CN108140848A - 自动化生物纳米催化剂生产 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于生产生物纳米催化剂(BNC)的机器、组合物和方法，这些生物纳米催化剂包含一种或多种酶，该一种或多种酶选自广泛的工业和医学上重要的酶。这些BNC是自组装的和磁性固定的酶。这些机器、组合物和方法可从工作台上完全扩展到工业制造体积。

Description

自动化生物纳米催化剂生产
发明领域
本发明提供了用于生产生物纳米催化剂(BNC)的机器、组合物和方法，这些生物纳米催化剂包含一种或多种酶，该一种或多种酶选自广泛的工业和医学上重要的酶。
发明背景
磁性酶固定涉及将酶捕获于在酶周围自组装的介孔磁性团簇中。固定效率取决于许多因素，这些因素包括酶和纳米颗粒的初始浓度、酶表面的性质、酶的静电势、纳米颗粒表面以及接触时间。在生物催化过程中用于工业目的的酶应该是高效的，在该过程之前和期间稳定的，可在数个生物催化循环内重复使用并且是经济的。
发明内容
本发明提供了用于生产生物纳米催化剂(BNC)的机器、组合物和方法，这些生物纳米催化剂包含一种或多种酶，该一种或多种酶选自广泛的工业和医学上重要的酶。这些BNC是自组装的并且将酶磁性地固定在磁性纳米颗粒中。这些方法可以防止在固定后酶活性的损失并使酶负载量最大化。这些机器、组合物和方法可从工作台上完全扩展到工业制造体积和量。
因此，本发明提供了一种用于自动化生产生物纳米催化剂(BNC)的机器，该机器包括：酶容器；磁性纳米颗粒(MNP)容器；酶泵；MNP泵；MNP破碎机；以及BNC混合器；其中该酶容器可操作来容纳酶制剂；其中该酶制剂催化可扩散底物转化成可扩散产物；其中该MNP容器可操作来容纳MNP制剂；其中所述MNP泵可操作来将该MNP制剂送至该MNP破碎机；其中该MNP泵可操作来将来自该MNP破碎机的多个破碎的MNP送至所述BNC混合器；其中该酶泵可操作来将酶制剂送至该BNC混合器；其中该混合器可操作来混合这些破碎的MNP和酶制剂以形成所述BNC。
在一个实施例中，该MNP破碎机是超声破碎器。在优选的实施例中，该超声破碎器进一步包括超声破碎器盘管和超声处理容器，其中该超声破碎器盘管可操作来对所述超声处理容器内的这些MNP进行超声处理。在其他实施例中，该超声破碎器是线内(in-line)超声破碎器。
在另一个实施例中，该机器包括可操作用于冷却所述超声破碎器的冷却系统。在优选实施例中，该冷却系统是水冷却系统。
在另一个实施例中，该MNP破碎机可操作来机械地破碎这些MNP。在另一个实施例中，该MNP破碎机可操作来磁性地破碎这些MNP。在另一个实施例中，该MNP破碎机可操作来热破碎这些MNP。
在另一个实施例中，该BNC混合器包括混合三通。在另一个实施例中，该BNC混合器包括混合盘管。
在另一个实施例中，该酶泵经由机械力或重力将该酶制剂送至该BNC混合器。在另一个实施例中，该MNP泵经由机械力或重力将该MNP制剂送至该MNP破碎机。
在另一个实施例中，该机器进一步包括磁性支架容器，该磁性支架容器可操作用于将磁性支架制剂与该支架容器中的BNC混合以产生呈级别2组装体的BNC。在优选的实施例中，该磁性支架容器可操作来机械地混合这些BNC和该支架。在另一个优选的实施例中，该磁性支架容器可操作来磁性地混合这些BNC和该支架。
在另一个实施例中，该机器进一步包括用于将这些BNC组装成稳定级别2组装体的模板系统(templator)。在优选的实施例中，该级别2组装体是磁性的。在更优选的实施例中，该磁性级别2组装体是磁性微颗粒(MMP)。
本发明提供了一种生产BNC的方法，该方法包括使用在此所述的这些机器将MNP制剂与酶制剂组合，其中该酶制剂包括选自下组的酶，该组由以下各项组成：水解酶、羟化酶、产生过氧化氢的酶(HPP)、腈水解酶、水合酶、异构酶、合成酶、脱氢酶、过氧化氢酶、转氨酶、烯还原酶(EREDS)、亚胺还原酶(IREDS)、氧化酶、氧化还原酶、过氧化物酶、醇腈酶、以及异构酶。
在一个实施例中，这些BNC是以小于约1ml的体积生产的。在优选的实施例中，这些BNC是以约1ml与10ml之间的体积生产的。在另一个优选的实施例中，所述BNC是以约10ml与100ml之间的体积生产的。在另一个优选的实施例中，这些BNC是以约100ml与1升之间的体积生产的。在另一个优选的实施例中，这些BNC是以约1升与10升之间的体积生产的。在另一个优选的实施例中，这些BNC是以约10升与100升之间的体积生产的。在另一个优选的实施例中，这些BNC是以约100升与1000升之间的体积生产的。在另一个优选的实施例中，这些BNC是以约1千升与10千升之间的体积生产的。在另一个优选的实施例中，这些BNC是以约10千升与20千升之间的体积生产的。在另一个优选的实施例中，这些BNC是以约20千升与50千升之间的体积生产的。在另一个优选的实施例中，这些BNC是以大于约50千升的体积生产的。
在另一个实施例中，在此提供的方法进一步包括将所述BNC模板化成稳定级别2组装体的步骤。
本发明提供了一种自组装的生物纳米催化剂(BNC)组合物，该组合物包含磁性纳米颗粒(MNP)和酶，该酶选自下组，该组由以下各项组成：水解酶、羟化酶、腈水解酶、水合酶、转氨酶、烯还原酶(EREDS)、亚胺还原酶(IREDS)、醇腈酶、以及异构酶；其中该酶制剂催化可扩散底物转化成可扩散产物。
在该BNC组合物的一些实施例中，该酶的浓度为约5-2,000μg/ml总溶液，并且这些MNP的浓度为约50-20,000μg/ml总溶液。在优选的实施例中，该酶的浓度为约5-15,000μg/ml总溶液。在另一个优选的实施例中，该酶的浓度为约5-10,000μg/ml总溶液。在另一个优选的实施例中，该酶的浓度为约5-5,000μg/ml总溶液。在另一个优选的实施例中，该酶的浓度为约100-20,000μg/ml总溶液。在另一个优选的实施例中，这些MNP的浓度为约500-20,000μg/ml总溶液。在另一个优选的实施例中，这些MNP的浓度为约1,000-20,000μg/ml总溶液。在另一个优选的实施例中，这些MNP的浓度为约5,000-20,000μg/ml总溶液。在另一个优选的实施例中，这些MNP的浓度为约10,000-20,000μg/ml总溶液。在另一个优选的实施例中，这些MNP的浓度为约5,000-10,000μg/ml总溶液。
在另一个实施例中，该BNC组合物进一步包含稳定级别2组装体。在优选的实施例中，该级别2组装体是磁性的。在更优选的实施例中，该磁性级别2组装体是磁性微颗粒(MMP)。
本发明提供了一种使用在此所述的BNC组合物的方法，该方法包括使BNC与可扩散底物接触并收集可扩散产物。
附图简要说明
图1：用于自动化生产BNC的示例性机器的示意图。
图2：用于自动化生产BNC的示例性机器的直观图。
图3：在自动化BNC生产机器中产生的固定的HRP的活性。通过由于形成粉红色醌亚胺染料而在500nm处吸光度的增加来测量活性。
图4：使用自动化BNC生产机器负载到BNC中的酶的量。该图示出固定到MNP(级别1)中的HRP蛋白质的浓度。它还示出进一步包含在磁性微颗粒(MMP)(级别2)中的BNC中的HRP蛋白质的浓度。
图5：在不同的泵速下从自动化BNC生产机器获得的洗脱样品的反应速度。该图比较了游离和磁性固定的辣根过氧化物酶(HRP)。所示出的速度来源于使用2.5mM HRP的反应的前315秒。
图6：通过由于醌亚胺染料形成而在500nm处增加的吸光度以分光光度法测量的固定的HRP的苯酚氧化活性。游离HRP(白色)。通过将pH 6的HRP与pH 11的磁性纳米颗粒(MNP)自动地混合制备的由磁性微颗粒(MMP)和生物纳米催化剂(BNC)组成的生物微型催化剂(BMC)。BLS具有40％(酶/MNP)的酶负载量；这些BMC具有5.6％(酶/(MNP+MMP))的酶负载量。这些“自动”BMC是使用不同的流速(10-60mL/分钟，阴影线)以连续流组装的。BMC由手动组合的pH 6的HRP与pH 11的磁铁矿纳米颗粒组成；手动BNC具有40％酶负载量并模板化到MMP上以形成5.6％酶负载量的BMC(黑色)。
发明详细说明
本发明提供了用于生产具有非常高水平的磁性固定的酶的纳米团簇的组合物和方法。这些纳米团簇通过自组装形成并且含有每克纳米颗粒5-20,000微克的酶。这些组合物和方法具有减少的方法步骤和化学试剂，并且对于用于工业用途的放大是理想的。
本发明提供自组装的介孔纳米团簇，这些纳米团簇包含在使用之前和使用期间高度活性且稳定的磁性固定的酶。该技术是生物化学、纳米技术和生物工程在三个一体化组织级别下的混合：级别1是酶与磁性纳米颗粒(MNP)的自组装以用于合成磁性介孔纳米团簇。这一级别使用分子自捕获机制来固定酶。固定在自组装的磁性纳米颗粒中的酶在此被称为“生物纳米催化剂”(BNC)。级别2是这些BNC稳定到其他组装体，如磁性基质中。在某些实施例中，为了商业或其他应用，这些BNC被“模板化”到微观或宏观结构上之或之中。在一个实施例中，级别2模板是磁性微颗粒(MMP)。级别3是用于使用级别1+级别2固定的酶的产品调节。
这些MNP允许在生物催化过程中使用酶的更广泛范围的操作条件，如温度、离子强度、pH和溶剂。这些MNP的大小和磁化强度影响BNC的形成和结构。这对所捕获的酶的活性具有显著影响。凭借其在各种反应条件下出人意料的弹性，自组装的MNP团簇可以用作酶的替代聚合树脂、交联凝胶、交联酶聚集体(CLEA)、交联磁珠等的优异固定材料。此外，它们可以用于可扩散底物上酶的任何应用。
BNC含有介孔，这些介孔是在这些簇集的磁性纳米颗粒之间的间隙空间。酶被固定在这些磁性BNC的至少一部分介孔内。如在此所用，术语“磁性”涵盖所有类型的有用磁性特征，包括永磁性、超顺磁性、顺磁性和铁磁性行为。
BNC大小是纳米级的，即通常不超过500nm。如在此所用，术语“大小”可以指当磁性纳米颗粒是近似或基本上球形时，该磁性纳米颗粒的直径。在磁性纳米颗粒不是近似或基本上球形(例如，基本上卵形或不规则)的情况下，术语“大小”可以指磁性纳米颗粒的最长尺寸抑或三维的平均值。术语“大小”还可以指在磁性纳米颗粒群体中计算的平均大小。
在不同的实施例中，磁性纳米颗粒具有精确、约、达或小于例如500nm、400nm、300nm、200nm、100nm、50nm、40nm、30nm、25nm、20nm、15nm、10nm、5nm、4nm、3nm、2nm或1nm的大小，或在由前述示例性大小中的任何两个限定的范围内的大小。
在BNC内，单独的磁性纳米颗粒可以是具有以上提供的任何大小的初级纳米颗粒(即，初级微晶)。BNC中纳米颗粒的聚集体的大小大于纳米颗粒，并且通常具有至少约5nm的大小(即，二级大小)。在不同的实施例中，这些聚集体具有精确、约、至少、高于、达或小于例如5nm、8nm、10nm、12nm、15nm、20nm、25nm、30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、150nm、200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm或800nm的大小，或在由前述示例性大小中的任何两个限定的范围内的大小。
通常，初级和/或聚集的磁性纳米颗粒或其BNC具有大小的分布，即，它们通常是在大小方面分散的，窄抑或宽分散的。在不同的实施例中，初级大小或聚集体大小的任何范围都可以构成初级大小或聚集体大小的总范围的大比例或小比例。例如，在一些实施例中，特定范围的初级粒度(例如，至少约1、2、3、5或10nm且达约15、20、25、30、35、40、45或50nm)或特定范围的聚集体粒度(例如，至少约5、10、15或20nm且达约50、100、150、200、250或300nm)构成初级粒度的总范围的至少或高于约50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或100％。在其他实施例中，特定范围的初级粒度(例如，小于约1、2、3、5或10nm，或高于约15、20、25、30、35、40、45或50nm)或特定范围的聚集体粒度(例如，小于约20、10或5nm，或高于约25、50、100、150、200、250或300nm)构成初级粒度的总范围的不超过或小于约50％、40％、30％、20％、10％、5％、2％、1％、0.5％或0.1％。
磁性纳米颗粒的聚集体(即“聚集体”)或其BNC可以具有任何程度的孔隙度，包括孔隙度的实质性缺乏，这取决于它们由其制成的单独初级微晶的量。在具体的实施例中，这些聚集体通过含有间隙介孔(即位于初级磁性纳米颗粒之间的介孔，通过堆积排列形成)而是介孔的。这些介孔的大小通常是至少2nm且达50nm。在不同的实施例中，这些介孔可以具有精确或约例如2、3、4、5、10、12、15、20、25、30、35、40、45或50nm的孔径，或在由前述示例性孔径中的任何两个限定的范围内的孔径。类似于粒度的情况，这些介孔通常具有大小的分布，即它们通常是在大小方面分散的，窄抑或宽分散的。在不同的实施例中，介孔大小的任何范围可以构成介孔大小的总范围或总孔体积的大比例或小比例。例如，在一些实施例中，特定范围的介孔大小(例如，至少约2、3或5以及达8、10、15、20、25或30nm)构成介孔大小的总范围或总孔体积的至少或高于约50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或100％。在其他实施例中，特定范围的介孔大小(例如，小于约2、3、4或5nm，或高于约10、15、20、25、30、35、40、45或50nm)构成介孔大小的总范围或总孔体积的不超过或小于约50％、40％、30％、20％、10％、5％、2％、1％、0.5％或0.1％。
磁性纳米颗粒可具有本领域中已知的任何组合物。在一些实施例中，这些磁性纳米颗粒是或包括磁性的零价金属部分。这类零价金属的一些实例包括钴、镍和铁，以及它们的混合物和合金。在其他实施例中，这些磁性纳米颗粒是或包括磁性金属的氧化物，如钴、镍或铁的氧化物或其混合物。在一些实施例中，这些磁性纳米颗粒具有不同的核心和表面部分。例如，这些磁性纳米颗粒可以具有由元素铁、钴或镍构成的核心部分和由钝化层(如金属氧化物)或贵金属涂层(如金、铂、钯或银的层)构成的表面部分。在其他实施例中，金属氧化物磁性纳米颗粒或其聚集体涂覆有一层贵金属涂层。该贵金属涂层可以例如减少磁性纳米颗粒表面上的电荷的数量，这可以有利地增加在溶液中的可分散性并且更好地控制BNC的大小。当螯合有机酸如柠檬酸盐、丙二酸盐或酒石酸盐用于生物化学反应或过程时，贵金属涂层保护磁性纳米颗粒免于氧化、通过浸出或通过螯合而溶解。该钝化层可以具有任何适合的厚度，并且具体地说至少、达或者小于约例如0.1nm、0.2nm、0.3nm、0.4nm、0.5nm、0.6nm、0.7nm、0.8nm、0.9nm、1nm、2nm、3nm、4nm、5nm、6nm、7nm、8nm、9nm或10nm，或在由这些值中的任何两个限定的范围内的厚度。
适用于本发明的磁性材料是本领域中熟知的。非限制性实例包括铁磁体和铁磁材料，包括矿石如铁矿石(磁铁矿或天然磁石)、钴和镍。在其他实施例中，使用稀土磁体。非限制性实例包括钕、钆、sysprosium、钐-钴、钕-铁-硼等。在又其他实施例中，这些磁体包括复合材料。非限制性实例包括陶瓷、铁氧体和铝镍钴磁体。在优选的实施例中，这些磁性纳米颗粒具有氧化铁组合物。氧化铁组合物可以是本领域中已知的任何磁性或超顺磁性氧化铁组合物，例如磁铁矿(FesO/O，赤铁矿(α-Fe2θ3)、磁赤铁矿(γ-Fe2C>3)、或根据式AB2O4的尖晶石型铁氧体，其中A是二价金属(例如，Xn2+、Ni2+、Mn2+、Co2+、Ba2+、Sr2+或其组合)，并且B是三价金属(例如Fe3+、Cr3+或其组合)。
在具体的实施例中，将磁性纳米颗粒的上述介孔聚集体(BNC)并入到连续的大孔支架中以形成具有第一级别和第二级别的组装体的分级催化剂组装体。第一级别的组装体在这些BNC中发现。在将这些BNC并入连续大孔支架中发现第二级别的组装体。在一些实施例中，该级别2组装体是磁性的。
如在此用于大孔磁性支架的术语“连续的”表示不是微粒组装体的材料，即，不是由彼此组装以形成宏观结构的颗粒或离散物体构成。与微粒组装体相比，连续结构在大孔周围是基本上无缝且均匀的，这些大孔周期性地中断该无缝且均匀的结构。因此连续支架中的大孔不是团聚颗粒之间的间隙空间。尽管如此，连续支架可以由较小的初级连续支架的组装体或聚集体构成，只要初级连续支架的组装体或聚集体不包括由初级连续支架之间的间隙空间形成的大孔(例如，大于约50nm且达约100)。特别是在无机材料(如陶瓷或单质材料)的情况下，连续支架还可能或可能不包含结晶域或相界。
术语“百分比固定产率”或“％固定产率”是指当与固定之前样品中的酶的初始量相比时，在固定物或纳米颗粒制剂中捕获的通过质量或活性测量的酶的百分比。
在具体的实施例中，将磁性纳米颗粒的上述介孔聚集体(BNC)并入到连续的大孔支架中以形成具有第一级别和第二级别的组装体的分级催化剂组装体。第一级别的组装体在这些BNC中发现。在将这些BNC并入连续大孔支架中发现第二级别的组装体。总体分级催化剂组装体至少由于这些BNC的存在而是磁性的。
大孔支架含有大小大于50nm的大孔(即宏观尺度大小的孔)。在不同的实施例中，这些大孔具有精确、约、至少、高于、达或小于例如60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、150nm、200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm、800nm、900nm、1微米(1μm)、1.2μm、1.5μm、2μm、3μm、4μm、5μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、或100μm的大小，或在由前述示例性大小中的任何两个限定的范围内的大小。
大孔支架可以具有任何适合的大小，只要它可以容纳大孔。在典型的实施例中，大孔支架具有在宏观尺度上的至少一个大小尺寸。该至少一个宏观尺度尺寸是高于50nm，并且可以是以上针对大孔所提供的任何值，并且具体地说，精确、约、至少、高于、达或小于例如1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm、900μm、1mm、2mm、5mm或1cm的尺寸，或在由前述示例性大小中的任何两个限定的范围内的大小。在这些大小尺寸中仅一个或两个处于宏观尺度的情况下，剩余的一个或两个尺寸可以处于纳米尺度，如以上针对磁性纳米颗粒提供的任何值(例如，独立地、精确地、约、至少、高于、达或小于例如1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100nm，或在由前述值中的任何两个限定的范围内的值)。在一些实施例中，大孔支架的大小尺寸中的至少两个或全部是处于宏观尺度。
在第一组实施例中，其中并入这些BNC的连续大孔支架是磁性的，即，即使在不存在这些BNC的情况下也是磁性的。该连续大孔支架可以例如由于由磁性聚合物组合物组成而是磁性的。磁性聚合物的一个实例是PANiCNQ，其是四氰基对醌二甲烷(TCNQ)和基于翠绿亚胺形式的聚苯胺(PANi)的组合，如本领域中所熟知。可替代地，或者此外，连续大孔支架可以通过在其中嵌入不属于这些BNC的磁性颗粒而是磁性的。不属于这些BNC的磁性颗粒可以是例如不与FRP酶或任何酶缔合的磁性纳米颗粒或微米颗粒。尽管不依赖于大孔大小，但是这些磁性微颗粒可以具有以上针对大孔所提供的大小或大小分布。在具体的实施例中，这些磁性微颗粒具有约、精确地或至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000nm的大小，或在由前述示例性大小中的任何两个限定的范围内的大小。在一些实施例中，连续大孔支架在其中嵌入磁性微颗粒，所述磁性微颗粒被吸附到这些BNC的至少一部分上，或其中这些磁性微颗粒不与这些BNC缔合或不吸附到这些BNC上。
在第二组实施例中，其中并入这些BNC的连续支架是非磁性的。尽管如此，含有非磁性支架的总体分级催化剂组装体至少由于其中并入的这些BNC的存在而保持磁性。
在一个实施例中，连续大孔支架(或其前体)具有聚合组合物。所述聚合组合物可以是本领域中已知的任何固体有机、无机或杂合有机-无机聚合物组合物，并且可以是充当粘合剂的合成或生物聚合物。优选地，聚合大孔支架不会在水或其中旨在使用分级催化剂的其他介质中溶解或降解。合成有机聚合物的一些实例包括乙烯基加成聚合物(例如，聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酸或聚丙烯酸盐、聚甲基丙烯酸或聚甲基丙烯酸盐、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯醇等)、含氟聚合物(例如，聚氟乙烯、聚偏二氟乙烯、聚四氟乙烯等)、环氧化物(例如，酚醛树脂、间苯二酚-甲醛树脂)、聚酰胺、聚氨酯、聚酯、聚酰亚胺、聚苯并咪唑、以及其共聚物。生物聚合物的一些实例包括多糖(例如，纤维素、半纤维素、木聚糖、壳聚糖、菊粉、葡聚糖、琼脂糖和海藻酸)、聚乳酸、以及聚乙醇酸。在纤维素的特定情况下，纤维素可以是微生物或藻类来源的纤维素。无机或杂合有机-无机聚合物的一些实例包括聚硅氧烷(例如，如通过溶胶凝胶合成所制备，如聚二甲基硅氧烷)和聚磷腈。在一些实施例中，以上提供的任何一种或多种类别或特定类型的聚合物组合物被排除作为大孔支架。
在另一个实施例中，连续大孔支架(或其前体)具有非聚合组合物。该非聚合组合物可以具有例如陶瓷或元素组合物。陶瓷组合物可以是结晶的、多晶的或非晶的，并且可以具有本领域中已知的任何组合物，包括氧化物组合物(例如，氧化铝、氧化铍、氧化铈、氧化钇或氧化锆)和非氧化物组合物(例如，碳化物、硅化物、氮化物、硼化物或硫化物组合物)。元素组合物也可以是结晶的、多晶的或非晶的，并且可以具有任何适合的元素组成，如碳、铝或硅。
在其他实施例中，这些BNC驻留在含有磁性微颗粒(MMP)的组装体(即，聚集体)(或由其构成)的非连续大孔载体中，该组装体包括大孔作为这些磁性微颗粒之间的间隙空间。这些磁性微颗粒通常是铁磁性的并且可以由磁铁矿或其他铁磁材料制成。这些BNC嵌入磁性微颗粒的聚集体的这些大孔的至少一部分中，并且也可以驻留在这些磁性微颗粒的表面上。这些BNC可以通过磁相互作用与这些磁性微颗粒的表面缔合。这些磁性微颗粒可以或可以不涂覆有金属氧化物或贵金属涂层。在一些实施例中，如上所述将BNC-MMP组装体并入(即，嵌入)到连续大孔支架中以提供分级催化剂组装体。
单独的磁性纳米颗粒或其聚集体或其BNC具有任何适合的磁性程度。例如，这些磁性纳米颗粒、BNC或BNC支架组装体可以具有至少或达约5、10、15、20、25、30、40、45、50、60、70、80、90或100emu/g的饱和磁化强度(Ms)。这些磁性纳米颗粒、BNC或BNC-支架组装体优选具有不超过(即，达)或小于5emu/g，且更优选达或小于4emu/g、3emu/g、2emu/g、1emu/g、0.5emu/g或0.1emu/g的剩余磁化强度(Mr)。这些磁性纳米颗粒、BNC或BNC-支架组装体的表面磁场可以是约或至少例如约0.5、1、5、10、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000高斯(G)，或在由前述值中的任何两个所限定的范围内的磁场。如果包含微颗粒，则这些微颗粒也可以具有任何上述磁性强度。
可以使这些磁性纳米颗粒或其聚集体吸附适合量的酶直至饱和水平或低于饱和水平(取决于应用)以产生所得到的BNC。在不同的实施例中，这些磁性纳米颗粒或其聚集体可以吸附约、至少、达或少于例如1、5、10、15、20、25或30pmol/m2的酶。或者，这些磁性纳米颗粒或其聚集体可以吸附为饱和水平的约、至少、达或少于例如约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的量的酶。
这些磁性纳米颗粒或其聚集体或其BNC具有任何适合的孔体积。例如，这些磁性纳米颗粒或其聚集体可以具有约、至少、达或小于例如约0.01、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95或1cm3/g的孔体积，或在由前述值中的任何两个所限定的范围内的孔体积。这些磁性纳米颗粒或其聚集体或其BNC具有任何适合的比表面积。例如，这些磁性纳米颗粒或其聚集体可以具有约、至少、达或小于例如约50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200m2/g的比较面积。
MNP、其结构、组织、适合的酶、以及用途在WO2012122437、WO2014055853和美国临时申请号62/163,032中进行了描述，这些专利通过引用以其全部内容结合在此。
本发明的一些实施例包括水解酶。水解酶通过使用水作为底物来催化许多类型的化学键的水解。底物通常在断裂键的位点处具有氢和羟基基团。水解酶在酶的EC号分类中被分类为EC 3。水解酶可以基于它们所作用的键而被进一步分成若干亚类。示例性的水解酶和它们所水解的键包括EC 3.1：酯键(酯酶：核酸酶、磷酸二酯酶、脂肪酶、磷酸酶)、EC3.2：糖(DNA糖基化酶、糖苷水解酶)、EC 3.3：醚键、EC 3.4：肽键(蛋白酶/肽酶)、EC 3.5：除了肽键以外的碳-氮键、EC 3.6酸酐(酸酐水解酶，包括解旋酶和GTP酶)、EC 3.7碳-碳键、EC3.8卤化物键、EC 3.9：磷-氮键、EC 3.10：硫-氮键、EC 3.11：碳-磷键、EC 3.12：硫-硫键、以及EC 3.13：碳-硫键。
在一些优选的实施例中，水解酶是糖苷水解酶。这些酶具有各种用途，包括植物材料的降解(例如用于将纤维素降解成用于乙醇生产的葡萄糖的纤维素酶)、食品制造(例如糖转化、麦芽糖糊精生产)和纸生产(从纸浆中除去半纤维素)。
在一些优选的实施例中，水解酶是脂肪酶lipolase 100L(EC 3.1.1.3)。它用于合成普瑞巴林(由辉瑞公司(Pfizer)作为销售)，其是一种用于神经性疼痛、焦虑症和癫痫的抗惊厥药物。这些病状影响世界人口的约1％。据发现Lipolase 100L使所需起始材料减少39％，并使每单位的废物减少80％。
在一些优选的实施例中，水解酶是γ-内酰胺酶(例如EC 3.1.5.49)。它被用来制造Vince内酰胺，其是一种用于阿巴卡韦(一种用于治疗HIV/AIDS的抗逆转录病毒药物)。据发现从化学计量过程转变为催化流动过程将单元操作的数量从17个减少到12个，并且是废物减少35％。此外，有毒物质氯化氰的使用被最小化。
在一些优选的实施例中，水解酶是乳糖酶(例如EC 3.2.1.108)。这些酶将乳中的乳糖分解成单糖以产生不含乳糖的乳。这种重要的产物服务于大约15％的乳糖不耐受的世界人口。
在一些优选的实施例中，水解酶是青霉素酰胺酶(例如EC 3.5.1.11)。这些酶将青霉素分解成羧酸酯和6-氨基青霉烷酸酯(6-APA)。6-APA是天然的和合成的青霉素衍生物中的核心结构。这些酶被用来产生经定制以对抗特定感染的半合成青霉素。
在一些优选的实施例中，水解酶是腈水解酶(例如EC 3.5.5.1)。这些酶将腈分解成羧基基团并释放出氨。它们对多种脂肪族和芳香族腈化合物具有活性，其中它们的相应羧酸中的一些具有工业意义。弓(Gong)等人，微生物细胞工厂(Microbial CellFactories)11(1):142(2012)。利用腈水解酶来由3-氰基吡啶生产烟酸(nicotinic acid)，也称为维生素B3或烟酸(vitamin)。肖(Shaw)等人，高级合成与催化(Adv.Synth.andCatalysis)345(4):425-435(2003)。烟酸可用作食品中的营养补充剂，并且也可用作药物中间体。例如，使用腈水解酶来制造阿托伐他汀(由辉瑞(Pfizer)公司作为销售)。它催化内消旋3-羟基戊二腈与(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的反应，后者形成阿托伐他汀的核心。
在以下参考文献中讨论了水解酶，这些参考文献通过引用以其全部内容结合在此：阿纳斯塔斯P.T.(Anastas,P.T.)绿色化学手册(Handbook of Green Chemistry.)威利-VCH出版社(Wiley-VCH-Verlag)，2009；邓恩(Dunn)、彼得J.(Peter J.)、安德鲁威尔斯(Andrew Wells)、以及迈克尔T.威廉姆斯(Michael T.Williams)编辑，医药产业中的绿色化学(Green chemistry in the pharmaceutical industry.)约翰威利父子公司(JohnWiley&Sons)，2010；马丁内斯(Martinez)等人，当前药物化学主题(Curr.TopicsMed.Chem.)13(12):1470-90(2010)；威尔斯(Wells)等人，有机加工研究与开发(OrganicProcess Res.Dev.)16(12):1986-1993(2012)。
在一些实施例中，本发明提供产生过氧化氢(HPP)的酶。在某些实施例中，这些HPP酶是可以具有EX 1.1.3亚属的氧化酶。在具体的实施例中，该氧化酶可以是EC 1.1.3.3(苹果酸氧化酶)、EC 1.1.3.4(葡萄糖氧化酶)、EC 1.1.3.5(己糖氧化酶)、EC 1.1.3.6(胆固醇氧化酶)、EC 1.1.3.7(芳基-醇氧化酶)、EC 1.1.3.8(L-古洛糖酸内酯氧化酶)、EC 1.1.3.9(半乳糖氧化酶)、EC 1.1.3.10(吡喃糖氧化酶)、EC 1.1.3.11(L-山梨糖氧化酶)、EC1.1.3.12(吡哆醇4-氧化酶)、EC 1.1.3.13(醇氧化酶)、EC 1.1.3.14(儿茶酚氧化酶)、EC1.1.3.15(2-羟基酸氧化酶)、EC 1.1.3.16(蜕皮激素氧化酶)、EC 1.1.3.17(胆碱氧化酶)、EC 1.1.3.18(仲醇氧化酶)、EC 1.1.3.19(4-羟基扁桃酸氧化酶)、EC 1.1.3.20(长链醇氧化酶)、EC 1.1.3.21(甘油-3-磷酸氧化酶)、EC 1.1.3.22、EC 1.1.3.23(硫胺素氧化酶)、EC1.1.3.24(L-半乳糖酸内酯氧化酶)、EC 1.1.3.25、EC 1.1.3.26、EC 1.1.3.27(羟基植烷酸酯氧化酶)、EC 1.1.3.28(核苷氧化酶)、EC 1.1.3.29(酰基己糖胺氧化酶)、EC 1.1.3.30(聚乙烯醇氧化酶)、EC 1.1.3.31、EC 1.1.3.32、EC 1.1.3.33、EC 1.1.3.34、EC 1.1.3.35、EC 1.1.3.36、EC 1.1.3.37(D-阿拉伯糖酸-1,4-内酯氧化酶)、EC 1.1.3.38(香草醇氧化酶)、EC 1.1.3.39(核苷氧化酶，形成H2O2)、EC 1.1.3.40(D-甘露醇氧化酶)或EC 1.1.3.41(木糖醇氧化酶)。
本发明的一些实施例可以包含羟化酶。羟基化是将羟基基团(-OH)引入到有机化合物中的化学过程。羟基化是空气中的有机化合物的氧化降解的第一步骤。羟基化通过将亲脂性化合物转化成更容易排泄的亲水性产物而在解毒中起作用。一些药物(例如类固醇)通过羟基化而活化或失活。羟化酶是在本领域中熟知的。示例性羟化酶包括脯氨酸羟化酶、赖氨酸羟化酶和酪氨酸羟化酶。
本发明的一些实施例包含腈水解酶(NIT)。它们是催化腈水解成具有高对映体纯度的手性羧酸和氨的水解酶(EC 3.5.5.1)。NIT活性可以通过监测扁桃腈转化成(R)-扁桃酸来测量。这导致pH下降，该pH下降可以采用分光光度法进行监测。
本发明的一些实施例包括水合酶。它们是催化添加或除去水的元素的酶。水合酶(也称为水解酶或水化酶)可以催化C-O键联的水合或脱水。
本发明的一些实施例包括氧化还原酶。这些酶催化电子从一个分子转移到另一个分子。这涉及H和O原子或电子从一种物质转移到另一种物质。它们通常利用NADP或NAD+作为辅因子。
在本发明的一些优选实施例中，氧化还原酶用于诸如多氯联苯和酚类化合物的污染物的分解、煤的降解以及木材水解产物的发酵的增强。本发明进一步包括它们在生物传感器和疾病诊断中的用途。
在一些优选的实施例中，氧化还原酶是脱氢酶(DHO)。这组氧化还原酶通过将一个或多个氢离子(H-)转移到电子受体(通常为NAD+/NADP+或黄素辅酶如FAD或FMN)的还原反应来氧化底物。脱氢酶的实例包括醛脱氢酶、乙醛脱氢酶、醇脱氢酶、谷氨酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、山梨醇脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、α-酮戊二酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、以及苹果酸脱氢酶。
在一些优选的实施例中，氧化还原酶是酮还原酶(EC 1.1.1.184)，一种用于制备阿托伐他汀的氧化还原酶(由辉瑞公司作为销售)。这种生物催化过程在商业上是重要的，因为它大大减少了起始材料，限制了有机溶剂的使用，并提高了废物流的生物可降解性。
在一些优选的实施例中，氧化还原酶是葡萄糖脱氢酶(例如EC 1.1.99.10)。它们被制药公司用来回收在药物生产中使用的辅因子。它们催化葡萄糖转化成葡糖酸酯。NADP+被还原成NADPH。这在Avastan生产中使用。
在一些优选的实施例中，氧化还原酶是P450(EC 1.14.14.1)。它在制药工业中用于困难氧化。在一些实施例中，使用P450来产生化学和药物代谢物。在优选的实施例中，当与涉及葡萄糖脱氢酶(GDH)或甲酸脱氢酶(FDH)的辅因子再生系统(例如NADPH/NADP+)结合使用时，p450的成本、一致性和效率得到改善。
在一些优选的实施例中，氧化还原酶是过氧化氢酶，如EC 1.11.1.6。在每种真核生物和许多原核生物中均观察到过氧化氢酶。过氧化氢酶通过将过氧化氢降解成水和氧来在调节过氧化应激中起到不可或缺的作用。过氧化氢酶是具有四个相同亚基的高度活性四聚体，这些亚基各自包含基于血红素的活性位点。盖塔尼特(Gaetanit)&柯克曼(Kirkman)，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.)81(14):4343-7(1984)。过氧化氢酶具有用于消除或调节过氧化氢的许多工业应用。实例包括除去织物漂白中的残余过氧化物，以用于生产酸度调节剂如葡糖酸，或防止在使用氧化酶的过程如奶酪生产中抑制性过氧化物浓度的累积。贝坦科尔(Betancor)等人，生物技术进展(Biotechnology Progress)(3)：763-767(2003)。
在一些优选的实施例中，氧化还原酶是葡萄糖氧化酶(glucose oxidase)(例如葡萄糖氧化酶(Notatin)，EC 1.1.3.4)。葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化成过氧化氢和D-葡糖酸-δ-内酯。葡萄糖氧化酶例如用来产生过氧化氢作为用于过氧化氢消耗酶如过氧化物酶的氧化剂。
在一些实施例中，本发明涵盖自由基产生(FRP)酶。在一些实施例中，FRP是过氧化物酶。过氧化物酶广泛存在于生物系统中并形成将过氧化氢(H2O2)还原成水以便氧化从苯酚到芳族胺的各种芳香族化合物的的氧化还原酶的子集。过氧化物酶是非常有效的酶，但由于在过量过氧化物存在下的强烈抑制而众所周知地难以在工业环境中部署。本发明提供了增加的反应转换和减少的抑制。因此，酶如辣根过氧化物酶(HRP)可以工业规模使用。
过氧化物酶属于亚属EC 1.11.1。在某些实施例中，EC 1.11.1酶可以更具体地是例如EC 1.11.1.1(NADH过氧化物酶)、EC 1.11.1.2(NADPH过氧化物酶)、EC 1.11.1.3(脂肪酸过氧化物酶)、EC 1.11.1.4、EC 1.11.1.5(细胞色素-c过氧化物酶)、EC 1.11.1.6(过氧化氢酶)、EC 1.11.1.7(过氧化物酶)、EC 1.11.1.8(碘化物过氧化物酶)、EC 1.11.1.9(谷胱甘肽过氧化物酶)、EC 1.11.1.10(氯化物过氧化物酶)、EC 1.11.1.11(L-抗坏血酸过氧化物酶)、EC 1.11.1.12(磷脂-氢过氧化物谷胱甘肽过氧化物酶)、EC 1.11.1.13(锰过氧化物酶)、EC 1.11.1.14(二芳基丙烷过氧化物酶)或EC 1.11.1.15(过氧化物还原酶)。
在其他实施例中，过氧化物酶也可以通过功能进一步指定，例如木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶或通用过氧化物酶。过氧化物酶也可以被指定为真菌、微生物、动物或植物过氧化物酶。过氧化物酶也可以被指定为I类、II类或III类过氧化物酶。过氧化物酶还可以被指定为髓过氧化物酶(MPO)、嗜曙红细胞过氧化物酶(EPO)、乳过氧化物酶(LP)、甲状腺过氧化物酶(TPO)、前列腺素H合酶(PGHS)、谷胱甘肽过氧化物酶、卤过氧化物酶、过氧化氢酶、细胞色素c过氧化物酶、辣根过氧化物酶、花生过氧化物酶、大豆过氧化物酶、芜菁过氧化物酶、烟草过氧化物酶、番茄过氧化物酶、大麦过氧化物酶或过氧蛋白(peroxidasin)。在具体的实施例中，过氧化物酶是辣根过氧化物酶。
乳过氧化物酶/葡萄糖氧化酶(LP/GOX)抗微生物系统天然存在于体液例如乳、唾液、眼泪和粘液中(波许(Bosch)等人，应用微生物学杂志(J.Applied Microbiol.)，89(2)，215-24(2000))。该系统利用对哺乳动物和高等生物体无害的两种天然存在的化合物硫氰酸酯(SCN-)和碘化物(I-)(韦尔克(Welk)等人口腔生物学档案(Archives of OralBiology)，2587(2011))。LP在过氧化氢(H2O2)存在下分别催化硫氰酸酯和碘离子氧化成次硫氰酸酯(OSCN-)和次碘酸盐(OI-)。该系统中的H2O2由GOX在氧存在下对β-D-葡萄糖的活性提供。这些自由基化合物继而氧化微生物的细胞膜中的巯基基团(珀迪，Tenovuo(Purdy,Tenovuo)等人感染与免疫(Infection and Immunity)，39(3)，1187(1983)；博施(Bosch)等人，应用微生物学杂志，89(2)，215–24(2000)，从而导致膜渗透性的损害(万，王(Wan,Wang)等人生物化学杂志(Biochemistry Journal)，362，355–362(2001))并最终导致微生物细胞死亡。
辣根过氧化物酶(EC 1.11.1.7)是一种在辣根植物辣根(A.rusticana)的根中发现的含血红素的氧化还原酶。它通常用作生物化学信号放大器和示踪剂，因为它通常与过氧化氢一起作用于显色底物以产生色彩鲜艳的产物络合物，这提高了目标分子的分光光度可检测性。辣根过氧化物酶(HRP)的这一特性已经应用于啮齿动物神经系统毛细血管的渗透性研究。最近，由于HRP降解各种芳族化合物的能力，已经建议它作为酚类废水的可能修复策略的一部分。周(Chau)和卢(Lu)，解剖与胚胎学(Anatomy and Embryology)，194(3):259–269(1996)；段(Duan)等人，化学物理化学(ChemPhysChem)，15(5):974–980(2014)。
本发明的一些实施例包括转移酶。“转移酶”是指将特定官能团从一个分子转移到另一个分子的一类酶。转移的基团的实例包括甲基基团和糖基基团。转移酶用于处理诸如化学致癌物和环境污染物的物质。此外，它们可以用于对抗或中和人体内发现的有毒化学物质和代谢物。
在一些优选的实施例中，转移酶是转氨酶。转氨酶或氨基转移酶催化氨基酸与α-酮酸之间的反应。它们在氨基酸的合成中是重要的。它们是肝损伤的重要指标。在转氨作用中，一个分子上的NH2基团与来自另一个分子上的另一个基团(例如酮基基团)的＝O交换。
在更优选的实施例中，转氨酶是ω-转氨酶(EC 2.6.1.18)。它催化氨基基团从氨基供体分子转移到氨基受体上的羧基基团的位置马修(Mathew)&云(Yun)，美国化学会·催化(ACS Catalysis)2(6):993–1001(2012)。这些酶在每种生物体中都观察到，并且在氨基酸合成和氮代谢中具有重要作用。由于ω-转氨酶对底物的高立体选择性和产物的立体定向性，它们被用来制备非天然氨基酸和光学纯的手性胺或酮酸。ω-转氨酶也可用于活性药物中间体的生物催化手性拆分中，从而与常规化学方法相比简化了方法。谢特勒等人，分析化学(Analytical Chemistry)81(19):8244–8248(2009)。除此之外，它还用于合成西他列汀(由默克公司(Merck and Co.)作为(一种抗糖尿病药物)销售)。工程化的ω-转氨酶据发现使生物催化活性提高例如25,000倍，从而导致西他列汀产率的13％总体增加以及总体工艺废物的19％减少。
在一些优选的实施例中，转移酶是胸苷酸合成酶(例如EC 2.1.1.45)。这些酶被用于制造糖核苷酸和寡糖。它们催化例如以下反应：
在一些优选的实施例中，转移酶是谷胱甘肽S-转移酶(例如EC 2.5.1.18)。这些酶催化谷胱甘肽转化成其他三肽。它们在食品工业中用作氧化剂以及在制药工业中用于制造抗衰老药物和皮肤配制品。
在一些优选的实施例中，转移酶是葡糖激酶(例如EC 2.7.1.2)。这些酶促进葡萄糖磷酸化成葡萄糖-6-磷酸。它们在食品工业中用于降低其生产流中的葡萄糖浓度，并且在制药工业中用于制造糖尿病药物。
在一些优选的实施例中，转移酶是核黄素激酶(例如EC 2.7.1.26)。在更优选的实施例中，核黄素激酶在食品工业中用于产生黄素单核苷酸(FMN)。FMN是一种橙红色的食用色素添加剂和分解过量核黄素(维生素B2)的药剂。核黄素激酶催化例如以下反应：
本发明的一些实施例包括烯还原酶(ERED)。这些酶以NAD(P)H依赖性方式催化烯烃还原。烯-还原酶的实例包括氧化还原酶的含FMN老黄酶(OYE)家族(EC 1.6.99)、梭菌烯酸酯还原酶(EnoR，C 1.3.1.31)、非黄素依赖性中链脱氢酶/还原酶(MDR；EC 1.3.1)、短链脱氢酶/还原酶(SDR；EC 1.1.1.207-8)、白三烯B4脱氢酶(LTD)、醌(QOR)、黄体酮5b-还原酶、大鼠长叶薄荷酮还原酶(PGR)、烟草双键还原酶(NtDBR)、蓝藻OYE、来自干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)的LacER、来自无色杆菌(Achromobacter)属JA81的Achr-OYE4、以及酵母OYE。
本发明的一些实施例包括亚胺还原酶(IRED)。亚胺还原酶(IRED)催化光学纯的环状仲胺的合成。它们可以转化酮或醛底物以及伯胺或仲胺底物以形成仲胺或叔胺产物化合物。示例性的IRED是来自类芽孢杆菌(Paenibacillus elgii)B69、番薯链霉菌(Streptomyces ipomoeae)91-03、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)KT2440和伍氏醋酸杆菌(Acetobacterium woodii)的那些。IRED在国际公开号WO2013170050中进行了详细论述，该国际公开通过引用以其全部内容结合在此。
在本发明的一些实施例中，这些酶是裂解酶。它们催化消除反应，其中通过除水解或氧化以外的过程从底物中除去一组原子。通常会产生新的双键或环结构。存在裂解酶的七个亚类。在优选的实施例中，使用果胶裂解酶来将高度酯化的果胶(例如水果中)降解成小分子。本发明的其他优选的实施例包括醇腈酶(也称为扁桃腈裂解酶或脂肪族(R)-羟基腈裂解酶)。它们将扁桃腈裂解成氰化氢+苯甲醛。
在一个优选的实施例中，裂解酶是羟基腈裂解酶(例如EC 4.1.2，巴旦杏裂解酶的一种突变)。羟基腈裂解酶催化氰醇的形成，氰醇可以充当广泛范围的化学和酶反应的通用结构单元。它们用于在较低pH下提高酶通量和稳定性，并可以用于生产氯吡格雷反应过程描述于格里德尔(Glieder)等人，应用化学(Chem.Int.Ed.)42:4815(2003)中，该文献通过引用以其全部内容结合在此。
在另一个优选的实施例中，裂解酶是2-脱氧-D-核糖磷酸醛缩酶(DERA，EC4.1.2.4)。它例如在立普妥生产中用于形成他汀侧链。
在另一个优选的实施例中，裂解酶是(R)-扁桃腈裂解酶(HNL，EC 4.1.2.10)。它被用来合成苏式-3-芳基-2,3-二羟基丙酸(一种用于生产地尔硫卓的前体氰醇)。地尔硫卓是一种治疗高血压和胸痛(心绞痛)的心脏药物。降低血压可降低中风和心脏病发作的风险。它是一种钙通道阻滞剂。地尔硫卓及其生产描述于Dadashipour和浅野(Asano)，美国化学会·催化(ACS Catal.)1:1121-49(2011)和埃拉W(Aehle W.)2008.工业中的酶(Enzymesin Industry)，威利-VCH出版社，魏恩海姆股份有限公司(GmbH Weinheim)，两者均通过引用以其全部内容结合。
在另一个优选的实施例中，裂解酶是腈水合酶(EC 4.2.1)。它在商业上用于将3-氰基吡啶转化成烟酰胺(nicotinamide)(维生素B3，烟酰胺(niacinamide))。它还用于制备中的活性药物成分左乙拉西坦(levetiracetam)。
在另一个优选的实施例中，裂解酶是苯基磷酸羧化酶。它们被例如用于使苯酚在室温和低于大气压的CO2压力下磷酸化。这些酶催化由苯酚和CO2合成4-OH苯甲酸，具有100％选择性。4-OH苯甲酸被用来制备其酯。在更优选的实施例中，这些酶用于生产用作化妆品和眼用溶液中的防腐剂的对羟基苯甲酸酯。
在本发明的一些实施例中，酶是碳酸酐酶。碳酸酐酶(EC 4.2.1.1)是存在于每种生物体中的普遍存在的金属酶。它是已知的最有效的酶之一(林斯科格(Lindskog)和西尔弗曼(Silverman)，新视野(New Horizons)7:175–95(2000))并且起到多种生理作用，包括CO2交换、pH调节和HCO3 -分泌(麦考尔(McCall)等人，营养学杂志(J.Nutrition)130(5S增刊):1437S-46S(2000))。碳酸酐酶在CO2隔离和方解石生产中也具有潜在工业应用(布恩(Boone)等人，国际化学工程杂志(Int'l J.Chem.Engin.)2013:22–27(2013))。
在本发明的一些实施例中，酶是异构酶。异构酶催化分子异构化，即将一种异构体转化成另一种异构体的反应。它们可以促进分子内重排，其中键断裂并形成，或者它们可以催化构象变化。异构酶在本领域中是众所周知的。
在优选的实施例中，异构酶用于糖制造。在更优选的实施例中，异构酶是葡萄糖异构酶EC 5.3.1.18。在其他实施例中，葡萄糖异构酶由密苏里游动放线菌(Actinoplanesmissouriensis)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)或链霉菌属物种产生。葡萄糖异构酶将D-木糖和D-葡萄糖转化成D-木酮糖和D-果糖，这是生产高果糖玉米糖浆和生物燃料领域中的重要反应。
葡萄糖异构酶(GIS)(EC 5.3.1.5)是最广泛使用的工业酶之一。它用于由葡萄糖生产高果糖玉米糖浆，GIS催化D-(+)-果糖和D-(+)-葡萄糖的可逆异构化(博萨莱(Bhosale)等人，微生物学评论(Microbiol.Rev.)60(2):280–300(1996))。
在另一个优选的实施例中，异构酶是马来酸顺反异构酶(EC 5.2.1.1)。它催化马来酸转化成富马酸。富马酸对于L-天冬氨酸、L-苹果酸、聚酯树脂、食品和饮料添加剂、以及染料的媒染剂的生物催化生产来说是重要的。
在另一个优选的实施例中，异构酶是亚油酸顺反异构酶(EC 5.2.1.5)。它催化缀合的亚油酸(CLA)的异构化。据报道CLA具有用于治疗肥胖症、糖尿病、癌症、炎症和动脉粥样硬化的许多潜在健康益处。CLA的不同异构体可以发挥不同的生理作用。因此，该酶用于制备单一异构体。
在本发明的另一个优选的实施例中，异构酶是磷酸丙糖异构酶(EC 5.3.1.1)。它催化D-甘油醛3-磷酸和二羟丙酮磷酸的相互转化。与转酮醇酶或醛缩酶组合时，磷酸丙糖异构酶用于各种糖或糖类似物的立体选择性多酶合成。一个优选的实施例是D-木酮糖-5-磷酸的一锅法酶制备。该合成开始于D-果糖1,6-二磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.13)对果糖1,6-二磷酸的逆醛醇裂解。接下来外消旋化，磷酸丙糖异构酶有助于产生两个当量的通过转酮醇酶(EC 2.2.1.1)转化成木酮糖5-磷酸的D-甘油醛3-磷酸。
在本发明的其他实施例中，酶是连接酶。这些酶与三磷酸核苷的水解结合催化将两个分子连接在一起的共价键的形成。连接酶是本领域中众所周知的并且通常用于重组核酸应用。在一个优选的实施例中，DNA连接酶是EC 6.5.1.1。
在一个优选的实施例中，连接酶是乙酰-辅酶A羧化酶(EC 6.4.1.2，ACC)。ACC在脂质合成和氧化途径的接合处具有作用。它与在此披露的发明一起用于临床目的，如抗生素的产生、糖尿病疗法、肥胖症、以及代谢综合症的其他表现。
在另一个优选的实施例中，连接酶是丙酰-辅酶A羧化酶(PCC，EC 6.4.1.3)。它催化丙酰-辅酶A的生物素依赖性羧化以便在线粒体基质中产生D-甲基丙二酰-辅酶A。甲基苹果酰-辅酶A是许多有机化合物的生物合成以及碳同化过程中的重要中间体。
在一些实施例中，谷氨酰胺合成酶(GluS)(EC 6.3.1.2)是磁性固定的。它在人体的各个部位，包括脑、肝和肾中发现。谷氨酰胺合成酶使用ATP和NH3(氨)来由谷氨酸形成谷氨酰胺。谷氨酰胺是制造用于药物和健康食品的重要氨基酸。在2001年，全世界L-谷氨酰胺的年产量是大约2000公吨。]纽肖姆(Newsholme)等人，细胞生物化学与功能(CellBiochem.and Function)，21(2002年4月):1–9(2003)；楠本，I.(Kusumoto,I.)，营养学杂志131:2552S–2555S(2001)。
在一些实施例中，在此披露的方法使用重组细胞，这些重组细胞表达在本发明中使用的酶。重组DNA技术在本领域中是已知的。在一些实施例中，将细胞用表达载体如表达酶的质粒转化。在其他实施例中，这些载体具有例如用于转录起始、转录终止、翻译起始和翻译终止的一个或多个遗传信号。在此，编码酶的核酸可以被克隆在载体中，这样使得当适当地转化到适合的宿主生物体中时它被表达。适合的宿主细胞可以来源于本领域中熟知的细菌、真菌、植物或动物。
本发明提供一种用于BNC的自动连续生产的方法。在一些实施例中，机器提供用于酶固定的连续流生产。在另外的实施例中，这些机器以工业规模使用。
图1示出该方法的示例性流程图。对纳米颗粒进行超声波处理以获得单分散状态。将它们以受控的比例和pH与酶混合。在一些实施例中，在超声处理之后，将这些纳米颗粒送至混合回路，将这些酶分别泵入该混合回路中。在优选的实施例中，BNC在孵育回路内产生。其他优选的实施例改变流动速率、管的长度和直径，如连续流制造领域中所已知。在其他实施例中，在孵育后不久，将这些BNC与磁性支架混合以形成稳定的级别2结构，该级别2结构可以被储存直到其最终催化用途。在优选的实施例中，在连续搅拌下将这些BNC与磁性支架混合。
在本发明的一些实施例中，将酶制剂在与单分散的MNP混合之前容纳于酶容器中。该酶容器可以由允许在合适的温度和pH条件下储存的任何材料制成。在一些实施例中，该容器阻止酶制剂与容器壁的非特异性结合。因此，它可以由玻璃、不锈钢、某些塑料等制成。类似地，在防止金属氧化物的表面氧化的条件下，将磁性纳米颗粒(MNP)容纳于任何适合的容器中。这些条件可能包括温度、压力或氧水平。在其他实施例中，该容器不会磁性地吸引MNP。
在本发明的一些实施例中，本发明的机器包括酶泵。酶泵经由机械或重力将一种或多种酶制剂(合并的、分离的或顺序地)送至BNC混合器。机械力可以包括正压、负压(真空)、搅拌等。类似地，在本发明的一些实施例中，本发明的机器包括MNP泵，该泵经由机械力或重力将所述MNP制剂送至MNP破碎机。在优选的实施例中，在此描述的这些泵可以经由施加在酶或MNP制剂上的正压或负压起作用。
本发明的机器具有产生磁性纳米颗粒的单分散的均匀悬浮液的MNP破碎机。在一些实施例中，MNP破碎机是超声破碎器(sonicator)或超声破碎器(ultrasonicator)。产生超声的超声破碎器在本领域中是众所周知的。在优选的实施例中，超声破碎器可以包括与MNP制剂接触的超声处理棒或延伸件。在更优选的实施例中，超声破碎器包括超声破碎器盘管和超声处理容器或者是线上(online)工艺超声破碎器。在更优选的实施例中，该机器包括用于冷却超声破碎器的冷却系统。在最优选的实施例中，该冷却系统使用水。
在其他实施例中，MNP破碎机可以通过振荡、剧烈搅拌、压力、穿过网或多孔材料或喷涂来机械地破碎MNP。在其他实施例中，MNP破碎机可以通过使这些MNP经受高pH(例如高于10)或通过(例如用柠檬酸酯或小型线性聚合物)官能化表面来化学地破碎这些MNP。在又其他实施例中，通过改变施加至MNP制剂的磁场来破碎这些MNP。在又其他实施例中，通过施加热量、冷却或冷冻来使这些MNP热破碎。在更优选的实施例中，通过以上提及的技术的组合来破碎这些MNP。
本发明的机器包括BNC混合器。本领域的技术人员将认识到，混合可以按各种方式完成。在优选的实施例中，BNC混合器包括混合三通，酶和MNC制剂被进料到该混合三通中并进行混合。或者，混合可以在腔室中完成，在该腔室中通过增加待混合的流动溶液的扰动而形成这些BNC。在其他实施例中，BNC混合器包括混合三通(T形管连接件)。在其他实施例中，BNC混合器是具有增加扰动的内脊或柱的管。
在一些实施例中，本发明的机器还包括用于将BNC模板化或浓缩到级别2支架材料之上或之中的支架组装装置。在优选的实施例中，该支架是磁性的。这些级别2结构可以是随机的或有序的。在其他优选的实施例中，该机器包括支架容器，该支架容器用于将支架制剂与这些BNC混合以产生用BNC官能化的级别2组装体。在又其他优选的实施例中，将该支架和这些BNC机械地或磁性地混合。在更优选的实施例中，将这些BNC立即置于支架中以阻止这些BNC过度聚集并促进均质固定的酶结构形成。
图2提供用于生产BNC的示例性机器。酶被容纳在容器(1)中，并且MNP被容纳在另一个容器(2)中。泵(4)将这些MNP送至超声处理盘管(7)，该超声处理盘管由缠绕在超声破碎器(6)的喇叭周围的管组成。超声处理盘管被容纳在不锈钢容器(5)内，该不锈钢容器弹回围绕盘管(7)的超声处理力。在其他实施例中，将超声处理盘管浸入超声处理浴中。在其他实施例中，使用线上超声破碎器以线上方式进行超声处理。
容器(5)被保持在冷却水浴(8)内。通过泵(10)将冷却水送至该浴，该泵从冷却系统(9)输送水。然后将经超声波处理的MNP泵送至混合三通(11)，使用泵(3)将酶送至该混合三通中。将这些酶和MNP在制备BNC的混合盘管(12)中混合。然后将这些BNC送至振荡器(14)，已将磁性支架从磁性支架容器(13)送至该振荡器中以产生用于催化用途的呈级别2组装体的BNC。
在一些实施例中，为了充分分解这些纳米颗粒，通过盘管(7)中的管的长度和直径以及泵(4)流速来计算和控制超声处理时间。计算如下：
其中
LS＝超声处理盘管的长度(m)
TS＝超声处理时间(分钟)
FA＝MNP泵的流速(ml/分钟)
DA＝MNP泵管内径(mm)
在一些实施例中，将已经经受超声处理的纳米颗粒送至混合盘管(12)。在其他实施例中，将这些管保持在距超声破碎器足够的距离处，以防止酶的无意超声处理和变性。
在一些实施例中，将酶和这些MNP管使用混合三通连接与混合回路连接。如下计算所需的混合时间的量：
其中
LM＝混合管的长度(m)
TM＝混合时间(分钟)
FB＝酶泵的流速(ml/分钟)
DO＝输出管内径(mm)
在一些实施例中，将连接到分流器上的这些管盘绕以节省空间。在其他实施例中，分流器将MNP/酶混合物滴入具有磁性支架的振荡器(14)中。该分流器允许混合物落在比仅单个管更大的表面积上。振荡该容器以确保这些BNC与这些支架完全混合。
为了可以更全面地理解在此描述的本发明，阐述以下实例。应理解，这些实例仅仅是出于说明性的目的，并且不应被解释为以任何方式限制本发明。
实例
实例1-优化酶与氧化铁磁性纳米颗粒的比例
通过优化酶与不同pH值下的MNP的比例，优化每种酶的酶负载量。确定固定到氧化铁磁性纳米颗粒团簇中的酶的负载量，例如间接地使用改良的布拉得福(Bradford)蛋白质定量测定来测量未结合的酶。
将调节至约4至11的pH的固定浓度的超顺磁性铁纳米颗粒(500μg/mL)与浓度为约5-1000μg/mL的酶组合。在1至12小时接触时间后，将酶/纳米颗粒团簇(级别1)固定在悬浮液中的过量磁铁矿微颗粒上(20g微颗粒/1g MNP)(级别2)。通过用永磁体沉淀来使固定的酶与悬浮液分离。可使用微板UV/可见光分光光度计，通过读取595nm处的吸光度并使用标准曲线来用布拉得福测定在微板中定量保留在上清液中的未结合的蛋白质。布拉得福试剂中的考马斯亮蓝G-250染料与碱性氨基酸残基结合以形成稳定的复合物，该复合物在595nm处具有UV吸收(蓝色)。这种吸收遵循比尔定律。通过使用蛋白质浓度对比A595的标准曲线，确定溶液中的蛋白质浓度。从总蛋白质与未结合的蛋白质之间的差异来计算固定的蛋白质的量：
[E]结合的＝[E]总-[E]未结合的
[E]＝酶浓度(μg/mL)
由朗格缪尔(Langmuir)吸附模型的[E]结合的对比[E]总以及二次拟合的曲线产生结合等温线。级别1固定的酶负载能力以就每克纳米颗粒结合的蛋白质的克数而言的百分比表示。例如：
1％负载＝(1g结合的蛋白质)/(100g纳米颗粒)
在确定了酶与纳米颗粒的最佳比例之后，用固定动力学曲线(10分钟、1小时、5小时和18小时)确定用于酶的100％捕获的最短接触时间。酶固定程序是如下：
为了定量，制备标准品，这些标准品包含2mL含MilliQ水的储备酶稀释液：0、10、50、100、250、500、750、1000、2000μg/mL。制备3管5mL 1000μg/mL纳米颗粒(MNP)。使用1MHCl和1M NaOH来调节MNP的pH，以获得各自pH 4、5、9和11的一个管。将MNP在20％振幅下超声处理1分钟。
将酶如下进行固定：将500μL超声处理的MNP等分到9个微量离心管中。对于每种pH的MNP进行此步骤以获得总计27管。将500μL的每种酶稀释液混合到每种pH的MNP等分试样中以产生总计27个样品(每种pH MNP 9个)，最终蛋白质浓度为0、5、25、50、125、250、375、500和1000μg/mL，且最终MNP浓度为500μg/mL。涡旋每个样品，然后在4℃下在转鼓中搅拌12小时以允许酶与MNP之间的接触时间。
制备5mL的20mg/mL磁铁矿微颗粒悬浮液；将100mg磁铁矿添加到5mL MilliQ水中。通过剧烈振荡混合磁铁矿悬浮液。通过上下吸移10次来使这些微颗粒分散。向27个酶样品中的每个添加500μL的20mg/mL微颗粒悬浮液。使用定轨振荡器将样品混合10分钟以将级别1固定的酶安装到级别2支架上。用稀土永磁体将该级别2沉淀。收集上清液并根据需要稀释，以使得最大浓度(即0％负载量)落入5-20μg/mL范围内。
对稀释的上清液进行布拉得福测定以确定稀释的上清液的浓度。通过适当的稀释因子来标定这些浓度，以发现在级别1固定后剩余的未结合蛋白质的浓度。根据初始总蛋白质与未结合的蛋白质之间的差异来计算结合的蛋
白质：
[E]结合的＝[E]总-[E]未结合的
[E]＝酶浓度(μg/mL)
通过绘制[E]结合的/500μg/mL MNP对比[E]总/500μg/mL的曲线来计算固定效率的定量。使用建模软件来将数据拟合至朗格缪尔吸附模型。在针对MNP将酶优化后，令人满意的酶负载量是1％-100％(每100g的材料的酶克数)。
实例2-用氧化铁磁性纳米颗粒优化酶固定时间
对于固定量的MNP，首先对每种酶的最大酶负载量进行优化，并且如以上实施例1中进行测定。在确定了酶与纳米颗粒的最佳比例之后，用固定动力学曲线(0分钟、5分钟、1小时、5小时和18小时)确定用于酶的100％捕获的最短接触时间。
酶固定程序是如下：从结合等温线选择产生酶的100％捕获的最高酶负载量([E]最大值)。制备6mL的在选定酶负载条件的pH下的1000μg/mL MNP。将MNP在20％振幅下超声处理1分钟。在1.5mL管中制备经超声处理的MNP的10个500μL等分试样。
制备6mL的2*[E]最大值。在MilliQ水中制备6mL 20mg/mL级别2。向这些MNP等分试样中的八个添加500μL酶，从而产生[E]最大值的最终酶浓度和500μg/mL的MNP浓度。
在以下时间点，将500μL充分混合的级别2添加至酶固定等分试样以终止固定：1分钟、5分钟、15分钟、30分钟、60分钟、90分钟、120分钟和18小时(过夜)。遵循上述布拉得福测定程序来使用1:1MilliQ水和布拉得福试剂作为空白，测定在给定时间后仍在溶液中的酶的浓度。酶的100％固定的最早时间是在上清液中不存在酶时。
该酶在最大负载容量(每100g材料的酶的克数)下在约5至30分钟内固定。
实例3–EC 1的固定。酶：脂氧化酶
脂氧化酶是催化将分子氧并入脂肪酸中的氧化还原酶(EC 1.13.11.12)。来自大豆品系大豆(Glycine max)的脂氧化酶(LPO)具有高容量，如通过将亚油酸铵转化成四种区域异构氢过氧基十八碳二烯酸(HPODE)的混合物所测量，这四种HPODE是亚油酸过氧化物：13-(Z,E)-、9-(E,Z)-、13-(E,E)-、9-(E,E)-HPODE。这些中的每一个在234nm处具有峰值UV吸光度，其中消光系数(ε)为25,000M-1cm-1。通过读取234nm处吸光度的增加，可以评价亚油酸铵至其氢过氧化物的转化率。参见，安东(Anthon)等人，农业与食品化学杂志(J.Agri.Food Chem.)49:32-37(2001)；维拉芙尔德(Villaverde)等人，工业原料作物与制品(Industrial Crops and Products)34(3):1474–1481(2011)。维拉芙尔德等人，化学工程杂志(Chemical EngineeringJournal)217:82–90(2013)。以上文献通过引用以其全部内容结合在此。
在一个实施例中，对脂氧化酶固定进行优化，并且如下用终点动力学测量所得到的生物催化活性。结合等温线确定用MNP固定LPO的基本条件：最佳pH、用于完全固定的最小纳米颗粒:酶比率、以及用于完全固定的最短接触时间。通过筛选用于固定LPO的纳米颗粒浓度，通过固定的LPO和用于固定的最佳纳米颗粒浓度来证明亚油酸至HPODE的转化率。这种固定的LPO被优化为等于或超过游离酶在18小时转化(工业上相关的时间尺度)时的活性并且也具有可比较的V最大值。
如上所述测定超顺磁性铁纳米颗粒(NP)上的LPO的峰值负载量。使用峰值负载量作为最小纳米颗粒浓度、pH和接触时间的基线，就活性而言对固定的LPO进行筛选以获得最佳LPO与NP比率。通过读取234nm处吸光度的增加，使用亚油酸酯至其氢过氧化物(HPODE)的转化率来测量级别2固定的LPO活性。将亚油酸酯和溶解氧在1mL分批反应中与级别2固定的LPO组合。通过在动力学时间过程(1分钟-18小时)中测量HPODE的浓度来确定反应速率。在仅短时间内，氢过氧化物开始氧化。将优化的固定的LPO与游离LPO针对底物的18小时总转化率进行比较。在选择用于固定的最佳条件后，测试级别2固定的LPO的可重复使用性。
如以上实例1-2所描述来测定脂氧化酶的结合等温线。测定在18小时60％转化所需的非固定的LPO浓度([E]60％)：在1％20和100mM磷酸盐缓冲液(pH 7)中制备30mM亚油酸储备溶液。总是用100mM磷酸盐缓冲液(pH 7)稀释。对于以下LPO浓度中的每一个，根据需要将250μL分配到两个各自1.5mL微量离心管中：4、20、40、200、400、500、1000或5000nM。用MilliQ水稀释酶。在以上每种酶浓度的一个管中，将底物和缓冲液按以下比例组合：
表1.用于[E]60％确定测定的反应混合物
*将使用其他含磷酸盐缓冲液的酶管并用250μL MilliQ水置换剩余的底物体积来制备空白。
将反应管和空白管用石蜡膜密封并使用定轨振荡器在室温下在黑暗中搅拌。在18小时接触时间后，将所有反应和酶空白管在12000g下离心10分钟。一式三份，使用Bio-TekEpoch板读取器在微板中读取来自反应样品和具有酶空白的空白的250μL的A234。使用234nm处HPODE的消光系数来计算上清液中HPODE的浓度。确定完成反应至60％转化率所需的最低酶浓度，以用于筛选固定的LPO([E]60％)。
用于MNP浓度筛选测定的LPO的固定如下进行：使用用ZYM结合等温线方案发现的用于固定的优化条件，制备具有20g级别2支架/1g MNP的3mL级别2固定的LPO。还使用5x和10x MNP固定LPO，所有其他条件保持不变。在使用前剧烈振荡以混合。还制备相同浓度的游离酶。制备3mL的稀释级别2固定的LPO和游离LPO至浓度4[E]60％，该浓度相当于4*(在18小时内将60％亚油酸转化成HPODE的LPO最低浓度)。对于用于LPO固定(1x、5x、10x)以及游离LPO的每种浓度的MNP，分配充分混合的固定的LPO的9x250μL等分试样以获得总计36个样品。
动力学时间过程：针对每个MNP浓度空白、1分钟、5分钟、15分钟、30分钟、60分钟、90分钟、120分钟和10800分钟(18小时)标记管，其中是蛋白质和缓冲液空白，并在适当的情况下将它们标记为“1x”、“5x”、“10x”或“游离”。制备12mL在100mM磷酸盐缓冲液(pH 7)中的2.4mM亚油酸和24mL 200mM磷酸盐缓冲液(pH 8)。通过将750μL的反应混合物吸移到标记1分钟-10800分钟的每个管中来开始反应。这使酶浓度达到[E]60％。
表2.用于筛选测定的反应混合物
用石蜡膜密封管并在定轨振荡器中在室温下在黑暗中搅拌。用250μL 200mM磷酸盐缓冲液(pH 8)和500μL MilliQ水填充每个空白，以获得分别[E]60％和50mM的最终LPO浓度和磷酸盐缓冲液浓度。在1分钟、5分钟、15分钟、30分钟、60分钟、90分钟、120分钟和18小时中的每个停止。使用稀土永磁体将各自1x、5x和10x的固定的酶的一个样品沉淀。一式三份，在沉淀固定的LPO之后立即读取来自每个样品的250μL的A234，以及具有稀释的酶空白的空白读数。使用234nm的消光系数来计算反应管中的HPODE浓度。
通过绘制转化成HPODE的亚油酸的量针对时间的曲线并从线性区域中的动力学曲线的斜率确定V最大值来选择优化的固定的LPO。
如下确定磁性固定的LPO的可重复使用性：选择具有最高V最大值的18小时固定的LPO样品(并且其还应该能够使反应到18小时时完成)以及其空白。用稀土永磁体将固定的LPO沉淀。除去上清液。
如下确定动力学时间过程：制备300μL的在100mM磷酸盐缓冲液(pH 7)中的2.4mM亚油酸和600μL 200mM磷酸盐缓冲液(pH 7)。通过将750μL的反应混合物吸移到反应管中来开始反应。这使酶浓度达到[E]60％。
表3.用于再循环测定的反应混合物
用石蜡膜密封管并在定轨振荡器中在室温下在黑暗中搅拌。用250μL 200mM磷酸盐缓冲液(pH 8)和500μL MilliQ水填充空白，以获得分别[E]60％和50mM的最终LPO浓度和磷酸盐缓冲液浓度。确定在该固定的LPO再循环测试期间转化成HPODE的亚油酸的量。
实例4–EC 3的固定。酶-腈水解酶
通过将扁桃腈转化成(R)-扁桃酸来测量腈水解酶(NIT)活性。扁桃酸的形成导致pH下降。使用板读取器，用微板中的染料如溴百里酚蓝(BB)将该pH下降采用分光光度法监测为在消光系数15703.79M–1cm–1情况下A616的减少(班纳吉(Banerjee)等人，生物分子筛选杂志(J.Biomolecular Screening)8(5):559–65(2003))。
使用结合等温线方案来确定超顺磁性铁纳米颗粒(NP)上的NIT的峰值负载量。使用峰值负载量作为最低纳米颗粒浓度、pH和接触时间的基线。对固定的NIT活性进行筛选以获得最佳的NIT与NP比率。使用溴百里酚蓝从蓝色到黄色的颜色变化，通过读取在616nm处吸光度的降低来测量扁桃腈至扁桃酸的级别2固定的NIT转化率。将扁桃腈和溴百里酚蓝在1mL分批反应中与级别2固定的NIT混合。将通过在动力学时间过程(1分钟-18小时)中采用比色法测量溶液的pH变化来确定反应速率。将确定在18小时内实现底物的完全转化所需的腈水解酶的浓度。
然后将固定的NIT优化为等于或超过游离NIT在18小时时的活性以获得底物的完全转化。在选择用于固定的最佳条件后，在连续测定中测试级别2固定的LPO的可重复使用性。然后使用实例1和2中描述的方法来确定结合等温线。
在一个实施例中，优化腈水解酶的固定，并使用比色测定法用终点动力学测量所得到的生物催化活性。首先，如下确定在18小时内底物的完全转化所需的游离NIT浓度(参考)([E]18小时)：
制备12mL在10％乙醇和MilliQ水中的50mM扁桃腈储备溶液，12mL在MilliQ水中的0.04％BB、以及12mL 40mM磷酸盐缓冲液(pH 7.2)。对于以下NIT浓度中的每一个，根据需要将250μL分配到两个各自1.5mL微量离心管中：4、20、40、200、400、500、1000、5000nM。用MilliQ水稀释酶。在以上每种酶浓度的一个管中，将底物和缓冲液按以下比例组合：
表4.用于[E]18小时确定测定的反应混合物
*使用其他含磷酸盐缓冲液的酶管并用250μL MilliQ水置换剩余的底物体积来制备空白。
将反应管和空白管用石蜡膜密封并使用定轨振荡器在室温下在黑暗中搅拌。在18小时接触时间后，将所有反应和酶空白管在12000g下离心10分钟。一式三份，使用Bio-Epoch板读取器在微板中读取来自反应样品和具有酶空白的空白的A616。
用以2.5％乙醇中的12.5mM扁桃酸开始的稀释系列、10mM磷酸盐缓冲液(pH 7.2)和0.01％溴百里酚蓝制备扁桃酸的标准曲线。使用10mM磷酸盐缓冲液(pH 7.2)和0.01％BB稀释。用该标准曲线计算所形成的扁桃酸的浓度。如果所有浓度的酶都使反应完成至100％转化，则选择最低浓度的酶作为用于筛选固定的NIT的酶([E]18小时)。
其次，将NIT固定到BNC中，并且使用标准优化测定对固定进行优化：使用实例1中用等温线方案发现的用于固定的优化条件，制备具有20g级别2支架/1g MNP的3mL级别2固定的NIT。还使用5x和10x MNP固定NIT，所有其他条件保持不变。在使用前剧烈振荡以混合。还制备相同浓度的游离酶。制备3mL的稀释级别2固定的NIT和游离NIT至浓度4*[E]18小时，该浓度相当于4*(在18小时内将100％扁桃腈转化成扁桃酸的NIT最低浓度)。对于用于NIT固定(1x、5x、10x)以及游离NIT的每种浓度的MNP，分配充分混合的固定的NIT的9x250μL等分试样以获得总计36个样品。
动力学时间过程：针对每个MNP浓度空白、1分钟、5分钟、15分钟、30分钟、60分钟、90分钟、120分钟和10800分钟(18小时)标记管，其中空白是蛋白质和缓冲液空白，并在适当的情况下将它们标记为“1x”、“5x”、“10x”或“游离”。制备12mL在10％乙醇和MilliQ水中的50mM扁桃腈储备溶液，12mL在MilliQ水中的0.04％BB、以及12mL 40mM磷酸盐缓冲液(pH7.2)。通过将750μL的反应混合物吸移到标记1分钟-10800分钟的每个管中来开始反应。这使酶浓度达到[E]18小时。
表5.用于筛选测定的反应混合物
用石蜡膜密封管并在定轨振荡器中在室温下在黑暗中搅拌。用250μL 40mM磷酸盐缓冲液(pH7.2)、250μL 0.01％BB和250μL MilliQ水填充每个空白以获得[E]18小时的最终NIT浓度。在1分钟、5分钟、15分钟、30分钟、60分钟、90分钟、120分钟和18小时中的每个停止。使用稀土永磁体将各自1x、5x和10x的固定的酶的1个样品沉淀。一式三份，在沉淀固定的NIT之后立即读取来自每个样品的250μL的A616，以及具有稀释的酶空白的空白读数。用以2.5％乙醇中的12.5mM扁桃酸开始的稀释系列、10mM磷酸盐缓冲液(pH 7.2)和0.01％溴百里酚蓝产生扁桃酸的标准曲线。使用10mM磷酸盐缓冲液(pH 7.2)和0.01％BB稀释。用该标准曲线计算所形成的扁桃酸的浓度。
通过绘制转化成扁桃酸的扁桃腈的量针对时间的曲线并从线性区域中的动力学曲线的斜率确定V最大值来选择优化的固定的NIT。针对多个循环测定可重复使用性：选择具有最高V最大值的18小时固定的NIT样品(并且其也可能能够使反应到18小时时完成)以及其空白。用稀土永磁体将固定的NIT沉淀。除去上清液。
动力学时间过程：制备各自300μL的在10％乙醇中的50mM扁桃腈、40mM磷酸盐缓冲液(pH 7.2)和0.04％BB。通过将750μL的反应混合物吸移到反应管中来开始反应。这使酶浓度达到[E]18小时。
表6.用于再循环测定的反应混合物
用石蜡膜密封管并在定轨振荡器中在室温下在黑暗中搅拌。用250μL 40mM磷酸盐缓冲液(pH7.2)、250μL 0.01％BB和250μL MilliQ水填充空白以获得[E]18小时的最终NIT浓度。通过重复该方案并回收材料并将其用于随后的循环来证明再循环。
结合等温线用于确定用MNP固定NIT的基本条件：最佳pH、最小纳米颗粒:酶比率，以及用于完全固定的最短接触时间。通过筛选用于固定NIT的纳米颗粒浓度，通过固定的NIT证明了扁桃腈至扁桃酸的转化。由此确定用于固定的纳米颗粒的最佳浓度。对于在工业上相关的时间尺度和V最大值下的18小时转化，优化的NIT可以至少与游离酶匹敌。优化的NIT再次用于确定固定的NIT的可重复使用性，在5个循环内18小时的活性无损失。
实例5-细胞色素氧化酶(EC 1.9.3.1)的固定
细胞色素c氧化酶(“CCO”，EC 1.9.3.1)参与在动物、植物、酵母和一些细菌的有氧代谢中的电子传递链。埃雷德(Errede)等人，美国国家科学院院刊(PNAS)73(1):113–117(1976)。它的活性是通过铁细胞色素c氧化成高铁细胞色素c来测量的。(参见例如细胞色素c氧化酶测定试剂盒，西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)2014:1-4。)以上文献通过引用以其全部内容结合在此。采用分光光度法将高铁细胞色素c的形成监测为550nm处吸光度的降低。铁细胞色素的消光系数和高铁细胞色素的消光系数的差异是21.85mM-1cm-1。
使用结合等温线方案来确定超顺磁性铁纳米颗粒(NP)上的CCO的最大负载量。使用峰值负载量作为最小纳米颗粒浓度、pH和接触时间的基线，对固定的CCO活性进行筛选以获得最佳CCO与NP比率。使用Bio-Epoch板读取器，使用在微板中测量的550nm处吸光度的变化来评价铁细胞色素c至高铁细胞色素c的级别2固定的CCO氧化。细胞色素c通过二硫苏糖醇(DTT)还原并在1mL分批反应中通过级别2固定的CCO再氧化。通过动力学时间过程(1分钟-18小时)中A550的降低来测量反应速率。
在一个实施例中，使用如下的比色测定法用终点动力学进行CCO固定到BNC中的优化以及其活性的随后测量：对于底物的18小时总转化，将固定的CCO优化为等于或超过游离CCO的活性。在选择用于固定的最佳条件后，在1mL测定中用5个连续18小时反应测试级别2固定的CCO的可重复使用性。如以上实例1中所描述来确定CCO的结合等温线。
如下测定在18小时时完全转化底物所需的游离CCO浓度(参考)([E]18小时)：制备具有92μM DTT和MilliQ水的12mL 40μM细胞色素C储备溶液，和具有240mM KCl的24mL 20mMTris-HCl(pH 7)。允许细胞色素c 20分钟以通过DTT还原，通过10与20之间的A550/A565确认。对于以下CCO浓度中的每一个，根据需要将250μL分配到两个各自1.5mL微量离心管中：4、20、40、200、400、500、1000、以及5000nM。用MilliQ水稀释酶。在以上每种酶浓度的一个管中，将底物和缓冲液按以下比例组合：
表7.用于[E]18小时确定测定的反应混合物
*将使用其他含磷酸盐缓冲液的酶管并用250μL MilliQ水置换剩余的底物体积来制备空白。
将反应管和空白管用石蜡膜密封并使用定轨振荡器在室温下在黑暗中搅拌。在18小时接触时间后，将所有反应和酶空白管在12000g下离心10分钟。一式三份，使用Bio-Epoch板读取器在微板中读取来自反应样品和具有酶空白的空白的A550。用以不含DTT的10μM氧化的细胞色素c(置于室温过夜)开始的稀释系列和具有120mM KCl的10mM Tris-HCl(pH 7)创建氧化的细胞色素c的标准曲线。使用具有120mM KCl的10mM Tris-HCl(pH 7)稀释。使用该标准曲线计算氧化的细胞色素c的浓度。如果所有浓度的酶都使反应完成至100％转化，则选择最低浓度的酶作为用于筛选固定的CCO的酶([E]18小时)。
用于MNP浓度筛选测定的CCO的固定：使用在实例1中描述的用于固定的优化条件，制备具有20g级别2支架/1g MNP的3mL级别2固定的CCO。还使用5x和10x MNP固定CCO，所有其他条件保持不变。在使用前剧烈振荡以混合。还制备相同浓度的游离酶。制备3mL的稀释级别2固定的CCO和游离CCO至浓度4*[E]18小时，该浓度相当于4*(在18小时内使100％细胞色素c氧化的CCO最低浓度)。对于用于CCO固定(1x、5x、10x)以及游离CCO的每种浓度的MNP，分配充分混合的固定的CCO的9x250μL等分试样以获得总计36个样品。
动力学时间过程：针对每个MNP浓度空白、1分钟、5分钟、15分钟、30分钟、60分钟、90分钟、120分钟和10800分钟(18小时)标记管，其中空白是蛋白质和缓冲液空白，并在适当的情况下将它们标记为“1x”、“5x”、“10x”或“游离”。制备12mL具有92μM DTT和MilliQ水的40μM细胞色素c储备溶液，和24mL具有240mM KCl的20mM Tris-HCl(pH 7)。允许细胞色素c20分钟以通过DTT还原，通过10与20之间的A550/A565确认。通过将750μL的反应混合物吸移到标记1分钟-10800分钟的每个管中来开始反应。这使酶浓度达到[E]18小时。
表8.用于筛选测定的反应混合物
用石蜡膜密封管并在定轨振荡器中在室温下在黑暗中搅拌。用具有240mM KCl的500μL 20mM Tris-HCl(pH 7)和250μL MilliQ水填充每个空白以获得[E]18小时的最终CCO浓度。在1分钟、5分钟、15分钟、30分钟、60分钟、90分钟、120分钟和18小时中的每个停止。使用稀土永磁体将各自1x、5x和10x的固定的酶的1个样品沉淀。一式三份，在沉淀固定的CCO之后立即读取来自每个样品的250μL的A550，以及具有稀释的酶空白的空白读数。
用以不含DTT的10μM氧化的细胞色素c(置于室温过夜)开始的稀释系列和具有120mM KCl的10mM Tris-HCl(pH 7)创建氧化的细胞色素c的标准曲线。使用具有120mM KCl的10mM Tris-HCl(pH 7)稀释。使用该标准曲线计算细胞色素c的浓度。
通过绘制随时间推移氧化的细胞色素c的量的曲线来确定优化的固定的CCO。V最大值由线性区域中的动力学曲线的斜率确定。
如下在5个循环内测定可重复使用性：选择具有最高V最大值的18小时固定的CCO样品(并且其还应该能够使反应到18小时时完成)以及其空白。用稀土永磁体将固定的CCO沉淀。除去上清液。如下计算动力学时间过程：制备300μL具有92μM DTT的40μM细胞色素c和600μL具有240mM KCl的20mM Tris-HCl(pH 7)。通过将750μL的反应混合物吸移到反应管中来开始反应。这使酶浓度达到[E]18小时。
表9.用于再循环测定的反应混合物
用石蜡膜密封管并在定轨振荡器中在室温下在黑暗中搅拌。用具有240mM KCl的500μL 20mM Tris-HCl(pH 7)和250μL MilliQ水填充每个空白以获得[E]18小时的最终CCO浓度。重复该程序多次以证明可重复使用性。
结合确定用MNP固定CCO的基本条件：最佳pH、最小纳米颗粒:酶比率，以及用于完全固定的最短接触时间。通过筛选用于固定CCO的纳米颗粒浓度，通过固定的CCO来证明铁细胞色素至高铁细胞色素的转化率并确定用于固定的最佳纳米颗粒浓度。对于工业上相关的时间尺度的18小时转化，这种优化的CCO可以至少与游离酶匹敌并可具有可比较的V最大值。一旦发现优化的CCO，就再次使用它以证明固定的CCO的可重复使用性。
实例6–葡萄糖异构酶的固定
葡萄糖异构酶(EC 5.3.1.5)以高立体选择性催化β-D-葡萄糖异构化成果糖。亚当斯(Adams)等人，生物化学与生物物理学集刊(Archives Biochem.Biophys.)91:230–234(1960)；威尔逊(Wilson)和特纳(Turner)，生物传感器与生物电子学(Biosensors&Bioelectronics)7:165-185(1992)，两者均通过引用以其全部内容而结合。当与游离酶相比时，将其固定针对高活性进行优化。通过葡萄糖转化成果糖来测量活性。使用葡萄糖氧化酶/辣根过氧化物酶系统(GOX/HRP)以分光光度法监测葡萄糖的消失。GOX将葡萄糖和溶解氧转化成过氧化氢，过氧化氢然后通过HRP用于氧化苯酚。酚自由基然后结合至4-抗氨基芘(4-AAP)(一种比色剂)。由于形成苯酚-4-AAP复合物，在550nm处增加的吸光度直接对应于溶液中的剩余葡萄糖的量。因此，在550nm处的较低吸光度表明更多的葡萄糖已经通过葡萄糖异构酶转化为果糖。
使用等温线方案来确定超顺磁性铁纳米颗粒(NP)上的GI的峰值负载量。使用峰值负载量作为最小纳米颗粒浓度、pH和接触时间的基线，对固定的GI活性进行筛选以获得最佳GI与NP比率。使用Bio-Epoch板读取器，使用在微板中测量的550nm处吸光度的变化来评价葡萄糖至果糖的级别2固定的GI转化。葡萄糖和级别2固定的GI在1mL分批反应中反应。在允许反应发生所需持续时间之后，将反应上清液在GOX/HRP混合物以及苯酚、缓冲液和4-AAP染料中稀释至最终1mL体积以定量剩余的葡萄糖。将通过在动力学时间过程(1分钟-18小时)中测量增加的A550来确定反应速率。
在一个实施例中，优化葡萄糖异构酶的固定，并使用如下的比色测定用终点动力学测量随后的活性：对于底物的18小时总转化，优化的固定的GI与游离GI匹敌。在选择用于固定的最佳条件后，将在1mL体积中用5个连续18小时反应测试级别2固定的GI的可重复使用性。
如以上所描述来确定GI的结合等温线。
确定18小时100％反应完成的游离GI浓度([E]18小时)：制备12mL 200mM葡萄糖储备溶液、24mL 200mM磷酸盐缓冲液(PB)pH 6、具有40nM HRP的12mL 40nM GOX、以及具有80mM苯酚的12mL 7mM 4-AAP。对于以下GI浓度中的每一个，根据需要将250μL分配到两个各自1.5mL微量离心管中：4、20、40、200、400、500、1000、以及5000nM。用MilliQ水稀释酶。在以上每种酶浓度的一个管中，将底物和缓冲液按以下比例组合：
表10.用于[E]18小时确定测定的反应混合物
*使用其他含磷酸盐缓冲液的酶管并用250μL MilliQ水置换剩余的底物体积来制备空白。
将反应管和空白管用石蜡膜密封并使用定轨振荡器在室温下在黑暗中搅拌。在18小时接触时间后，将所有反应和酶空白管在12000g下离心10分钟。稀释葡萄糖拆分反应混合物中的所有样品和空白。
用于MNP浓度筛选测定的GI的固定：使用用ZYM结合等温线方案发现的用于固定的优化条件，制备具有20g级别2支架/1g MNP的3mL级别2固定的GI。还使用5x和10x MNP固定GI，所有其他条件保持不变。在使用前剧烈振荡以混合。还制备相同浓度的游离酶。
制备3mL的稀释级别2固定的GI和游离GI至浓度4[E]18小时，该浓度相当于4*(在18小时内将100％葡萄糖转化成果糖的GI最低浓度)。对于用于GI固定(1x、5x、10x)以及游离GI的每种浓度的MNP，分配充分混合的固定的GI的9x250μL等分试样以获得总计36个样品。
如下确定动力学时间过程：针对每个MNP浓度空白、1分钟、5分钟、15分钟、30分钟、60分钟、90分钟、120分钟和10800分钟(18小时)标记管，其中是蛋白质和缓冲液空白，并在适当的情况下将它们标记为“1x”、“5x”、“10x”或“游离”。制备12mL 200mM葡萄糖储备溶液、24mL 200mM磷酸盐缓冲液(PB)pH 6、具有40nM HRP的12mL 40nM GOX、以及具有80mM苯酚的12mL 7mM 4-AAP。
通过将750μL的反应混合物吸移到标记1分钟-10800分钟的每个管中来开始反应。这使酶浓度达到[E]18小时。
表11.用于筛选测定的反应混合物
试剂 [储备液] [测定] 体积
β-D-葡萄糖 200mM 50mM 10mL
磷酸盐缓冲液(pH 6) 200mM 50mM 10mL
MilliQ水 10mL
用石蜡膜密封管并在定轨振荡器中在室温下在黑暗中搅拌。用250μL 200mM PBpH 6、250μL 200mM葡萄糖和250μL MilliQ水填充每个空白以获得[E]18小时的最终GI浓度。在1分钟、5分钟、15分钟、30分钟、60分钟、90分钟、120分钟和18小时中的每个停止。使用稀土永磁体将各自1x、5x和10x的固定的酶的1个样品沉淀。稀释葡萄糖拆分反应混合物中的每种样品和空白。通过绘制葡萄糖的量针对时间的曲线并从线性区域中的动力学曲线的斜率确定V最大值来选择优化的固定的GI。
针对5个循环测定可重复使用性：选择具有最高V最大值的18小时固定的GI样品(并且其也可能能够使反应到18小时时完成)以及其空白。用稀土永磁体将固定的GI沉淀。除去上清液。
如下确定动力学时间过程：制备300μL 200mM葡萄糖储备溶液、600μL 200mM磷酸盐缓冲液(PB)pH 6、具有40nM HRP的300μL 40nM GOX、以及具有80mM苯酚的300μL 7mM 4-AAP。通过将750μL的反应混合物吸移到反应管中来开始反应。这使酶浓度达到[E]18小时。
表12.用于再循环测定的反应混合物
试剂 [储备液] [测定] 体积
β-D-葡萄糖 200mM 50mM 300μL
磷酸盐缓冲液(pH 6) 200mM 50mM 300μL
MilliQ水 300μL
用石蜡膜密封管并在定轨振荡器中在室温下在黑暗中搅拌。用250μL 200mM PBpH 6、250μL 200mM葡萄糖和250μL MilliQ水填充每个空白以获得[E]18小时的最终GI浓度。稀释葡萄糖拆分反应混合物中的每种样品和空白。
结合等温线确定用MNP固定GI的基本条件：最佳pH、最小纳米颗粒:酶比率，以及用于完全固定的最短接触时间。通过筛选用于固定GI的纳米颗粒浓度，通过固定的GI证明了葡萄糖至果糖的转化。确定用于固定的纳米颗粒的最佳浓度。
在一些实施方案中，磁性固定的GI在55℃-60℃下以高底物浓度使用，并且用碳酸钠将pH调节至7.5-8.0。添加硫酸镁以保持酶活性(因为Mg2+是辅因子)。Co2+也可以用作辅因子。对于工业上相关的时间尺度的18小时转化，这种优化的GI可以至少与游离酶匹敌并可具有可比较的V最大值。
实例7–转氨酶的固定
ω-转氨酶是催化氨基基团转移以形成手性胺或酮的转移酶(EC2.6.1.18)。当与游离酶比较时，ω-转氨酶或胺-转氨酶(ATA)被固定以获得高活性。通过将来自α-甲基苄胺(MBA)的胺转移到丙酮酸酯以形成苯乙酮和丙氨酸来测量该活性。经由在245nm处增加的UV吸光度来读取苯乙酮(AP)的形成。AP的消光系数是12M-1cm-1。(参见Karim EngelmarkCassimjee博士论文，KTH皇家理工学院(KTH Royal Institute of Technology)，生物技术学院(School of Biotechnology)，斯德哥尔摩(Stockholm)(2012年)；沃森内托(WatsonNeto)，博士论文，工艺工程和技术中心(Center for Process Engineering andTechnology)，化学和生物化学工程系(Dept.of Chemical and BiochemicalEngineering)，丹麦技术大学(Technical University of Denmark)。)以上文献通过引用以其全部内容结合在此。
使用上文描述的结合等温线方法来确定超顺磁性铁纳米颗粒(NP)上的ATA的峰值负载量。使用峰值负载量作为最小纳米颗粒浓度、pH和接触时间的基线，就酶活性而言对固定的ATA进行筛选以获得最佳ATA与NP比率。使用通过在245nm处的吸光度增加读取的MBA至苯乙酮的转化率来评价级别2固定的ATA活性。将MBA和共底物丙酮酸酯在1mL分批反应中与级别2ATA组合。通过在动力学时间过程(1分钟-18小时)中测量苯乙酮的浓度来确定反应速率。
在一个实施例中，优化葡萄糖异构酶ATA的固定，并使用如下的比色测定用终点动力学测量随后的活性：对于底物的18小时总转化，优化固定的ATA以获得最大V最大值并与游离ATA的活性匹敌。在选择用于固定的最佳条件后，测试级别2固定的ATA的可重复使用性。
用于MNP浓度筛选测定的ATA的固定：使用在实例1中所示的用于固定的优化条件，制备具有20g级别2支架/1g MNP的3mL级别2固定的ATA。还使用5x和10x MNP固定ATA，所有其他条件保持不变。在使用前剧烈振荡以混合。还制备相同浓度的游离酶。
制备3mL的稀释级别2固定的ATA和游离ATA至浓度[E]18小时，该浓度相当于在18小时内将100％MBA转化成AP的最低ATA浓度的4倍)。对于用于ATA固定(1x、5x、10x)以及游离ATA的每种浓度的MNP，分配充分混合的固定的ATA的9x250μL等分试样以获得总计36个样品。
如下确定动力学时间过程：针对每个MNP浓度空白、1分钟、5分钟、15分钟、30分钟、60分钟、90分钟、120分钟和18小时标记管，其中空白是蛋白质和缓冲液空白，并在适当的情况下将它们标记为“1x”、“5x”、“10x”或“游离”。制备4mL 6M HCl。制备各自12mL的在1％DMSO中的10mM MBA、10mM丙酮酸钠和200mM磷酸盐缓冲液(pH 8)。通过将750μL的反应混合物吸移到每个管中来开始反应。这使酶浓度达到[E]18小时。
表13.用于筛选测定的反应混合物
用石蜡膜密封管并在定轨振荡器中在室温下在黑暗中搅拌。在1分钟、5分钟、15分钟、30分钟、60分钟、90分钟、120分钟和18小时中的每个停止。通过热变性(例如在沸水中5分钟)停止在适当管中的反应。用250μL200mM磷酸盐缓冲液(pH 8)和500μL MilliQ水填充每个空白，以获得分别[E]18小时和50mM的最终ATA浓度和磷酸盐缓冲液浓度。用在50mM磷酸盐缓冲液(pH 8)中具有156.25mM的稀释系列作为最高浓度，建立苯乙酮浓度对A245的标准曲线。稀释剂将是50mM磷酸盐缓冲液(pH 8)，标准曲线的空白也是如此。
使用稀土永磁体将所有固定的酶沉淀。稀释来自每个管的上清液：62.5μL稀释到937.5μL MilliQ水中。一式三份，从每个稀释的反应样品和具有稀释的酶空白的空白中读取A245。使用苯乙酮标准品来计算稀释的上清液中的苯乙酮的浓度。通过将上清液中的AP浓度乘以稀释因子(1000/62.5)来计算反应管中的最终AP浓度。
通过绘制转化成苯乙酮的MBA的量针对时间的曲线并从线性区域中的动力学曲线的斜率确定V最大值来选择优化的固定的ATA。
如下在5个循环内测定可重复使用性：选择具有最高V最大值的10800分钟(18小时)固定的ATA样品(并且其还应该能够使反应到18小时时完成)以及其空白。用稀土永磁体将固定的ATA沉淀。除去上清液。
确定动力学时间过程：制备150μL 6M HCl。制备各自300μL的在1％DMSO中的10mMMBA、10mM丙酮酸钠和200mM磷酸盐缓冲液(pH 8)。通过将750μL的反应混合物吸移到反应管中来开始反应。这使酶浓度达到[E]18小时。
表14.用于筛选测定的反应混合物
用石蜡膜密封管并在定轨振荡器中在室温下在黑暗中搅拌。在18小时后用100μL6M HCl终止。用250μL 200mM磷酸盐缓冲液(pH 8)和500μL MilliQ水填充空白，以获得分别[E]18小时和50mM的最终ATA浓度和磷酸盐缓冲液浓度。确定在该固定的ATA再循环测试期间转化成苯乙酮的MBA的量。测试可重复使用性。
结合等温线确定用MNP固定ATA的基本条件：最佳pH、最小纳米颗粒:酶比率，以及用于完全固定的最短接触时间。通过筛选用于固定ATA的纳米颗粒浓度，通过固定的ATA来证明MBA至AP的转化率并确定用于固定的最佳纳米颗粒浓度。对于工业上相关的时间尺度的18小时转化，这种优化的ATA可以至少与游离酶匹敌并可具有可比较的V最大值。一旦发现优化的ATA，就将其收回并重新使用，在5个循环内18小时的活性无损失。
实例8-磁性固定的纳米颗粒的自动化连续流生产
构建了一台机器并其用来将示例性酶HRP磁性地固定在MNP团簇中。对于达50％的负载量表现出超过99％的固定效率。在抑制浓度的H2O2存在下，固定的HRP对游离酶具有优异活性。
构建该机器并其用来将辣根过氧化物酶(HRP)固定在超顺磁性铁纳米颗粒(NP)团簇中，这些团簇显示连续流酶固定。用MNP团簇将HRP捕获至25％和50％负载量，具有>99％的固定效率。通过醌亚胺染料(4-氨基安替比林(4-AAP)与苯酚的复合物)的形成速率来评价固定的HRP的活性，该活性通过在500nm处的吸光度增加而测量。使用0.5mM苯酚、0.5mM4-AAP、100mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)、2.5mM H2O2和2nM HRP的反应混合物，50％负载量的固定的HRP实现在所测试的条件下优于游离HRP的反应速度5±0.1倍的初始反应速度(所形成的μM醌亚胺染料/分钟)。
苯酚、4-AAP、冻干的HRP、以及缓冲盐来自西格玛-奥德里奇。H2O2(30％)由飞世尔科技公司(Fisher Scientific)提供。将HRP溶解在MilliQ水中，并通过在消光系数102mM- 1cm-1情况下其在404nm处的吸光度来确定储液浓度。也用MilliQ水制备了所有其他溶液。
HRP的固定：将HRP和MNP与具有通过铂金-埃尔默(Perkin-Elmer)系列200微量泵双泵HPLC系统控制的流速的连续流组合以将HRP捕获在MNP团簇中(级别1)。使用等体积的80μg/mL MNP和20或40μg/mL HRP制备固定的酶，以获得10μg/mL HRP/40μg/mL MNP的最终浓度(25％负载量)和20μg/mL HRP/40μg/mL MNP的最终浓度(50％负载量)。在使用前，使用1M HCl和NaOH将MNP悬浮液调节至pH 5，并通过飞世尔科技声波破碎仪(FB-505)以40％振幅超声处理1分钟。将两种试剂以0.833mL/分钟的速率通过0.762mm内径的不锈钢管泵入并在T型混合器中组合，从而产生1.67mL/分钟的组合输出。在这些试剂到达T型混合器后，使输出流动通过1.016mm内径的不锈钢管。为了确保MNP的均匀性和分散，使MNP溶液穿过置于冷水中的不锈钢管盘管，其中超声破碎器探头位于盘管的中心处，从而以40％振幅以两秒时间间隔脉冲接通和关闭。MNP储器也被放置在超声破碎器探头附近以维持MNP分散。以这种方式，对于25％和50％酶负载量中的每一个，将5个1mL的级别1批次收集在微量离心管中。通过将固定的HRP直接收集到800μg磁铁矿粉末上(级别2)、然后用定轨振荡器充分混合级别1和级别2 10分钟来终止在连续流之外的未结合的酶的进一步固定。将级别2用永磁体沉淀，并收集上清液用于蛋白质定量。然后用1mL MilliQ水重新悬浮这些球粒。
固定的酶的定量：使用如上所述的改良的布拉得福测定来测量在级别2上捕获的固定的HRP的量，并将其与在级别1溶液中检测到的总蛋白质进行比较。
HRP活性测定：使用由于形成粉红色醌亚胺染料而在500nm处吸光度的增加来确定固定的HRP的活性(图3)。苯酚与4-氨基安替比林(4-AAP)的复合物具有13.78mM-1cm-1的消光系数。反应混合物含有0.5mM苯酚、0.5mM 4-AAP、100mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)、过量H2O2(2.5mM)和2nM HRP，并在室温下在微量离心管中进行，同时在定轨振荡器中搅拌。终点吸光度读数从1-60分钟的接触时间取得，使用Bio-Epoch板读取器在UV可透过微板中读取，路径长度校正至1cm。游离HRP和50％负载的固定的HRP的活性通过比较就每分钟形成的μM醌亚胺染料而言的其初始反应速度来进行评估。
固定效率：用于HRP浓度的布拉得福测定揭示，在25％和50％负载的样品中，超过99％的酶被MNP捕获。图4示出在溶液中作为级别1固定的HRP测量的蛋白质的量和从溶液中除去的结合至级别2固定的HRP的量。在级别2上的酶的量被计算为溶液中总蛋白质与未结合的蛋白质的差异。
固定的HRP的活性：通过醌亚胺染料的浓度对比时间的曲线(图3)的线性区域的斜率来确定由级别2固定的HRP催化的4-AAP:苯酚反应的初始速度。固定的HRP具有1.58±0.03μM/分钟的初始速度。与具有0.31±0.04μM/分钟初始速度的游离HRP相比，固定的HRP具有大5倍的初始速度。过氧化物酶经历过氧化氢的底物抑制，即通过捕获在纳米颗粒中所赋予的保护而降低的敏感性。
实例9：用于自动化BNC合成的超声处理和流速优化
使用连续流组装体来优化磁铁矿纳米颗粒(MNP)团簇内的辣根过氧化物酶的固定。该连续流系统以非常精确的浓度比例将酶与单分散纳米颗粒混合。将所得到的BNC立即模板化到磁性材料上。组装系统包括两个配备有0.0625英寸OD x 0.043英寸ID 316不锈钢管的HPLC泵(铂金-埃尔默系列200微量泵)。标记为A和B的泵分别通过钢管的单独区段(也指定为A和B)转移MNP和酶。这些MNP和酶通过充当混合室的钢制三通接头在下游组合。为了获得MNP的单分散悬浮液，将管A盘绕三次成直径3.18cm的“超声处理环”并置于超声水浴(必能信(Branson)1800)内。三通接头下游的管也被盘绕十次成7.6cm“孵育环”以增强终止于收集端口的MNP-酶混合。
在每天第一次运行之前，通过以3.00mL/分钟运行35mL的1M HCl、随后50mL去离子水来清洁这些泵。接下来，将均以所需浓度制备的5mL辣根过氧化物酶(HRP)和5mL MNP溶液转移至单独的储库中。然后将这些MNP以25％振幅连续超声处理60秒(505声波破碎仪，飞世尔科技型号，配备有1/4英寸探头尖端)，其对应于大约12-14W的超声处理功率。将MNP管在必能信浴中固定在适当位置中，其中对于运行的持续时间维持40kHz超声处理。然后将两个泵的塑料吸入管固定在其各自的样品容器内，尽可能远低于液体的表面以防止空气进入。然后将两个泵设定在所需的流速(即0.83mL/分钟的整数和分数倍数)下，并且泵A开始泵送。在泵A启动20秒后，启动泵B。在收集端口，当洗脱液中的MNP停止聚集时，收集前1mL洗脱液。继续收集直到获得10个1mL样品级分。然后用50mL去离子水冲洗这些泵，以准备用于下一次试验。遵循该收集方案，流速为0.21(1/4X)、0.42(1/2X)、0.83(1X)、1.66(2X)和3.32(4X)mL/分钟。
对于每个泵速度，将五个1ml样品在室温下连续搅拌以确保MNP用于固定酶的过量时间。将八个样品以15,000g离心15分钟。然后在每个离心样品的上清液上进行布拉得福测定。
使用每个试验的剩余2mL来测量固定的HRP的活性，并在25℃下保持搅拌直到准备好进行测定。使用25mM的过氧化氢作为测定的底物。使用在具有磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4)和Milli-Q水的10mL溶液中组合的10mM的苯酚和10mM的4-氨基安替比林(4-AAP)作为反应混合物。将所有含酶样品稀释至25nM，然后在将反应混合物和过氧化物添加至反应孔后进一步稀释至2.5nM。
随着HRP-过氧化物反应在Epoch微板分光光度计内在500nm处扫描时进行，在10分钟内实时测定吸光度。图5示出与游离HRP的初始反应速度相比，对于所测试的每个泵速度，在100:1MNP:HRP浓度比例下MNP固定的HRP的初始反应速度。这些速度是来自使用浓度为2.5nM的HRP的反应的前315秒。通过稀释含有25μg/mL HRP和2,500μg/mL MNP的原始洗脱液来获得测定浓度。假定ε＝13.78mM-1cm-1的消光系数和0.717cm的平均路径长度来计算产物形成。
MNP固定的HRP展示比单独HRP高5至9倍的酶活性(图5)。唯一的例外是3.32mL/分钟样品。对于MNP和HRP来说，这可能被洗脱得太快而不能相互作用并形成所需的团簇。在收集时仅水被洗脱。值得注意的是，在0.83mL/分钟的泵速下，实现了最高活性(与游离HRP相比，反应速度增加了9倍)，但是随着泵速相对于该最佳点增加或降低，活性降低。因此，泵速度影响酶活性：较高的流速改进混合湍流，二氢减少MNP-酶接触时间。
实例10：磁性载体上的自动化腈水解酶固定
材料和方法。使用自动化BNC组装系统以20％负载量制备含有腈水解酶(14个相同的亚基，其中MW＝41kDa，pI＝8.1)和磁铁矿纳米颗粒的BNC，然后将这些BNC模板化到细磁铁矿粉末(50-100nm)支架上，从而产生具有1％总体负载量的生物微催化剂(BMC)。对于烟酸的合成，优化的固定条件产生相对于游离酶>99％的保留活性。
在大肠杆菌中表达的重组腈水解酶、3-氰基吡啶、邻苯二甲醛、2-巯基乙醇、BICINE-KOH和乙醇购自西格玛(圣路易斯(St.Louis)，密苏里州(MO)，美国)。盐酸、氯化铵和氢氧化钾来自万安精细化学品(Macron Fine Chemicals)(中央山谷(Center Valley)，宾夕法尼亚州(PA)，美国)。快速启动TM布拉得福蛋白质测定购自伯乐(Bio-Rad)(赫拉克勒斯(Hercules)，加利福利亚州(CA)，美国)。如先前在WO2012122437和WO2014055853中所描述来合成磁铁矿纳米颗粒和磁性大孔聚合物杂化支架，这些专利通过引用以其全部内容结合在此。在通过BarnsteadTM NanopureTM纯化的18.2MΩ-cm水中制备储备溶液。使用Gen5TM软件操作的SynergyTM H1板读取器，在康宁(Corning)3925黑底荧光微板中测量荧光强度。具有1/8英寸探头的超声破碎器(FB-505)购自(沃尔瑟姆(Waltham)，马萨诸塞州(MA))。自动化BNC组装器使用新时代泵系统公司(New Era PumpSystems Inc.)(法明代尔(Farmingdale)，纽约州(NY))的两个连接的NE-1000注射泵。都具有0.04内径和0.125外径的不锈钢管、混合不锈钢三通和两个PEEK七端口径向歧管、连同必要的PEEK或不锈钢接头都购自麦克马斯特-卡尔(McMaster-Carr)(克利夫兰(Cleveland)，俄亥俄州(OH))。
将冻干的腈水解酶溶解于水中。在100％乙醇中制备邻苯二甲醛(OPA)储备溶液(75mM)并保持在冰上或储存在4℃下。还在使用之前立即在100％乙醇中制备了2-巯基乙醇(2-ME)储备溶液(72mM)。通过将450mL上述溶液加入到9.1mL 200mM(pH 9.0)BICINE-KOH缓冲液中来制备缓冲的OPA/2-ME试剂。将该缓冲的试剂保持在冰上，直到在使用前，此时使其平衡至室温(21℃)。
使用用于制备BNC的连续流系统来提高固定之间的一致性并改进游离酶与MNP的混合，以获得具有受控的BNC直径的更均匀的产物。该系统包括两个注射泵，各自具有充当游离酶或超声处理的纳米颗粒的储器的60mL注射器。酶和MNP流动通过内径为0.04”的不锈钢管，从而在不锈钢混合三通中相遇。在该三通前，将MNP线盘绕并浸没在水中。声波探头位于该盘管的中心，并且该探头在40％振幅下是活性的，同时MNP流动通过管。这种盘管/超声破碎器安排用于线内超声处理的目的。三通之后是七端口PEEK歧管线内混合器，该混合器将该流分成六个通道。这些通道中的每一个通入第二歧管，在该第二歧管中它们与单个输出重新组合。最后，在第二歧管后放置另一段管以能够收集BNC。
将游离腈水解酶储备液(250μg/mL)调节至pH 8.75，并将5mL1250μg/ml MNP储备液以40％振幅超声处理1分钟，使用水浴平衡至室温，然后将其pH调节至3。将游离腈水解酶(2mL)负载到酶泵注射器中，并将等体积的MNP负载到MNP泵中。使用注射泵ProV1泵控制软件同时启动两个泵，每个泵设定在30mL/分钟下以获得60mL/分钟的有效流速。通过向1mL腈水解酶储备液中加入1mL超声处理的MNP储备液、然后移液混合10次来制备手动组装的腈水解酶BNC。通过将1mL自动组装或手动组装的BNC添加到594μL 20mg/mL磁铁矿粉末并移液混合10次来制备腈水解酶BMC。将这些BMC在旋转器上轻轻混合1小时，然后磁性地沉淀。保存其上清液以用于定量固定的腈水解酶。这些BMC分别被称为自动化BMC和手动BMC。
腈水解酶反应和活性测定。腈水解酶反应和活性测定方法两者均是基于由班纳吉(Banerjee)，生物技术与应用生物化学(Biotechnol.and Appl.Biochem)37(3):289–293(2003)描述的方法的修改。简言之，腈水解酶催化3-氰基吡啶水解成烟酸，从而释放出氨。腈水解酶反应在2mL微量离心管中在50℃下运行20小时，总反应体积为1mL，含有50mM 3-氰基吡啶、87.5mM BICINE-KOH(pH 9.0)和218nM游离或固定的腈水解酶(NIT)。通过向等体积的腈水解酶反应混合物加入13.35μL 100mM HCl来终止反应。将固定的NIT磁性地沉淀，并用HCl处理上清液。
通过检测将氨并入到异吲哚荧光染料中来使用荧光测定法测量酶活性。将缓冲的试剂(624μL)添加至上清液中并在室温下轻轻混合20分钟。在孵育后，将150μL 100mM HCl添加到该溶液中以增加荧光信号。使用412nm激发，467nm发来射测量荧光强度，相对于具有最高强度的孔自动调节增益。每个荧光读数包括内部线性NH4Cl标准曲线(R2>0.99)。一个单位(U)的腈水解酶活性被定义为在87.5mM BICINE-KOH(pH 9.0)中在50℃下每分钟释放的1μmol NH3。
蛋白质定量。将BMC磁性地沉淀，并测定上清液中的蛋白质含量，包括线性腈水解酶标准曲线(R2>0.99)。布拉得福，分析生物化学(Analytical Biochem.)72(1-2):248–254(1976)。
结果
对照显示不存在未催化的氨释放。自动和手动制备的腈水解酶BNC被固定在磁铁矿粉末(50-100nm)支架上，具有>99％固定产率以获得在BMC上1％的有效负载(表15)。活性自动化腈水解酶BMC相对于游离腈水解酶大部分保留(>99％)，而手动腈水解酶BMC具有较低活性(约38％)。
表15：酶负载到BMC上
酶 自动固定(％) 手动固定(％)
腈水解酶(NIT) 1 1
ω-转氨酶(ωTA) 1 1
碳酸酐酶(CAN) 9.5 9.5
过氧化氢酶(CAT) 0.79 0.7
葡萄糖异构酶(GIS) 8.1 9.6
谷氨酰胺合成酶(GluS) 1.0 0.94
辣根过氧化物酶(HRP) 5.6 5.6
实例11：用于生物催化的在磁性载体上的转氨酶固定
使用自动化BNC组装系统以20％负载量制备含有ω-转氨酶(EC2.6.1.18，MW＝195kDa)和磁铁矿纳米颗粒的BNC，然后将这些BNC模板化到细磁铁矿粉末(50-100nm)支架上，从而产生具有1％总体负载量的BMC。对于由(R)-(+)-α-甲基苄胺合成苯乙酮，优化的固定条件产生相对于游离酶>99％的保留活性。
材料和设备。重组ω-转氨酶(ωTA)是来自在大肠杆菌中表达的范巴伦分枝杆菌(Mycobacterium vanbaaleni)。(R)-(+)-α-甲基苄胺(MBA)、丙酮酸钠和苯乙酮(AP)是来自西格玛(圣路易斯，密苏里州，美国)。二甲亚砜(DMSO)购自飞世尔科技公司(费尔劳恩(FairLawn)，新泽西州(NJ)，美国)。盐酸、氢氧化钠和磷酸盐缓冲盐是来自万安精细化学品(中央山谷，宾夕法尼亚州，美国)。快速启动TM布拉得福蛋白质测定购自伯乐(Bio-Rad)(赫拉克勒斯(Hercules)，加利福利亚州(CA)，美国)。用通过BarnsteadTM NanopureTM纯化的18.2MΩ-cm水制备储备溶液。使用以Gen5TM软件操作的Biotek EpochTM板读取器在CostarTM 3635UV可透过微板中一式三份测量吸光度。具有1/8英寸探头的超声破碎器(FB-505)是来自(沃尔瑟姆，马萨诸塞州)。自动化BNC组装器使用新时代泵系统公司(NewEra Pump Systems Inc.)(法明代尔(Farmingdale)，纽约州(NY))的两个连接的NE-1000注射泵。都具有0.04内径和0.125外径的不锈钢管、混合不锈钢三通和两个PEEK七端口径向歧管、连同必要的PEEK或不锈钢接头都来自麦克马斯特-卡尔(McMaster-Carr)(克利夫兰(Cleveland)，俄亥俄州(OH))。
试剂。将冻干的ωTA溶解于水中。通过将12.78μL MBA溶解在100μL DMSO中，然后用水使总体积达到10mL以获得10mM的最终浓度来制备(R)-(+)-α-甲基苄胺(MBA)储备溶液。通过将丙酮酸钠粉末溶解在水中来制备45mM丙酮酸钠储备液。通过将12μL AP溶解在水中来制备苯乙酮储备溶液。将所有储备溶液都保持在冰上。就在测定中使用之前制备稀释液，并使这些稀释液平衡至室温(21℃)。
自动化BNC组装。使用用于制备BNC的连续流系统来提高固定之间的一致性并改进游离酶与MNP的混合，以获得具有受控的BNC直径的更均匀的产物。该系统包括两个注射泵，各自具有充当游离酶或超声处理的纳米颗粒的储器的60mL注射器。酶和MNP流动通过内径为0.04英寸的不锈钢管并在不锈钢混合三通中相遇。在该三通前，将MNP线盘绕并浸没在水中。声波探头位于该盘管的中心，并且该探头在40％振幅下是活性的，同时MNP流动通过管。该盘管/超声破碎器安排提供线内超声处理。三通之前是线内七端口PEEK歧管混合器，该混合器将该流分成六个通道。这些通道中的每一个通入第二歧管，在该第二歧管中它们与单个输出重新组合。最后，在第二歧管后放置另一段管以用于收集BNC。
固定。将游离ωTA储备液(250μg/mL)调节至pH 7.15，并将5mL1250μg/ml MNP储备液以40％振幅超声处理1分钟，使用水浴平衡至室温，然后将其pH调节至3。将游离ωTA(2mL)负载到酶泵注射器中，并将等体积的MNP负载到MNP泵中。使用注射泵ProV1泵控制软件同时启动两个泵，每个泵设定在30mL/分钟下以获得60mL/分钟的有效流速。通过向1mLωTA储备液中加入1mL超声处理的MNP储备液、然后移液混合10次来制备手动组装的ωTABNC。通过将1mL自动组装或手动组装的BMC添加到594μL 20mg/mL磁铁矿粉末并移液混合10次来制备ωTA BMC。将这些BMC在旋转器上轻轻混合1小时，然后磁性地沉淀。保存其上清液以用于定量固定的ωTA。这些BMC分别被称为自动化BMC和手动BMC。
ω-转氨酶活性测定。ωTA活性测定方法是基于上文引用的谢特勒等人，(2009)所描述的方法，但针对微板进行改编。简言之，ωTA催化氨基基因从MBA(胺供体)转移到丙酮酸，从而分别形成AP和丙氨酸。通过由于形成AP而在245nm处吸光度的增加来测量酶活性，上文引用的马修和云(2012)。ωTA反应在2mL微量离心管中在21℃下运行1小时，使用含有50mM pH 8.0磷酸盐缓冲盐水(PBS)、0.1mM MBA、1mM丙酮酸酯和349nMω-转氨酶的1mL总反应体积。将固定的ωTA磁性地沉淀，并读取其上清液的吸光度。使用含有0-0.1mM AP和0-0.1mM丙氨酸(R2>0.99)的线性标准曲线来定量AP。一个单位(U)的ω-转氨酶活性被定义为在21℃下在50mM PBS(pH 8.0)中每分钟产生的1μmol AP。
蛋白质定量。将BMC磁性地沉淀，并使用布拉得福方法测定上清液中的蛋白质含量，包括线性ωTA标准曲线(R2>0.99)。
结果
对照显示不存在未催化的苯乙酮释放。将自动和手动制备的ωTA BNC固定在磁铁矿粉末(50-100nm)支架上，具有>99％固定产率以获得在BMC上1％的有效负载(表15)。相对于游离腈水解酶，活性自动化和手动ωTA BMC的活性在很大程度上保留(>99％)。
实例12：用于生物催化的在磁性载体上的碳酸酐酶固定
使用自动化BNC组装系统以20％负载量产生含有牛碳酸酐酶II(CAN)(MW＝30kDa)和磁铁矿纳米颗粒的BNC，然后将这些BNC模板化到细磁铁矿粉末(50-100nm)支架上，从而形成具有9％总体负载量的BMC。对于碳酸氢盐脱水成二氧化碳，优化的固定条件产生相对于游离酶95±8％的保留活性。
材料和设备。来自牛红细胞碳酸酐酶II(CAN)、BICINE-KOH、HEPES-KOH、以及8-羟基-芘-1,3,6-三磺酸酯(荧光黄(pyranine))(圣路易斯，密苏里州，美国)。盐酸、氯化铵和氢氧化钾来自万安精细化学品(Macron Fine Chemicals)(中央山谷(Center Valley)，宾夕法尼亚州(PA)，美国)。快速启动TM布拉得福蛋白质测定购自伯乐(Bio-Rad)(赫拉克勒斯(Hercules)，加利福利亚州(CA)，美国)。如WO2012122437、WO2014055853中合成磁铁矿纳米颗粒以及如先前所描述合成磁性大孔聚合物杂化支架。在通过BarnsteadTM NanopureTM纯化的18.2MΩ-cm水中制备储备溶液。使用以Gen5TM软件操作的具有溶剂注入系统的SynergyTM H1板读取器，在康宁3925黑底荧光微板中测量荧光强度。具有1/8”探头的超声破碎器(FB-505)购自(沃尔瑟姆，马萨诸塞州)。自动化BNC组装器使用新时代泵系统公司(New Era Pump Systems Inc.)(法明代尔(Farmingdale)，纽约州(NY))的两个连接的NE-1000注射泵。都具有0.04内径和0.125外径的不锈钢管、混合不锈钢三通和两个PEEK七端口径向歧管、连同必要的PEEK或不锈钢接头都购自麦克马斯特-卡尔(McMaster-Carr)(克利夫兰(Cleveland)，俄亥俄州(OH))。
试剂。将冻干的CAN溶解于水中。试剂A含有2mM KHCO3和0.5mM BICINE-KOH缓冲液(pH 8)。试剂B含有500pM碳酸酐酶、100nM荧光黄和0.5mM HEPES-KOH缓冲液(pH6)。
自动化BNC组装。使用连续流系统来制备这些BNC。该系统包括两个注射泵，各自具有充当游离酶或超声处理的纳米颗粒的储器的60mL注射器。酶和MNP流动通过内径为0.04英寸的不锈钢管，从而在不锈钢混合三通中相遇。在该三通前，将MNP线盘绕并浸没在水中。声波探头位于该盘管的中心，并且该探头在40％振幅下是活性的，同时MNP流动通过管。这种盘管/超声破碎器设置用于线内超声处理的目的。继三通之后是线内七端口PEEK歧管混合器，该混合器将该流分成六个通道。这些通道中的每一个通入第二歧管，在该第二歧管中它们与单个输出重新组合。最后，在第二歧管后放置另一段管以能够收集BNC。
固定。将游离CAN储备液(250μg/mL)调节至pH 6，并将5mL1250μg/mL MNP储备液以40％振幅超声处理1分钟，使用水浴平衡至室温，然后将其pH调节至11。将游离CAN(2mL)负载到酶泵注射器中，并将等体积的MNP负载到MNP泵中。使用注射泵ProV1泵控制软件同时启动两个泵，每个泵设定在30mL/分钟下以获得60mL/分钟的有效流速。通过向1mL CAN储备液中加入1mL超声处理的MNP储备液、然后移液混合10次来制备手动组装的CAN BNC。通过将1mL自动组装或手动组装的BMC添加到62.5μL 20mg/mL磁铁矿粉末并移液混合10次来制备CAN BMC。将这些BMC在旋转器上轻轻混合1小时，然后磁性地沉淀。保存其上清液以用于定量固定的ωTA。这些BMC分别被称为自动化BMC和手动BMC。
碳酸酐酶活性测定：CAN可逆地催化碳酸的脱水：
标准碳酸酐酶活性测定是威尔伯-安德森(Wilbur-Anderson)方法。威尔伯和安德森，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)176:147–154(1948)。测量缓冲的CO2饱和溶液从8.3至6.3的pH降低速率。这是通过由二氧化碳形成碳酸氢盐引起的。如辛格尔斯(Shingles)和莫罗尼(Moroney)，分析生物化学(Analytical Biochemistry)252(1)190–197(1997)所描述，使用另一种基于荧光pH的测定。简言之，将荧光黄用作荧光pH指示剂。这种pH增加是由于碳酸氢盐脱水所致，由荧光强度的增加所反映。通过混合等体积的试剂A和试剂B来开始反应。用样品注入系统将试剂A添加至微板中的试剂B，并且立即开始荧光读取。由于高反应速度，所有样品读数一次进行一个孔，一式三份。使用具有512nm发射波长的pH敏感性(Fs)和不敏感性(Fis)激发波长(分别为466nm和413nm)测量荧光。使用包括在每个板上的缓冲标准品(pH 6-10)的Fs/Fis对pH的线性校准曲线来将荧光强度转换为pH。辛格尔斯和麦卡蒂，植物生理学(Plant Physiol.)106(2):731–737(1994)。一个单位(U)的CAN活性被定义为在上述条件下的测量的前10秒期间每秒的pH变化。
蛋白质定量。将BMC磁性地沉淀，并使用布拉得福方法测定上清液中的蛋白质含量，包括线性CAN标准曲线(R2>0.99)，2.5-10μg/mL。
结果
对照显示不存在未催化的pH变化。将CAN BNC自动地和手动地固定在磁铁矿粉末(50-100nm)支架上，各自具有95％固定产率，获得BMC上9％的有效负载量(表15)。碳酸酐酶杂化支架和磁铁矿粉末BMC的活性也相对于游离碳酸酐酶在很大程度上保留(>95％)
实例13：用于生物催化的在磁性载体上的过氧化氢酶固定
使用自动化BNC组装系统以30％负载量制备含有过氧化氢酶(MW＝240kDa)和磁铁矿纳米颗粒的BNC，然后将这些BNC模板化到细磁铁矿粉末(50-100nm)支架上，从而产生具有0.83％总体负载量的BMC。优化的固定条件产生相对于游离酶>99％的保留活性。
材料和设备。牛肝过氧化氢酶(CAT)购自西格玛(圣路易斯，密苏里州，美国)。过氧化氢、盐酸、氢氧化钠、以及磷酸盐缓冲盐是来自万安精细化学品(中央山谷，宾夕法尼亚州，美国)。快速启动TM布拉得福蛋白质测定购自伯乐(Bio-Rad)(赫拉克勒斯(Hercules)，加利福利亚州(CA)，美国)。用通过BarnsteadTM NanopureTM纯化的18.2MΩ-cm水制备储备溶液。使用以Gen5TM软件操作的Biotek EpochTM板读取器在CostarTM 3635UV可透过微板中一式三份测量吸光度。具有1/8”探头的超声破碎器(FB-505)购自(沃尔瑟姆，马萨诸塞州)。自动化BNC组装器使用新时代泵系统公司(New Era Pump Systems Inc.)(法明代尔(Farmingdale)，纽约州(NY))的两个连接的NE-1000注射泵。都具有0.04内径和0.125外径的不锈钢管、混合不锈钢三通和两个PEEK七端口径向歧管、连同必要的PEEK或不锈钢接头都购自麦克马斯特-卡尔(克利夫兰，俄亥俄州)。
试剂。将冻干的CAT溶解于水中并使用布拉得福方法用牛血清白蛋白标准品进行定量。将所有储备溶液都保持在冰上。就在测定中使用之前制备稀释液，并使这些稀释液平衡至室温(21℃)。
自动化BNC组装。使用连续流系统来制备BNC。该系统包括两个注射泵，各自具有充当游离酶或超声处理的纳米颗粒的储器的60mL注射器。酶和MNP流动通过内径为0.04英寸的不锈钢管并在不锈钢混合三通中相遇。在该三通前，将MNP线盘绕并浸没在水中。声波探头位于该盘管的中心，并且该探头在40％振幅下是活性的，同时MNP流动通过管。这种盘管/超声破碎器设置用于线内超声处理的目的。继三通之后是线内七端口PEEK歧管混合器，该混合器将该流分成六个通道。这些通道中的每一个通入第二歧管，在该第二歧管中它们与单个输出重新组合。最后，在第二歧管后放置另一段管以能够收集BNC。
固定。将游离CAT储备液(300μg/mL)调节至pH 7，并将5mL1000μg/mL MNP储备液以40％振幅超声处理1分钟，使用水浴平衡至室温，然后将其pH调节至3。将游离CAT(2mL)负载到酶泵注射器中，并将等体积的MNP负载到MNP泵中。使用注射泵ProV1泵控制软件同时启动两个泵，每个泵设定在30mL/分钟下以获得60mL/分钟的有效流速。通过向1mL CAT储备液中加入1mL超声处理的MNP储备液、然后移液混合10次来制备手动组装的CAT BNC。通过将1mL自动组装或手动组装的BMC添加到725μL 20mg/mL磁铁矿粉末(50-100nm)并移液混合10次来制备CAT BMC。将这些BMC在旋转器上轻轻混合1小时，然后磁性地沉淀。保存其上清液以用于定量固定的CAT。这些BMC分别被称为自动化BMC和手动BMC。
过氧化氢酶活性测定。CAT催化过氧化氢降解成水和氧。由于过氧化物的减少，由240nm处吸光度的降低来测量酶活性，李(Li)和舍尔霍尔恩(Schellhorn)，生物分子技术杂志(J.Biomolecular Techniques)18(4):185–187(2007)。CAT反应在2mL微量离心管中在21℃下运行2分钟，使用含有100mM pH 7.0磷酸盐缓冲盐水(PBS)和5nM过氧化氢酶的1mL总反应体积。将固定的CAT磁性地沉淀，并读取其上清液的吸光度。使用含有10-100mM H2O2(R2>0.99)的线性标准曲线对过氧化氢进行定量。一个单位(U)的过氧化氢酶活性被定义为在21℃下在50mM PBS(pH 7.0)中每分钟降解的1μmol H2O2。
蛋白质定量。将BMC磁性地沉淀，并使用布拉得福方法测定上清液中的蛋白质含量，包括线性CAT标准曲线(R2>0.99)。
结果
对照显示不存在未催化的H2O2降解。将自动制备的CAT BNC固定在磁铁矿粉末(50-100nm)支架上，具有79％固定产率，获得在BMC上0.79％的有效负载(表15)。将手动制备的CAT BNC固定在相同类型的支架上，具有70％固定产率和0.7％的有效负载量。相对于游离过氧化氢酶，CAT BMC的活性在很大程度上保留，对于自动化BMC和手动BMC分别有96％和78％残余活性
实例14：用于生物催化的在磁性载体上的葡萄糖异构酶固定
来自杜邦(DuPont)公司的Gensweet(TM)是可溶性GIS。使用果糖至葡萄糖的转化来评定其活性。使用自动化BNC组装系统以80％负载量制备含有葡萄糖异构酶(MW＝173kDa)和磁铁矿纳米颗粒的BNC，然后将这些BNC模板化到细磁铁矿粉末(50-100nm)支架上，从而产生具有8.1％总体负载量的BMC。优化的固定条件产生相对于游离酶>121％的保留活性。
材料和设备。可溶性葡萄糖异构酶(GIS)Gensweet(TM)由杜邦公司(锡达拉皮兹市(Cedar Rapids)，艾奥瓦州(IA))提供。来自辣根的辣根过氧化物酶(HRP)、来自黑曲霉的葡萄糖氧化酶(GOX)、苯酚、4-氨基安替比林(4-AAP)、50-100nm磁铁矿粉、D-(+)-果糖、以及D-(+)-葡萄糖购自西格玛(圣路易斯，密苏里州，美国)。硫酸镁、盐酸、氢氧化钠、以及磷酸盐缓冲盐来自万安精细化学品(中央山谷，宾夕法尼亚州，美国)。。快速启动TM布拉得福蛋白质测定购自伯乐(Bio-Rad)(赫拉克勒斯(Hercules)，加利福利亚州(CA)，美国)。磁铁矿纳米颗粒在ZYMtronix催化系统(伊萨卡(Ithaca)，纽约州，美国)(PCT1和2)中内部合成，如先前所描述。用通过BarnsteadTM NanopureTM纯化的18.2MΩ-cm水制备储备溶液。使用以Gen5TM软件操作的Biotek EpochTM板读取器在CostarTM 3635UV可透过微板中一式三份测量吸光度。具有1/8英寸探头的超声破碎器(FB-505)购自(沃尔瑟姆(Waltham)，马萨诸塞州(MA))。自动化BNC组装器使用新时代泵系统公司(New Era Pump Systems Inc.)(法明代尔(Farmingdale)，纽约州(NY))的两个连接的NE-1000注射泵。不锈钢管、混合不锈钢三通和两个PEEK七端口径向歧管都具有0.04内径和0.125外径。PEEK或不锈钢接头购自麦克马斯特-卡尔(克利夫兰，俄亥俄州。
试剂。用容量瓶定量制备果糖储备溶液(5M)。制备苯酚(10mM)、4-氨基安替比林(4-AAP，10mM)、pH 7.4PBS(500mM)、葡萄糖(100mM)、以及硫酸镁(1M)并在4℃下储存。在使用前将试剂平衡至室温(21℃)。GIS储备液是呈溶液形式，而HRP和GOX溶液是由冻干粉末制备的。
葡萄糖异构酶反应和活性测定。使用葡萄糖报道反应确定GIS异构酶活性。初级反应(GIS催化的果糖异构化为葡萄糖)在2mL微量离心管中以含有390mM果糖、50mM pH7.8PBS和1.27-1.45μM GIS的1mL反应体积在65℃下运行。该反应运行30分钟，在旋转器上轻轻混合，并用50μL 0.1M HCl终止。将GIS BMC磁性地沉淀。
第二报道反应用于将葡萄糖浓度与由苯酚自由基和4-AAP的络合形成的比色指示剂相互关联，其中形成由HRP氧化活性催化的苯酚自由基。简言之，以含有0.25mM苯酚、0.25mM 4-AAP、50mM pH 7.4PBS、30nM HRP、30nM GOX和25μL的来自初级反应的稀释100倍的上清液的250μL总体积在室温下在微板中进行该报道反应。该报道反应被允许运行30分钟。使用25μL葡萄糖标准品(0.125-1.25mM)代替稀释的初级反应上清液，由由于染料形成所致的吸光度对葡萄糖浓度的线性回归(R2>0.99)来计算葡萄糖浓度。一个单位的GIS活性被定义为在65℃下孵育30分钟，每分钟1μmol果糖至葡萄糖异构化。
蛋白质定量。将BMC磁性地沉淀，并使用布拉得福方法测定上清液中的蛋白质含量，包括线性GIS标准曲线(R2>0.99)。
结果
对照显示在反应条件下没有形成可检测到的未催化的葡萄糖。将自动制备的GISBNC固定在磁铁矿粉末(50-100nm)支架上，在BMC上具有8.1％的有效负载量(表15)。将手动制备的GIS BNC固定在相同的支架上，具有9.6％的有效负载量。相对于具有65％残余活性的游离GIS，手动固定的GIS BMC的活性降低。自动固定的GIS BMC显示活性增加，具有121％残余活性
实例15：用于生物催化的在磁性载体上的谷氨酰胺合成酶固定
使用自动化BNC组装系统以16％负载量制备含有谷氨酰胺合成酶(MW＝588kDa)和磁铁矿纳米颗粒的BNC。然后将BNC模板化到细磁铁矿粉末(50-100nm)支架上，从而产生具有1％总体负载量的BMC。优化的固定条件产生相对于游离酶>99％的保留活性。
材料和设备。来自大肠杆菌的谷氨酰胺合成酶(GluS)、50-100nm磁铁矿粉末、谷氨酸单钠、5'-三磷酸腺苷(ATP)、磷酸(烯醇)丙酮酸(PEP)、β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠水合物(NADH)、以及来自兔肌肉的丙酮酸激酶/乳酸脱氢酶(PK/LDH)购自西格玛(圣路易斯，密苏里州，美国)。氯化镁、氯化钾、氯化铵、盐酸、氢氧化钠、以及磷酸盐缓冲盐来自万安精细化学品(中央山谷，宾夕法尼亚州，美国)。快速启动TM布拉得福蛋白质测定购自伯乐(Bio-Rad)(赫拉克勒斯(Hercules)，加利福利亚州(CA)，美国)。如先前在WO2012122437和WO2014055853中所描述来合成磁铁矿纳米颗粒和磁性大孔，这些专利通过引用以其全部内容结合在此。用通过BarnsteadTM NanopureTM纯化的18.2MΩ-cm水制备储备溶液。使用以Gen5TM软件操作的Biotek EpochTM板读取器在CostarTM 3635UV可透过微板中一式三份测量吸光度。具有1/8英寸探头的超声破碎器(FB-505)购自 (沃尔瑟姆，马萨诸塞州)。自动化BNC组装器使用新时代泵系统公司(New Era Pump Systems Inc.)(法明代尔(Farmingdale)，纽约州(NY))的两个连接的NE-1000注射泵。都具有0.04内径和0.125外径的不锈钢管、混合不锈钢三通和两个PEEK七端口径向歧管、连同必要的PEEK或不锈钢接头都购自麦克马斯特-卡尔(McMaster-Carr)(克利夫兰(Cleveland)，俄亥俄州(OH))。
试剂。制备磷酸盐缓冲盐水(pH 7.1PBS，250mM)、谷氨酸盐(3M)、ATP(90mM)、PEP(50mM)、氯化镁(1M)、氯化钾(500mM)、氯化铵(1M)、NADH(50mM)、以及PK/LDH(6000/900PK/LDH活性单位(U))，其中一个单位PK在37℃下在pH 7.6下每分钟将1μmol PEP转化成丙酮酸酯，并且一个单位的LDH在37℃下在pH 7.5下每分钟将1μmol丙酮酸酯转化成L-乳酸)储备液并在4℃下储存。在使用前将试剂平衡至室温(21℃)。GluS储备液由冻干粉末制备。
固定。将游离GluS储备液(200μg/mL)调节至pH 7.1，并将5mL的1.25mg/mL MNP储备液以40％振幅超声处理1分钟，使用水浴平衡至室温，然后将其pH调节至3。将游离GluS(2mL)负载到酶泵注射器中，并将等体积的MNP负载到MNP泵中。使用注射泵ProV1泵控制软件同时启动两个泵，每个泵设定在30mL/分钟下以获得60mL/分钟的有效流速。通过向1mLGluS储备液中加入1mL超声处理的MNP储备液、然后移液混合10次来制备手动组装的GluSBNC。通过将1mL自动组装或手动组装的BMC添加到438μL 20mg/mL磁铁矿粉末(50-100nm)并移液混合10次来制备GluS BMC。将这些BMC在旋转器上轻轻混合1小时，然后磁性地沉淀。保存其上清液以用于定量固定的GluS。这些BMC分别被称为自动化BMC和手动BMC。
谷氨酰胺合成酶反应和活性测定。使用腺苷5'-二磷酸(ADP)报道反应来测定GluS活性。由ATP活化的GluS催化由谷氨酸盐和铵合成L-谷氨酰胺。该反应也产生了ADP和磷酸酯。ATP在将PEP转化成丙酮酸酯的PK催化反应中再生。最后，用NADH作为辅因子将丙酮酸通过LDH转化成L-乳酸酯，从而产生NAD。由于NADH浓度的降低，通过340nm处的吸光度降低来监测反应进程。该反应在37℃下在2mL微量离心管中以含有30mM PBS pH7.1、100mM谷氨酸盐、10mM ATP、1mM PEP、60mM MgCl2、20mM KCl、40mM NH4Cl、300μM NADH、8/120U PK/LDH、81.7nM GluS的1mL反应体积进行。该反应运行60分钟，在旋转器上轻轻混合，并用50μL0.1M HCl终止。将GluS BMC磁性地沉淀。通过NADH标准品(3-300μM)的吸光度对浓度的线性回归(R2>0.99)来计算NADH浓度。将NADH消耗与L-谷氨酰胺的形成化学计量上相关。一个单位的GluS活性被定义为在37℃下孵育60分钟，每分钟合成的1μmol的L-谷氨酰胺。
蛋白质定量。将BMC磁性地沉淀，并使用布拉得福方法测定上清液中的蛋白质含量，包括线性GluS标准曲线(R2>0.99)。
结果
对照显示在反应条件下没有形成可检测到的未催化的葡萄糖。将自动制备的GluSBNC固定在磁铁矿粉末(50-100nm)支架上，在BMC上具有1％的有效负载量(表15)。将手动制备的GluS BNC固定在相同类型的支架上，具有0.94％的有效负载量。手动和自动固定的GluS BMC的活性与游离酶的活性相当(>99％)。
实例16：磁性载体上的辣根过氧化物酶固定
用40％标称负载量制备含辣根过氧化物酶(MW＝44kDa)和磁铁矿纳米颗粒的BNC，然后模板化到纯磁铁矿粉末(50-100nm)上，从而形成具有约5.6％有效负载量的BMC。对于苯酚的氧化，优化的固定条件产生相对于游离酶，活性的三倍增加。
材料和设备。来自辣根的根部的辣根过氧化物酶(HRP)、苯酚和4-氨基安替比林(4-AAP)购自西格玛(圣路易斯，密苏里州，美国)。过氧化氢、盐酸、氢氧化钠、以及磷酸盐缓冲盐是来自万安精细化学品(中央山谷，宾夕法尼亚州，美国)。快速启动TM布拉得福蛋白质测定购自伯乐(Bio-Rad)(赫拉克勒斯(Hercules)，加利福利亚州(CA)，美国)。如先前在WO2012122437和WO2014055853中所描述来合成磁铁矿纳米颗粒，这些专利通过引用以其全部内容结合在此。用通过BarnsteadTM NanopureTM纯化的18.2MΩ-cm水制备储备溶液。使用以Gen5TM软件操作的Biotek EpochTM板读取器在CostarTM 3635UV可透过微板中一式三份测量吸光度。具有1/8”英寸探头的超声破碎器(FB-505)购自(沃尔瑟姆，马萨诸塞州)。自动化BNC组装器使用新时代泵系统公司(New Era Pump Systems Inc.)(法明代尔(Farmingdale)，纽约州(NY))的两个连接的NE-1000注射泵。都具有0.04内径和0.125外径的不锈钢管、不锈钢混合三通和两个PEEK七端口径向歧管、连同必要的PEEK或不锈钢接头都购自麦克马斯特-卡尔(克利夫兰，俄亥俄州)。
试剂。将冻干的HRP溶解于水中以形成储备溶液。在使用前立即制备新鲜的HRP试剂：在水中的500mM磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲液(pH 7.4)、10mM苯酚和10mM 4-AAP。将该溶液储存在4℃下并保持在黑暗中直到即将使用之前，此时将其平衡至室温。
固定。将游离HRP储备液(500μg/mL)调节至pH 6，并将5mL 1.25mg/mL MNP储备液以40％振幅超声处理1分钟，使用水浴平衡至室温，然后将其pH调节至11。将游离HRP(2mL)负载到酶泵注射器中，并将等体积的MNP负载到MNP泵中。使用注射泵ProV1泵控制软件同时启动两个泵，每个泵设定在30mL/分钟下以获得60mL/分钟的有效流速。使用10、20和40mL/分钟的有效流速进行另外的固定。通过向1mL HRP储备液中加入1mL超声处理的MNP储备液、然后移液混合10次来制备手动组装的HRP BNC。通过将1mL自动组装或手动组装的BMC添加到31.3μL 20mg/mL磁铁矿粉末(50-100nm)并移液混合10次来制备HRP BMC。将这些BMC在旋转器上轻轻混合1小时，然后磁性地沉淀。保存它们的上清液以用于定量固定的HRP。这些BMC分别被称为自动化BMC和手动BMC。
辣根过氧化物酶活性测定。HRP不可逆地催化苯酚氧化成苯酚自由基。经由形成由苯酚自由基和4-AAP组成的有色复合物来监测苯酚氧化。所得产物是在λ＝500nm处具有显著吸光度的明亮的粉红色醌亚胺染料。标准辣根活性测定-爱默生-特林德(Emerson-Trinder)方法的生物催化形式将由于所形成的酚类染料产物所致的在λ＝500nm处的吸光度增加速率与酶活性相关联。乌卡施(Wukasch)等人，第48届普渡大学工业废弃物会议论文集，423-430(1993)。用于固定的和游离HRP两者的HRP分批反应在2mL离心管中在21℃下运行30分钟，使用含有50mM pH 7.4磷酸盐缓冲盐水(PBS)、0.25mM苯酚、0.25mM 4-AAP、15nMHRP、以及初始开始反应的1mM H2O2的1mL总反应体积。将这些分批反应轻轻搅动。将固定的酶磁性地沉淀。在微板中读取上清液的吸光度，每个样品使用250μL的三份重复。还制备了含有相应量的游离酶的空白以减去背景吸光度。使用500nm处的消光系数(12mM-1cm-1)对产物染料进行定量。一个单位(U)的HRP活性被定义为在21℃下在50mM PBS(pH 7.4)中每分钟产生的1mmol醌亚胺染料。
蛋白质定量。将BMC磁性地沉淀，并使用布拉得福方法测定上清液中的蛋白质含量，包括线性HRP标准曲线(R2>0.99)。
结果。对照显示不存在未催化的染料形成。将HRP BNC模板化在磁铁矿粉末(50-100nm)支架上。所得到的BMC对于手动和自动固定的HRP BMC两者均具有约5.6％的有效负载量(表15)。然而，活性随着流速而变化。在自动固定过程中，相对于游离酶对比流速的活性是如下：10mL/分钟具有100％活性，20mL/分钟具有120％活性，40mL/分钟具有160％活性，并且60mL/分钟具有320％活性，如手动固定的BMC一样。这种活性的提高与BNC中的先前HRP固定一致(图6)。
在此披露或提及的所有公开和专利文件都通过引用以其全部内容结合。已经仅出于说明和描述的目的呈现了前述描述。该描述不旨在将本发明限制为所披露的精确形式。旨在本发明的范围将由随附的权利要求书限定。

Claims (47)

1.一种用于自动化生产生物纳米催化剂(BNC)的机器，该机器包括：
a.酶容器；
b.磁性纳米颗粒(MNP)容器；
c.酶泵；
d.MNP泵；
e.MNP破碎机；以及
f.BNC混合器；
其中所述酶容器可操作来容纳酶制剂；其中所述酶制剂催化可扩散底物转化成可扩散产物；其中所述MNP容器可操作来容纳MNP制剂；其中所述MNP泵可操作来将所述MNP制剂送至所述MNP破碎机；其中所述MNP泵可操作来将来自所述MNP破碎机的多个破碎的MNP送至所述BNC混合器；其中所述酶泵可操作来将酶制剂送至所述BNC混合器；其中所述混合器可操作来混合所述破碎的MNP和酶制剂以形成所述BNC。
2.如权利要求1所述的机器，其中所述MNP破碎机是超声破碎器。
3.如权利要求2所述的机器，其中所述超声破碎器进一步包括超声破碎器盘管和超声处理容器，其中所述超声破碎器盘管可操作来对所述超声处理容器内的所述MNP进行超声处理。
4.如权利要求2所述的机器，其中该超声破碎器是线内超声破碎器。
5.如权利要求2至4中任一项所述的机器，该机器进一步包括可操作用于冷却所述超声破碎器的冷却系统。
6.如权利要求5所述的机器，其中所述冷却系统是水冷却系统。
7.如权利要求1所述的机器，其中所述MNP破碎机可操作来机械地破碎所述MNP。
8.如权利要求1所述的机器，其中所述MNP破碎机可操作来磁性地破碎所述MNP。
9.如权利要求1所述的机器，其中所述MNP破碎机可操作来热破碎所述MNP。
10.如权利要求1至9中任一项所述的机器，其中所述BNC混合器包括混合三通。
11.如权利要求1至10中任一项所述的机器，其中所述BNC混合器包括混合盘管。
12.如权利要求1至11中任一项所述的机器，其中所述酶泵经由机械力或重力将所述酶制剂送至所述BNC混合器。
13.如权利要求1至11中任一项所述的机器，其中所述MNP泵经由机械力或重力将所述MNP制剂送至所述MNP破碎机。
14.如权利要求1至13中任一项所述的机器，该机器进一步包括磁性支架容器，该磁性支架容器可操作用于将磁性支架制剂与所述支架容器中的所述BNC混合以产生呈级别2组装体的BNC。
15.如权利要求14所述的机器，其中所述磁性支架容器可操作来机械地混合所述BNC和所述支架。
16.如权利要求14所述的机器，其中所述磁性支架容器可操作来磁性地混合所述BNC和所述支架。
17.如权利要求14所述的机器，其中所述磁性级别2组装体是磁性微颗粒(MMP)。
18.如权利要求1至13中任一项所述的机器，该机器进一步包括用于将所述BNC组装成稳定级别2组装体的模板系统。
19.如权利要求18所述的机器，其中所述级别2组装体是磁性的。
20.一种生产BNC的方法，该方法包括使用如权利要求1-18中任一项的所述机器将所述MNP制剂与所述酶制剂组合，其中所述酶制剂包括选自下组的酶，该组由以下各项组成：水解酶、羟化酶、产生过氧化氢的酶(HPP)、腈水解酶、水合酶、异构酶、合成酶、脱氢酶、过氧化氢酶、转氨酶、烯还原酶(EREDS)、亚胺还原酶(IREDS)、氧化酶、氧化还原酶、过氧化物酶、醇腈酶、以及异构酶。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述BNC是以小于约1ml的体积生产的。
22.如权利要求20所述的方法，其中所述BNC是以在约1ml与10ml之间的体积生产的。
23.如权利要求20所述的方法，其中所述BNC是以在约10ml与100ml之间的体积生产的。
24.如权利要求20所述的方法，其中所述BNC是以在约100ml与1升之间的体积生产的。
25.如权利要求20所述的方法，其中所述BNC是以在约1升与10升之间的体积生产的。
26.如权利要求20所述的方法，其中所述BNC是以在约10升与100升之间的体积生产的。
27.如权利要求20所述的方法，其中所述BNC是以在约100升与1000升之间的体积生产的。
28.如权利要求20所述的方法，其中所述BNC是以在约1千升与10千升之间的体积生产的。
29.如权利要求20所述的方法，其中所述BNC是以在约10千升与20千升之间的体积生产的。
30.如权利要求20所述的方法，其中所述BNC是以在约20千升与50千升之间的体积生产的。
31.如权利要求20所述的方法，其中所述BNC是以大于约50千升的体积生产的。
32.如权利要求19至31中任一项所述的方法，该方法进一步包括将所述BNC模板化成稳定级别2组装体的步骤。
33.一种自组装的生物纳米催化剂(BNC)组合物，该组合物包含磁性纳米颗粒(MNP)和酶，该酶选自下组，该组由以下各项组成：水解酶、羟化酶、腈水解酶、水合酶、转氨酶、烯还原酶(EREDS)、亚胺还原酶(IREDS)、醇腈酶、以及异构酶；其中所述酶制剂催化可扩散底物转化成可扩散产物。
34.如权利要求33所述的BNC组合物，其中所述酶的浓度为约5-2,000μg/ml总溶液，并且所述MNP的浓度为约50-20,000μg/ml总溶液。
35.如权利要求34所述的BNC组合物，其中所述酶的浓度为约5-15,000μg/ml总溶液。
36.如权利要求35所述的BNC组合物，其中所述酶的浓度为约5-10,000μg/ml总溶液。
37.如权利要求36所述的BNC组合物，其中所述酶的浓度为约5-5,000μg/ml总溶液。
38.如权利要求34所述的BNC组合物，其中所述酶的浓度为约100-20,000μg/ml总溶液。
39.如权利要求38所述的BNC组合物，其中所述MNP的浓度为约500-20,000μg/ml总溶液。
40.如权利要求39所述的BNC组合物，其中所述MNP的浓度为约1000-20,000μg/ml总溶液。
41.如权利要求40所述的BNC组合物，其中所述MNP的浓度为约5000-20,000μg/ml总溶液。
42.如权利要求41所述的BNC组合物，其中所述MNP的浓度为约10,000-20,000μg/ml总溶液。
43.如权利要求34所述的BNC组合物，其中所述MNP的浓度为约5000-10,000μg/ml总溶液。
44.如权利要求33-46中任一项所述的BNC组合物，该组合物进一步包含稳定级别2组装体。
45.如权利要求44所述的BNC组合物，其中所述级别2组装体是磁性的。
46.如权利要求45所述的BNC组合物，其中所述磁性级别2组装体是磁性微颗粒(MMP)。
47.一种使用如权利要求33至46中任一项所述的BNC组合物的方法，该方法包括使所述BNC与所述可扩散底物接触并收集所述可扩散产物。
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