CN108066370A

CN108066370A - 一种羊传染性脓疱病毒在制备抗结直肠癌细胞药物中的应用

Info

Publication number: CN108066370A
Application number: CN201810142962.9A
Authority: CN
Inventors: 罗树红; 成敏; 郝文波; 陈达香; 龙銘坚; 王勇; 龚道元; 王瑞雪
Original assignee: Foshan University
Current assignee: Foshan University
Priority date: 2018-02-11
Filing date: 2018-02-11
Publication date: 2018-05-25

Abstract

本发明公开了一种羊传染性脓疱病毒在制备抗结直肠癌细胞药物中的应用，本发明的羊传染性脓疱ORFV病毒有效抑制结直肠癌肿瘤细胞生长中的应用。本发明涉及基因改造过的ORFV用做溶瘤病毒，对结肠癌细胞的生长和转移有很强的抑制作用，不参入宿主基因组，对人类安全性好，可以重复接种，潜在疗效好、成本低、毒性小。

Description

一种羊传染性脓疱病毒在制备抗结直肠癌细胞药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种羊传染性脓疱病毒在制备抗结直肠癌细胞药物中的应用。

背景技术

羊传染性脓疱病毒(俗称羊口疮病毒，ORFV)属痘病毒科，副痘病毒属，是羊传染性脓疱病(羊口疮)的病原体。羊传染性脓疱病是一种局限性，高度传染性疾病，以在患羊口唇等处皮肤和黏膜形成丘疹、脓疮、溃疡和结成疣状厚痂为特征。羔羊最易患病，多为群发。由于病毒的抵抗力强，羊群一旦被感染则不易清除，可持续危害羊群多年，给养羊业造成极大的经济损失。ORFV病毒粒子呈砖形或椭圆形，其表面呈绳索样纵横交错排列结构。该病毒是一种高度嗜上皮样病毒，粘膜细胞如角质细胞等是ORFV在体内复制的重要场所。ORFV引发病灶的组织病理学特征包括角化细胞的空泡和肿胀，细胞间质变性，表皮增生显著,表皮内微肿胀，皮下组织中性粒细胞、树突状细胞(DCs)、T细胞和B细胞聚集，痂皮壳形成等。与其它痘病毒感染相比，ORFV感染具有3个特点：1)损伤局限在病毒侵入点附近；2)无病毒血症；3)病毒主要作用于角化细胞。这些特点使ORFV感染成为研究病毒与表皮间相互作用的一个很有吸引力的模型。同时也是细胞分化和调节研究的代表性病原。

ORFV被公认具有强大的宿主免疫调节功能。ORFV可快速介导机体的体液和适应性免疫反应。宿主感染羊传染性脓疱病毒后，固有免疫系统的多种细胞被激活并且诱导趋化因子和细胞因子的分泌，中性粒细胞、自然杀伤(NK)细胞和树突状细胞(DCs)在感染部位募集。在感染的早期阶段，ORFV主要诱导Th1型免疫应答，外周免疫细胞主要分泌IFNγ、TNF-α、IL-6、IL-8、IL-12、IL-18等，继而出现Th2型免疫应答，主要分泌IL-4、IL-10、IL-1受体拮抗剂(IL-1RA)。补体的调理作用和APC介导的抗原提呈是激活免疫反应的重要环节。灭活的ORFV可能是通过TLR依赖性和非依赖性途径来调节其免疫特性[7]。ORFV自身及其编码的部分蛋白具有很好的免疫调节功能。

溶瘤病毒是一类能特异性感染和杀伤肿瘤细胞的病毒。近几十年来，溶瘤病毒治疗引起了广泛关注，相关研究取得了巨大进展。目前研究最深入的溶瘤病毒包括腺病毒、I型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus,HSV)、痘苗病毒等，它们特异性识别并感染肿瘤细胞，最终导致细胞溶胀而摧毁肿瘤细胞，但无法在正常机体细胞内复制而不具有杀伤作用，理论上具有更高的抗肿瘤效应和更低的副作用。溶瘤病毒具备靶向感染并杀伤肿瘤细胞的能力，基于不同病毒对肿瘤细胞的易感性存在差异，不同的病毒颗粒可作为纳米级药物用于不同肿瘤的治疗。选择性感染肿瘤细胞是病毒的固有属性，适当的改造病毒的衣壳结构可增强病毒对肿瘤细胞的易感性。通过插入或缺失特定基因改造病毒基因组使得病毒能够携带外源治疗分子进入肿瘤细胞从而杀伤肿瘤细胞，并且减弱其对正常细胞的影响。通过体内外试验研究携带增强免疫反应和或促凋亡等基因的溶瘤疫苗能够有效的杀伤肿瘤细胞。多种溶瘤病毒疫苗已经用于肿瘤治疗，其安全性和有效性也得到很好的鉴定。安进(Amgen)的Imlygic(talimogenelaherparepvec；T-VEC)是第一个被美国FDA批准的溶瘤病毒疗法。该药物是经过基因改造的HSV1，用于治疗病灶在皮肤和淋巴结，没能通过手术完全清除的黑色素瘤。

结直肠癌(Colorectal cancer)是现今世界上最常见的恶性肿瘤之一，侵袭和转移是导致患者死亡的主要原因。近年来，新型靶向药物的出现，如靶向EGFR的西妥单抗和帕尼单抗，靶向VEGF的贝伐单抗以及VEGF-trap抗体等，给晚期结直肠癌患者带来了明显的生存利益。然而靶向抗体也存在耐药等副作用，成本高，价格昂贵，使其在肿瘤患者中的应用受到很大限制。研发疗效好、成本低、毒性小的溶瘤病毒治疗方法是结直肠癌治疗的一个很好的研究方向。

ORFV具有的以下独特的生物学特性

使其更适于研制溶瘤病毒：一、ORFV基因在细胞浆中复制转录，不整合到宿主基因组中，安全性高；二、宿主范围比较有限，引起的损伤具有皮肤局限性、快速痊愈，毒性低，未见病毒系统性传播证据；三、快速介导机体的体液和适应性免疫反应，非感染性宿主尤为明显；四、免疫后不产生中和性血清抗体，短期内支持多次免疫接种，即使在抗体存在的情况下仍可介导载体特异的免疫反应；五、可通过靶向敲除病毒的毒力基因从而构建病毒的减毒株；六、作为病毒疫苗载体的基因兼容性大，可复制和表达外源性基因；七、ORFV感染后引起免疫调节分子的分泌，包括粒细胞刺激因子(CSF)、干扰素(IFN)、IL-2、肿瘤坏死因子(TNF-)等。因此，ORFV可能是一种非常理想的溶瘤病毒载体。

发明内容

本发明的目的在于提供一种对人类安全性好的羊传染性脓疱病毒在制备抗结直肠癌细胞药物中的应用。

为达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：本发明的一种羊传染性脓疱ORFV病毒在制备抗结直肠癌细胞药物中的应用。

本发明的羊传染性脓疱ORFV病毒有效抑制结直肠癌肿瘤细胞生长中的应用。

本发明的羊传染性脓疱ORFV病毒抑制小鼠皮下成瘤肿瘤组织生长中的应用。

进一步地，所述ORFV病毒在小鼠肿瘤转移模型中抑制肿瘤转移中的应用。

进一步地，所述结直肠癌肿瘤细胞为人的结肠癌细胞Caco-2、HCT116、LoVo、RKO、SW480或SW1116中的一种或几种的组合。

本发明的一种抗结直肠癌细胞药物，其特征在于所述的羊传染性脓疱ORFV病毒为肿瘤靶向的抑制剂。

进一步地，所述的羊传染性脓疱ORFV病毒为杀伤肿瘤细胞的病毒。

有益效果：本发明涉及基因改造过的ORFV用做溶瘤病毒，对结肠癌细胞的生长和转移有很强的抑制作用，不参入宿主基因组，对人类安全性好，可以重复接种，潜在疗效好、成本低、毒性小。

与现有技术相比，本发明具有如下优点:

(1)可在6种结直肠瘤细胞系中复制增殖，并同时降低肿瘤细胞的生存率，抑制结直肠癌6种细胞系生长及转移的作用。

(2)可在小鼠皮下肿瘤模型内抑制肿瘤的生长。

(3)可在小鼠转移瘤模型中抑制肿瘤的转移。从而为结肠癌的用药方案提供了一种潜在的更为安全有效的技术。

附图说明

图1为本发明的羊口疮病毒的示意图；

图2为本发明的ORFV病毒有效抑制结直肠癌肿瘤生长图；

图3为本发明的ORFV病毒抑制小鼠皮下成瘤肿瘤组织生长图；

图4为本发明的ORFV病毒引起结直肠癌肿瘤细胞死亡图(对应实例2)；

图5为本发明的ORFV病毒在细胞水平上对肿瘤细胞迁徙的抑制作用图；

图6为本发明的ORFV病毒在代谢小鼠动物模型中溶瘤效果图。

具体实施方式

通过以下实施例进一步详细说明本发明，但应注意本发明的范围并不受这些实施例的任何限制。

本发明的一种羊传染性脓疱ORFV病毒在制备抗结直肠癌细胞药物中的应用。

本发明的羊传染性脓疱ORFV病毒有效抑制结直肠癌肿瘤细胞生长中的应用。所述ORFV病毒在小鼠肿瘤转移模型中抑制肿瘤转移中的应用。

所述结直肠癌肿瘤细胞为人的结肠癌细胞Caco-2、HCT116、LoVo、RKO、SW480或SW1116中的一种或几种的组合。

所述的羊传染性脓疱ORFV病毒为杀伤肿瘤细胞的病毒。

实施例1

ORFV病毒有效抑制结直肠癌肿瘤生长

可在6种结直肠瘤细胞系中复制增殖，并同时降低肿瘤细胞的生存率，抑制结直肠癌6种细胞系生长及转移的作用,6种人的结肠癌细胞Caco-2、HCT116、LoVo、RKO、SW480和SW1116购于上海细胞库(上海，中国)。小鼠结肠癌细胞CT26是来源于BALB/c小鼠，且保存于实验室。所有结肠癌细胞用含10％的牛血清的DMEM培养基培养。

CCK-8法检测接种于96孔板中密度为每孔103个肿瘤细胞，用不同病毒滴度(MOI＝0、1、5、10)的ORFV刺激肿瘤细胞。分别在0、24、48和72小时收集细胞。去除细胞上清，在37℃，5％的CO₂条件下用CCK-8溶液(10％CCK-8稀释的含10％牛血清的DMEM培养基)培养2小时，在酶标仪(BIO-RAD,iMARK)中测量光密度为450nm激发光的值。

结晶紫染色法

肿瘤细胞接种于24孔板中，密度为106/孔。用不同病毒滴度(MOI＝0、1、5、10)的ORFV刺激肿瘤细胞。分别在0、24、48和72小时收集细胞，用结晶紫溶液(5％结晶紫)对活细胞进行染色。结晶紫(0.5克)溶出100ml PBS。细胞用PBS洗三次清除碎片，500μl甲醇固定5min。PBS除去甲醇洗三次细胞，室温静置10min。结晶紫溶液的细胞染色。污渍被丢弃，盘子再次用PBS清洗三次。

实施例2

ORFV病毒引起结直肠癌肿瘤细胞死亡

流式细胞仪检测ORFV病毒引起的肿瘤细胞凋亡。肿瘤细胞接种于96孔板且密度为每孔106个，加入病毒滴度(MOI＝10)的ORFV或PBS培养24小时后，800RCF，5min收集肿瘤细胞。贴壁细胞，用0.25％胰蛋白酶-EDTA消化(Solabio，北京，中国)，用PBS洗两次，收集在1.5ml干净的EP管中。用流式细胞仪检测细胞凋亡(BD LSR Fortessa)。

实施例3

ORFV病毒抑制小鼠皮下成瘤肿瘤组织生长

于Balb/c小鼠皮下接种CT26(50μL 0.9％NaCl/5 ⅹ 105)细胞建立肿瘤模型，当肿瘤达到200-250mm3时，将小鼠随机分为两组。一组用50μl PBS进行瘤内注射处理，另一组用ORFV(108TCID50，50μL)进行瘤内注射处理。每3天注射一次。12天后处死小鼠，收集小鼠肿瘤和脾脏。在转移模型中，在Balb/c小鼠皮下接种CT26(50μL 0.9％NaCl/5ⅹ10⁵)细胞。24小时后，将小鼠随机分为两组，分别在1，3天和8天对小鼠一组尾静脉注射ORFV(108PFU)，另外一组静脉注射PBS，11天后处死小鼠。收集小鼠脾脏和血清。

收集到的CT26肿瘤和脾脏组织经10％的福尔马林固定后，制作石蜡切片。用肿瘤组织切片对caspase-3(Cell Signaling Technology)进行免疫组化染色，并对脾脏组织切片进行染色。

实施例4

病毒制备方法

在以前的研究中已经分离获得了羊口疮病毒(NA1/11)和绵羊胚胎鼻甲骨(OFTu)细胞。OFTU细胞保存在含有10％牛血清的MEM培养基中。

实施例5

ORFV病毒在细胞水平实验中抑制肿瘤细胞的迁徙，ORFV病毒在小鼠肿瘤转移模型中抑制肿瘤的转移

如图1所示，本发明为本发明的羊口疮病毒的示意图；图1为本发明的羊口疮病毒随着浓度增加，可以感染结肠癌细胞增多；图2为本发明的ORFV病毒有效抑制结直肠癌肿瘤生长图；图3为本发明的ORFV病毒抑制小鼠皮下成瘤肿瘤组织生长图；图4为本发明的ORFV病毒引起结直肠癌肿瘤细胞死亡图(对应实例2)；图5为本发明的ORFV病毒在细胞水平上对肿瘤细胞迁徙的抑制作用图；本发明的羊口疮病毒感染结肠癌细胞后，在细胞水平能抑制肿瘤的迁移。

在(A)和(B)中CT26细胞经不同浓度滴度的羊口疮病毒感染(MOI为0,1,5和10)，而在(C)中LOVO细胞经浓度滴度为MOI为0,0.1和1的病毒感染。(A)病毒感染后在显微镜下观察细胞的生长状态。(B)和(C)划痕试验中羊口疮病毒抑制结肠癌细胞的迁移；

如图6所示，图6为本发明的ORFV病毒在代谢小鼠动物模型中溶瘤效果图。在转移小鼠动物模型中检测ORFVD的溶瘤效果

用Balb/c小鼠静脉注射5 ⅹ 105 CT26细胞建立肿瘤转移模型，在不同的时间点(1.3.8天)对小鼠进行静脉注射108pfu羊口疮病毒或者PBS，并在11天时处死小鼠。对(A)脾脏和(B)肺进行解剖分离并拍照。(C.D)用HE染色对肺肿瘤转移组织学进行评估。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。

Claims

1.一种羊传染性脓疱ORFV病毒在制备抗结直肠癌细胞药物中的应用。

2.权利要求1所述的羊传染性脓疱ORFV病毒有效抑制结直肠癌肿瘤细胞生长中的应用。

3.权利要求1所述的羊传染性脓疱ORFV病毒抑制小鼠皮下成瘤肿瘤组织生长中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述ORFV病毒在小鼠肿瘤转移模型中抑制肿瘤转移中的应用。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述结直肠癌肿瘤细胞为人的结肠癌细胞Caco-2、HCT116、LoVo、RKO、SW480或SW1116中的一种或几种的组合。

6.一种抗结直肠癌细胞药物，其特征在于所述的羊传染性脓疱ORFV病毒为肿瘤靶向的抑制剂。

7.根据权利要求6所述的一种抗结直肠癌细胞药物，其特征在于所述的羊传染性脓疱ORFV病毒为杀伤肿瘤细胞的病毒。