CN105878401A - 管花肉苁蓉苯乙醇苷在制备抗黑色素瘤药物中的应用 - Google Patents
管花肉苁蓉苯乙醇苷在制备抗黑色素瘤药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于医药领域,具体公开了管花肉苁蓉苯乙醇苷在制备抗黑色素瘤药物中的应用。所述管花肉苁蓉苯乙醇苷的主要成分为松果菊苷、毛蕊花糖苷和异麦角兹苷。实验表明,管花肉苁蓉苯乙醇苷在体外对黑色素瘤细胞的抑制率达到了90%以上,对体内的肿瘤生长抑制率达到了50%以上,黑色素瘤小鼠生存率从8%提高到40%,具有良好的抗黑色素瘤作用。
Description
技术领域
本发明属于医药领域,具体涉及管花肉苁蓉苯乙醇苷在制备抗黑色素瘤药物中的应用。
背景技术
在过去的几十年,针对有丝分裂原激活蛋白激酶(MAPK)信号通路突变成分和免疫检查点的相关抑制剂已有大量的研究,其中细胞毒性T淋巴细胞相关抗原(CTLA-4)和程序性细胞死亡蛋白(PD-1)抑制剂已经由美国食品和药物管理局(FDA)批准用于治疗转移性黑色素瘤。然而,世界范围内黑色素瘤的发病率和死于黑色素瘤的人数持续上升。2014在美国,估计恶性黑色素瘤病例是76100,估计的死亡人数是9710。因此,迫切需要开发新的药物来延长黑色素瘤病人的无进展生存期和总生存期。
中草药用来治疗包括癌症在内的各种疾病已经有数千年的历史了,具有抗肿瘤活性的中草药可以为开发抗癌药物提供潜在的候选药物。管花肉苁蓉为传统补益类中草药,具有多种生物活性包括抗氧化、抗衰老、抗骨质疏松、镇痛、抗炎症和保护神经活动,含有多种成分包括苯乙醇苷类、环烯醚萜类、木脂素类化合物、糖醇、低聚糖、多糖和挥发油。苯乙醇苷是管花肉苁蓉的主要活性成分,具有抗氧化、抗凋亡的作用,抗炎、保肝、神经保护作用;其中松果菊苷和毛蕊花糖苷是苯乙醇苷两大主要的成分。然而,苯乙醇苷的抗肿瘤活性有待于进一步的研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种管花肉苁蓉苯乙醇苷(CTPG)的新用途。
本发明实现上述目的所采用的技术方案如下:
管花肉苁蓉苯乙醇苷在制备抗黑色素瘤药物中的应用。
进一步,所述管花肉苁蓉苯乙醇苷的主要成分为松果菊苷(Echinacoside)、毛蕊花糖苷(Acteoside)和异麦角兹苷(Isoacteoside)。
优选地,松果菊苷含量不低于25wt%,毛蕊花糖苷含量不低于10wt%,异麦角兹苷含量不低于1.5wt%。
最优选地,所述管花肉苁蓉苯乙醇苷含26.64wt%的松果菊苷、10.19wt%的毛蕊花糖苷和1.71wt%的异麦角兹苷。
一种抗黑色素瘤的药物,药物活性成分为管花肉苁蓉苯乙醇苷。
进一步,所述管花肉苁蓉苯乙醇苷的主要成分为松果菊苷、毛蕊花糖苷和异麦角兹苷。
优选地,松果菊苷含量不低于25wt%,毛蕊花糖苷含量不低于10wt%,异麦角兹苷含量不低于1.5wt%。
最优选地,所述管花肉苁蓉苯乙醇苷含26.64wt%的松果菊苷、10.19wt%的毛蕊花糖苷和1.71wt%的异麦角兹苷。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解,并且构成说明书的一部分,与本发明的实施例一起用于解释本发明,并不构成对本发明的限制。在附图中:
图1为CTPG(管花肉苁蓉苯乙醇苷)的高效液相色谱图,其中上图为CTPG样品,下图为标准品。
图2为CTPG对体外B16-F10细胞生长的抑制效应,其中(A)CTPG处理24 h后的B16-F10细胞的形态学变化,上图和下图放大倍数分别为10倍和20倍;(B)B16-F10细胞活力和抑制率,CTPG处理24、48和72 小时(h)后, MTT法检测和分析细胞的抑制率,数据来自4个独立的实验,并进行单因素方差分析,**p<0.01, *** p <0.001,处理组与对照组比较得出。
图3为CTPG诱导B16-F10细胞凋亡结果,其中,不同浓度CTPG处理24 h后,用流式细胞仪分析B16-F10和293T细胞的凋亡和坏死(A和C),免疫印迹法检测Bax和Bcl-2蛋白表达(B),数据来自3个独立的实验,并进行单因素方差分析,**p<0.01, *** p
<0.001,处理组与对照组比较得出。
图4为CTPG诱导B16-F10细胞染色体凝聚和细胞周期阻滞结果,其中,CTPG处理24小时后,细胞用Hoechst 33342和PI染色,用荧光显微镜观察细胞核凋亡的形态(A);流式细胞仪分析细胞周期(B),箭头表示染色体凝聚,数据来自3个独立的实验,并进行单因素方差分析,**p<0.01, *** p
<0.001,处理组与对照组比较得出。
图5为ΔψM的减少和细胞色素c、ROS的增加结果,其中,(A)CTPG处理48 h后,JC-1染色检测ΔψM,样品用流式细胞仪进行分析,左图显示FL-1通道的JC-1荧光强度,右边的图片显示的是异硫氰酸荧光素(FITC)阳性细胞的频率;(B)CTPG处理48 小时,通过荧光探针DCFH-DA检测ROS的产生,样品用流式细胞仪进行分析,左图显示活性氧的产生水平,右图显示ROS+ 细胞的比例,数据来自3个独立的实验,并进行单因素方差分析,**p<0.01, *** p <0.001,处理组与对照组比较得出;(C)CTPG处理24小时后用免疫印迹法检测细胞色素c的水平。
图6为CTPG激活的caspase的水平。CTPG处理24小时后,提取B16-F10细胞蛋白质,分离后用免疫印迹法检测caspase水平。
图7为CTPG对体内肿瘤生长的抑制作用。通过注射B16-F10细胞诱导小鼠肿瘤模型。3天后,肿瘤小鼠(每组12只)进行CTPG处理或没有CTPG处理。在所指示的时间点对肿瘤生长(A)和生存率(B)进行了监测。
图8为CTPG对脾淋巴细胞增殖和脾脏中CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的影响,其中,(A)从naïve C57BL/6小鼠分离脾细胞,用不同浓度CTPG刺激。24和48 小时后,采用MTT法检测细胞增殖。(B)从肿瘤小鼠中分离脾淋巴细胞并用FITC-anti-CD4和PE-anti-CD8染色细胞,流式细胞仪分析样品,上图为门控的CD4+ T细胞和CD8+ T细胞,图上的数字表示脾脏中CD4+ 和CD8+ T细胞频率,下图为数据统计结果。* p<0.05,** p<0.01, *** p<0.0001 与对照组相比。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明,应当理解,此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明,并不用于限定本发明。
本发明所用的管花肉苁蓉苯乙醇苷从和田帝辰医药生物科技有限公司购买,其中,管花肉苁蓉苯乙醇苷中的松果菊苷含量不低于25wt%,毛蕊花糖苷含量不低于10wt%,异麦角兹苷含量不低于1.5wt%。
采用高效液相色谱法对购买的其中一批次管花肉苁蓉苯乙醇苷进行定性和定量检测(与松果菊苷、毛蕊花糖苷和异麦角兹苷的标准品进行比较),结果如图1所示,管花肉苁蓉苯乙醇苷的主要成分为松果菊苷(Echinacoside)、毛蕊花糖苷(Acteoside)和异麦角兹苷(Isoacteoside),三者的浓度分别为266.38毫克/克、101.88毫克/克和17.08毫克/克,也即松果菊苷(Echinacoside)、毛蕊花糖苷(Acteoside)和异麦角兹苷(Isoacteoside)在CTPG中所占的比例分别是26.64%、10.19%和1.71%。
管花肉苁蓉苯乙醇苷(
CTPG
)在体外和体内对黑色素瘤细胞生长的抑制作用及其抑制机理研究
1
、
CTPG
在体外抑制黑色素瘤细胞(
B16-F10
)的生长
为了探讨CTPG是否能抑制B16-F10细胞生长,以不同浓度CTPG(100、200、300、400 μg/ml)在体外处理B16-F10细胞。24小时后,在显微镜下观察B16-F10细胞形态。CTPG剂量依赖性的改变了B16-F10细胞的形态(图2A)。CTPG处理不同时间后(24、48、72小时),采用MTT法检测B16-F10细胞的增殖情况。发现,CTPG呈剂量和时间依赖性地显著减少了B16-F10细胞的增殖活性(图2B)。用100 μg/ml的CTPG处理48小时(h)或200 μg/ml CTPG处理72 h的 B16-F10细胞生长的抑制率分别高于60%和90%。这些结果表明,CTPG呈剂量依赖性和时间依赖性地抑制B16-F10细胞的生长。
2
、
CTPG
细胞诱导
B16-F10
细胞凋亡
检测CTPG抑制B16-F10细胞生长的抑制效应是否由诱导细胞凋亡引起。B16-F10细胞用不同浓度(100、200、300、400 μg/ml)的CTPG处理。24小时后,用PI和Annexin V对B16-F10细胞染色并采用流式细胞仪对样品进行分析(图3A)。结果表明CTPG剂量依赖性地诱导B16-F10细胞凋亡。实验还观察到,CTPG诱导B16-F10细胞坏死,但主要是引起了细胞的凋亡(包括早期和晚期凋亡)。进一步用免疫印迹法检测了抗凋亡的B细胞淋巴瘤(Bcl-2)和促细胞凋亡相关蛋白(Bax)的表达。数据显示,Bax和Bcl-2蛋白表达分别呈剂量依赖性地增加和减少(图3B)。这些结果表明,CTPG诱导 B16-F10细胞凋亡。然而,CTPG不能诱导293T细胞(正常细胞对照)的凋亡和坏死(图3C)。
3
、
CTPG
诱导
B16-F10
细胞染色体凝聚和细胞周期阻滞
为了进一步证明CTPG诱导的B16-F10细胞凋亡,用不同浓度(200、400 μg/ml)的CTPG处理B16-F10细胞,24小时后,B16-F10细胞用Hoechst 33342染色并用荧光显微镜观察凋亡的细胞核形态。对照组的细胞核均匀染色,而CTPG处理的细胞表现出明显的形态学变化:细胞核的染色质凝聚和断裂(图4A)。PI染色后进一步用流式细胞仪分析了细胞周期。CTPG显著增加了G0/G1期细胞的比例,显著减少了S期细胞的比例(图4B),这表明CTPG诱导B16-F10细胞G0/G1期阻滞。实验还观察到,CTPG处理显著性增加了sub-G1期细胞比例,这与CTPG处理后增加了细胞死亡率相一致。
4
、
CTPG
降低了线粒体膜电位并增加细胞内活性氧(
ROS
)的生成
线粒体膜电位(ΔψM)的降低诱导细胞凋亡。当Δψm降低,JC-1多聚体(红色荧光)会分解成单体(绿色荧光)。因此,用JC-1染色检测了CTPG处理48 小时后的ΔψM。实验观察到,通过流式细胞仪检测,CTPG剂量依赖性地增加了绿色荧光(图5A),这表明CTPG降低ΔψM,这与促凋亡Bax水平升高和抗凋亡Bcl-2水平下降相一致。
ΔψM的减少会导致活性氧的产生,而活性氧在诱导细胞凋亡中起着至关重要的作用。通过荧光探针DCFH-DA检测活性氧的生成。发现,CTPG剂量依赖性地增加ROS的产生(图5B)。细胞色素c与氧化磷脂的解离和ΔψM的降低促进细胞色素c的释放。实验进一步发现,CTPG处理增加了细胞色素c的水平(图5C)。这些结果表明,由CTPG诱导B16-F10细胞凋亡可能是通过ΔψM的减少和ROS的产生。
5
、
CTPG
增加
caspase-9
和
caspase-3
的活性
线粒体膜的完整性在caspase蛋白酶的激活及诱导细胞凋亡起着关键的作用,并由BCL-2蛋白家族抗凋亡因子和促凋亡因子严格调控。实验研究了CTPG处理后caspase-3,caspase-8和caspase-9的活性。发现,CTPG增加了激活的caspase-9和caspase-3的水平,并呈现剂量依赖性,但是 caspase-8水平没有增加(图6)。这与Δψm减少相一致,表明CTPG可能是通过线粒体介导的Caspase活化途径诱导B16-F10细胞凋亡。
6
、
CTPG
抑制体内黑色素瘤的生长
为了评估CTPG在体内抗肿瘤作用,将B16-F10细胞皮下注射到C57BL/6小鼠右侧背部,3天之后,长肿瘤的小鼠进行随机分组,分别注射200 mg/kg(小鼠体重)或400 mg/kg CTPG或注射DMSO(二甲基亚砜,CTPG溶剂)作为对照。与对照组相比,200 mg/kg或400 mg/kg CTPG治疗组显著抑制了小鼠肿瘤生长(图7A)。当肿瘤长度超过12毫米时处死小鼠,实验结束时(B16-F10细胞注射后31天)计算小鼠存活率(图7B)。对照组小鼠存活率为8.3%(12只小鼠中11只死亡);CTPG-200组存活率为36.4%(11只小鼠中7只死亡),其中一只在注射时意外窒息死亡;CTPG-400组存活率为41.7%(12只小鼠中7只死亡)。体内的数据表明,CTPG能抑制肿瘤生长并且能增加肿瘤小鼠的存活率。
7
、
CTPG
增强了小鼠脾淋巴细胞的增殖,增加了肿瘤小鼠脾脏
CD4+
和
CD8+ T
细胞的频率
为了探讨CTPG在体外是否影响脾淋巴细胞的增殖,从naïve C57BL/6小鼠分离来的脾细胞用不同浓度(0、100、200、300、400 μg/ml)CTPG处理。24 h和48 h后,采用MTT法检测小鼠脾淋巴细胞的增殖。CTPG在24 h和48 h可剂量依赖性地增强小鼠脾细胞增殖(图8A)。实验进一步检测了肿瘤小鼠的脾脏CD4+ 和CD8+ T细胞的频率。收集的脾脏是来自由于肿瘤太大处死或在实验结束时处死的小鼠,而不是自然死亡的小鼠。脾淋巴细胞用FITC-anti-CD4和PE-anti-CD8抗体染色,流式细胞仪分析样品。结果表明,CTPG-400组与对照组相比CD4+ 和CD8+ T细胞的频率显著增加(图8B)。
以上采用不同的方法检测了管花肉苁蓉苯乙醇苷对黑色素瘤的抑制作用,包括体外及体内实验进行了详细验证,并阐明了其作用机理。发现管花肉苁蓉苯乙醇苷在体外对黑色素瘤细胞的抑制率达到了90%以上,对体内的肿瘤生长抑制率达到了50%以上,黑色素瘤小鼠生存率从8%提高到40%,具有良好的抗黑色素瘤作用。
最后应说明的是:以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,对于本领域的技术人员来说,其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.管花肉苁蓉苯乙醇苷在制备抗黑色素瘤药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述管花肉苁蓉苯乙醇苷的主要成分为松果菊苷、毛蕊花糖苷和异麦角兹苷。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,松果菊苷含量不低于25wt%,毛蕊花糖苷含量不低于10wt%,异麦角兹苷含量不低于1.5wt%。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述管花肉苁蓉苯乙醇苷含26.64wt%的松果菊苷、10.19wt%的毛蕊花糖苷和1.71wt%的异麦角兹苷。
5.一种抗黑色素瘤的药物,药物活性成分为管花肉苁蓉苯乙醇苷。
6.根据权利要求5所述的药物,其特征在于,所述管花肉苁蓉苯乙醇苷的主要成分为松果菊苷、毛蕊花糖苷和异麦角兹苷。
7.根据权利要求6所述的药物,其特征在于,松果菊苷含量不低于25wt%,毛蕊花糖苷含量不低于10wt%,异麦角兹苷含量不低于1.5wt%。
8.根据权利要求7所述的药物,其特征在于,所述管花肉苁蓉苯乙醇苷含26.64wt%的松果菊苷、10.19wt%的毛蕊花糖苷和1.71wt%的异麦角兹苷。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20160824 |
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |