CN108179211A - 产肠毒素性大肠杆菌耐热肠毒素基因SYBR Green I荧光定量PCR诊断试剂盒 - Google Patents

产肠毒素性大肠杆菌耐热肠毒素基因SYBR Green I荧光定量PCR诊断试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种产肠毒素性大肠杆菌耐热肠毒素基因SYBR Green I荧光定量PCR诊断试剂盒，涉及试剂盒技术领域。本发明包括40μL特异性引物、250μL荧光定量PCR反应混合液(Premix Ex Taq)、20μL ROX Reference Dye、20μL阴性对照、20μL阳性对照、500μL超纯水；根据GenBank中猪源产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)耐热肠毒素(STⅡ)基因序列，设计1对特异性引物，进行试验，试验方法灵敏度可达1.0×101拷贝/μL，重复性好，将PCR产物测序结果与GenBank中的ST基因序列比对，相似度为98.2％～100％。本发明试剂盒具有检测速度快、检出率高的特点。

Description

产肠毒素性大肠杆菌耐热肠毒素基因SYBR Green I荧光定量 PCR诊断试剂盒
技术领域
本发明涉及试剂盒技术领域，尤其是产肠毒素性大肠杆菌耐热肠毒素基因SYBRGreen I荧光定量PCR诊断试剂盒。
背景技术
产肠毒素性大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC)是引起仔猪腹泻的重要病原菌，初生仔猪被ETEC感染后，常因剧烈水样腹泻和迅速脱水而死亡。ETEC引起仔猪腹泻的主要病原是具有宿主特异性的黏附素(F4、F5)和肠毒素(袁万哲，何孔旺，陆承平，等.产肠毒素性大肠杆菌主要毒力因子的研究进展[J]，动物医学进展，2005，26(2)：6-9)。ETEC通过细菌表面的黏附素吸附到小肠上皮细胞，然后在小肠内定居和增殖(SommerU,Petersen J,Pfeiffer M,Schrotz-King P,Morsczeck C.2010.Comparison of surfaceproteomes of enterotoxigenic(ETEC)and commensal Escherichia coli strains[J].JMicrobiol Methods,83(1):13-19)，但这并不能影响小肠上皮细胞的正常功能，直到ETEC产生的肠毒素分泌到菌体外并作用于小肠上皮细胞表面，才会改变小肠的吸收和分泌功能，引起水和电解质大量蓄积，导致小肠上皮细胞的代谢发生紊乱，出现腹泻和脱水的症状(Nicklasson M,Sjoling A,Lebens M,Tobias J,Janzon A,Brive L,Svennerholm AM.2008.Mutations in the periplasmic chaperone leading to loss of surfaceexpression of the colonization factor CS6 in enterotoxigenic Escherichia coli(ETEC)clinical isolates[J].Microb Pathog,44(3):246-254)。ETEC主要有不耐热性肠毒素(Heat-labile toxin，LT)和耐热性肠毒素(Heat-stable toxin，ST)。检测肠毒素对大肠杆菌腹泻病的诊断有极其重要的意义。
目前，检测大肠杆菌肠毒素的方法主要有动物试验、凝集试验、琼脂扩散试验，这些方法不仅费时费力，还有一定的局限性，如华荣虹等《猪源肠毒素菌毛基因多重PCR检测方法的建立》，曾群辉等《牦牛大肠埃希氏菌的肠毒素试验》。随着分子生物学技术的发展，该菌株的肠毒素基因相继被克隆和测序，从基因水平的基础上鉴定大肠埃希菌的菌型及致病性。成大荣等《仔猪腹泻源大肠杆菌的PCR快速检测》通过PCR方法对临床上采集的腹泻仔猪的直肠棉拭子样品进行检测，与常规的细菌分离进行比较，证明PCR方法可对大肠埃希菌病病原进行快速的检测和鉴定。但常规PCR需通过凝胶电泳进行鉴定，费时费力，且只能定性不能定量。荧光定量PCR技术已应用到微生物检测，从敏感性、特异性和速度上都具有优势。冯洁等《啮齿柠檬酸杆菌SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立》建立SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测啮齿柠檬酸杆菌，结果表明检测率高。但是，现有技术中并未存在对猪源产肠毒素性大肠杆菌耐热肠毒素基因提供快速准确诊断的PCR诊断试剂盒，使得对猪源产肠毒素性大肠杆菌耐热肠毒素基因的诊断和检测依然存在操作繁琐，敏感性低，且只能定性不能定量等缺陷。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供一种产肠毒素性大肠杆菌耐热肠毒素基因SYBR Green I荧光定量PCR诊断试剂盒，该试剂盒对ETEC菌株ST Ⅱ基因检测率高，耗时少，对动物细菌性腹泻和ETEC引起的其他疾病的诊断和治疗提供了新的检测途径。
具体是通过以下技术方案实现的：
产肠毒素性大肠杆菌耐热肠毒素基因SYBR Green I荧光定量PCR诊断试剂盒包括40μL特异性引物、250μL荧光定量PCR反应混合液(Premix Ex Taq)、20μL ROX ReferenceDye、20μL阴性对照、20μL阳性对照、500μL超纯水；其中，特异性引物包括上游引物和下游引物，上游引物为
5’,-TATCAATAGCATTCAGCACCAT-3’，下游引物为
5’,-AATGTCCGTCTTGCGTTAGGA-3’。
所述的阴性对照为超纯水。
所述的阳性对照为pMD-18T-ST质粒。
所述的特异性引物浓度为10μmol/L，退火温度为55℃。
所述的试剂盒，-20℃下保存时间≤12个月。
具体本发明创造在研究过程中，是通过如下试验进行的：
1材料与方法
1.1试验材料
菌株：标准产肠毒素大肠杆菌(含黏附素F4)由四川农业大学动物医学院惠赠、标准大肠杆菌C83278(含黏附素F5)、标准大肠杆菌C83922(含黏附素F5)由贵州省畜牧兽医研究所畜禽疫病研究室保存。
主要试剂及仪器：2×Taq PCR Mastermix、Goldview、1XTAE、DL2000、DH5α、pMD-18T、细菌的DNA快速提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒等购自天根生化科技(北京)有限公司；SYBR Green I荧光定量PCR酶购自宝生物(大连)工程有限公司；荧光定量PCR仪为Eppendorf Mastercycler ep realplex 4实时荧光定量PCR仪。
1.2试验方法
1.2.1引物设计
根据GenBank中STⅡ基因设计1对特异性的引物，上游引物：
5’,-TATCAATAGCATTCAGCACCAT-3’，下游引物
5’,-AATGTCCGTCTTGCGTTAGGA-3’，引物由上海英骏生物技术有限公司合成。
1.2.2 DNA的提取
将各标准大肠杆菌参照细菌DNA快速提取试剂盒说明书进行，将提取的DNA-20℃保存。
1.2.3 pMD-18T-ST阳性标准品的构建
利用1.2.1中的引物，以标准产肠毒素大肠杆菌菌株为模板进行PCR扩增，反应条件为：94℃5min；94℃1min，55℃30s，72℃30s，30个循环；最后72℃10min。
将扩增的PCR产物，与pMD-18-克隆载体连接，转化进感受态细胞DH5α，重组质粒命名为pMD-18T-ST，同时送上海英骏生物技术有限公司测序。将重组质粒的浓度和纯度进行测定后，作为阳性标准品进行10倍倍比稀释。
1.2.4荧光定量PCR条件的优化
荧光定量PCR条件，包括引物浓度(5、10、20μmol/L)，退火温度(50℃、55℃、60℃)，ROX Reference Dye的用量(0.5μL、1μL)进行优化以确定荧光定量PCR最佳条件。荧光定量PCR反应程序为：94℃10s；94℃5s、(50℃、55℃、60℃)退火10s、72℃10s，40个循环。
1.2.5荧光定量PCR标准曲线的建立
将重组质粒的浓度和纯度进行测定后，计算DNA拷贝数，作为阳性标准品进行10倍倍比稀释。以优化好的的条件进行扩增，每个稀释倍数2个重复，以拷贝数为横坐标，以Ct值为纵坐标建立标准曲线。
1.2.6荧光定量PCR敏感性试验
将重组质粒计算DNA拷贝数后，10倍稀释后分别进行荧光定量PCR，每个稀释倍数2个重复，以确定荧光定量PCR敏感性。
1.2.7荧光定量PCR特异性试验
以标准产肠毒素大肠杆菌(含黏附素F4)、标准大肠杆菌C83278(含黏附素F5)、标准大肠杆菌C83922(含黏附素F5)DNA进行荧光定量PCR，每个样品3个重复，以确定荧光定量PCR特异性。
1.2.8荧光定量PCR重复性试验
应用建立的荧光定量PCR方法重复检测标准产肠毒素大肠杆菌菌株样品2次，以建立的荧光定量PCR重复的稳定性。
1.3试剂盒的研制
试剂盒组成：①特异性引物40μL；②荧光定量PCR反应混合液(Premix Ex Taq)250μL；③ROX Reference Dye 20μL；④阴性对照20μL；⑤阳性对照20μL，⑥超纯水500μL。
试剂盒保存：将试剂盒在4℃、-20℃分别保存3个月、6个月、12个月，对ETEC菌株STⅡ基因阳性菌株进行检测，观察试剂盒的稳定性。
1.4临床分离的大肠杆菌STⅡ基因检测
对2017年贵州省贵阳市、大方县、施秉县、关岭县、瓮安县等生猪规模化养殖场分离鉴定的149株大肠杆菌进行传统的分离及PCR鉴定，同时应用试剂盒对149株大肠杆菌STⅡ基因进行检测。传统的PCR检测出10株含有STⅡ毒素的菌株，而试剂盒检测出12株含有STⅡ毒素的大肠杆菌。
2结果与分析
2.1 pMD-18T-ST阳性标准品的制备
对标准产肠毒素大肠杆菌菌株DNA进行PCR扩增，扩增出104bp大小的目的片段，无非特异性扩增，见图1。将PCR产物测序结果与GenBank中的ST基因序列比对，相似度为98.2％～100％。
2.2荧光定量PCR条件的优化
在25μL反应体系中(引物2μL、Premix Ex Taq 12.5μL、ROX Reference Dye 1μL、模板1μL，ddH2O 8.5μL)最佳的荧光定量PCR条件为：引物浓度10μmol/L、退火温度55℃能出现最高的荧光值、最小的Ct值，且熔解曲线分析中不出现非特异性扩增峰。
2.3荧光定量PCR反应标准曲线的建立
以1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102、1.0×101拷贝/μL 5种不同浓度重组质粒作为模板进行荧光定量PCR扩增反应，每个浓度重复2次，从而建立荧光定量PCR反应标准曲线，线性回归方程为Ct＝-3.186×lgcopies+29.5(R2＝0.996)，见图2。
2.4荧光定量PCR敏感性试验
以1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102、1.0×101拷贝/μL 6种不同浓度重组质粒作为模板进行荧光定量PCR扩增，每个浓度重复2次，结果其灵敏度为1.0×101拷贝/μL，见图3。
2.5荧光定量PCR特异性试验
以标准产肠毒素大肠杆菌(含黏附素F4)、标准大肠杆菌C83278(含黏附素F5)、标准大肠杆菌C83922(含黏附素F5)DNA进行荧光定量PCR以研究建立的荧光定量PCR诊断方法的特异性，结果产肠毒素大肠杆菌(含黏附素F4)菌株为阳性，而标准大肠杆菌C83278(含黏附素F5)、标准大肠杆菌C83922(含黏附素F5)DNA为阴性，见图4。
2.6重复性试验
应用建立的方法重复检测大肠杆菌STⅡ基因阳性菌株2次，结果扩增曲线重复性较好，结果见图5。
2.7试剂盒保存结果
将试剂盒在4℃、-20℃分别保存3个月、6个月、12个月，对ETEC菌株STⅡ基因阳性菌株进行检测，4℃保存6月、12月标准阳性品拷贝数分别降低10倍、1000倍；-20℃保存3月、6月对标准阳性品拷贝数无影响，保存12个月标准阳性品拷贝数降低10倍。
肠毒素性大肠杆菌是引起仔猪腹泻的主要病原，引发仔猪黄痢(早发性大肠杆菌病)仔猪白痢(迟发性大肠杆菌病)，传染性强，毒力因子主要是菌毛黏附素和肠毒素，黏附素也称菌毛，猪源ETEC的黏附素抗原主要有F4(K88)、F5(K99)、F6(987P)、F7(F41)和F18，肠毒素只有热敏肠毒素(LT)和耐热肠毒素(ST)，两者均有质粒编码，其中ST包含STⅠ和STⅡ(分别又称STa和STb)，ETEC菌株可单独产生ST或LT，或同时产生两种毒素。
目前检测大肠杆菌肠毒素的方法主要有动物试验、凝集试验、琼脂扩散试验，这些方法不仅费时费力，还有一定的局限性。随着分子生物学技术的发展，该菌株的肠毒素基因相继被克隆和测序，从基因水平的基础上鉴定大肠埃希菌的菌型及致病性。本研究研制的试剂盒对ETEC菌株STⅡ基因检测率高，耗时少，对仔猪等动物细菌性腹泻快速临床诊断具有一定的临床意义，对ETEC引起的其他疾病提供了快速有效的检测方法。
附图说明
图1为STⅡ基因PCR扩增结果；
M：DL1000；1：STⅡ基因PCR产物；2：阴性对照。
图2为SYBR Green I荧光定量PCR标准曲线。
图3为SYBR Green I荧光定量PCR敏感性试验结果；
1～5：重组质粒DNA 1.0×105～101拷贝/μL稀释的荧光定量PCR结果。
图4为SYBR Green I荧光定量PCR特异性试验；
1、产肠毒素STⅡ大肠杆菌菌株荧光定量PCR结果；2、C83278(含黏附素F5)菌株荧光定量PCR结果；3、C83922(含黏附素F5)。
图5为SYBR Green I荧光定量PCR重复性试验；
1号为重组质粒DNA 1.0×103拷贝/μL，2号为重组质粒DNA 1.0×103/μL。
具体实施方式
本发明的实施例：一种产肠毒素性大肠杆菌耐热肠毒素基因SYBR Green I荧光定量PCR诊断试剂盒包括40μL特异性引物、250μL荧光定量PCR反应混合液(Premix Ex Taq)、20μL ROX Reference Dye、20μL阴性对照、20μL阳性对照、500μL超纯水；其中，特异性引物包括上游引物和下游引物，上游引物为
5’,-TATCAATAGCATTCAGCACCAT-3’，下游引物为
5’,-AATGTCCGTCTTGCGTTAGGA-3’。
在某些实施例中，阴性对照为超纯水；阳性对照为pMD-18T-ST质粒。
在某些实施例中，特异性引物浓度选取为10μmol/L。对于特异性引物中的上游引物与下游引物的用量是相等的。
在某些实施例中，特异性引物的退火温度为55℃。
在某些实施例中，选取将本发明试剂盒，-20℃下保存时间≤12个月。

Claims (6)

1.一种产肠毒素性大肠杆菌耐热肠毒素基因SYBR Green I荧光定量PCR诊断试剂盒，其特征在于，包括40μL特异性引物、250μL荧光定量PCR反应混合液(Premix Ex Taq)、20μLROX Reference Dye、20μL阴性对照、20μL阳性对照、500μL超纯水；其中，特异性引物包括上游引物和下游引物，上游引物为
5’,-TATCAATAGCATTCAGCACCAT-3’，下游引物为
5’,-AATGTCCGTCTTGCGTTAGGA-3’。
2.如权利要求1所述的产肠毒素性大肠杆菌耐热肠毒素基因SYBR Green I荧光定量PCR诊断试剂盒，其特征在于，所述的阴性对照为超纯水。
3.如权利要求1所述的产肠毒素性大肠杆菌耐热肠毒素基因SYBR Green I荧光定量PCR诊断试剂盒，其特征在于，所述的阳性对照为pMD-18T-ST质粒。
4.如权利要求1所述的产肠毒素性大肠杆菌耐热肠毒素基因SYBR Green I荧光定量PCR诊断试剂盒，其特征在于，所述的特异性引物浓度为10μmol/L,。
5.如权利要求1所述的产肠毒素性大肠杆菌耐热肠毒素基因SYBR Green I荧光定量PCR诊断试剂盒，其特征在于，所述的特异性引物退火温度为55℃。
6.如权利要求1所述的产肠毒素性大肠杆菌耐热肠毒素基因SYBR Green I荧光定量PCR诊断试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒，-20℃下保存时间≤12个月。
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