞及上清(第一个时间点)；
4)随后在细胞换液后的不同时间点(12、24、36、48、60、72小时)收集另外各孔的细胞及上清；
5)将收集到的细胞及上清于37℃水浴及-80℃中反复冻融三次，4000rcf离心10分钟收集上清；
6)检测步骤5中各上清的病毒浓度并绘制病毒在不同肿瘤细胞中的生长曲线(TCID50)。
(2)CCK-8检查三种病毒对肿瘤细胞生长的影响
1)于96孔板中铺加各种肿瘤细胞104个/孔，每种细胞铺12个孔；
2)铺细胞24小时后，按不同滴度(MOI＝0、1、10、100)分别加入三种病毒刺激肿瘤细胞，每个滴度设置3个复孔；
3)病毒刺激24小时后，加入CCK-8检测试剂(使用含10％FBS的培养基按每孔10ul的原液将CCK-8试剂稀释至100ul工作液)，在5％CO2、37℃的细胞培养箱中孵育2小时；
4)使用酶标仪，在波长等于450nm下，检测并记录各孔数值。
试验1
图1PCR成功扩增目的基因p53、ORFV132LF、ORFV132RF
1:DNAmarkerDL2000
2&3:the PCRproducts ofp53
4&5:the PCRproduct ofORFV132LF
6&7:the PCRproduct ofORFV132RF
PCR扩增目的基因结果如图1：以p53基因、NA1/11为模板，设计p53、ORFV132LF、ORFV132RF引物，扩增目的片段。图1可见，在1200bp、800bp、700bp处可见一清晰条带，预测的p53为1179bp、132LF为743bp、132RF为676bp，大小相符。所以，PCR已成功扩增出目的基因p53、ORFV132LF、ORFV132RF。
试验2
图2重组质粒p53-pSPV-EGFP的PCR和酶切鉴定
1：DNA分子量标准，
2&3:质粒pSPV-EGFP
4&5:重组质粒p53-pSPV-EGFP的PCR产物
6&7:重组质粒p53-pSPV-EGFP的酶切产物
p53-pSPV-EGFP的PCR和双酶切结果如图2:重组质粒条带在5000bp处，PCR扩增条带在1200bp处，酶切后两个条带分别在1200bp和4000bp左右。预测的p53-pSPV-EGFP为4896bp，p53为1179bp，双酶切后两个条带大小分别为3727bp和1179bp。经测序，发现质粒p53-pSPV-EGFP构建成功。
试验3
图3重组质粒ORFV132LF-p53-pSPV-EGFP的PCR和酶切鉴定1：DNA分子量标准
2&3:重组质粒p53-pSPV-EGFP
4&5:重组质粒ORFV132LF-p53-pSPV-EGFP的PCR产物
6&7:重组质粒ORFV132LF-p53-pSPV-EGFP的酶切产物
ORFV132LF-p53-pSPV-EGFP的PCR和双酶切结果如图3，重组质粒条带在5600bp处，PCR扩增条带在800bp处，酶切后两个条带分别在5000bp和800bp左右。预测的ORFV132LF-p53-pSPV-EGFP为5649bp，ORFV132LF为743bp，双酶切后两个条带大小分别为4896bp和743bp。经测序，发现质粒ORFV132LF-p53-pSPV-EGFP构建成功。
试验4
图4为本发明的重组质粒ORFV132LF-p53-pSPV-EGFP-ORFV132RF的PCR和酶切鉴定
1：DNA分子量标准
2&3:重组质粒ORFV132LF-p53-pSPV-EGFP
4&5:重组质粒ORFV132LF-p53-pSPV-EGFP-ORFV132RF的PCR产物
6&7:重组质粒ORFV132LF-p53-pSPV-EGFP-ORFV132RF的酶切产物
ORFV132LF-p53-pSPV-EGFP-ORFV132RF的PCR和双酶切结果如图4，重组质粒条带在6500bp处，PCR扩增条带在700bp处，酶切后两个条带分别在5600bp和700bp左右。预测的ORFV132LF-p53-pSPV-EGFP-ORFV132RF为6392bp，ORFV132RF为676bp，双酶切后两个条带大小分别为5649bp和676bp。经测序，发现质粒ORFV132LF-p53-pSPV-EGFP-ORFV132RF构建成功。
试验5
图5为本发明的转染OFTu细胞后荧光鉴定p53和EGFP表达图
质粒转染后，48h观察荧光信号，拍照如图5：图5A为pSPV-EGFP转染后，可见有绿色荧光分布于整个细胞质；图5B为p53-pSPV-EGFP转染后，可见有绿色荧光分布于细胞核，而p53定位于细胞核，初步判断有p53的表达；图5C为ORFV132LF-pSPV-EGFP-ORFV132RF转染后，可见有绿色荧光分布于整个细胞质；图5D为ORFV132LF-p53-pSPV-EGFP-ORFV132RF可见有绿色荧光分布于细胞核，而p53定位于细胞核，初步判断有p53的表达。
试验6
图6为本发明的Westernblot鉴定质粒转染后p53和EGFP表达
质粒转染后，用Westernblot鉴定p53和EGFP的表达。由图6所示：第一个孔为pSPV-EGFP转染后，一抗为抗GFP，条带大小为27kDa，说明GFP表达；第二个孔为p53-pSPV-EGFP转染后，一抗为抗GFP，条带大小为80kDa，说明GFP和p53融合表达；第三个孔为ORFV132LF-pSPV-EGFP-ORFV132RF转染后，一抗为抗GFP，条带大小为27kDa，说明GFP表达；第四个孔为ORFV132LF-p53-pSPV-EGFP-ORFV132RF转染后，一抗为抗GFP，条带大小为80kDa，说明GFP和p53融合表达；第五个孔为ORFV132LF-pSPV-EGFP-ORFV132RF转染后，一抗为抗p53，没有条带，说明没有p53表达；第六个孔为ORFV132LF-p53-pSPV-EGFP-ORFV132RF转染后，一抗为抗p53，条带大小为80kDa，说明GFP和p53融合表达；所以，经Westernblot鉴定，重组质粒ORFV132LF-p53-pSPV-EGFP-ORFV132RF转染后p53和EGFP成功表达。
试验7
图7为本发明的荧光筛选携带EGFP和p53的重组病毒NA1/11Δ132-GFP和NA1/11Δ132-p53-GFP
荧光筛选结果如图7，NA1/11Δ132-GFP和NA1/11Δ132-p53-GFP感染OFTu后，观察到有绿色荧光，其中NA1/11Δ132-GFP感染后绿色荧光定位于细胞质，NA1/11Δ132-p53-GFP定位于细胞核。经Merge后，发现绿色荧光和细胞重合。
试验8
图8为本发明的PCR验证纯化的重组羊传染性脓疱病毒纯度
1：模板为NA1/11，引物为ORFV132，在约400bp处出现一条带，132基因扩增成功
2：模板为NA1/11Δ132-GFP，引物为ORFV132，未出现条带
3：模板为NA1/11Δ132-p53-GFP，引物为ORFV132，未出现条带
4：模板为NA1/11，引物为EGFP，未出现条带
5：模板为NA1/11Δ132-GFP，引物为EGFP，在约700bp处有一条带，说明EGFP基因扩增成功
6：模板为NA1/11Δ132-p53-GFP，引物为EGFP，在约700bp处有一条带，说明EGFP基因扩增成功
7：模板为NA1/11，引物为p53，未出现条带
8：模板为NA1/11Δ132-GFP，引物为p53，未出现条带
9：模板为NA1/11Δ132-p53-GFP，引物为p53，在约1200左右有一条带，说明p53基因扩增成功
NA1/11Δ132-GFP和NA1/11Δ132-p53-GFP经纯化后，用PCR验证纯度。由图8可知，NA1/11Δ132-GFP和NA1/11Δ132-p53-GFP缺陷株纯化成功。
试验9
图9为本发明的三种病毒NA1/11、NA1/11Δ132-GFP、NA1/11Δ132-p53-GFP感染OFTu细胞后，荧光显微镜鉴定GFP的表达
图9展示了OFTu细胞经三种病毒株NA1/11，NA1/11Δ132-GFP，NA1/11Δ132-p53-GFP刺激后，GFP的表达情况。图9A展示了正常的OFTu细胞；图9B是NA1/11感染OFTu细胞后，细胞形态由长梭形变为扁圆形，没有GFP的表达；图9C是NA1/11Δ132-GFP感染OFTu细胞后，细胞形态由长梭形变为扁圆形，GFP表达且大部分定位于细胞质；图9D是NA1/11Δ132-p53-GFP感染OFTu细胞后，细胞形态由长梭形变为扁圆形，GFP表达且大部分定位于细胞核。
试验10
图10为本发明的Western blot鉴定OFTu细胞经NA1/11，NA1/11Δ132-GFP，NA1/11Δ132-p53-GFP(MOI：5)刺激后p53和EGFP蛋白表达图
1：OFTu细胞，未经病毒刺激
2：OFTu细胞经NA1/11刺激
3：OFTu细胞经NA1/11Δ132-GFP刺激
4：OFTu细胞经NA1/11Δ132-p53-GFP刺激
GFP和p53表达情况如图10所示，
(1)用抗p53抗体作为一抗，发现OFTu细胞经NA1/11Δ132-p53-GFP刺激后，GFP和p53融合表达，大小为80kDa；
(2)用抗GFP的抗体作为一抗，发现OFTu细胞经NA1/11Δ132-GFP刺激后，GFP表达，大小为27kDa；
(3)用抗GFP的抗体作为一抗，发现OFTu细胞经NA1/11Δ132-p53-GFP刺激后，GFP和p53融合表达，大小为80kDa。
试验11
图11为本发明的NA1/11Δ132-p53-GFP感染OFTu细胞后不同时间点的p53蛋白动态表达图
图11为本发明的OFTu细胞经NA1/11Δ132-p53-GFP感染后在0h、12h、24h、36h、48h、72h的p53表达情况，图中可见在12小时及以后均有p53和GFP蛋白的融合表达，大小为80kDa。GAPDH为内参平衡蛋白。
试验12
图12为本发明的NA1/11、NA1/11Δ132-GFP和NA1/11Δ132-p53-GFP感染OFTu后，ORFV086蛋白表达图
1：OFTu细胞，未加病毒刺激
2：OFTu细胞经NA1/11刺激后
3：OFTu细胞经NA1/11Δ132-GFP刺激后
4：OFTu细胞经NA1/11Δ132-p53-GFP刺激后
ORFV086蛋白为病毒结构蛋白，是病毒颗粒成熟释放的标志之一。ORFV086在三种病毒中的表达情况如图12。用抗ORFV086的抗体孵育后，三种病毒刺激的OFTu细胞均有ORFV086蛋白的表达，大小分别为20kDa、100kDa。而且由Western blot可知，ORFV086蛋白在NA1/11Δ132-GFP中表达量较其他两种病毒高，而在NA1/11和NA1/11Δ132-p53-GFP中ORFV086表达量相近。其中GAPDH为内参。
试验13
图13为本发明的三种病毒NA1/11，NA1/11Δ132-GFP，NA1/11Δ132-p53-GFP感染OFTu后细胞生长曲线分析图
三种病毒感染后的体外生长复制能力比较如图13所示，痘病毒的复制周期大约20个小时左右，故在0-24h左右，有成熟病毒颗粒释放去感染新的OFTu细胞。24-48h为一个新的复制周期，故在0-48h，病毒复制处于对数生长期。在48h-96h,病毒的复制趋于稳定。将各个时间点的TCID50导入到GraphPad Prism 6软件中绘制生长曲线发现，NA1/11，NA1/11Δ132-GFP，NA1/11Δ132-p53-GFP三种病毒的体外生长复制能力没有统计学差异。
试验14
图14为本发明的三种病毒感染宿主细胞OFTu及多种肿瘤细胞后生长曲线分析图
a.为Na1/11分别感染各种结直肠癌细胞/肺癌细胞/宿主细胞后，绘制病毒增殖曲线
b.为NA1/11Δ132-GFP分别感染各种结直肠癌细胞/肺癌细胞/宿主细胞后，绘制病毒增殖曲线
c.为NA1/11Δ132-p53-GFP分别感染各种结直肠癌细胞/肺癌细胞/宿主细胞后，绘制病毒增殖曲线
d.为宿主细胞OFTu细胞分别感染Na1/11、NA1/11Δ132-GFP、NA1/11Δ132-p53-GFP，绘制病毒增殖曲线
e.为结直肠癌细胞LoVo细胞分别感染Na1/11、NA1/11Δ132-GFP、NA1/11Δ132-p53-GFP绘制病毒增殖曲线
f.为肺癌细胞A549细胞分别感染Na1/11、NA1/11Δ132-GFP、NA1/11Δ132-p53-GFP，绘制病毒增殖曲线
Na1/11、NA1/11Δ132-GFP、NA1/11Δ132-p53-GFP均能在宿主细胞OFTu及多种肿瘤细胞(LoVo、HCT116、CT26、A549、H1299)中增殖复制(a-c)；三种病毒在细胞中的增殖复制能力没有明显差异(d-f)。结果表明，敲除ORFV132基因及插入P53基因并不影响病毒的增殖复制能力。
试验15
图15为本发明的三种病毒对多种结直肠癌细胞增殖活性的影响
a.为Na1/11(MOI：10)分别感染各种结直肠癌细胞后，不同时间点检测细胞存活比例
b.为NA1/11Δ132-GFP(MOI：10)分别感染各种结直肠癌细胞后，不同时间点检测细胞存活比例
c.为NA1/11Δ132-p53-GFP(MOI：10)分别感染各种结直肠癌细胞后，不同时间点检测细胞存活比例
d.为HCT116细胞分别感染Na1/11、NA1/11Δ132-GFP、NA1/11Δ132-p53-GFP(MOI：10)，不同时间点检测细胞存活比例
e.为RKO细胞分别感染Na1/11、NA1/11Δ132-GFP、NA1/11Δ132-p53-GFP(MOI：10)，不同时间点检测细胞存活比例
f.为SW480细胞分别感染Na1/11、NA1/11Δ132-GFP、NA1/11Δ132-p53-GFP(MOI：10)，不同时间点检测细胞存活比例；
野生株病毒Na1/11能够抑制多种结直肠癌细胞(HCT116、RKO、Caco-2、SW480、SW1116、LoVo)的增殖，对LoVo细胞作用最为明显，对SW480细胞作用效果最弱(a)；NA1/11Δ132-GFP对结直肠癌细胞增殖的抑制作用弱于野生株Na1/11(b)；NA1/11Δ132-p53-GFP也能够抑制结直肠癌细胞增殖作用，相对于野生株与ORFV132缺失株，其抑制作用明显增强(c)；在对病毒较敏感的HCT116与RKO细胞系中，病毒感染24h后，三种病毒对HCT116与RKO细胞增殖的抑制作用已经出现统计学差异，其中NA1/11Δ132-p53-GFP最强，Na1/11次之，NA1/11Δ132-GFP最弱(d、e)；而对病毒不敏感SW480细胞系中，病毒感染24h后，野生株Na1/11与ORFV132缺失株NA1/11Δ132-GFP对肿瘤细胞增殖的抑制能力无统计学差异，NA1/11Δ132-p53-GFP与NA1/11Δ132-GFP之间对肿瘤细胞增殖的抑制能力存在统计学差异，在病毒感染72h后，三种病毒之间对肿瘤细胞增殖的抑制能力均有统计学差异，依然为NA1/11Δ132-p53-GFP最强，Na1/11次之，NA1/11Δ132-p53-GFP最弱(f)。
图16为本发明的重组羊传染性脓疱病毒株构建示意图。
(1)-(3)为穿梭质粒构建示意图。空载为pSPV-EGFP，然后插入p53基因成为重组质粒p53-pSPV-EGFP。随后再插入ORFV132基因的左右侧，构建穿梭质粒ORFV132LF-p53-pSPV-EGFP-ORFV132RF。利用同源重组的技术将p53和EGFP基因插入到病毒基因组132的位置，从而将ORFV132基因敲除。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。
序列表
<110> 南方医科大学
<120> 一种重组传染性脓疱溶瘤病毒及其制备方法与应用
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cagtgacgcc tcgaggaatt catggaggag ccgcagtcag a 41
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<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Hp53-Rv引物序列)
<400> 2
gctcaccatg gtggcgaatt cgtctgagtc aggcccttct gtctt 45
<210> 3
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(NA1/11-ORFV132L-Fw引物序列)
<400> 3
agtaggcctg cgcgcaagct tcgtcttctc ccgctggata aa 42
<210> 4
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(NA1/11-ORFV132R-Rv引物序列)
<400> 4
gacctgcagg catgcaagct tgcctcaccc ttaaaagttg g 41
<210> 5
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(NA1/11-ORFV132L-Fw引物序列)
<400> 5
cgcatgcatc cgcggagatc tcaacttttt atggaccgca g 41
<210> 6
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(NA1/11-ORFV132R-Rv引物序列)
<400> 6
tatagggaga ccggcagatc tgcgggatgc tggtctaatc acta 44
<210> 7
<211> 636
<212> PRT
<213> 人工序列(描述氨基酸序列)
<400> 7
Met Glu Glu Pro Gln Ser Asp Pro Ser Val Glu Pro Pro Leu Ser Gln
1 5 10 15
Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn Asn Val Leu
20 25 30
Ser Pro Leu Pro Ser Gln Ala Met Asp Asp Leu Met Leu Ser Pro Asp
35 40 45
Asp Ile Glu Gln Trp Phe Thr Glu Asp Pro Gly Pro Asp Glu Ala Pro
50 55 60
Arg Met Pro Glu Ala Ala Pro Pro Val Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro
65 70 75 80
Thr Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ser Trp Pro Leu Ser Ser Ser
85 90 95
Val Pro Ser Gln Lys Thr Tyr Gln Gly Ser Tyr Gly Phe Arg Leu Gly
100 105 110
Phe Leu His Ser Gly Thr Ala Lys Ser Val Thr Cys Thr Tyr Ser Pro
115 120 125
Ala Leu Asn Lys Met Phe Cys Gln Leu Ala Lys Thr Cys Pro Val Gln
130 135 140
Leu Trp Val Asp Ser Thr Pro Pro Pro Gly Thr Arg Val Arg Ala Met
145 150 155 160
Ala Ile Tyr Lys Gln Ser Gln His Met Thr Glu Val Val Arg Arg Cys
165 170 175
Pro His His Glu Arg Cys Ser Asp Ser Asp Gly Leu Ala Pro Pro Gln
180 185 190
His Leu Ile Arg Val Glu Gly Asn Leu Arg Val Glu Tyr Leu Asp Asp
195 200 205
Arg Asn Thr Phe Arg His Ser Val Val Val Pro Tyr Glu Pro Pro Glu
210 215 220
Val Gly Ser Asp Cys Thr Thr Ile His Tyr Asn Tyr Met Cys Asn Ser
225 230 235 240
Ser Cys Met Gly Gly Met Asn Arg Arg Pro Ile Leu Thr Ile Ile Thr
245 250 255
Leu Glu Asp Ser Ser Gly Asn Leu Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu Val
260 265 270
His Val Cys Ala Cys Pro Gly Arg Asp Arg Arg Thr Glu Glu Glu Asn
275 280 285
Leu Arg Lys Lys Gly Glu Pro His His Glu Leu Pro Pro Gly Ser Thr
290 295 300
Lys Arg Ala Leu Pro Asn Asn Thr Ser Ser Ser Pro Gln Pro Lys Lys
305 310 315 320
Lys Pro Leu Asp Gly Glu Tyr Phe Thr Leu Gln Ile Arg Gly Arg Glu
325 330 335
Arg Phe Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu Lys Asp
340 345 350
Ala Gln Ala Gly Lys Glu Pro Gly Gly Ser Arg Ala His Ser Ser His
355 360 365
Leu Lys Ser Lys Lys Gly Gln Ser Thr Ser Arg His Lys Lys Leu Met
370 375 380
Phe Lys Thr Glu Gly Pro Asp Ser Asp Gly Lys Ala Thr Met Val Ser
385 390 395 400
Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu
405 410 415
Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu
420 425 430
Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr
435 440 445
Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr
450 455 460
Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp
465 470 475 480
Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile
485 490 495
Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe
500 505 510
Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe
515 520 525
Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn
530 535 540
Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys
545 550 555 560
Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu
565 570 575
Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu
580 585 590
Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp
595 600 605
Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala
610 615 620
Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
625 630 635
<210> 8
<211> 1911
<212> DNA
<213> 人工序列(描述核苷酸序列)
<400> 8
atggaggagc cgcagtcaga tcctagcgtc gagccccctc tgagtcagga aacattttca 60
gacctatgga aactacttcc tgaaaacaac gttctgtccc ccttgccgtc ccaagcaatg 120
gatgatttga tgctgtcccc ggacgatatt gaacaatggt tcactgaaga cccaggtcca 180
gatgaagctc ccagaatgcc agaggctgct ccccccgtgg cccctgcacc agcagctcct 240
acaccggcgg cccctgcacc agccccctcc tggcccctgt catcttctgt cccttcccag 300
aaaacctacc agggcagcta cggtttccgt ctgggcttct tgcattctgg gacagccaag 360
tctgtgactt gcacgtactc ccctgccctc aacaagatgt tttgccaact ggccaagacc 420
tgccctgtgc agctgtgggt tgattccaca cccccgcccg gcacccgcgt ccgcgccatg 480
gccatctaca agcagtcaca gcacatgacg gaggttgtga ggcgctgccc ccaccatgag 540
cgctgctcag atagcgatgg tctggcccct cctcagcatc ttatccgagt ggaaggaaat 600
ttgcgtgtgg agtatttgga tgacagaaac acttttcgac atagtgtggt ggtgccctat 660
gagccgcctg aggttggctc tgactgtacc accatccact acaactacat gtgtaacagt 720
tcctgcatgg gcggcatgaa ccggaggccc atcctcacca tcatcacact ggaagactcc 780
agtggtaatc tactgggacg gaacagcttt gaggtgcatg tttgtgcctg tcctgggaga 840
gaccggcgca cagaggaaga gaatctccgc aagaaagggg agcctcacca cgagctgccc 900
ccagggagca ctaagcgagc actgcccaac aacaccagct cctctcccca gccaaagaag 960
aaaccactgg atggagaata tttcaccctt cagatccgtg ggcgtgagcg cttcgagatg 1020
ttccgagagc tgaatgaggc cttggaactc aaggatgccc aggctgggaa ggagccaggg 1080
gggagcaggg ctcactccag ccacctgaag tccaaaaagg gtcagtctac ctcccgccat 1140
aaaaaactca tgttcaagac agaagggcct gactcagacg aattcgccac catggtgagc 1200
aagggcgagg agctgttcac cggggtggtg cccatcctgg tcgagctgga cggcgacgta 1260
aacggccaca agttcagcgt gtccggcgag ggcgagggcg atgccaccta cggcaagctg 1320
accctgaagt tcatctgcac caccggcaag ctgcccgtgc cctggcccac cctcgtgacc 1380
accctgacct acggcgtgca gtgcttcagc cgctaccccg accacatgaa gcagcacgac 1440
ttcttcaagt ccgccatgcc cgaaggctac gtccaggagc gcaccatctt cttcaaggac 1500
gacggcaact acaagacccg cgccgaggtg aagttcgagg gcgacaccct ggtgaaccgc 1560
atcgagctga agggcatcga cttcaaggag gacggcaaca tcctggggca caagctggag 1620
tacaactaca acagccacaa cgtctatatc atggccgaca agcagaagaa cggcatcaag 1680
gtgaacttca agatccgcca caacatcgag gacggcagcg tgcagctcgc cgaccactac 1740
cagcagaaca cccccatcgg cgacggcccc gtgctgctgc ccgacaacca ctacctgagc 1800
acccagtccg ccctgagcaa agaccccaac gagaagcgcg atcacatggt cctgctggag 1860
ttcgtgaccg ccgccgggat cactctcggc atggacgagc tgtacaagta a 1911

Claims (10)

1.一种重组传染性脓疱溶瘤病毒，其特征在于：所述重组溶瘤病毒为携带P53-EGFP融合蛋白基因的溶瘤病毒，所述融合蛋白包括P53蛋白和EGFP蛋白。
2.根据权利要求1所述的重组传染性脓疱溶瘤病毒，其特征在于：所述融合蛋白具有如下氨基酸序列：
(1)由SEQ ID No.7所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
(2)与序列SEQ ID No.7限定的氨基酸序列同源性在80％至100％编码相同功能蛋白质的氨基酸序列。
(3)SEQ ID No.7所示的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸具有同等活性的由(1)衍生的蛋白。
3.一种核酸分子，其编码权利要求1或2所述的融合蛋白。
4.根据权利要求3所述的核酸分子，其核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。
5.权利要求1所述的重组传染性脓疱溶瘤病毒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)overlap PCR扩增权利要求7所述蛋白的基因p53；
(2)连接到pSPV-EGFP载体，插入p53基因成为重组质粒得到重组质粒p53-pSPV-EGFP，随后再插入ORFV132基因的左右侧，构建穿梭质粒ORFV132LF-p53-pSPV-EGFP-ORFV132RF；利用同源重组的技术将p53和EGFP基因插入到病毒基因组132的位置，从而将ORFV132基因敲除；
(3)将其转化宿主菌TOP10，获得阳性重组菌；
(4)转染OFTu细胞后荧光鉴定p53和EGFP的融合表达；筛选重组羊传染性脓疱病毒缺陷株NA1/11Δ132-GFP和NA1/11Δ132-p53-GFP；经过6-8轮筛选后，制得纯化的重组传染性脓疱溶瘤病毒。
6.根据权利要求5所述的重组传染性脓疱溶瘤病毒的制备方法，其特征在于：
在步骤(2)中，ORFV132LF-p53-pSPV-EGFP-ORFV132RF的PCR和双酶切：重组质粒条带在6500bp处，PCR扩增条带在700bp处，酶切后两个条带分别在5600bp和700bp；预测的ORFV132LF-p53-pSPV-EGFP-ORFV132RF为6392bp，ORFV132RF为676bp，双酶切后两个条带大小分别为5649bp和676bp；经测序，发现质粒ORFV132LF-p53-pSPV-EGFP-ORFV132RF构建成功。
7.根据权利要求5所述的重组传染性脓疱溶瘤病毒的制备方法，其特征在于：在步骤(1)中，利用Primer Premier 5软件设计PCR引物：
上游引物Hp53-Fw:具有SEQID NO.1的核苷酸序列；
下游引物Hp53-Rv具有SEQID NO.2的核苷酸序列。
8.根据权利要求5所述的重组传染性脓疱溶瘤病毒的制备方法，其特征在于：在步骤(2)中，构建重组质粒ORFV132LF-p53-pSPV-EGFP的上下游引物:
上游引物NA1/11-ORFV132L-Fw具有SEQID NO.3的核苷酸序列；
下游引物NA1/11-ORFV132L-Rv具有SEQID NO.4的核苷酸序列；
9.根据权利要求5所述的重组传染性脓疱溶瘤病毒的制备方法，其特征在于：在步骤(2)中，构建穿梭质粒ORFV132LF-p53-pSPV-EGFP-ORFV132RF的上下游引物:
上游引物NA1/11-ORFV132R-Fw具有SEQID NO.5的核苷酸序列；
下游引物NA1/11-ORFV132R-Rv具有SEQID NO.6的核苷酸序列。
10.权利要求1-9任一项所述的的重组传染性脓疱溶瘤病毒的试剂盒及其在靶向杀伤肿瘤细胞的应用。
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