CN108179132A - 一种胰岛分离装置及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种胰岛分离装置及方法，该装置包括腔体、过滤机构。过滤机构将腔体的内腔隔离成第一腔室、第二腔室。第一腔室设置有第一开口。第二腔室设置有第二开口。该装置通过过滤机构将腔体隔离成两个腔室，胰腺在一端的腔室消化后，释放的胰岛从第一腔室通过过滤机构过滤到第二腔室，可以间隙性的旋开第二开口，将第二腔室内的胰岛液放出，避免胰岛过度消化；且结构简单、成本低、操作方便。

Description

一种胰岛分离装置及方法
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一种胰岛分离装置及方法。
背景技术
应用胰岛细胞移植方法治疗糖尿病，以及应用胰岛细胞开展相关基础生物学和药学研究中，都涉及到从胰腺组织分离获得具有功能的胰岛细胞。胰腺由内分泌腺胰岛(也称Langerhans细胞)和外分泌腺腺泡组成，胰岛散布于腺泡中，其总体积仅占整个胰腺的1-2％。
目前，从胰腺组织分离胰岛细胞的基本技术原理是利用胶原酶消化胰腺结缔组织，释放胰岛细胞，并经过后续纯化步骤将胰岛细胞和外分泌腺细胞分离[Ricordi C.etal.,Isolation of the elusive pig islet.Surgery.1990.107:688-694]。这样的方法原理可以适用于小动物(比如，大鼠[CN1699556A])、大动物(比如，猪[CN101033460A])以及人胰岛细胞[半自动消化法分离纯化人胰岛细胞的实验研究.南方医科大学学报.2007.27(6):824-826]的分离。
当然，由于不同种属胰腺组成和结构上的差异，具体的分离过程需要针对性的优化，才能建立合适的方法，以稳定获得较高数量和质量的胰岛。除此之外，尽管胰岛分离原理简单，但其方法过程中涉及酶的品种、酶消化酶溶液的浓度和pH、消化酶溶液灌注过程、消化时间、终止消化和洗涤过程等复杂因素，导致胰岛分离方法的标准化比较困难，很多时候还依赖于操作者的经验判断，还存在许多有待进一步优化探讨的地方。
针对小动物，因为胰腺较小，消化过程比较均匀，相对快速，而且一般实验室的常规器材即可满足，比如离心管(50毫升)、筛网、恒温水浴设备和离心机。针对大动物(主要是猪)及人胰岛分离，由于胰腺体积很大，采取完全人工的方法很难实现均匀消化，难以保证收获胰岛的数量和质量。
国外已经开发了半自动化设备来进行胰岛分离，最主要的代表是美国Biorep公司的Ricordi胰岛分离系统(主要功能是胰腺消化)，再结合美国Terumo BCT公司的COBE 2991全自动胰岛细胞纯化设备，应用于规模化、标准化的胰岛制备。但是，这些设备价格非常昂贵，一般实验室难以承受，而且也存在一些缺陷，胰岛分离过程操作比较复杂。比如，在Ricordi的系统中，一般情况下从循环的消化酶溶液中采样，观察有无胰岛细胞及外分泌细胞消化的状态来推测消化腔内胰腺组织的消化状态，以决定继续消化还是终止消化。但是，实际上操作很难做到，而且需要非常熟练的技术。
国内也有研究人员开发了相应的系统来应用于大动物及人的胰岛分离[半自动消化法分离纯化人胰岛细胞的实验研究.南方医科大学学报.2007.27(6):824-826；CN205556072U；CN102304477A；CN103952371A；CN205741019U]，但基本上是简单复制Ricordi的系统，集成循环消化和控温功能，并没有解决过程中长时间消化易产生过度消化胰岛的关键问题，从而降低胰岛得率。在胰岛分离方法中，大动物胰腺消化由于体积较大，从而消化时间较长，在消化过程中胰岛的释放是逐步的。我们发现，只要在消化过程中实现分段式消化，就可以有效控制过度消化胰岛现象，从而显著提高胰岛的得率和质量。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提出了一种胰岛分离装置及方法，该装置通过过滤机构将腔体隔离成两个腔室，胰腺在一端的腔室消化后，释放的胰岛从第一腔室通过过滤机构过滤到第二腔室，可以间隙性的旋开第二开口，将第二腔室内的胰岛液放出，避免胰岛过度消化；且解决了现有胰岛分离装置结构复杂、成本高、操作不方便的问题。
为了实现上述目的，本发明技术方案如下：
一种胰岛分离装置，用于对胰腺进行消化处理，包括腔体、过滤机构。过滤机构将腔体的内腔隔离成第一腔室、第二腔室。第一腔室设置有第一开口。第二腔室设置有第二开口。
进一步地，腔体包含第一球冠型腔体、第二球冠型腔体。过滤机构将第一球冠型腔体与第二球冠型腔体相衔接；并且，过滤机构将第一球冠型腔体的内腔和第二球冠型腔体的内腔相隔离，形成所述第一腔室和第二腔室。第一开口设置在第一球冠型腔体上。第二开口设置在第二球冠型腔体上。
进一步地，第一开口、第二开口上分别带有盖。盖用于将腔体密闭。
进一步地，过滤机构包含腔体连接筒、筛网。第一球冠型腔体、第二球冠型腔体的底面直径与筛网的直径相同。筛网安装在腔体连接筒内，将腔体连接筒内部空间横截成两部分。腔体连接筒的一端套在第一球冠型腔体上，腔体连接筒的另一端套在第二球冠型腔体上。
进一步地，筛网呈圆盘状。筛网的盘面上设置有若干圆形过滤通孔。
进一步地，腔体连接筒的侧壁的两边上分别设置有相反向的外螺纹。在第一球冠型腔体上，与腔体连接筒相衔接处设置有内螺纹。在第二球冠型腔体上，与腔体连接筒相衔接处设置有内螺纹。第一球冠型腔体、第二球冠型腔体分别通过螺纹与腔体连接筒相衔接。
进一步地，第一开口、第二开口上分别设置有外螺纹。第一开口的盖上设置有内螺纹。第二开口的盖上设置有内螺纹。第一开口的盖旋拧在第一开口上。第二开口的盖旋拧在第二开口上。
进一步地，腔体由透明材质制成。
进一步地，腔体、腔体连接筒由塑料材质制成。筛网由钢材质制成。
进一步地，第一腔室、第二腔室的体积比在1:1～10:1之间。
进一步地，第一开口的轴线与第二开口的轴线相重合。
一种胰岛分离方法，包括以下步骤：
S1：获取新鲜的动物的胰腺；
S2：剔除胰腺上的结缔组织；
S3：配置消化酶溶液；
S4：将胰腺置于培养皿中，然后放在冰浴上；用注射器吸取消化酶溶液，将消化酶溶液注射至胰腺的每一个腺泡结构中；待腺泡充满消化酶溶液后，将胰腺分成小块组织；
S5：盖上胰岛分离装置上第一开口的盖；将分成小块的胰腺组织从第二开口置于胰岛分离装置的第一腔室内，盖上胰岛分离装置上第二开口的盖；将胰岛分离装置置于37℃的水浴中孵育，消化胰腺组织；开始计时，并轻轻摇晃胰岛分离装置，消化8－15分钟；过滤机构的过滤通孔孔径为450μm；打开第二开口上的盖，收集滤液；再将滤液通过200μm孔径的筛网过滤，收集滤液；对滤液进行离心；取出离心后的细胞沉淀；将细胞沉淀用培养基重悬，记第1次收集样品，置于冰浴中待用。
本发明的有益效果：
(1)该装置通过过滤机构将腔体隔离成两个腔室，胰腺在一端的腔室消化后，释放的胰岛从第一腔室通过过滤机构过滤到第二腔室，可以间隙性的旋开第二开口，将第二腔室内的胰岛液放出，避免胰岛过度消化；且结构简单、成本低、操作方便。
(2)该装置通过过滤机构将第一球冠型腔体、第二球冠型腔体组装并隔离成两个腔室，装配简单、使用方便。
附图说明
图1为本发明的胰岛分离装置的立体结构示意图。
其中，图1的附图标记为：腔体1、过滤机构2；第一球冠型腔体11、第二球冠型腔体12；腔体连接筒21、筛网22；第一开口111、第二开口112、盖10。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，进一步阐述本发明。
如图1所示，一种胰岛分离装置，用于对胰腺进行消化处理，以分离胰岛，包括腔体1、过滤机构2。
过滤机构2将腔体1的内腔隔离成第一腔室、第二腔室。第一腔室设置有带盖10的第一开口111。第二腔室设置有带盖10的第二开口112。
将胰腺置于第一腔室内，从第一开口111向第一腔室内加入消化酶溶液。第一开口111、第二开口112盖上盖10后，腔体1密闭；将其置于一定的温度条件下，并且摇晃该装置(可将该装置盖上盖10后置于具有摇床功能的水浴锅中，设置好温度)。胰腺消化一定时间后，胰腺释放的胰岛，含有小细胞团的消化液体从第一腔室通过过滤机构2过滤到第二腔室。这样，可以间隙性的旋开第二开口112，将第二腔室内的含有小细胞团的消化液体放出。该装置结构简单、成本低、操作方便。消化液体可以从第一腔室过滤到第二腔室，并间隙性的放出，避免胰岛过度消化；而剩余的胰腺组织被过滤机构2隔离在第一腔室，继续消化；通过间隙性的控制第二开口112，放出消化液体，实现胰腺的分段式消化，可以有效控制过度消化胰岛现象，从而显著提高胰岛的得率和质量。
消化酶溶液是根据胰腺组织的重量，按5ml/g胰腺组织的比例配制相应体积的1.5mg/ml胶原酶V溶液。消化液体放出后，进行离心，先以1700r/min转速离心3分钟，然后以2400r/min转速离心3分钟，分别收集沉淀，取细胞沉淀，用培养基重悬，记第1次收集样品，置于冰浴中待用。
较佳地，第一开口111的轴线与第二开口112的轴线相重合。
较佳地，第一腔室、第二腔室的体积比在1:1～10:1之间。
具体地，腔体1包含第一球冠型腔体11、第二球冠型腔体12。
第一开口111设置在第一球冠型腔体11上。第二开口112设置在第二球冠型腔体12上。过滤机构2将第一球冠型腔体11与第二球冠型腔体12相衔接，并隔离第一球冠型腔体11与第二球冠型腔体12的内腔；过滤机构2将第一球冠型腔体11的内腔和第二球冠型腔体12的内腔隔离成第一腔室和第二腔室。
具体地，过滤机构2包含腔体连接筒21、筛网22。
第一球冠型腔体11、第二球冠型腔体12的底面直径与筛网22的直径相同。筛网22安装在腔体连接筒21内，将腔体连接筒21内部空间横截成左、右两部分。腔体连接筒21的一端外套或内套在第一球冠型腔体11上，腔体连接筒21的另一端外套或内套在第二球冠型腔体12上。
较佳地，筛网22呈圆盘状。筛网22的盘面上设置有若干微米级的圆形或方形过滤通孔。圆形过滤通孔较方形过滤通孔，可以提高胰岛液的透过率。
较佳地，腔体连接筒21的侧壁的两边上分别设置有相反向的外螺纹。在第一球冠型腔体11上，与腔体连接筒21相衔接处设置有内螺纹。在第二球冠型腔体12上，与腔体连接筒21相衔接处设置有内螺纹。第一球冠型腔体11、第二球冠型腔体12分别通过螺纹与腔体连接筒21相衔接。
较佳地，第一开口111、第二开口112上分别设置有外螺纹。第一开口111的盖10上设置有内螺纹。第二开口112的盖10上设置有内螺纹。第一开口111的盖10旋拧在第一开口111上。第二开口112的盖10旋拧在第二开口112上。
较佳地，腔体1由透明的塑料材质制成。腔体1选用医用级别的硬质透明材料，包括但不局限于PC、PSU、PS、K树脂、PVC等。
较佳地，盖10由塑料材质制成。盖10选用医用级别的硬质塑料材料，包括但不局限于ABS、PEEK、PTFE、PET、PBT、PPSU、PP、PC、PSU、PS、K树脂、PVC等。
较佳地，腔体连接筒21由塑料材质制成。
较佳地，筛网22由钢质材质制成。选用医用级别钢材，筛网22的过滤通孔为激光打孔形成的圆形孔结构。
此外，本发明还公开了一种胰岛分离方法，应用上述的胰岛分离装置，包括以下步骤：
S1、取猪胰腺：选成年猪(0.5-5岁健康猪)，放血处理(动脉、心脏放血，方式是用刀割破颈动脉或刺破心脏)，大约1-2分钟后，待猪停止呼吸，立即将完整胰腺与周围组织切割分离取出，将胰腺用保鲜膜包裹后，置于冰浴上冷藏，迅速运回实验室，准备胰岛分离(注：建议立即进行胰岛分离，但也可以4度保留，3-4小时内分离不会显著影响分离效果)；
S2、剔除结缔组织：在超净台里，将胰腺组织置于大培养皿中，用镊子和手术剪去除脂肪、网膜、血液等附着组织，然后称净重，取整个胰腺或者用手术剪剪取所需重量的胰腺组织(比如，20克)进行消化；
S3、配制消化酶溶液：根据胰腺组织重量，按5ml/g胰腺组织的比例配制相应体积的1.5mg/ml胶原酶V溶液；
S4、灌注处理：将胰腺(或部分胰腺组织)置于新的培养皿中，放在冰浴上，用注射器(建议使用5-20ml注射器，配1ml注射器标配针头)吸取胶原酶V消化酶溶液，注射至每一个腺泡结构中，使腺泡膜鼓胀充满消化酶溶液，然后用镊子将胰腺扯成小块组织(3-5毫米大小)，
S5、胰腺消化：首先盖上第二开口112上的盖10，并将第二球冠型腔体12与过滤机构2组装起来；将注有和消化酶溶液的胰腺组织转移至第一球冠型腔体11内；再盖上第一开口111上的盖10将胰岛分离装置置于37度的水浴中孵育，消化胰腺组织，开始计时，并不断轻轻摇晃装置，消化8－15分钟(注：根据酶的批次、猪的品系和个体不同，孵育时间会略有变化，需要略作调整延长或缩短消化时间)；过滤机构2的过滤通孔孔径为450μm；打开第二开口112上的盖10，收集滤液(筛网上截留的组织留待下一步骤处理)；再将滤液通过200μm孔径的筛网过滤，收集滤液(筛网上截留的组织留待下一步骤处理)；离心(注：先1700r/min离心3分钟，然后2400r/min离心3分钟，分别收集沉淀)，取细胞沉淀，用培养基重悬，记第1次收集样品，置于冰浴中待用；(注：第1次收集的离心上清液(也即酶液)，收集起来在下面步骤中使用)。
以上所述的仅是本发明的优选实施方式，本发明不限于以上实施例。可以理解，本领域技术人员在不脱离本发明的基本构思的前提下直接导出或联想到的其它改进和变化均应认为包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种胰岛分离装置，用于对胰腺进行消化处理其特征在于：
包括腔体(1)、过滤机构(2)；
过滤机构(2)将腔体(1)的内腔隔离成第一腔室、第二腔室；
第一腔室设置有第一开口(111)；
第二腔室设置有第二开口(112)。
2.根据权利要求1所述的胰岛分离装置，其特征在于：
腔体(1)包含第一球冠型腔体(11)、第二球冠型腔体(12)；
过滤机构(2)将第一球冠型腔体(11)与第二球冠型腔体(12)相衔接；并且，过滤机构(2)将第一球冠型腔体(11)的内腔和第二球冠型腔体(12)的内腔相隔离，形成所述第一腔室和第二腔室；
第一开口(111)设置在第一球冠型腔体(11)上；
第二开口(112)设置在第二球冠型腔体(12)上。
3.根据权利要求1或2所述的胰岛分离装置，其特征在于：
第一开口(111)、第二开口(112)上分别带有盖(10)；
所述盖(10)用于将腔体(1)密闭。
4.根据权利要求2所述的胰岛分离装置，其特征在于：
过滤机构(2)包含腔体连接筒(21)、筛网(22)；
筛网(22)安装在腔体连接筒(21)内，将腔体连接筒(21)内部空间横截成两部分；
腔体连接筒(21)的一端套在第一球冠型腔体(11)上，腔体连接筒(21)的另一端套在第二球冠型腔体(12)上。
5.根据权利要求4所述的胰岛分离装置，其特征在于：
筛网(22)呈圆盘状；
筛网(22)的盘面上设置有若干过滤通孔。
6.根据权利要求4所述的胰岛分离装置，其特征在于：
腔体连接筒(21)的侧壁的两边上分别设置有相反向的外螺纹；
在第一球冠型腔体(11)上，与腔体连接筒(21)相衔接处设置有内螺纹；
在第二球冠型腔体(12)上，与腔体连接筒(21)相衔接处设置有内螺纹；
第一球冠型腔体(11)、第二球冠型腔体(12)分别通过螺纹与腔体连接筒(21)相衔接。
7.根据权利要求3所述的胰岛分离装置，其特征在于：
第一开口(111)、第二开口(112)上分别设置有外螺纹；
第一开口(111)的盖(10)上设置有内螺纹；
第二开口(112)的盖(10)上设置有内螺纹；
第一开口(111)的盖(10)旋拧在第一开口(111)上；
第二开口(112)的盖(10)旋拧在第二开口(112)上。
8.根据权利要求1所述的胰岛分离装置，其特征在于：
腔体(1)由透明材质制成。
9.根据权利要求4所述的胰岛分离装置，其特征在于：
腔体(1)、腔体连接筒(21)由塑料材质制成；
筛网(22)由钢材质制成。
10.一种胰岛分离方法，应用权利要求1-9任意一所述的胰岛分离装置，其特征在于：
包括以下步骤：
S1：获取新鲜的动物胰腺；
S2：剔除胰腺上的结缔组织；
S3：配置消化酶溶液；
S4：将胰腺置于培养皿中，然后放在冰浴上；用注射器吸取消化酶溶液，将消化酶溶液注射至胰腺的每一个腺泡结构中；待腺泡充满消化酶溶液后，将胰腺分成小块组织；
S5：盖上胰岛分离装置上第一开口(111)的盖；将分成小块的胰腺从第二开口(112)置于胰岛分离装置的第一腔室内，盖上胰岛分离装置上第二开口(112)的盖；将胰岛分离装置置于37℃的水浴中孵育，消化胰腺；开始计时，并轻轻摇晃胰岛分离装置，胰腺消化8－15分钟；过滤机构(2)的过滤通孔孔径为450μm；打开第二开口(112)上的盖(10)，收集滤液；再将滤液通过200μm孔径的筛网过滤，收集滤液；对滤液进行离心；取出离心后的细胞沉淀；将细胞沉淀用培养基重悬，记第一次收集样品，置于冰浴中待用。
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