CN108169352A - 一种ase-hplc法测定卷柏中穗花双黄酮含量的方法 - Google Patents

一种ase-hplc法测定卷柏中穗花双黄酮含量的方法 Download PDF

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张云平
黄林杰
赖秀梅
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Abstract

本发明公开了一种ASE‑HPLC法测定卷柏中穗花双黄酮含量的方法，该方法萃取时间短、且检测精度高，属于化学检测领域。该方法采用ASE法萃取卷柏粉末，并收集甲醇萃取液；采用HPLC法测定甲醇萃取液中的穗花双黄酮含量。本发明可代替药典方法对卷柏中穗花双黄酮含量进行提取以及含量检测。

Description

一种ASE-HPLC法测定卷柏中穗花双黄酮含量的方法
技术领域
本发明属于化学检测领域，尤其是一种ASE-HPLC法测定卷柏中穗花双黄酮含量的方法。
背景技术
2015年版药典方法：取本品粉末(过三号筛)约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，加热回流5小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
该方法的回流时间较长，对技术人员的专业水平较高。
发明内容
针对上述不足，本发明旨在提供一种ASE-HPLC法测定卷柏中穗花双黄酮含量的方法，该方法萃取时间短、且检测精度高。
为了实现上述技术效果，本发明提供的技术方案是这样的：一种ASE-HPLC法测定卷柏中穗花双黄酮含量的方法，依次包括下述步骤：
步骤1：采用ASE法萃取卷柏粉末，并收集甲醇萃取液；
步骤2：采用HPLC法测定甲醇萃取液中的穗花双黄酮含量。
优选地，所述的步骤1包括下述子步骤：
步骤S1：将卷柏样品粉碎，过三号筛，取0.5g与1g硅藻土混合；
步骤S2：将步骤S1所得的混合物装于放有滤膜的ASE萃取池中，加硅藻土至与池口平行；
步骤S3：用甲醇萃取，结束后用甲醇定容至25ml，离心，去上清液。
优选地，步骤S3所述的ASE萃取条件：压力为1500psi、温度为110℃，时间为3min，次数为4次，冲洗体积为80％，吹扫时间为80％。
优选地，所述的HPLC法的检测参数为：色谱柱为Thermo Syncronis C18；柱温为40℃；流速为0.5mL/min；流动相为甲醇-0.1％磷酸；检测波长为330nm。
优选地，步骤S3所述的离心步骤的参数为：离心速度为15000r/min，离心时间为3min。
优选地，步骤S2所述的ASE萃取池的体积为5ml。
优选地，所述的色谱柱的规格为3*100mm，3μm。
优选地，所述的流动相为体积比等于55：45的甲醇-0.1％磷酸。
本发明与传统方法相比，具有以下优点：
本发明曾对快速溶剂萃取使用的溶剂进行考察，《中国药典》使用甲醇回流5小时。本实验选用甲醇、乙醇、乙腈作为提取溶剂进行了溶剂考察，结果显示甲醇提取后穗花杉双黄酮含量最高，故采用与药典一致的提取溶剂甲醇。
ASE提取原理如下所示：A:提高温度降低溶剂的黏度，减少溶剂进入样品基体的阻止，增加了溶剂进入样品基体的扩散，降低溶剂和样品基体之间的表面张力，使溶剂溶解待测物的容量增加；B:萃取液体的沸点随压力升高而提高，从而使溶剂在高温高压下仍保持在液态 (液体对溶质的溶解能力远大于气体对溶质的溶解能力)。
我们经过正交试验选择采用110℃，提取5min，提取3次，即可达到与药典含量接近，更多的提取时间、温度、次数对结果已经无明显影响。最终确定最佳提取工艺组合为提取温度110℃，提取时间5min，提取次数3次。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，对本发明的权利要求做进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制，任何在本发明权利要求保护范围内所做的有限次修改、仍在本发明的权利要求保护范围之内。
实施例1
1、仪器设备及试剂
1.1仪器：
电子分析天平(XA205DU)、ASE350快速溶剂萃取仪(美国DIONEX公司)、ThermoU3000 UHPLC液相色谱仪
1.2试剂：
水：符合GB/T 6682规定的一级水；
甲醇：色谱纯；
硅藻土：2mm；
2、方法
2.1对照品溶液的制备
取穗花双黄酮对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含25μg的溶液，即得。
2.2供试品溶液的制备
2015年版药典方法：取本品粉末(过三号筛)约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，加热回流5小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
快速溶剂萃取法(ASE)制备供试品方法：样品经粉碎机粉碎，过三号筛，约0.2g，精密称定，与1g硅藻土混合均匀，待用，移入到预先放好过滤膜的ASE5ml萃取池中再加入适量硅藻土，轻轻振摇使之与池口在同一水平线上，拧紧萃取池上盖。萃取结束后，把萃取液转移于25ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，在15000r/min下离心3min，取上清液，进入HPLC 测定。
2.3ASE萃取条件：压力为1500psi、温度为110℃，时间为3min，次数为4次，冲洗体积为80％，吹扫时间为80％。
2.4色谱条件与系统适用性试验
a)仪器：Thermo双三元液相(U-3000)；
b)色谱柱：Thermo Syncronis C18，3*100mm 3μm；
c)柱温：40℃；
d)流速：0.5mL/min；
e)流动相：：甲醇-0.1％磷酸(55:45)；
f)检测波长：330nm；
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；理论板数按穗花杉双黄酮峰计算应不低于3000。
2.5测定法
照高效液相色谱法(通则0512)测定
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各2μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
2.6标准限值要求
本品按干燥品计算，含穗花杉双黄酮(C30H18O10)不得少于0.30％。
2.7计算(外标法)
式中CR——对照品溶液浓度，单位为微克每升(mg/L)；
AX——供试品的峰面积；
AR——对照品峰面积。
注意：
使用前萃取池底部应拆卸清理干净，否则容易引起压力不稳；
萃取池底部的滤纸应在密封圈内，否则引起渗漏；
萃取池装样时松紧适中，太松容易导致提取液过多；
开机前检查气瓶气压是否达到1Mpa；
使用结束后清理干净，萃取池要及时晾干(容易生锈)。
3、结果
3.1线性关系
取取穗花杉双黄酮对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含25μg的溶液，即得，然后分别精密吸取该溶液0.1μl、0.2μl、0.5μl、1μl、2μl进入LC测定，并依照上述方法测定，结果详见表1。
以浓度(μg/ml)-峰面积进行线性回归，求得回归方程：y＝17.132x+9.1974，R2＝0.99998。穗花杉双黄酮在2.7～53.9μg/ml范围内呈良好的线性关系。
表1线性试验结果
3.2重现性试验
取相同批号的样品(批号：1409122广西)0.2g，共3份，精密称定，按ASE提取方法提取供试品溶液，进样量为1μL，以上述的色谱条件平行试验，测得样品中穗花杉双黄酮的含量见表2，RSD为2.70％，结果表明ASE提取方法重复性良好。
表2
3.3样品含量测定结果(4批)
表3
4、讨论：
4.1ASE提取溶剂的选择：
本发明曾对快速溶剂萃取使用的溶剂进行考察，《中国药典》使用甲醇回流5小时。本实验选用甲醇、乙醇、乙腈作为提取溶剂进行了溶剂考察，结果显示甲醇提取后穗花杉双黄酮含量最高，故采用与药典一致的提取溶剂甲醇。
4.2ASE提取条件的优化
甲醇的熔沸点较高，快速溶剂萃取(以下简称ASE)提取原理：A:提高温度降低溶剂的黏度，减少溶剂进入样品基体的阻止，增加了溶剂进入样品基体的扩散，降低溶剂和样品基体之间的表面张力，使溶剂溶解待测物的容量增加；B:萃取液体的沸点随压力升高而提高，从而使溶剂在高温高压下仍保持在液态(液体对溶质的溶解能力远大于气体对溶质的溶解能力)。我们经过正交试验选择采用110℃，提取5min，提取3次，即可达到与药典含量接近，更多的提取时间、温度、次数对结果已经无明显影响。最终确定最佳提取工艺组合为提取温度110℃，提取时间5min，提取次数3次。
以上所述的仅为本发明的较佳实施例，凡在本发明的精神和原则范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围内。

Claims (8)

1.一种ASE-HPLC法测定卷柏中穗花双黄酮含量的方法，其特征在于，依次包括下述步骤：
步骤1：采用ASE法萃取卷柏粉末，并收集甲醇萃取液；
步骤2：采用HPLC法测定甲醇萃取液中的穗花双黄酮含量。
2.根据权利要求1所述的一种ASE-HPLC法测定卷柏中穗花双黄酮含量的方法，其特征在于，所述的步骤1包括下述子步骤：
步骤S1：将卷柏样品粉碎，过三号筛，取0.5g与1g硅藻土混合；
步骤S2：将步骤S1所得的混合物装于放有滤膜的ASE萃取池中，加硅藻土至与池口平行；
步骤S3：用甲醇萃取，结束后用甲醇定容至25ml，离心，去上清液。
3.根据权利要求2所述的一种ASE-HPLC法测定卷柏中穗花双黄酮含量的方法，其特征在于，步骤S3所述的ASE萃取条件：压力为1500psi、温度为110℃，时间为3min，次数为4次，冲洗体积为80％，吹扫时间为80％。
4.根据权利要求1所述的一种ASE-HPLC法测定卷柏中穗花双黄酮含量的方法，其特征在于，所述的HPLC法的检测参数为：色谱柱为Thermo Syncronis C18；柱温为40℃；流速为0.5mL/min；流动相为甲醇-0.1％磷酸；检测波长为330nm。
5.根据权利要求2所述的一种ASE-HPLC法测定卷柏中穗花双黄酮含量的方法，其特征在于，步骤S3所述的离心步骤的参数为：离心速度为15000r/min，离心时间为3min。
6.根据权利要求2所述的一种ASE-HPLC法测定卷柏中穗花双黄酮含量的方法，其特征在于，步骤S2所述的ASE萃取池的体积为5ml。
7.根据权利要求4所述的一种ASE-HPLC法测定卷柏中穗花双黄酮含量的方法，其特征在于，所述的色谱柱的规格为3*100mm，3μm。
8.根据权利要求4所述的一种ASE-HPLC法测定卷柏中穗花双黄酮含量的方法，其特征在于，所述的流动相为体积比等于55：45的甲醇-0.1％磷酸。
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