CN108220234A - 一种非前哨淋巴结来源抗肿瘤t细胞的体外扩增方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞的体外扩增方法，该方法包括抗原致敏及免疫抑制阻断、T细胞亚群分离和刺激增殖、T细胞亚群的再刺激和快速增殖及收获四个步骤。具有利于T细胞特异性活化、可提高T细胞抗肿瘤能力、提升肿瘤特异性T细胞数量、操作简便且易于推广的特点。

Description

一种非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞的体外扩增方法
技术领域
本发明属于医疗卫生技术领域，具体来说涉及一种非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞的体外扩增方法。
背景技术
肿瘤免疫治疗，是应用免疫学原理和方法，提高肿瘤细胞的免疫原性和/或对淋巴细胞杀伤的敏感性，激发和增强机体抗肿瘤免疫应答，并应用免疫细胞和/或效应分子输注宿主体内，协同机体免疫系统杀伤肿瘤、抑制肿瘤生长。
在众多肿瘤免疫治疗方案中，“过继性T淋巴细胞输注”是重要的一种，它指将体外激活、扩增的自体或异体抗肿瘤T淋巴细胞输注给患者，杀伤患者体内的肿瘤细胞的过程。
在过继性T细胞免疫治疗中，T细胞的来源主要有两个方面，即外周血及肿瘤组织。其中，最容易采集和分离的是外周血T细胞，但这种来源的T细胞由于远离肿瘤区域(这里主要指非血液系统肿瘤)，未受过肿瘤刺激，因此肿瘤特异性T细胞含量较少；同时大部分外周血T细胞属于分化终末期的效应T细胞，寿命较短，扩增效率较差。所以，目前采用较多的是肿瘤浸润T细胞,即从肿瘤组织中分离的T细胞，这部分T细胞与肿瘤近距离接触，有部分识别肿瘤的能力，但含量少、难于分离，且因处于肿瘤微环境中，抗肿瘤能力受到抑制。
淋巴结是哺乳动物特有的次级免疫器官，其中含有大量淋巴细胞，是发生免疫识别和免疫效应的场所。淋巴结中的淋巴细胞接受刺激以后，会产生大量的细胞因子、免疫活化蛋白和抗体等，能对病原物或肿瘤细胞产生杀伤作用。因此，理论上，淋巴结应是一道免疫屏障，可阻止肿瘤细胞的迁徙与扩散,且淋巴结中存在肿瘤特异性T细胞。
然而，随着肿瘤免疫研究的发展，发现肿瘤微环境(肿瘤细胞与其周围的间质细胞和淋巴细胞等共同组成的局部区域)中的免疫抑制能够阻碍淋巴细胞发挥正常功能。肿瘤转移淋巴结中，肿瘤细胞产生的负向免疫调节能够诱导淋巴细胞向免疫抑制性细胞分化，可以通过分泌免疫检测点蛋白使淋巴细胞失活，甚至逆转淋巴细胞功能向促进肿瘤生长和转移的方向转变。正是因为肿瘤细胞对微环境的这种“驯化”，使得淋巴细胞无法识别肿瘤细胞或者失去本应有的抗肿瘤活性，导致免疫屏障的淋巴结失去屏障功能，甚至变成帮助肿瘤转移的渠道。
因此，挑选合适的淋巴结是得到特异性抗肿瘤T细胞的关键。
研究表明，扩增大量肿瘤特异性T细胞的数量是取得前述过继性T细胞免疫治疗良好效果的关键，回输T细胞的数量与抗肿瘤效果呈正相关。故，获取高效的T细胞体外扩增方法是本领域呈待解决的技术问题。
目前，就已有T细胞的体外扩增方法而言，除T细胞取材、体外激活和扩增过程获得肿瘤特异性T细胞数量不够外，还存在如下3个方面的问题：
(1)采用肿瘤匀浆裂解物作为抗原刺激T细胞增殖，因肿瘤匀浆物成分复杂，其中包含大量死细胞释放的因子和免疫抑制因子，这些成分不利于T细胞的特异性活化；
(2)在培养过程中会造成诱导性的免疫抑制效应(如程序性死亡受体1的升高等)，降低T细胞的抗肿瘤能力；
(3)使用单一细胞因子扩增T细胞，会造成T细胞的亚群极化，使得单一亚群的抗肿瘤功能弱于混合亚群。
发明内容
本发明的目的在于克服前述困难而提供一种利于T细胞特异性活化、可提高T细胞抗肿瘤能力、提升肿瘤特异性T细胞数量、操作简便且易于推广的非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞的体外扩增方法。
本发明的一种非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞的体外扩增方法，包括以下步骤：
(2)抗原致敏及免疫抑制阻断：
a、取体积比为100:2-5的淋巴细胞培养基、胎牛血清混合，得淋巴细胞培养基、胎牛血清混合物；在淋巴细胞培养基、胎牛血清混合物中加入白细胞介素2，调整所述白细胞介素2在淋巴细胞培养基、胎牛血清混合物中的浓度为100-1000单位/毫升，得培养液A，备用；
b、取部分培养液A，加入非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞，调整培养液体积，使所述非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞在培养液A中的密度为1*106-2*106个/毫升，培养12-24小时；
c、另取部分培养液A，加入抗免疫抑制抗体进行免疫抑制阻断，得培养液B，备用；
d、将在培养液A中培养12-24小时后得到的非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞全部吸出，转移至离心管中，离心3-5分钟，离心力为300-350g；离心完成后弃掉上层培养液；
e、在离心完成后弃掉上层培养液的非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞中加入培养液B，调整所述非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞在培养液B中的浓度为0.5*106-1*106个/毫升，培养24-48小时后，加入细胞培养用常规人工合成肿瘤多肽，调整所述细胞培养用常规人工合成肿瘤多肽在所加入体系中的浓度为0.5-1微克/毫升，继续培养24-48小时，得非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞培养物；
(2)T细胞亚群分离和刺激增殖：
采用常规分选方法对非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞培养物进行亚群分选，得到CD4+、CD25-辅助T细胞亚群和CD8+杀伤性T细胞亚群，将两个亚群分别置于X-VIVO培养基中独立培养并加入激活试剂，培养密度为1*105-1*107个/毫升，各组每隔3天进行半量换液，培养9-12天后分别进行细胞计数；
其中，CD4+、CD25-辅助T细胞亚群的激活试剂为：CD3/CD28磁珠及白细胞介素7，调整所述CD3/CD28磁珠在所加入体系中为1-5个/细胞、白细胞介素7的浓度为5-20纳克/毫升；
CD8+杀伤性T细胞亚群的激活试剂为：anti-CD3、白细胞介素7及白细胞介素21，调整所述anti-CD3在所加入体系中的浓度为5-50纳克/毫升、白细胞介素7的浓度为2-20纳克/毫升、白细胞介素21的浓度为1-5纳克/毫升；
(3)T细胞亚群的再刺激和快速增殖：
上阶段培养结束后，加入经15-35千戈瑞X射线辐照的外周血单个核细胞，所述外周血单个核细胞与CD4+、CD25-辅助T细胞亚群和CD8+杀伤性T细胞亚群经培养9-12天后所得细胞的数量比例为100-500:1，加入细胞培养用常规人工合成肿瘤多肽，调整所述细胞培养用人工合成肿瘤多肽在所加入体系中的的浓度为0.5-3微克/毫升，继续培养12-15天，培养过程中控制培养密度为1*106-2*106个/毫升；
(4)收获：
培养结束后，在CD4+、CD25-辅助T细胞亚群和CD8+杀伤性T细胞亚群中分别取样培养细胞，进行微生物、内毒素、流式细胞学和细胞因子分泌分析后，混合两个亚群细胞，即得。
上述的一种非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞的体外扩增方法，其中，所述抗免疫抑制抗体是抗-程序性死亡受体1，调整所述抗-程序性死亡受体1在培养液A中的浓度为5-30微克/毫升即可。
上述的一种非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞的体外扩增方法，其中，所述抗免疫抑制抗体是抗-细胞毒T淋巴细胞相关抗原4，调整所述抗-细胞毒T淋巴细胞相关抗原4在培养液A中的浓度为5-30微克/毫升即可。
上述的一种非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞的体外扩增方法，其中，所述抗免疫抑制抗体是抗-T细胞免疫球蛋白黏蛋白3，调整所述抗-T细胞免疫球蛋白黏蛋白3在培养液A中的浓度为5-30微克/毫升即可。
上述的一种非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞的体外扩增方法，其中，所述抗免疫抑制抗体是抗-程序性死亡受体1、抗-细胞毒T淋巴细胞相关抗原4、抗-T细胞免疫球蛋白黏蛋白3中的任意两种按体积比1:1组合而成，调整所述抗-程序性死亡受体1或抗-细胞毒T淋巴细胞相关抗原4或抗-T细胞免疫球蛋白黏蛋白3在培养液A中的浓度分别为5-30微克/毫升即可。
上述的一种非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞的体外扩增方法，其中，所述抗免疫抑制抗体是抗-程序性死亡受体1、抗-细胞毒T淋巴细胞相关抗原4、抗-T细胞免疫球蛋白黏蛋白3按体积比1:1:1组合而成，调整所述抗-程序性死亡受体1或抗-细胞毒T淋巴细胞相关抗原4或抗-T细胞免疫球蛋白黏蛋白3在培养液A中的浓度分别为5-30微克/毫升即可。
上述的一种非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞的体外扩增方法，其中，所述非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞是指没有肿瘤细胞侵润、位于前哨淋巴结与远端淋巴结之间的肿瘤引流淋巴结。
上述的一种非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞的体外扩增方法，其中，所述非前哨淋巴结T细胞是采如下方法分离得到：
(1)引流淋巴结中段选取淋巴结：
取离体肿瘤组织，于所述离体肿瘤组织上、下、左、右分4点注射专利蓝Paten BlueV，每点推注0.2-1毫升，推注后以纱布吸取注射点多余专利蓝；
按照蓝染淋巴管的走向寻找被蓝染的淋巴结，即肿瘤引流淋巴结TDLNs，其中，第一个或多个被蓝染的淋巴结为前哨淋巴结；
以原发肿瘤为中心，取3-4枚处于前哨淋巴结与远端淋巴结之间，即距离原发肿瘤中心5-7厘米的肿瘤引流淋巴结，每个肿瘤引流淋巴结以最大径为轴；
(2)以流式细胞学鉴定与分离方法去除淋巴结附着的脂肪组织：
将所取肿瘤引流淋巴结切成1-3毫米的小块，加入肿瘤引流淋巴结3-5倍体积的DNA酶及胶原酶于36.5-37.5摄氏度下消化30-60分钟，在消化过程中以注射器针头吹吸3-4次，所述DNA酶及胶原酶按体积比1:1混合；
消化结束后，过筛，取细胞液，用肿瘤细胞特异性染色抗体对所述细胞液染色后进行流式细胞学鉴定，取染色结果为阴性的细胞培养8-15小时；
(3)酶联免疫斑点检测法鉴定：
采用伽马干扰素酶联免疫斑点检测试剂盒，对已培养8-15小时的阴性细胞进行酶联免疫斑点鉴定，选择鉴定结果为阳性的细胞，即得非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞。
上述的一种非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞的体外扩增方法，其中，所述肿瘤细胞特异性染色抗体为上皮细胞粘附分子、细胞角蛋白20、癌坯抗原、细胞糖蛋白199按体积比1:1:1:1组成。
上述的一种非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞的体外扩增方法，其中，所述注射器针头是指21号注射器针头。
本发明与现有技术相比，具有明显有益效果，从以上技术方案可知：本发明所提供的非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞的体外扩增方法，各技术步骤相辅相成，所确定的各培养试剂组合及工艺参数是获得高质、高量肿瘤特异性T细胞的必要条件。
首先，本发明采用非前哨淋巴结来抗肿瘤源T细胞作为体外扩增的起始原料，具有以下优势：(1)淋巴结中T细胞含量丰富，淋巴结是正常机体的器官，不存在不同肿瘤间的差异，因此是一个稳定的T细胞来源；(2)肿瘤区域淋巴结(包括肿瘤细胞浸润淋巴结和非浸润淋巴结)接受过肿瘤抗原刺激，存在肿瘤特异性T细胞；(3)距离原发肿瘤最近的(特别是肿瘤细胞浸润的)淋巴结特异性抗肿瘤能力最弱；距离原发肿瘤太远的淋巴结，由于距离原因无法接收到肿瘤抗原信号，因此也没有特异性抗肿瘤能力；而处在中间的非肿瘤浸润淋巴结(即非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞)由于没有被肿瘤细胞“驯化”，免疫抑制性不强，同时其所处位置又在能接收到肿瘤抗原信号的区域，因此是特异性抗肿瘤能力最强的淋巴结。
其次，本发明在培养过程中联合免疫检测点抑制剂，突破了肿瘤免疫抑制效应，能有效维持T细胞的抗肿瘤活性。
再次，本发明采用人工合成的多肽片段刺激T细胞增殖，一方面增强了T细胞肿瘤特异性，另一方面纯化的多肽不会造成免疫抑制效应。
最后，本发明在免疫识别后即将CD4+、CD25-和CD8+T细胞亚群分开，分别采用两种不同的培养方案进行针对性的扩增，扩增后再混合，能使两个亚群的细胞分别增殖，发挥1+1＞2的抗肿瘤效果。
具有利于T细胞特异性活化、可提高T细胞抗肿瘤能力、提升肿瘤特异性T细胞数量、操作简便且易于推广的的特点。
具体实施方式
以下通过实验例来进一步阐述本发明所述扩增方法的有益效果。
实验例
以本发明实施例3扩增得到的与以常规方法扩增得到的非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞的数量、增殖效率、免疫抑制分子与免疫活化分子表达情况及抗肿瘤能力进行对比，具体为：
1、关于细胞数量：
取数量为1.6*106个的非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞，以本发明实施例3所述方法进行体外扩增，培养完成后计数，所得非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞的总量为413*106个。
取数量同为1.6*106个的非前哨淋巴结来源T细胞，以常规方法进行体外扩增，培养完成后计数，所得非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞的总量为45.6*106个。
该对比实验结果表明：
由于本发明对不同亚群淋巴细胞采用针对性的培养方案，较常规方法而言能获得更多数量的细胞，细胞增殖倍数之比为258:28。
2、关于增殖效率：
将以本发明实施例3扩增得到的与以常规方法扩增得到的非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞进行流式细胞学鉴定，以本发明实施例3扩增得到的增殖活化T淋巴细胞百分比为83.2％，以常规方法扩增得到的增值活化T淋巴细胞百分比为24.4％。
该对比实验结果表明：
本发明使用人工合成多肽进行刺激，并联合免疫抑制阻断抗体，提高了T淋巴细胞的增殖效率；本发明得到的增殖活化T淋巴细胞是常规培养方法的3.41倍。
3、关于免疫抑制分子与免疫活化分子表达情况：
将以本发明实施例3扩增得到的与以常规方法扩增得到的非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞以流式细胞学方法测定其免疫抑制分子与免疫活化分子的表达情况，以本发明实施例3扩增得到的非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞中，免疫抑制分子程序性死亡受体1的表达百分比为2.11％、免疫抑制分子细胞毒T淋巴细胞相关抗原4的表达百分比为2.3％、免疫活化分子CD69的表达百分比为14.51％，以常规方法扩增得到的非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞中，程序性死亡受体1的表达百分比为16.29％、细胞毒T淋巴细胞相关抗原4的表达百分比为22.62％、免疫活化分子CD69的表达百分比为5.67％。
该对比实验结果表明：
本发明在T淋巴细胞的扩增过程中加入了免疫抑制分子的抗体，从而使扩增后产品中免疫抑制分子表达比常规扩增方法低；同时，T淋巴细胞活化分子比例升高。
4、关于抗肿瘤能力：
将以本发明实施例3扩增得到的与以常规方法扩增得到的非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞以ELISPOT，即酶联免疫斑点测定法测定其抗肿瘤能力，以本发明实施例3扩增得到的细胞中分泌γ干扰素的细胞数量为467个，以常规方法扩增得到的细胞中分泌γ干扰素的细胞数量为189个。
该对比实验结果表明：
本发明扩增的非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞特异性抗肿瘤能力是传统方法的2.46倍。
实施例1
一种非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞的体外扩增方法，包括以下步骤：
(1)抗原致敏及免疫抑制阻断：
a、取体积比为100:2的淋巴细胞培养基、胎牛血清混合，得淋巴细胞培养基、胎牛血清混合物；在淋巴细胞培养基、胎牛血清混合物中加入白细胞介素2，调整所述白细胞介素2在淋巴细胞培养基、胎牛血清混合物中的浓度为100单位/毫升，得培养液A，备用；
b、取部分培养液A，加入非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞，调整培养液体积，使所述非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞在培养液A中的密度为1*106个/毫升，培养12小时；
c、另取部分培养液A，加入抗-程序性死亡受体1进行免疫抑制阻断，调整所述抗-程序性死亡受体1在培养液A中的浓度为5微克/毫升，得培养液B，备用；
d、将在培养液A中培养12小时后得到的非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞全部吸出，转移至离心管中，离心3分钟，离心力为300g；离心完成后弃掉上层培养液；
e、在离心完成后弃掉上层培养液的非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞中加入培养液B，调整所述非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞在培养液B中的浓度为0.5*106/毫升，培养24小时后，加入细胞培养用常规人工合成肿瘤多肽，调整所述细胞培养用常规人工合成肿瘤多肽在所加入体系中的浓度为0.5微克/毫升，继续培养48小时，得非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞培养物；
(2)T细胞亚群分离和刺激增殖：
采用常规分选方法对非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞培养物进行亚群分选，得到CD4+、CD25-辅助T细胞亚群和CD8+杀伤性T细胞亚群，将两个亚群分别置于X-VIVO培养基中独立培养并加入激活试剂，培养密度为1*105个/毫升，各组每隔3天进行半量换液，培养9天后分别进行细胞计数；
其中，CD4+、CD25-辅助T细胞亚群的激活试剂为：CD3/CD28磁珠及白细胞介素7，调整所述CD3/CD28磁珠在所加入体系中为1个/细胞、白细胞介素7在所加入体系中的浓度为5纳克/毫升；
CD8+杀伤性T细胞亚群的激活试剂为：anti-CD3、白细胞介素7及白细胞介素21，调整所述anti-CD3在所加入体系中的浓度为5纳克/毫升、白细胞介素7在所加入体系中的浓度为2纳克/毫升、白细胞介素21在所加入体系中的浓度为1纳克/毫升；
(3)T细胞亚群的再刺激和快速增殖：
上阶段培养结束后，加入经15千戈瑞X射线辐照的外周血单个核细胞，所述外周血单个核细胞与CD4+、CD25-辅助T细胞亚群和CD8+杀伤性T细胞亚群经培养9天后所得细胞的数量比例为100:1，加入细胞培养用常规人工合成肿瘤多肽，调整所述细胞培养用人工合成肿瘤多肽在所加入体系中的的浓度为0.5微克/毫升，继续培养12天，培养过程中控制培养密度为1*106个/毫升；
(4)收获：
培养结束后，在CD4+、CD25-辅助T细胞亚群和CD8+杀伤性T细胞亚群中分别取样培养细胞，进行微生物、内毒素、流式细胞学和细胞因子分泌分析后，混合两个亚群细胞，即得。
上述的一种非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞的体外扩增方法，其中：所述非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞是指没有肿瘤细胞侵润、位于前哨淋巴结与远端淋巴结之间的肿瘤引流淋巴结；是采如下方法分离得到：
(1)引流淋巴结中段选取淋巴结：
取离体肿瘤组织，于所述离体肿瘤组织上、下、左、右分4点注射专利蓝Paten BlueV，每点推注0.2毫升，推注后以纱布吸取注射点多余专利蓝；
按照蓝染淋巴管的走向寻找被蓝染的淋巴结，即肿瘤引流淋巴结TDLNs，其中，第一个或多个被蓝染的淋巴结为前哨淋巴结；
以原发肿瘤为中心，取3枚处于前哨淋巴结与远端淋巴结之间，即距离原发肿瘤中心5厘米的肿瘤引流淋巴结，每个肿瘤引流淋巴结以最大径为轴；
(2)以流式细胞学鉴定与分离方法去除淋巴结附着的脂肪组织：
将所取肿瘤引流淋巴结切成1毫米的小块，加入肿瘤引流淋巴结3倍体积的DNA酶及胶原酶于36.5摄氏度下消化30分钟，在消化过程中以注射器针头吹吸3次，所述DNA酶及胶原酶按体积比1:1混合；
消化结束后，过40微米筛网，取细胞液，用肿瘤细胞特异性染色抗体对所述细胞液染色后进行流式细胞学鉴定，取染色结果为阴性的细胞培养8小时；
(3)酶联免疫斑点检测法鉴定：
采用伽马干扰素酶联免疫斑点检测试剂盒，对已培养8小时的阴性细胞进行酶联免疫斑点鉴定，选择鉴定结果为阳性的细胞，即得非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞。
实施例2
一种非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞的体外扩增方法，包括以下步骤：
(1)抗原致敏及免疫抑制阻断：
a、取体积比为100:5的淋巴细胞培养基、胎牛血清混合，得淋巴细胞培养基、胎牛血清混合物；在淋巴细胞培养基、胎牛血清混合物中加入白细胞介素2，调整所述白细胞介素2在淋巴细胞培养基、胎牛血清混合物中的浓度为1000单位/毫升，得培养液A，备用；
b、取部分培养液A，加入非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞，调整培养液体积，使所述非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞在培养液A中的密度为2*106个/毫升，培养24小时；
c、另取部分培养液A，加入抗-细胞毒T淋巴细胞相关抗原4进行免疫抑制阻断，调整所述抗-细胞毒T淋巴细胞相关抗原4在培养液A中的浓度为30微克/毫升，得培养液B，备用；
d、将在培养液A中培养24小时后得到的非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞全部吸出，转移至离心管中，离心5分钟，离心力为350g；离心完成后弃掉上层培养液；
e、在离心完成后弃掉上层培养液的非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞中加入培养液B，调整所述非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞在培养液B中的浓度为1*106个/毫升，培养48小时后，加入细胞培养用常规人工合成肿瘤多肽，调整所述细胞培养用常规人工合成肿瘤多肽在所加入体系中的浓度为1微克/毫升，继续培养24小时，得非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞培养物；
(2)T细胞亚群分离和刺激增殖：
采用常规分选方法对非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞培养物进行亚群分选，得到CD4+、CD25-辅助T细胞亚群和CD8+杀伤性T细胞亚群，将两个亚群分别置于X-VIVO培养基中独立培养并加入激活试剂，培养密度为1*107个/毫升，各组每隔3天进行半量换液，培养12天后分别进行细胞计数；
其中，CD4+、CD25-辅助T细胞亚群的激活试剂为：CD3/CD28磁珠及白细胞介素7，调整所述CD3/CD28磁珠在所加入体系中为5个/细胞、白细胞介素7在所加入体系中的浓度为20纳克/毫升；
CD8+杀伤性T细胞亚群的激活试剂为：anti-CD3、白细胞介素7及白细胞介素21，调整所述anti-CD3在所加入体系中的浓度为50纳克/毫升、白细胞介素7在所加入体系中的浓度为20纳克/毫升、白细胞介素21在所加入体系中的浓度为5纳克/毫升；
(3)T细胞亚群的再刺激和快速增殖：
上阶段培养结束后，加入经35千戈瑞X射线辐照的外周血单个核细胞，所述外周血单个核细胞与CD4+、CD25-辅助T细胞亚群和CD8+杀伤性T细胞亚群经培养12天后所得细胞的数量比例为500:1，加入细胞培养用常规人工合成肿瘤多肽，调整所述细胞培养用人工合成肿瘤多肽在所加入体系中的的浓度为3微克/毫升，继续培养15天，培养过程中控制培养密度为2*106个/毫升；
(4)收获：
培养结束后，在CD4+、CD25-辅助T细胞亚群和CD8+杀伤性T细胞亚群中分别取样培养细胞，进行微生物、内毒素、流式细胞学和细胞因子分泌分析后，混合两个亚群细胞，即得。
上述的一种非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞的体外扩增方法，其中：所述非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞是指没有肿瘤细胞侵润、位于前哨淋巴结与远端淋巴结之间的肿瘤引流淋巴结；是采如下方法分离得到：
(1)引流淋巴结中段选取淋巴结：
取离体肿瘤组织，于所述离体肿瘤组织上、下、左、右分4点注射专利蓝Paten BlueV，每点推注1毫升，推注后以纱布吸取注射点多余专利蓝；
按照蓝染淋巴管的走向寻找被蓝染的淋巴结，即肿瘤引流淋巴结TDLNs，其中，第一个或多个被蓝染的淋巴结为前哨淋巴结；
以原发肿瘤为中心，取4枚处于前哨淋巴结与远端淋巴结之间，即距离原发肿瘤中心7厘米的肿瘤引流淋巴结，每个肿瘤引流淋巴结以最大径为轴；
(2)以流式细胞学鉴定与分离方法去除淋巴结附着的脂肪组织：
将所取肿瘤引流淋巴结切成3毫米的小块，加入肿瘤引流淋巴结3-5倍体积的DNA酶及胶原酶于37.5摄氏度下消化60分钟，在消化过程中以注射器针头吹吸4次，所述DNA酶及胶原酶按体积比1:1混合；
消化结束后，过70微米筛网，取细胞液，用肿瘤细胞特异性染色抗体对所述细胞液染色后进行流式细胞学鉴定，取染色结果为阴性的细胞培养15小时；
(3)酶联免疫斑点检测法鉴定：
采用伽马干扰素酶联免疫斑点检测试剂盒，对已培养15小时的阴性细胞进行酶联免疫斑点鉴定，选择鉴定结果为阳性的细胞，即得非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞。
实施例3
一种非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞的体外扩增方法，包括以下步骤：
(1)抗原致敏及免疫抑制阻断：
a、取体积比为100:3的淋巴细胞培养基、胎牛血清混合，得淋巴细胞培养基、胎牛血清混合物；在淋巴细胞培养基、胎牛血清混合物中加入白细胞介素2，调整所述白细胞介素2在淋巴细胞培养基、胎牛血清混合物中的浓度为500单位/毫升，得培养液A，备用；
b、取部分培养液A，加入非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞，调整培养液体积，使所述非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞在培养液A中的密度为1.5*106个/毫升，培养18小时；
c、另取部分培养液A，加入抗-T细胞免疫球蛋白黏蛋白3，调整所述抗-T细胞免疫球蛋白黏蛋白3在培养液A中的浓度为15微克/毫升，得培养液B，备用；
d、将在培养液A中培养18小时后得到的非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞全部吸出，转移至离心管中，离心4分钟，离心力为325g；离心完成后弃掉上层培养液；
e、在离心完成后弃掉上层培养液的非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞中加入培养液B，调整所述非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞在培养液B中的浓度为0.7*106个/毫升，培养36小时后，加入细胞培养用常规人工合成肿瘤多肽，调整所述细胞培养用常规人工合成肿瘤多肽在所加入体系中的浓度为0.7微克/毫升，继续培养36小时，得非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞培养物；
(2)T细胞亚群分离和刺激增殖：
采用常规分选方法对非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞培养物进行亚群分选，得到CD4+、CD25-辅助T细胞亚群和CD8+杀伤性T细胞亚群，将两个亚群分别置于X-VIVO培养基中独立培养并加入激活试剂，培养密度为1*106个/毫升，各组每隔3天进行半量换液，培养10天后分别进行细胞计数；
其中，CD4+、CD25-辅助T细胞亚群的激活试剂为：CD3/CD28磁珠及白细胞介素7，调整所述CD3/CD28磁珠在所加入体系中为3个/细胞、白细胞介素7在所加入体系中的浓度为15纳克/毫升；
CD8+杀伤性T细胞亚群的激活试剂为：anti-CD3、白细胞介素7及白细胞介素21，调整所述anti-CD3在所加入体系中的浓度为25纳克/毫升、白细胞介素7在所加入体系中的浓度为11纳克/毫升、白细胞介素21在所加入体系中的浓度为3纳克/毫升；
(3)T细胞亚群的再刺激和快速增殖：
上阶段培养结束后，加入经25千戈瑞X射线辐照的外周血单个核细胞，所述外周血单个核细胞与CD4+、CD25-辅助T细胞亚群和CD8+杀伤性T细胞亚群经培养10天后所得细胞的数量比例为300:1，加入细胞培养用常规人工合成肿瘤多肽，调整所述细胞培养用人工合成肿瘤多肽在所加入体系中的的浓度为1.5微克/毫升，继续培养14天，培养过程中控制培养密度为1.5*106个/毫升；
(4)收获：
培养结束后，在CD4+、CD25-辅助T细胞亚群和CD8+杀伤性T细胞亚群中分别取样培养细胞，进行微生物、内毒素、流式细胞学和细胞因子分泌分析后，混合两个亚群细胞，即得。
上述的一种非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞的体外扩增方法，其中：所述非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞是指没有肿瘤细胞侵润、位于前哨淋巴结与远端淋巴结之间的肿瘤引流淋巴结；是采如下方法分离得到：
(1)引流淋巴结中段选取淋巴结：
取离体肿瘤组织，于所述离体肿瘤组织上、下、左、右分4点注射专利蓝Paten BlueV，每点推注0.6毫升，推注后以纱布吸取注射点多余专利蓝；
按照蓝染淋巴管的走向寻找被蓝染的淋巴结，即肿瘤引流淋巴结TDLNs，其中，第一个或多个被蓝染的淋巴结为前哨淋巴结；
以原发肿瘤为中心，取3枚处于前哨淋巴结与远端淋巴结之间，即距离原发肿瘤中心6厘米的肿瘤引流淋巴结，每个肿瘤引流淋巴结以最大径为轴；
(2)以流式细胞学鉴定与分离方法去除淋巴结附着的脂肪组织：
将所取肿瘤引流淋巴结切成2毫米的小块，加入肿瘤引流淋巴结4倍体积的DNA酶及胶原酶于37摄氏度下消化45分钟，在消化过程中以21号注射器针头吹吸3次，所述DNA酶及胶原酶按体积比1:1混合；
消化结束后，过70微米筛网，取细胞液，用上皮细胞粘附分子、细胞角蛋白20、癌坯抗原、细胞糖蛋白199按体积比1:1:1:1组成的肿瘤特异性染色抗体对所述细胞液染色后进行流式细胞学鉴定，取染色结果为阴性的细胞培养12小时；
(3)酶联免疫斑点检测法鉴定：
采用伽马干扰素酶联免疫斑点检测试剂盒，对已培养12小时的阴性细胞进行酶联免疫斑点鉴定，选择鉴定结果为阳性的细胞，即得非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，任何未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞的体外扩增方法，包括以下步骤：
(1)抗原致敏及免疫抑制阻断：
a、取体积比为100:2-5的淋巴细胞培养基、胎牛血清混合，得淋巴细胞培养基、胎牛血清混合物；在淋巴细胞培养基、胎牛血清混合物中加入白细胞介素2，调整所述白细胞介素2在淋巴细胞培养基、胎牛血清混合物中的浓度为100-1000单位/毫升，得培养液A，备用；
b、取部分培养液A，加入非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞，调整培养液体积，使所述非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞在培养液A中的密度为1*106-2*106个/毫升，培养12-24小时；
c、另取部分培养液A，加入抗免疫抑制抗体进行免疫抑制阻断，得培养液B，备用；
d、将在培养液A中培养12-24小时后得到的非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞全部吸出，转移至离心管中，离心3-5分钟，离心力为300-350g；离心完成后弃掉上层培养液；
e、在离心完成后弃掉上层培养液的非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞中加入培养液B，调整所述非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞在培养液B中的浓度为0.5*106-1*106个/毫升，培养24-48小时后，加入细胞培养用常规人工合成肿瘤多肽，调整所述细胞培养用常规人工合成肿瘤多肽在所加入体系中的浓度为0.5-1微克/毫升，继续培养24-48小时，得非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞培养物；
(2)T细胞亚群分离和刺激增殖：
采用常规分选方法对非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞培养物进行亚群分选，得到CD4+、CD25-辅助T细胞亚群和CD8+杀伤性T细胞亚群，将两个亚群分别置于X-VIVO培养基中独立培养并加入激活试剂，培养密度为1*105-1*107个/毫升，各组每隔3天进行半量换液，培养9-12天后分别进行细胞计数；
其中，CD4+、CD25-辅助T细胞亚群的激活试剂为：CD3/CD28磁珠及白细胞介素7，调整所述CD3/CD28磁珠在所加入体系中为1-5个/细胞、白细胞介素7的浓度为5-20纳克/毫升；
CD8+杀伤性T细胞亚群的激活试剂为：anti-CD3、白细胞介素7及白细胞介素21，调整所述anti-CD3在所加入体系中的浓度为5-50纳克/毫升、白细胞介素7的浓度为2-20纳克/毫升、白细胞介素21的浓度为1-5纳克/毫升；
(3)T细胞亚群的再刺激和快速增殖：
上阶段培养结束后，加入经15-35千戈瑞X射线辐照的外周血单个核细胞，所述外周血单个核细胞与CD4+、CD25-辅助T细胞亚群和CD8+杀伤性T细胞亚群经培养9-12天后所得细胞的数量比例为100-500:1，加入细胞培养用常规人工合成肿瘤多肽，调整所述细胞培养用人工合成肿瘤多肽在所加入体系中的的浓度为0.5-3微克/毫升，继续培养12-15天，培养过程中控制培养密度为1*106-2*106个/毫升；
(4)收获：
培养结束后，在CD4+、CD25-辅助T细胞亚群和CD8+杀伤性T细胞亚群中分别取样培养细胞，进行微生物、内毒素、流式细胞学和细胞因子分泌分析后，混合两个亚群细胞，即得。
2.如权利要求1所述的一种非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞的体外扩增方法，其中：所述抗免疫抑制抗体是抗-程序性死亡受体1，调整所述抗-程序性死亡受体1在培养液A中的浓度为5-30微克/毫升即可。
3.如权利要求1所述的一种非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞的体外扩增方法，其中：所述抗免疫抑制抗体是抗-细胞毒T淋巴细胞相关抗原4，调整所述抗-细胞毒T淋巴细胞相关抗原4在培养液A中的浓度为5-30微克/毫升即可。
4.如权利要求1所述的一种非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞的体外扩增方法，其中：所述抗免疫抑制抗体是抗-T细胞免疫球蛋白黏蛋白3，调整所述抗-T细胞免疫球蛋白黏蛋白3在培养液A中的浓度为5-30微克/毫升即可。
5.如权利要求1所述的一种非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞的体外扩增方法，其中：所述抗免疫抑制抗体是抗-程序性死亡受体1、抗-细胞毒T淋巴细胞相关抗原4、抗-T细胞免疫球蛋白黏蛋白3中的任意两种按体积比1:1组合而成，调整所述抗-程序性死亡受体1或抗-细胞毒T淋巴细胞相关抗原4或抗-T细胞免疫球蛋白黏蛋白3在培养液A中的浓度分别为5-30微克/毫升即可。
6.如权利要求1所述的一种非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞的体外扩增方法，其中：所述抗免疫抑制抗体是抗-程序性死亡受体1、抗-细胞毒T淋巴细胞相关抗原4、抗-T细胞免疫球蛋白黏蛋白3按体积比1:1:1组合而成，调整所述抗-程序性死亡受体1或抗-细胞毒T淋巴细胞相关抗原4或抗-T细胞免疫球蛋白黏蛋白3在培养液A中的浓度分别为5-30微克/毫升即可。
7.如权利要求1所述的一种非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞的体外扩增方法，其中：所述非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞是指没有肿瘤细胞侵润、位于前哨淋巴结与远端淋巴结之间的肿瘤引流淋巴结。
8.如权利要求1、2、3、4、5、6、7之一所述的一种非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞的体外扩增方法，其中：所述非前哨淋巴结T细胞是采如下方法分离得到：
(1)引流淋巴结中段选取淋巴结：
取离体肿瘤组织，于所述离体肿瘤组织上、下、左、右分4点注射专利蓝，每点推注0.2-1毫升，推注后以纱布吸取注射点多余专利蓝；
按照蓝染淋巴管的走向寻找被蓝染的淋巴结，即肿瘤引流淋巴结，其中，第一个或多个被蓝染的淋巴结为前哨淋巴结；
以原发肿瘤为中心，取3-4枚处于前哨淋巴结与远端淋巴结之间，即距离原发肿瘤中心5-7厘米的肿瘤引流淋巴结，每个肿瘤引流淋巴结以最大径为轴；
(2)以流式细胞学鉴定与分离方法去除淋巴结附着的脂肪组织：
将所取肿瘤引流淋巴结切成1-3毫米的小块，加入肿瘤引流淋巴结3-5倍体积的DNA酶及胶原酶于36.5-37.5摄氏度下消化30-60分钟，在消化过程中以注射器针头吹吸3-4次，所述DNA酶及胶原酶按体积比1:1混合；
消化结束后，过筛，取细胞液，用肿瘤细胞特异性染色抗体对所述细胞液染色后进行流式细胞学鉴定，取染色结果为阴性的细胞培养8-15小时；
(3)酶联免疫斑点检测法鉴定：
采用伽马干扰素酶联免疫斑点检测试剂盒，对已培养8-15小时的阴性细胞进行酶联免疫斑点鉴定，选择鉴定结果为阳性的细胞，即得非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞。
9.如权利要求8所述的一种非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞的体外扩增方法，其中：所述肿瘤细胞特异性染色抗体为上皮细胞粘附分子、细胞角蛋白20、癌坯抗原、细胞糖蛋白199按体积比1:1:1:1组成。
10.如权利要求9所述的一种非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞的体外扩增方法，其中：所述注射器针头是指21号注射器针头。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022123394A1 (en) 2020-12-08 2022-06-16 Guizhou Sinorda Biotechnology Co. Ltd. Modified t cells for adoptive immunotherapy
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CN115747160A (zh) * 2022-12-05 2023-03-07 贵州生诺生物科技有限公司 一种体外扩增冷冻保存的淋巴结抗肿瘤t细胞的方法及其应用
WO2023164990A1 (zh) * 2022-03-03 2023-09-07 中山大学孙逸仙纪念医院深汕中心医院 一种自体肿瘤引流淋巴结淋巴细胞的制备方法及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102517213A (zh) * 2011-12-29 2012-06-27 辽宁迈迪生物科技有限公司 用于t淋巴细胞的体外培养试剂盒

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102517213A (zh) * 2011-12-29 2012-06-27 辽宁迈迪生物科技有限公司 用于t淋巴细胞的体外培养试剂盒

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANTHONY VISIONI, M.D. ET AL: "Expansion of Melanoma-Specific T cells from Lymph Nodes of Stage III Patients: Implications for Adoptive Immunotherapy of Cancer", 《SURGERY》 *
YUN‑HUAN ZHEN ET AL: "Phase I/II study of adjuvant immunotherapy with sentinel lymph node T lymphocytes in patients with colorectal cancer", 《CANCER IMMUNOL IMMUNOTHER》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022123394A1 (en) 2020-12-08 2022-06-16 Guizhou Sinorda Biotechnology Co. Ltd. Modified t cells for adoptive immunotherapy
EP4032973A1 (en) 2021-01-21 2022-07-27 Guizhou Sinorda Biotechnology CO., Ltd. Modified t cells for adoptive immunotherapy
WO2023164990A1 (zh) * 2022-03-03 2023-09-07 中山大学孙逸仙纪念医院深汕中心医院 一种自体肿瘤引流淋巴结淋巴细胞的制备方法及其应用
CN115747160A (zh) * 2022-12-05 2023-03-07 贵州生诺生物科技有限公司 一种体外扩增冷冻保存的淋巴结抗肿瘤t细胞的方法及其应用

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