CN108210505A - 管花肉苁蓉苯乙醇苷在制备抗肝癌和食管癌药物中的应用 - Google Patents
管花肉苁蓉苯乙醇苷在制备抗肝癌和食管癌药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明为管花肉苁蓉苯乙醇苷在制备抗肝癌和食管癌药物中的应用,涉及医药新用途的技术领域。管花肉苁蓉苯乙醇苷在制备抗肝癌和食管癌药物中的应用;其特征在于,所述管花肉苁蓉苯乙醇苷的主要成分为松果菊苷。本发明还公布了一种抗肝癌和食管癌的药物。经试验证明管花肉苁蓉苯乙醇苷可以增加天冬氨酸蛋白水解酶活性、降低线粒体膜电位,诱导人体肝癌细胞和人体食管癌细胞周期阻滞,从而可以诱导人体肝癌细胞和人体食管癌细胞凋亡,进而还可以抑制人体肝癌细胞和人体食管癌细胞的生长,从而可以抗肝癌和食管癌,并可以应用于制备抗肝癌和食管癌药物中,具有广阔的市场前景。
Description
技术领域
本发明医药新用途的技术领域,具体涉及管花肉苁蓉苯乙醇苷在制备抗肝癌和食管癌药物中的应用。
背景技术
流行病学数据表明,肝癌有逐年上升的趋势,己跃居世界恶性肿瘤致死病因第2位,病死率在中国恶性肿瘤中居第2位。肝癌起病隐匿,早期诊断率低,病情发展快,大多数患者临床确诊时已为中晚期,发生了局部或远处转移,丧失根治性切除机会。即使早期发现肝癌,以手术切除局部病灶,但术后复发率高,预后差。通常要实施综合治疗,包括血管栓塞、射频、放射治疗、化疗和生物治疗等,但治疗效果有限。
食管癌也是世界范围内常见的恶性肿瘤之一,致死率高,每年造成400000多人死亡。新近流行病学资料显示我国食管癌发病率和病死率分别占全部恶性肿瘤的第6位和第4位。食管癌患者治疗的5年生存率约为17%,其主要的治疗方式为化疗、放疗和手术治疗。因为食管癌早期无明显临床症状,导致食管癌患者诊断时往往处于晚期,约有40-60%的患者因为分期较晚或手术风险高而不能手术,放射治疗就成为了重要的治疗手段。但约有40%食管癌患者放疗后出现进展,同时食管癌术后复发、转移也比较常见,预后较差。
中草药用来治疗包括癌症在内的各种疾病已经有数千年的历史了,具有抗肿瘤活性的中草药可以为开发抗癌药物提供潜在的候选药物。管花肉苁蓉为传统补益类中草药,具有免疫增强、抗氧化、抗炎症等多种生物活性,含有苯乙醇苷类、萜类、多糖等多种成分。苯乙醇苷是管花肉苁蓉的主要活性成分,具有抗氧化、抗炎、保肝等作用;其中松果菊苷是管花肉苁蓉苯乙醇苷的主要成分。然而,目前尚无管花肉苁蓉苯乙醇苷在制备抗肝癌及食管癌药物中的应用的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于提供管花肉苁蓉苯乙醇苷的新用途,即在制备抗肝癌和食管癌药物中的应用。
管花肉苁蓉苯乙醇苷在制备抗肝癌和食管癌药物中的应用;其中,所述管花肉苁蓉苯乙醇苷的主要成分为松果菊苷。
进一步的,所述管花肉苁蓉苯乙醇苷中松果菊苷的含量不低于30wt%。
再进一步的,所述管花肉苁蓉苯乙醇苷中松果菊苷的含量为35wt%。
进一步的,所述抗肝癌和食管癌指抑制人体肝癌细胞和人体食管癌细胞的生长。
再进一步的,所述抗肝癌和食管癌指诱导人体肝癌细胞和人体食管癌细胞凋亡。
再进一步的,所述抗肝癌和食管癌指诱导人体肝癌细胞和人体食管癌细胞周期阻滞。
再进一步的,所述抗肝癌和食管癌指降低线粒体膜电位和增加天冬氨酸蛋白水解酶活性。
本发明另一个目的在于提供一种抗肝癌和食管癌的药物,可以有效治疗肝癌和食管癌。
为了实现上述目的,所采用的技术方案为:
一种抗肝癌和食管癌的药物,
所述药物的活性成分为管花肉苁蓉苯乙醇苷;
其中,所述管花肉苁蓉苯乙醇苷的主要成分为松果菊苷。
进一步的,其特征在于,所述管花肉苁蓉苯乙醇苷中松果菊苷的含量不低于30wt%。
再进一步的,所述管花肉苁蓉苯乙醇苷中松果菊苷的含量为35wt%。
经试验证明管花肉苁蓉苯乙醇苷可以增加天冬氨酸蛋白水解酶活性和降低线粒体膜电位、诱导人体肝癌细胞和人体食管癌细胞凋亡,可以诱导人体肝癌细胞和人体食管癌细胞周期阻滞,还可以抑制人体肝癌细胞和人体食管癌细胞的生长,从而可以抗肝癌和食管癌,可以应用于制备抗肝癌和食管癌药物中,并且具有广阔的市场前景。
附图说明
图1为CTPG-W(水溶性管花肉苁蓉苯乙醇苷)的产品检测报告;
图2为人体肝癌细胞的细胞形态图;
图3为人体食管癌细胞的细胞形态图;
图4为人体肝癌细胞的细胞活性图;
图5为人体食管癌细胞的细胞活性图;
图6为小鼠脾脏细胞的细胞活性图;
图7为人体肝癌细胞的细胞凋亡图;
图8为人体肝癌细胞凋亡的统计图;
图9为人体食管癌细胞的细胞凋亡图;
图10为人体食管癌细胞凋亡的统计图;
图11为人体食管癌细胞的蛋白表达图;
图12为人体肝癌细胞的细胞周期图;
图13为人体肝癌细胞的周期统计图;
图14为人体食管癌细胞的细胞周期图;
图15为人体食管癌细胞的周期统计图;
图16为人体肝癌细胞的线粒体膜电位流式细胞图;
图17为人体肝癌细胞的线粒体膜电位频率统计图;
图18为人体食管癌细胞的线粒体膜电位流式细胞图;
图19为人体食管癌细胞的线粒体膜电位频率统计图;
图20为细胞线粒体膜电位荧光图;
图21为人体食管癌细胞的蛋白表达图;
图22为人体食管癌细胞的蛋白表达图。
具体实施方式
为了进一步阐述本发明管花肉苁蓉苯乙醇苷在制备抗肝癌和食管癌药物中的应用,达到预期发明目的,以下结合较佳实施例,对依据本发明提出的管花肉苁蓉苯乙醇苷在制备抗肝癌和食管癌药物中的应用,其具体实施方式、结构、特征及其功效,详细说明如后。在下述说明中,不同的“一实施例”或“实施例”指的不一定是同一实施例。此外,一或多个实施例中的特定特征、结构或特点可由任何合适形式组合。
在详细阐述本发明管花肉苁蓉苯乙醇苷在制备抗肝癌和食管癌药物中的应用之前,有必要对本发明中提及的原料和方法等做进一步说明,以达到更好的效果。
实施例中未注明具体技术或条件的,按照本领域内的文献所描述的技术或条件进行。实施例中所用原料或设备未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
本发明的管花肉苁蓉苯乙醇苷,在制备成药物制剂时可加入药物可接受的载体,可接受的载体选自以下载体的一种或几种:防腐剂、表面活性剂、填充剂、润湿剂、分散剂、矫味剂等,常用的载体如:水、甘露糖醇、右旋糖苷、山梨醇、甘露醇、木糖醇、氯化钠、纤维素及纤维素衍生物、亚硫酸钠、藻酸盐、明胶、甘油、琼脂、碳酸钙、碳酸氢钙、β-环糊精、淀粉、尼泊金乙酯、苯甲酸钠、山梨酸等。
本发明的管花肉苁蓉苯乙醇苷的药物制剂,是通过将管花肉苁蓉原料经过提取或其他方式加工,制成药物活性物质,随后,以该活性物质为原料,需要时加入药物可接受的载体,按照制剂学的常规技术制成药物制剂。
本发明的管花肉苁蓉苯乙醇苷优选为水溶性管花肉苁蓉苯乙醇苷(CTPG-W)。本发明所用的水溶性管花肉苁蓉苯乙醇苷从上海昂卜生物科技有限公司购买,其中,管花肉苁蓉苯乙醇苷中的松果菊苷含量不低于30wt%。所购买的其中一批次水溶性管花肉苁蓉苯乙醇苷产品检测报告结果如图1所示,水溶性管花肉苁蓉苯乙醇苷的主要成分为松果菊苷(Echinacoside),松果菊苷在CTPG-W中所占的比例是35%。
本发明中wt%为重量百分比,指混合物中,某种物质的质量占混合物总质量的百分比。
本发明中剂量依赖性指:随着药物浓度增加,抑制效果也相应增加,存在统计学意义。则认为该药物对细胞生长抑制作用呈剂量依赖性。
在了解了上述原料和方法等之后,下面将对本发明管花肉苁蓉苯乙醇苷在制备抗肝癌和食管癌药物中的应用做进一步的详细介绍:
一管花肉苁蓉苯乙醇苷在制备抗肝癌和食管癌药物中的应用
实施例1.
1、水溶性管花肉苁蓉苯乙醇苷(简称:CTPG-W)抑制人体肝癌细胞(简称:BEL-7404)和人体食管癌细胞(简称:Eca-109)的生长
(1)细胞形态:
方法:以不同浓度CTPG-W(200、400、600、800μg/ml)在体外处理BEL-7404和Eca-109细胞,并且设置有Control(不做处理)、DMSO(二甲基亚砜)、Cisplatin(顺铂)对照组。24小时后,在显微镜下观察BEL-7404和Eca-109细胞形态。
结果:由图2和图3可知,随着CTPG-W剂量的增加,BEL-7404和Eca-109细胞数量减少,并且改变了细胞形态,细胞变小变圆。
(2)增殖情况:
方法:以不同浓度CTPG-W(200、400、600、800μg/ml)在体外处理BEL-7404和Eca-109细胞,并且设置有Control、DMSO、Cisplatin对照组,处理不同时间后(24、48、72小时),采用MTT法检测BEL-7404和Eca-109细胞的增殖情况。MTT法检测和分析细胞的活性或抑制率,数据来自4个独立的实验,并进行单因素方差分析。
结果:由图4和图5可知,CTPG-W呈剂量和时间依赖性地显著减少了BEL-7404和Eca-109细胞的增殖活性。用800μg/ml的CTPG-W处理72小时的BEL-7404和Eca-109细胞生长的抑制率分别高于88%和90%。这些结果表明,CTPG-W呈剂量依赖性和时间依赖性地抑制BEL-7404和Eca-109细胞的生长。
(3)对正常细胞毒性作用的验证
方法:以不同浓度CTPG-W(100、200、300、400、500、600、700、800μg/ml)在处理小鼠脾脏细胞,并且设置有Control、DMSO对照组,处理不同时间后(24、48、72小时),采用MTT法检测小鼠脾脏细胞的增殖活性,以刺激指数(SI)进行表示。
数据处理:数据来自3个独立的实验,并进行单因素方差分析;其差异度为*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,处理组与对照组比较得出。
结果:通过进一步检测CTPG-W对小鼠脾脏细胞增殖的影响,如图6所示,发现CTPG-W不但没有抑制小鼠脾脏细胞的增殖,反而增强了小鼠脾脏细胞的增殖,说明CTPG-W对正常细胞没有毒性作用。
2、CTPG-W细胞诱导BEL-7404和Eca-109细胞凋亡
目的:检测CTPG-W抑制BEL-7404和Eca-109细胞生长的抑制效应是否由诱导细胞凋亡引起。
(1)方法:BEL-7404和Eca-109细胞用不同浓度(200、400、600、800μg/ml)的CTPG-W处理,并且设置有Control、DMSO、Cisplatin对照组。24小时后,用PI和Annexin V对BEL-7404和Eca-109细胞染色,并采用流式细胞仪对样品进行分析BEL-7404细胞和Eca-109细胞的凋亡和坏死。
结果:由图7-10可知,CTPG-W剂量依赖性地诱导BEL-7404和Eca-109细胞凋亡。虽然CTPG-W能够诱导部分BEL-7404和Eca-109细胞坏死,但主要还是引起了细胞的早期和晚期凋亡。
(2)方法:进一步用免疫印迹法检测了CTPG-W处理的Eca-109细胞凋亡相关蛋白的表达水平,包括抗凋亡的B细胞淋巴瘤(Bcl-2)和促细胞凋亡相关蛋白(Bax)。
数据处理:数据来自3个独立的实验,并进行单因素方差分析,其差异度为*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,处理组与对照组比较得出
结果:数据显示,如图11所示,Bax和Bcl-2蛋白表达分别呈剂量依赖性地增加和减少。这些表明,CTPG-W诱导了BEL-7404和Eca-109细胞凋亡。
3、CTPG-W诱导BEL-7404和Eca-109细胞周期阻滞
目的:为了进一步证明CTPG-W诱导的BEL-7404和Eca-109细胞凋亡。
方法:用不同浓度(200、400、600μg/ml)的CTPG-W处理BEL-7404和Eca-109细胞,并且设置有Control、DMSO对照组,24小时后,BEL-7404和Eca-109细胞用PI染色,并采用流式细胞仪分析细胞周期。
数据处理:数据来自3个独立的实验,并进行单因素方差分析,其差异度为*p<0.05,**p<0.01,处理组与对照组比较得出。
结果:如图12-15所示,CTPG-W显著增加了S期细胞的比例,显著减少了G0/G1期细胞的比例,这表明CTPG-W将BEL-7404和Eca-109细胞阻滞在了S期。同时,CTPG-W处理一定程度上增加了sub-G1期细胞比例,这与CTPG-W处理后增加了细胞死亡率相一致。
4、CTPG-W降低了线粒体膜电位
原理:线粒体膜电位(ΔψM)的降低能够诱导细胞凋亡。当Δψm降低,JC-1多聚体(红色荧光)会分解成单体(绿色荧光)。
(1)方法:不同浓度CTPG-W处理BEL-7404和Eca-109细胞,并设置有对照组,24小时后,采用JC-1对细胞进行染色,通过流式细胞仪检测了的ΔψM和倒置荧光显微镜进行观察。
数据处理:数据来自3个独立的实验,并进行单因素方差分析,其差异度为***p<0.001,处理组与对照组比较得出;
结果:由图16-19可知,CTPG-W剂量依赖性地降低了红色荧光并增加了绿色荧光。由图20可知,表明了CTPG-W降低了ΔψM,这与促凋亡Bax水平升高和抗凋亡Bcl-2水平下降相一致。
(2)ΔψM的降低可促进线粒体细胞色素c(cytochrome c)向细胞质释放。
方法:CTPG-W处理24小时后用免疫印迹法检测细胞色素c和JNK的水平。
结果:如图21,可知,CTPG-W处理的Eca-109细胞增加了细胞质中细胞色素c的水平,进一步证明了CTPG-W降低了肿瘤细胞的ΔψM并由此诱导了细胞凋亡。c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号通路在调控细胞凋亡中发挥重要作用,促进线粒体细胞色素c向细胞质释放,进而激活caspase蛋白酶,促进凋亡。与上述结果相同,CTPG-W处理显著增加了JNK的水平,证明JNK信号通路参与了CTPG-W诱导的细胞凋亡。
5、CTPG-W增加caspase-7、caspase-9和caspase-3的活性
原理:线粒体膜的完整性在天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)的激活及诱导细胞凋亡方面起着关键的作用,并由BCL-2蛋白家族抗凋亡因子和促凋亡因子严格调控。
方法:采用不同浓度(200、600μg/ml)CTPG-W处理Eca-109细胞,并且设置有Control、DMSO对照组,24h后,提取Eca-109细胞蛋白质,分离后用免疫印迹法检测caspase-3,caspase-7,caspase-8和caspase-9的活性,以及PARP水平。
结果:实验发现,由图22可知(图22显示了CTPG-W激活的caspase和切割的PARP水平),CTPG-W增加了激活的caspase-9和caspase-7的水平,增加了总的caspase-3的水平,并呈现剂量依赖性,但是caspase-8水平没有增加。这与Δψm减少相一致,表明CTPG-W可能是通过线粒体介导的Caspase活化途径诱导BEL-7404和Eca-109细胞凋亡。多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶(PARP)是一种DNA修复酶,在DNA损伤修复与细胞凋亡中发挥着重要作用,是caspase的切割底物。实验发现,CTPG-W处理后,切割的PARP的水平显著上升,这与caspase活性增加相关,并且PARP的切割抑制了DNA的损伤修复,进一步促进了细胞凋亡。
结论:以上采用不同的方法检测了水溶性管花肉苁蓉苯乙醇苷对人肝癌及食管癌的抑制作用,并阐明了其作用机理。发现水溶性管花肉苁蓉苯乙醇苷在体外对人肝癌(BEL-7404)及食管癌(Eca-109)细胞的抑制率分别达到了88%和90%以上,具有良好的抗肝癌及食管癌作用。
二一种抗肝癌和食管癌的药物
实施例2.
将200mg水溶性管花肉苁蓉苯乙醇苷(松果菊苷在水溶性管花肉苁蓉苯乙醇苷中所占的比例是35%)加入到1000ml的水,并使其完全溶解后,装入瓶中密封,消毒,制成0.2mg/ml的抗肝癌和食管癌的药物。
本发明实施例所述的管花肉苁蓉苯乙醇苷在制备抗肝癌和食管癌药物中的应用,提供了一种管花肉苁蓉苯乙醇苷的新用途,即在制备抗肝癌和食管癌药物的应用,并且以管花肉苁蓉苯乙醇苷,制备了抗肝癌和食管癌的药物。
实施例3.
将300mg水溶性管花肉苁蓉苯乙醇苷(松果菊苷在水溶性管花肉苁蓉苯乙醇苷中所占的比例是35%)加入到1000ml的水,并使其完全溶解后,分装成0.3mg/ml/支浓度的注射液于药瓶中密封,消毒,制成0.3mg/ml的抗肝癌和食管癌的药物。
本发明实施例所述的管花肉苁蓉苯乙醇苷在制备抗肝癌和食管癌药物中的应用,提供了一种管花肉苁蓉苯乙醇苷的新用途,即在制备抗肝癌和食管癌药物的应用,并且以管花肉苁蓉苯乙醇苷,制备诱导细胞自噬药物。
实施例4.
将100mg水溶性管花肉苁蓉苯乙醇苷(松果菊苷在水溶性管花肉苁蓉苯乙醇苷中所占的比例是35%)加入到1000ml的水,并使其完全溶解后,装入瓶中密封,消毒,制成0.1mg/ml的抗肝癌和食管癌的药物。
本发明实施例所述的管花肉苁蓉苯乙醇苷在制备抗肝癌和食管癌药物中的应用,提供了一种管花肉苁蓉苯乙醇苷的新用途,即在制备抗肝癌和食管癌药物的应用,并且以管花肉苁蓉苯乙醇苷,制备诱导细胞自噬药物。
实施例5.
将20g水溶性管花肉苁蓉苯乙醇苷(松果菊苷在水溶性管花肉苁蓉苯乙醇苷中所占的比例是35%)和50g淀粉混合均匀,并制成散剂,消毒,制成抗肝癌和食管癌的药物。
本发明实施例所述的管花肉苁蓉苯乙醇苷在制备抗肝癌和食管癌药物中的应用,提供了一种管花肉苁蓉苯乙醇苷的新用途,即在制备抗肝癌和食管癌药物的应用,并且以管花肉苁蓉苯乙醇苷,制备诱导细胞自噬药物。
以上所述,仅是本发明实施例的较佳实施例而已,并非对本发明实施例作任何形式上的限制,依据本发明实施例的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰,均仍属于本发明实施例技术方案的范围内。
Claims (10)
1.管花肉苁蓉苯乙醇苷在制备抗肝癌和食管癌药物中的应用;其特征在于,所述管花肉苁蓉苯乙醇苷的主要成分为松果菊苷。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述管花肉苁蓉苯乙醇苷中松果菊苷的含量不低于30wt%。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述管花肉苁蓉苯乙醇苷中松果菊苷的含量为35wt%。
4.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述抗肝癌和食管癌指抑制人体肝癌细胞和人体食管癌细胞的生长。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,所述抗肝癌和食管癌指诱导人体肝癌细胞和人体食管癌细胞凋亡。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述抗肝癌和食管癌指诱导人体肝癌细胞和人体食管癌细胞周期阻滞。
7.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述抗肝癌和食管癌指降低线粒体膜电位和增加天冬氨酸蛋白水解酶活性。
8.一种抗肝癌和食管癌的药物,其特征在于,
所述药物的活性成分为管花肉苁蓉苯乙醇苷;
其中,所述管花肉苁蓉苯乙醇苷的主要成分为松果菊苷。
9.根据权利要求8所述的药物,其特征在于,所述管花肉苁蓉苯乙醇苷中松果菊苷的含量不低于30wt%。
10.根据权利要求9所述的药物,其特征在于,所述管花肉苁蓉苯乙醇苷中松果菊苷的含量为35wt%。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20180629 |
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