CN108205023B - 一种分离和/或检测l-卡谷氨酸光学异构体的方法 - Google Patents

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CN108205023B CN201611182199.XA CN201611182199A CN108205023B CN 108205023 B CN108205023 B CN 108205023B CN 201611182199 A CN201611182199 A CN 201611182199A CN 108205023 B CN108205023 B CN 108205023B
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Abstract

本申请公开了一种分离L‑卡谷氨酸，和/或检测L‑卡谷氨酸纯度的方法，特别是使用高效液相色谱法分离和/或检测L‑卡谷氨酸。包括如下步骤：1)选用的色谱柱为硅胶类手性柱，流动相为反相溶剂；2)设置所述流动相的速度为0.8ml/min至1.1ml/min，检测波长为249nm至259nm；3)向高效液相色谱仪注入样品，在所述L‑卡谷氨酸在色谱图上出峰时，收集所述L‑卡谷氨酸；和/或根据色谱图上的出峰情况确定所述L‑卡谷氨酸的纯度。

Description

一种分离和/或检测L-卡谷氨酸光学异构体的方法
技术领域
本申请涉及一种分离L-卡谷氨酸，和/或检测L-卡谷氨酸纯度的方法，特别是使用高效液相色谱法分离和/或检测L-卡谷氨酸。
背景技术
卡谷氨酸为一种抗高氨血症类药物，其分子式为C6H10N2O5，化学名为N-氨基甲酰-L-谷氨酸或(2S)-2-(氨甲酰氨基)戊二酸，结构式为
Figure BDA0001185578730000011
该分子中含有1个手性中心，只有一个光学异构体，即为D-卡谷氨酸，该杂质可通过后续反应，残留在氨基类药物中，影响药品质量。因此，对于L-卡谷氨酸的光学异构体杂质，在药物合成过程当中是需要进行质量控制的。控制L-卡谷氨酸中光学异构体的含量，对提高氨基酸类药物的质量、保证广大患者用药的安全性具有重大意义。
然而，含手性碳原子的光学异构体的分离一直是手性药物合成和制剂过程中质量控制的难点。
发明内容
本申请根据现有技术中存在的技术问题，提供了一种分离L-卡谷氨酸，和/或检测L-卡谷氨酸纯度和/或含量的方法，所述方法为高效液相色谱法，包括如下步骤：1)选用的色谱柱为硅胶类手性柱，流动相为反相溶剂；2)设置所述流动相的速度为0.8ml/min至1.1ml/min，检测波长为249nm至259nm；3)向高效液相色谱仪注入样品，在所述L-卡谷氨酸在色谱图上出峰时，收集所述L-卡谷氨酸。通过本方法的建立，可以有效的分离L-卡谷氨酸和/或D-卡谷氨酸，和/或检测L-卡谷氨酸的纯度和/或含量和D-卡谷氨酸的纯度。
在一个具体实施方式中，所述硅胶类手性柱为CRS10W色谱柱；所述反相溶剂1mM至3mM的硫酸铜溶液与甲醇的混合液。
在一个具体实施方式中，所述硫酸铜溶液的浓度为2mM。
在一个具体实施方式中，所述硫酸铜溶液和甲醇的体积比例为96:4至99:1。
在一个具体实施方式中，所述硫酸铜溶液和甲醇的体积比例为97:3至98:2。例如2mM硫酸铜溶液和甲醇的体积比例为97:3。
在一个具体实施方式中，所述流动相的速度为0.9ml/min至1.0ml/min，例如所述流动相的速度为1.0ml/min。
在一个具体实施方式中，所述样品中的L-卡谷氨酸的浓度为2mg/ml至3mg/ml。
在一个具体实施方式中，所述样品中的L-卡谷氨酸的浓度为2mg/ml至2.5mg/ml
在一个具体实施方式中，所述检测波长为252nm至256nm，例如最优的检测波长为254nm。
在一个具体实施方式中，所述色谱柱的柱温为20℃至35℃。例如，柱温为20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃。
在一个具体实施方式中，述色谱柱的柱温为25℃至30℃。
在一个具体实施方式中，所述方法还包括提供L-卡谷氨酸溶液作为阳性对照。
附图说明
图1显示了实施例1的HPLC图。其中，图中1号峰为异构体D-卡谷氨酸，2号峰为L-卡谷氨酸。
图2显示了实施例2的HPLC图。其中，图中1号峰为异构体D-卡谷氨酸，2号峰为L-卡谷氨酸。
图3显示了实施例3的HPLC图。其中，图中1号峰为异构体D-卡谷氨酸，2号峰为L-卡谷氨酸。
图4显示了实施例4的HPLC图。其中，图中1号峰为异构体D-卡谷氨酸，2号峰为L-卡谷氨酸。
图5显示了实施例5的HPLC图。其中，图中1号峰为异构体D-卡谷氨酸，2号峰为L-卡谷氨酸。
图6显示了实施例6的HPLC图。其中，图中1号峰为异构体D-卡谷氨酸，2号峰为L-卡谷氨酸。
图7显示了实施例7的HPLC图。其中，图中1号峰为异构体D-卡谷氨酸，2号峰为L-卡谷氨酸。
图8显示了实施例8的HPLC图。其中，图中1号峰为异构体D-卡谷氨酸，2号峰为L-卡谷氨酸。
图9显示了实施例9的HPLC图。其中，图中1号峰为异构体D-卡谷氨酸，2号峰为L-卡谷氨酸。
图10显示了实施例10的HPLC图。其中，图中1号峰为异构体D-卡谷氨酸，2号峰为L-卡谷氨酸。
图11显示了实施例11的HPLC图。其中，图中1号峰为异构体D-卡谷氨酸，2号峰为L-卡谷氨酸。
图12显示了实施例12的HPLC图。其中，图中1号峰为异构体D-卡谷氨酸，2号峰为L-卡谷氨酸。
图13显示了实施例13的HPLC图。其中，图中1号峰为异构体D-卡谷氨酸，2号峰为L-卡谷氨酸。
图14显示了实施例14的HPLC图。其中，图中1号峰为异构体D-卡谷氨酸，2号峰为L-卡谷氨酸。
图15显示了实施例15的HPLC图。其中，图中1号峰为异构体D-卡谷氨酸，2号峰为L-卡谷氨酸。
图16显示了实施例16的HPLC图。其中，图中1号峰为异构体D-卡谷氨酸，2号峰为L-卡谷氨酸。
具体实施方式
下面结合实施例详述本申请，但本申请并不局限于这些实施例。
如无特别说明，本申请的实施例中的原料均通过商业途径购买。
L-卡谷氨酸的制备方法如下：
Figure BDA0001185578730000041
在250ml烧瓶中，加入120g的5wt％的氢氧化钾水溶液，在室温下搅拌，向其中加入4.7g的L-谷氨酸和5.1g氰酸钾。继续在室温下搅拌反应24h，然后向水层中加入浓盐酸调节反应液pH＝1-2，析出大量白色固体。抽滤，干燥，得到白色固体3g，即L-卡谷氨酸。
D-卡谷氨酸的制备方法如下：
Figure BDA0001185578730000042
在250ml烧瓶中，加入120g的5wt％的氢氧化钾水溶液，在室温下搅拌，向其中加入4.7g的D-谷氨酸和5.1g氰酸钾。继续在室温下搅拌反应24h，然后向水层中加入浓盐酸调节反应液pH＝1-2，析出大量白色固体。抽滤，干燥，得到白色固体3g，即D-卡谷氨酸。
实施例1
仪器与条件
色谱柱：CRS10W，50mm×4.6mm
流动相：2mM硫酸铜溶液:甲醇＝97:3
柱温：30℃
波长：254nm
流速：1.0ml/min
进样量：5μl
实验步骤
D-卡谷氨酸储备液：称取D-卡谷氨酸10mg，置100ml量瓶中，用纯水稀释定容。
供试品溶液：称取L-卡谷氨酸20mg，精密称定，置10ml量瓶中，加纯水溶解并稀释至刻度，摇匀。
系统适用性溶液：称取L-卡谷氨酸20mg置10ml量瓶中，移取D-卡谷氨酸储备液1.0ml至此容量瓶中，加纯水溶解并稀释至刻度，摇匀。
L-卡谷氨酸自身对照溶液：取供试品溶液1.0ml置100ml量瓶中，用纯水溶解并稀释至刻度，摇匀。
量取系统适用性溶液5μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，D-卡谷氨酸峰和L-卡谷氨酸峰的分离度大于0.8。
分别取供试品溶液和L-卡谷氨酸自身对照溶液各5μl，按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图。按自身对照法计算D-卡谷氨酸含量。
结果见附图1，图中1号峰为异构体D-卡谷氨酸，2号峰为L-卡谷氨酸，可以看出在该条件下L-卡谷氨酸主峰和异构体D-卡谷氨酸峰完全分离开来，且L-卡谷氨酸主峰在21.6min左右。
实施例2
仪器与条件
色谱柱：CRS10W，50mm×4.6mm
流动相：2mM硫酸铜溶液:甲醇＝97:3
柱温：25℃
波长：254nm
流速：1.0ml/min
进样量：5μl
实验步骤
其他同实施例1。
量取系统适用性溶液5μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，D-卡谷氨酸峰和L-卡谷氨酸峰的分离度大于0.8。
分别取供试品溶液和L-卡谷氨酸自身对照溶液各5μl，按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图。按自身对照法计算D-卡谷氨酸含量。
结果见附图2，图中1号峰为异构体D-卡谷氨酸，2号峰为L-卡谷氨酸，可以看出在该条件下L-卡谷氨酸主峰和异构体D-卡谷氨酸峰完全分离开来，且L-卡谷氨酸主峰在24.613min左右。
实施例3
色谱柱：CRS10W，50mm×4.6mm
流动相：2mM硫酸铜溶液:甲醇＝97:3
柱温：35℃
波长：254nm
流速：1.0ml/min
进样量：5μl
实验步骤
其他同实施例1。
量取系统适用性溶液5μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，D-卡谷氨酸峰和L-卡谷氨酸峰的分离度大于0.8。
分别取供试品溶液和L-卡谷氨酸自身对照溶液各5μl，按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图。按自身对照法计算D-卡谷氨酸含量。
结果见附图3，图中1号峰为异构体D-卡谷氨酸，2号峰为L-卡谷氨酸，可以看出在该条件下L-卡谷氨酸主峰和异构体D-卡谷氨酸峰完全分离开来，且L-卡谷氨酸主峰在17.8min左右。
实施例4
色谱柱：CRS10W，50mm×4.6mm
流动相：2mM硫酸铜溶液:甲醇＝98:2
柱温：20℃
波长：254nm
流速：1.0ml/min
进样量：5μl
实验步骤
其他同实施例1。
量取系统适用性溶液5μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，D-卡谷氨酸峰和L-卡谷氨酸峰的分离度大于0.8。
分别取供试品溶液和L-卡谷氨酸自身对照溶液各5μl，按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图。按自身对照法计算D-卡谷氨酸含量。
结果见附图4，图中1号峰为异构体D-卡谷氨酸，2号峰为L-卡谷氨酸，可以看出在该条件下L-卡谷氨酸主峰和异构体D-卡谷氨酸峰完全分离开来，且L-卡谷氨酸主峰在33.4min左右。
实施例5
色谱柱：CRS10W，50mm×4.6mm
流动相：2mM硫酸铜溶液:甲醇＝96:4
柱温：30℃
波长：254nm
流速：1.0ml/min
进样量：5μl
实验步骤
其他同实施例1。
量取系统适用性溶液5μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，D-卡谷氨酸峰和L-卡谷氨酸峰的分离度大于0.8。
分别取供试品溶液和L-卡谷氨酸自身对照溶液各5μl，按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图。按自身对照法计算D-卡谷氨酸含量。
结果见附图5，图中1号峰为异构体D-卡谷氨酸，2号峰为L-卡谷氨酸，可以看出在该条件下L-卡谷氨酸主峰和异构体D-卡谷氨酸峰完全分离开来，且L-卡谷氨酸主峰在20.1min左右。
实施例6
色谱柱：CRS10W，50mm×4.6mm
流动相：2mM硫酸铜溶液:甲醇＝98:2
柱温：30℃
波长：254nm
流速：1.0ml/min
进样量：5μl
实验步骤
其他同实施例1。
量取系统适用性溶液5μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，D-卡谷氨酸峰和L-卡谷氨酸峰的分离度大于0.8。
分别取供试品溶液和L-卡谷氨酸自身对照溶液各5μl，按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图。按自身对照法计算D-卡谷氨酸含量。
结果见附图6，图中1号峰为异构体D-卡谷氨酸，2号峰为L-卡谷氨酸，可以看出在该条件下L-卡谷氨酸主峰和异构体D-卡谷氨酸峰完全分离开来，且L-卡谷氨酸主峰在23.5min左右。
实施例7
色谱柱：CRS10W，50mm×4.6mm
流动相：2mM硫酸铜溶液:甲醇＝99:1
柱温：30℃
波长：254nm
流速：1.0ml/min
进样量：5μl
实验步骤
其他同实施例1。
量取系统适用性溶液5μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，D-卡谷氨酸峰和L-卡谷氨酸峰的分离度大于0.8。
分别取供试品溶液和L-卡谷氨酸自身对照溶液各5μl，按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图。按自身对照法计算D-卡谷氨酸含量。
结果见附图7，图中1号峰为异构体D-卡谷氨酸，2号峰为L-卡谷氨酸，可以看出在该条件下L-卡谷氨酸主峰和异构体D-卡谷氨酸峰完全分离开来，且L-卡谷氨酸主峰在32.4min左右。
实施例8
色谱柱：CRS10W，50mm×4.6mm
流动相：2mM硫酸铜溶液:甲醇＝97:3
柱温：30℃
波长：249/259nm
流速：1.0ml/min
进样量：5μl
实验步骤
其他同实施例1。
量取系统适用性溶液5μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，D-卡谷氨酸峰和L-卡谷氨酸峰的分离度大于0.8。
分别取供试品溶液和L-卡谷氨酸自身对照溶液各5μl，按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图。按自身对照法计算D-卡谷氨酸含量。
结果见附图8，图中1号峰为异构体D-卡谷氨酸，2号峰为L-卡谷氨酸，可以看出在该条件下L-卡谷氨酸主峰和异构体D-卡谷氨酸峰完全分离开来，且L-卡谷氨酸主峰在25.4min左右。
实施例9
色谱柱：CRS10W，50mm×4.6mm
流动相：2mM硫酸铜溶液:甲醇＝97:3
柱温：30℃
波长：252/256nm
流速：1.0ml/min
进样量：5μl
实验步骤
其他同实施例1。
量取系统适用性溶液5μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，D-卡谷氨酸峰和L-卡谷氨酸峰的分离度大于0.8。
分别取供试品溶液和L-卡谷氨酸自身对照溶液各5μl，按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图。按自身对照法计算D-卡谷氨酸含量。
结果见附图9，图中1号峰为异构体D-卡谷氨酸，2号峰为L-卡谷氨酸，可以看出在该条件下L-卡谷氨酸主峰和异构体D-卡谷氨酸峰完全分离开来，且L-卡谷氨酸主峰在20.7min左右。
实施例10
色谱柱：CRS10W，50mm×4.6mm
流动相：2mM硫酸铜溶液:甲醇＝97:3
柱温：30℃
波长：254nm
流速：0.8ml/min
进样量：5μl
实验步骤
其他同实施例1。
量取系统适用性溶液5μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，D-卡谷氨酸峰和L-卡谷氨酸峰的分离度大于0.8。
分别取供试品溶液和L-卡谷氨酸自身对照溶液各5μl，按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图。按自身对照法计算D-卡谷氨酸含量。
结果见附图10，图中1号峰为异构体D-卡谷氨酸，2号峰为L-卡谷氨酸，可以看出在该条件下L-卡谷氨酸主峰和异构体D-卡谷氨酸峰完全分离开来，且L-卡谷氨酸主峰在31.2min左右。
实施例11
色谱柱：CRS10W，50mm×4.6mm
流动相：2mM硫酸铜溶液:甲醇＝97:3
柱温：30℃
波长：254nm
流速：0.9ml/min
进样量：5μl
实验步骤
其他同实施例1。
量取系统适用性溶液5μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，D-卡谷氨酸峰和L-卡谷氨酸峰的分离度大于0.8。
分别取供试品溶液和L-卡谷氨酸自身对照溶液各5μl，按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图。按自身对照法计算D-卡谷氨酸含量。
结果见附图11，图中1号峰为异构体D-卡谷氨酸，2号峰为L-卡谷氨酸，可以看出在该条件下L-卡谷氨酸主峰和异构体D-卡谷氨酸峰完全分离开来，且L-卡谷氨酸主峰在22.8min左右。
实施例12
色谱柱：CRS10W，50mm×4.6mm
流动相：2mM硫酸铜溶液:甲醇＝97:3
柱温：30℃
波长：254nm
流速：1.1ml/min
进样量：5μl
实验步骤
同实施例1。
量取系统适用性溶液5μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，D-卡谷氨酸峰和L-卡谷氨酸峰的分离度大于0.8。
分别取供试品溶液和L-卡谷氨酸自身对照溶液各5μl，按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图。按自身对照法计算D-卡谷氨酸含量。
结果见附图12，图中1号峰为异构体D-卡谷氨酸，2号峰为L-卡谷氨酸，可以看出在该条件下L-卡谷氨酸主峰和异构体D-卡谷氨酸峰完全分离开来，且L-卡谷氨酸主峰在18.9min左右。
实施例13
色谱柱：CRS10W，50mm×4.6mm
流动相：2mM硫酸铜溶液:甲醇＝97:3
柱温：30℃
波长：254nm
流速：1.0ml/min
进样量：5μl
实验步骤
D-卡谷氨酸储备液：称取D-卡谷氨酸10mg，置100ml量瓶中，用纯水稀释定容。
供试品溶液：称取L-卡谷氨酸25mg，精密称定，置10ml量瓶中，加纯水溶解并稀释至刻度，摇匀。
系统适用性溶液：称取L-卡谷氨酸25mg置10ml量瓶中，移取D-卡谷氨酸储备液1.0ml至此容量瓶中，加纯水溶解并稀释至刻度，摇匀。
L-卡谷氨酸自身对照溶液：取供试品溶液1.0ml置100ml量瓶中，用纯水溶解并稀释至刻度，摇匀。
量取系统适用性溶液5μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，D-卡谷氨酸峰和L-卡谷氨酸峰的分离度大于0.8。
分别取供试品溶液和L-卡谷氨酸对照品溶液各5μl，按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图。按自身对照法计算D-卡谷氨酸含量。
结果见附图13，图中1号峰为异构体D-卡谷氨酸，2号峰为L-卡谷氨酸，可以看出在该条件下L-卡谷氨酸主峰和异构体D-卡谷氨酸峰完全分离开来，且L-卡谷氨酸主峰在24.9min左右。
实施例14
色谱柱：CRS10W，50mm×4.6mm
流动相：2mM硫酸铜溶液:甲醇＝97:3
柱温：30℃
波长：254nm
流速：1.0ml/min
进样量：5μl
实验步骤
D-卡谷氨酸储备液：称取D-卡谷氨酸10mg，置100ml量瓶中，用纯水稀释定容。
供试品溶液：称取L-卡谷氨酸30mg，精密称定，置10ml量瓶中，加纯水溶解并稀释至刻度，摇匀。
系统适用性溶液：称取L-卡谷氨酸30mg置10ml量瓶中，移取D-卡谷氨酸储备液1.0ml至此容量瓶中，加纯水溶解并稀释至刻度，摇匀。
L-卡谷氨酸自身对照溶液：取供试品溶液1.0ml置100ml量瓶中，用纯水溶解并稀释至刻度，摇匀。
量取系统适用性溶液5μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，D-卡谷氨酸峰和L-卡谷氨酸峰的分离度大于0.8。
分别取供试品溶液和L-卡谷氨酸对照品溶液各5μl，按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图。按自身对照法计算D-卡谷氨酸含量。
结果见附图14，图中1号峰为异构体D-卡谷氨酸，2号峰为L-卡谷氨酸，可以看出在该条件下L-卡谷氨酸主峰和异构体D-卡谷氨酸峰完全分离开来，且L-卡谷氨酸主峰在24.7min左右。
实施例15
色谱柱：CRS10W，50mm×4.6mm
流动相：3mM硫酸铜溶液:甲醇＝97:3
柱温：30℃
波长：254nm
流速：1.0ml/min
进样量：5μl
实验步骤
其他同实施例1。
量取系统适用性溶液5μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，D-卡谷氨酸峰和L-卡谷氨酸峰的分离度大于0.8。
分别取供试品溶液和L-卡谷氨酸自身对照溶液各5μl，按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图。按自身对照法计算D-卡谷氨酸含量。
结果见附图15，图中1号峰为异构体D-卡谷氨酸，2号峰为L-卡谷氨酸，可以看出在该条件下L-卡谷氨酸主峰和异构体D-卡谷氨酸峰完全分离开来，且L-卡谷氨酸主峰在28.6min左右。
实施例16
色谱柱：CRS10W，50mm×4.6mm
流动相：1mM硫酸铜溶液:甲醇＝97:3
柱温：30℃
波长：254nm
流速：1.0ml/min
进样量：5μl
实验步骤
其他同实施例1。
量取系统适用性溶液5μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，D-卡谷氨酸峰和L-卡谷氨酸峰的分离度大于0.8。
分别取供试品溶液和L-卡谷氨酸自身对照溶液各5μl，按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图。按自身对照法计算D-卡谷氨酸含量。
结果见附图15，图中1号峰为异构体D-卡谷氨酸，2号峰为L-卡谷氨酸，可以看出在该条件下L-卡谷氨酸主峰和异构体D-卡谷氨酸峰完全分离开来，且L-卡谷氨酸主峰在28.6min左右。
以上所述，仅是本申请的几个实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。

Claims (9)

1.一种分离L-卡谷氨酸，和/或检测L-卡谷氨酸纯度和/或含量的方法，其特征在于，所述方法为高效液相色谱法，包括如下步骤：
1）选用的色谱柱为硅胶类手性柱，流动相为反相溶剂；
所述硅胶类手性柱为CRS10W色谱柱；所述反相溶剂为1 mM至3 mM的硫酸铜溶液与甲醇的混合液；
所述硫酸铜溶液和甲醇的体积比例为96:4至99:1；
2）设置所述流动相的速度为0.8 ml/min至1.1 ml/min，检测波长为249nm至259nm；
3）向高效液相色谱仪注入样品，在所述L-卡谷氨酸在色谱图上出峰时，收集所述L-卡谷氨酸；和/或根据色谱图上的出峰情况确定所述L-卡谷氨酸的纯度；
所述样品中的L-卡谷氨酸的浓度为2mg/ml至3mg/ml；
所述方法有效的分离L-卡谷氨酸和D-卡谷氨酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述硫酸铜溶液的浓度为2 mM。
3.根据权利要求1至2中任意一项所述的方法，其特征在于，所述硫酸铜溶液和甲醇的体积比例为97:3至98:2。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流动相的速度为0.9 ml/min至1.0ml/min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测波长为252 nm至256 nm。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样品中的L-卡谷氨酸的浓度为2mg/ml至2.5mg/ml。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述色谱柱的柱温为20℃至35℃。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述色谱柱的柱温为25℃至30℃。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法还包括提供L-卡谷氨酸溶液作为阳性对照。
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