CN107064347A - 一种ase‑hplc法测定补骨酯中补骨酯素、异补骨酯素含量的方法 - Google Patents

一种ase‑hplc法测定补骨酯中补骨酯素、异补骨酯素含量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种ASE‑HPLC法测定补骨酯中补骨酯素、异补骨酯素含量的方法，属于化学检测领域，旨在提供一种可同时测定补骨酯中补骨酯素、异补骨酯素两种有效成分的方法。该方法采用ASE萃取方法用甲醇萃取粉碎后的补骨酯，并制备甲醇萃取液；采用HPLC法检测甲醇萃取液中补骨酯素、异补骨酯素的含量。本发明可用于补骨酯中有效成分含量的测定。

Description

一种ASE-HPLC法测定补骨酯中补骨酯素、异补骨酯素含量的 方法
技术领域
本发明属于化学检测领域，尤其是一种ASE-HPLC法检测补骨酯中补骨酯素、异补骨酯素含量的方法。
背景技术
补骨脂(学名：Psoralea corylifolia Linn.)，又名：破故纸，婆固脂，胡韭子。属蔷薇目，果实入药，具有补益肝肾，健脾益气，涩精止遗的功效，用于肝肾不足，脾气虚弱，面色萎黄，倦怠纳差，腰膝酸痛，遗精梦泄，并可治牛皮癣等皮肤病。
现有技术中没有关于补骨酯中补骨酯素、异补骨酯素含量测定的文献报道，为了更好的控制该产品的质量，保证患者服用的药物确实有效，有必要对含量测定方法进行研究。
发明内容
针对上述不足，本发明旨在提供一种可同时测定补骨酯中补骨酯素、异补骨酯素两种有效成分的ASE-HPLC的方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是这样的：一种ASE-HPLC法测定补骨脂中补骨脂素、异补骨脂素含量的方法，依次包括下述步骤：
步骤1：采用ASE萃取方法用甲醇萃取粉碎后的补骨酯，并制备甲醇萃取液；
步骤2：采用HPLC法检测甲醇萃取液中补骨酯素、异补骨酯素的含量。
进一步的，所述的步骤1包括下述子步骤：
步骤S1：将补骨酯样品粉粹，过三号筛，取过筛后的粉末0.5g；
步骤S2：将0.5g补骨酯粉末与1g硅藻土混合，装于放有滤膜的10mlASE萃取池中，加硅藻土至与池口平行；
步骤S3：用甲醇萃取，蒸干，加甲醇溶解，并用甲醇定容至50ml；
步骤S4：将步骤3所得溶液离心，取上清液，得到甲醇萃取液。
进一步的，步骤S3所述的萃取，参数如下：萃取温度为90℃，萃取时间为5min，萃取次数为3次，冲洗体积为60％，吹扫时间为60s，压力为1500psi。
进一步的，步骤S4所述的离心参数为：速度为15000r/min，时间为3min。
进一步的，所述的步骤2的HPLC检测参数为：色谱柱为Thermo Accucore C18；柱温为40℃；流速为0.5mL/min；流动相为体积比为49:51的甲醇-水；检测波长：246nm。
进一步的，所述的色谱柱的规格为2.6μm，50mm×2.1mm。
进一步的，所述的萃取方法所采用的仪器为美国DIONEX公司的ASE350快速溶剂萃取仪；所述的HPLC法所采用的仪器为Thermo U3000UHPLC液相色谱仪。
本发明与传统方法相比，具有以下优点：
1.本发明的质量分析方法在同一色谱条件下检出补骨脂素和异补骨脂素两个有效成分，检测方法经过参数的最优化组合，从而使本发明的检测方法灵敏度高，具有很好的分离度，基线稳定，阴性对照无干扰，检测方法的准确性、重现性、线性关系、稳定性均能达到科研和生产的要求；
2.本发明所采用的ASE萃取法提高了温度降低溶剂的黏度，从而减少溶剂进入样品基体的阻止，增加了溶剂进入样品基体的扩散，降低溶剂和样品基体之间的表面张力，使溶剂溶解待测物的容量增加；ASE提取溶剂的选择：
3.本发明曾对快速溶剂萃取使用的溶剂进行考察，《中国药典》使用甲醇索氏2h；为了减少杂质，故本实验选用甲醇、乙醇、乙腈作为提取溶剂进行了溶剂考察，结果显示甲醇与乙醇提取后补骨脂素与异补骨脂素含量与2015年版《中国药典》含量一致，且杂质峰基本相同，故采用与药典一致的提取溶剂甲醇；
4.萃取液体的沸点随压力升高而提高，从而使溶剂在高温高压下仍保持在液态(液体对溶质的溶解能力远大于气体对溶质的溶解能力)；故我们选择采用90℃，提取5min，提取3次，即可达到与药典含量接近，更多的提取时间、温度、次数对结果已经无明显影响。
附图说明
图1为补骨酯素以浓度(mg/ml)-峰面积进行线性回归图；
图2为异补骨脂素以浓度(mg/ml)-峰面积进行线性回归图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，对本发明的权利要求做进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制，任何在本发明权利要求保护范围内所做的有限次的修改，仍在本发明的权利要求保护范围之内。
实施例1
1、仪器设备及试剂
1.1仪器：
电子分析天平(XA205DU)、ASE350快速溶剂萃取仪(美国DIONEX公司)、ThermoU3000UHPLC液相色谱仪；
1.2试剂(除特别注明外，本实验所用试剂均为分析纯)：
水：符合GB/T 6682规定的一级水；
甲醇(CH4O)：色谱纯(液相色谱用)；
石英砂：粒径2mm。
2方法
2.1对照品溶液的制备：
取补骨脂素、异补骨脂素对照品适量，加甲醇制成每1ml含20ug的溶液，即得。
2.2供试品溶液的制备
2.2.1《中国药典》2015年版一部制备供试品方法：
供试品溶液的制备：取本品粉末(过三号筛)约0.5g，精密称定，置索氏提取器中，加甲醇适量，加热回流提取2小时，放冷，转移至100ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，在15000r/min下离心3min，取上清液，进入LC测定。
2.2.2快速溶剂萃取法(ASE)制备供试品方法：
步骤S1：将补骨酯样品粉粹，过三号筛，取过筛后的粉末0.5g；
步骤S2：将0.5g补骨酯粉末与1g硅藻土混合，装于放有滤膜的10mlASE萃取池中，加硅藻土至与池口平行；
步骤S3：用甲醇萃取，蒸干，加甲醇溶解，并用甲醇定容至50ml；
步骤S4：将步骤3所得溶液在15000r/min下离心3min，取上清液，得到甲醇萃取液。
2.3ASE萃取条件
萃取温度为90℃，萃取时间为5min，萃取次数为3次，冲洗体积为60％，吹扫时间为60s，压力为1500psi。
2.4色谱条件与系统适用性试验
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；理论板数按补骨脂素峰计算应不低于3000。
HPLC检测参数为：色谱柱为Thermo Accucore C18，2.6μm，50mm×2.1mm；柱温为40℃；流速为0.5mL/min；流动相为体积比为49:51的甲醇-水；检测波长：246nm。
2.5测定法
按照高效液相色谱法(通则0512)测定
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
2.6标准限值要求
本品按干燥品计算，含补骨脂素(C11H6O3)和异补骨脂素(C11H6O3)的总量不得少于0.70％。
2.7、计算(外标法)
式中CR——对照品溶液浓度，单位为微克每升(mg/L)；
AX——供试品的峰面积；
AR——对照品峰面积。
注意：
1.使用前萃取池底部应拆卸清理干净，否则容易引起压力不稳；
2.萃取池底部的滤纸应在密封圈内，否则引起渗漏；
3.萃取池装样时松紧适中，太松容易导致提取液过多；
4.开机前检查气瓶气压是否达到1Mpa；
5.使用结束后清理干净，萃取池要及时晾干(容易生锈)。
3结果
3.1线性关系
取补骨脂素、异补骨脂素对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加1甲醇制成每1ml含补骨脂素14.722μg、异补骨脂素11.472μg的溶液，然后分别精密吸取该溶液0.5μl、1μl、2μl、5μl进入LC测定，并依照上述方法测定。
补骨脂素线性试验结果详见表1，异补骨脂素线性试验结果详见表2。
以浓度(mg/ml)-峰面积进行线性回归。
求得补骨脂素回归方程：y＝12154.8147x+10.3900，R2＝0.9996，补骨脂素在7.361～73.61μg/ml范围内呈良好的线性关系，详见图1；
求得异补骨脂素回归方程：y＝13087.1681x-1.6855，R2＝1.0000，异补骨脂素在5.736～57.36μg/ml范围内呈良好的线性关系，详见图2。
表1
表2
3.2重现性试验
取相同批号的样品(批号：1511073)0.5g，共4份，精密称定，按ASE提取方法提取供试品溶液，进样量为1μL，以上述的色谱条件平行试验，测得样品中补骨酯素的含量见表3、测得样品中异补骨酯素的含量见表4，试验表明ASE提取方法重复性良好。
表3
表4
3.3样品不同仪器提取结果及与药典方法结果比较(3批)
结果见表5：
表5
4.讨论：
4.1 ASE提取溶剂的选择：
试验中，曾对快速溶剂萃取使用的溶剂进行考察，《中国药典》使用甲醇索氏提取2h。为了减少杂质，故本实验选用甲醇、乙醇、乙腈作为提取溶剂进行了溶剂考察，结果显示甲醇与乙醇提取后补骨脂素与异补骨脂素含量与2015年版《中国药典》含量一致，且杂质峰基本相同，故采用与药典一致的提取溶剂甲醇。
4.2 ASE提取条件的优化
甲醇的熔沸点较低，ASE提取原理：A:提高温度降低溶剂的黏度，减少溶剂进入样品基体的阻止，增加了溶剂进入样品基体的扩散，降低溶剂和样品基体之间的表面张力，使溶剂溶解待测物的容量增加；B:萃取液体的沸点随压力升高而提高，从而使溶剂在高温高压下仍保持在液态(液体对溶质的溶解能力远大于气体对溶质的溶解能力)。故我们选择采用90℃，提取5min，提取3次，即可达到与药典含量接近，更多的提取时间、温度、次数对结果已经无明显影响。最终确定最佳提取工艺组合为提取温度90℃，提取时间5min，提取次数3次。
以上所述的仅为本发明的较佳实施例，凡在本发明的精神和原则范围内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种ASE-HPLC法测定补骨脂中补骨脂素、异补骨脂素含量的方法，其特征在于，依次包括下述步骤：
步骤1：采用ASE萃取方法用甲醇萃取粉碎后的补骨酯，并制备甲醇萃取液；
步骤2：采用HPLC法检测甲醇萃取液中补骨酯素、异补骨酯素的含量。
2.根据权利要求1所述的一种ASE-HPLC法测定补骨酯中补骨酯素、异补骨酯素含量的方法，其特征在于，所述的步骤1包括下述子步骤：
步骤S1：将补骨酯样品粉粹，过三号筛，取过筛后的粉末0.5g；
步骤S2：将0.5g补骨酯粉末与1g硅藻土混合，装于放有滤膜的10mlASE萃取池中，加硅藻土至与池口平行；
步骤S3：用甲醇萃取，蒸干，加甲醇溶解，并用甲醇定容至50ml；
步骤S4：将步骤3所得溶液离心，取上清液，得到甲醇萃取液。
3.根据权利要求2所述的一种ASE-HPLC法测定补骨酯中补骨酯素、异补骨酯素含量的方法，其特征在于，步骤S3所述的萃取，参数如下：萃取温度为90℃，萃取时间为5min，萃取次数为3次，冲洗体积为60％，吹扫时间为60s，压力为1500psi。
4.根据权利要求2所述的一种ASE-HPLC法测定补骨酯中补骨酯素、异补骨酯素含量的方法，其特征在于，步骤S4所述的离心参数为：速度为15000r/min，时间为3min。
5.根据权利要求1所述的一种ASE-HPLC法测定补骨酯中补骨酯素、异补骨酯素含量的方法，其特征在于，所述的步骤2的HPLC检测参数为：色谱柱为Thermo Accucore C18；柱温为40℃；流速为0.5mL/min；流动相为体积比为49:51的甲醇-水；检测波长：246nm。
6.根据权利要求1或5所述的一种ASE-HPLC法测定补骨酯中补骨酯素、异补骨酯素含量的方法，其特征在于，所述的色谱柱的规格为2.6μm，50mm×2.1mm。
7.根据权利要求1所述的一种ASE-HPLC法测定补骨酯中补骨酯素、异补骨酯素含量的方法，其特征在于，所述的萃取方法所采用的仪器为美国DIONEX公司的ASE350快速溶剂萃取仪；所述的HPLC法所采用的仪器为Thermo U3000UHPLC液相色谱仪。
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