CN108139267A - Srs成像的动态锁定检测带宽 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种包括锁定放大器(300)的用于显微镜(20)的电路，其中，所述锁定放大器(300)包括输入信号(s)的输入端、参考信号(r)的输入端、输出信号(o)的输出端、和带宽滤波器设备(302)，其中，所述带宽滤波器设备(302)被适配为使得能够可变地设置低带宽频率值和/或高带宽频率值，其中，所述电路包括动态带宽控制器单元(500)，其中，所述显微镜(20)的当前设置的至少一个参数(P)被输入所述动态带宽控制器单元(500)，其中，所述动态带宽控制器单元(500)被适配为以所述显微镜(20)的当前设置的至少一个参数(P)的函数来控制所述锁定放大器(300)的低带宽频率值和/或高带宽频率值。

Description

SRS成像的动态锁定检测带宽
技术领域
本发明涉及用于显微镜的电路和具有这种电路的显微镜。根据本发明的主题优选地结合受激拉曼散射显微术(SRS)[1,2]并且为各种成像设置的最佳成像提供自动适应性锁定检测带宽(或时间常数)。
背景技术
最近，相干拉曼散射显微术(CRSM)在进行生物/制药/食品科学相关样本的化学成像方面获得了很多重要性和用途。与传统拉曼显微术相比，CRSM的优势在于成像速度更快。相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)、相干斯托克斯拉曼散射(CSRS)、拉曼诱导克尔效应散射(RIKES)和受激拉曼散射(SRS)构成各种CRSM技术。
CRSM技术包括两个脉冲(频率范围通常为1-100MHz)光场，脉冲宽度范围从100fs-20ps的不同波长通过共焦显微镜系统，并紧紧聚焦在感兴趣的样品上。光束路径和聚焦光学器件被制成使得两个光场在样品处空间和时间地叠加。对于SRS或外差RIKES成像，两个光束中的一个在样本中与其他光场相互作用之前以(典型地在kHz至MHz范围内的)特定频率Ω进行强度调制或者频率调制或者偏振调制。
对于SRS和RIKES成像，人们检测初始未调制的光束并使用锁定[1-2,5]或包络检测技术[6]，提取强度的调制并显示为图像。由于与样品的相互作用，在CARS和CSRS的情况下，第三个光场被检测并显示为图像[7-9]。在所有上述CRSM技术中，只有当入射场之间的频率差与样品中的振动谐振频率匹配时，信号才是强的。
在各种相干拉曼成像技术中，SRS成像由于其图像中没有非谐振背景而在近期得到普及。以下内容仅集中于SRS成像方法。但是，得出的结论直接适用于CRSM、CARS、CSRS和RIKES成像。只需使用合适的偏振元件、检测单元和光学滤波器来提取这些信号，这些都是已知的，并在现有文献中进行了描述。
典型的SRS显微镜系统20在图1中示出。两个脉冲激光源(激光器1和激光器2)分别产生用于SRS成像的所谓的“斯托克斯”和“泵浦”光束(参见图2，窗口100，其中示出强度随时间t的变化)。通常，在CRSM文献中，具有较小波长的激光源被指定为“泵浦”，以及具有较长波长的激光被指定为的“斯托克斯”光束。其中一个光束(激光1)在调制器3，例如AOM(声光调制器)或EOM(电光调制器)，的帮助下进行振幅调制，并且使用二向色镜4与第二激光源(激光器2)共线组合。调制器3由提供RF频率信号的RF驱动器9驱动。
借助于(优选可变的)光学延迟台5确保两个激光源的时间重叠。组合的光束行进通过扫描设备或激光扫描(共焦)显微镜6，并且与在显微镜物镜(未示出)的焦点处的被测试样品相互作用。在样品后面，激光器1的光束被阻挡滤波器11阻挡。
由于与样品的相互作用，激光器2的光获得微小的振幅调制，其频率对应于激光器1的光的调制频率(见图2，窗口200)。
当两束光束撞击样品时，激光器2的光会根据其(与激光器1的光的)相对波长而获得或失去能量。如果激光器2的波长小于激光器1的波长，即λ激光器2<λ激光器2，则存在强度损失ISRL，否则就存在增益ISRG。
借助于高灵敏度的检测器7和信号提取电子器件8检测激光器2中的这种微小增益或损失。后面的电子单元可以包括锁定放大器/混频器；使用RF驱动频率的调制器3作为本地振荡器来解调SRS信号。所产生的信号被路由用于图像显示、存储或分析10。
已经证明，使用合适的检测器和低噪声电子器件，可以使SRS成像对于实时成像(每秒25帧)足够灵敏[3]。
锁定放大器是提取调制SRS信号所需的检测电子器件的重要组成部分。尽管已经使用包络检测电子器件实施SRS检测[6]，但使用锁定检测可提供灵活的检测带宽(意味着不同的激光扫描频率)和更高的信号线性。
如图3所示，基本锁定放大器300包括电子混频器301，该电子混频器301将振幅调制信号s和参考时钟信号r作为其输入。它提供在由r提供的参考频率下的s的解调信号作为输出。另外，商用锁定放大器可以在输入端口和/或输出端口处提供一定量的信号放大303和滤波302。提取的信号o的频率带宽取决于混频器输出级的滤波器302的带宽设置BW。该带宽设置通常从十分之几Hz到几MHz(或者相当于几十秒到几纳秒)。
在SRS成像期间，人们通常改变各种图像采集参数以获得好的图像或者包括显微镜用户感兴趣的成像物体的一个部分/多个部分的图像。例如，由于拉曼信号在指纹区域中弱得多(500cm-1-1800cm-1)，因此需要增加像素驻留时间并执行慢扫描以获得好的SRS图像。可以根据成像要求改变的其他采集参数包括激光扫描/载物台扫描速度、物镜放大倍率、物镜数值孔径、图像扫描格式(像素大小)、图像扫描宽度(物理图像大小)、像素驻留时间、缩放等。改变这些值中的任何值都会导致调制信号的不同带宽。如果锁定时间常数是固定的，那么改变这些参数可能会降低图像质量。
因此，本发明的目的是提供锁定输出滤波器带宽的合适设置。优选地，对于任何给定的图像采集参数，可以获得与信噪比相关的好的图像。
发明内容
根据本发明，提出了用于显微镜的电路，特别是用于相干拉曼散射显微镜(CRSM)、相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)显微镜、相干斯托克斯拉曼散射(CSRS)显微镜、拉曼诱导的克尔效应散射(RIKES)显微镜、受激拉曼散射(SRS)显微镜或泵浦探针显微镜的电路，其包括锁定放大器，其中锁定放大器包括用于输入信号的输入端，用于参考信号的输入端、用于输出信号的输出端以及带宽滤波器设备，其中，带宽滤波器设备被适配为使得能够可变地设置低带宽频率值和/或高带宽频率值，其中，电路包括动态带宽控制器单元，其中，显微镜的当前设置的至少一个参数被输入所述动态带宽控制器单元，其中，动态带宽控制器单元被适配为以所述显微镜的当前设置的至少一个参数的函数来控制锁定放大器的低带宽频率值和/或高带宽频率值。本发明还提出了具有这种电路的特别是上述一种类型的显微镜(系统)。进一步有利的进展形成从属权利要求和后续描述的主题。
本发明提供这样的有益效果，即锁定放大器的带宽可以适配于当前设置，以使得获得最大的测量带宽频谱作为用于另外的信号和/或图像处理的输出信号。
本发明描述了一种用于实现例如具有自动适应性锁定检测带宽(或时间常数)的受激拉曼散射显微术(SRS)以用于各种成像设置的最佳成像。本发明的一个方面是提供一种装置和方法，其中，锁定带宽/时间常数被自动调节(增加或减少)以针对给定的一组图像采集参数提供高质量图像和/或最佳可能图像。所描述的装置可以直接应用于其他基于锁定的成像技术，如OHD-RIKES[2]和泵探针显微技术[4]。
有利地，显微镜的当前设置的至少一个参数是以下中的至少一个：像素驻留时间、激光扫描速度、载物台扫描速度、物镜的放大倍率、物镜的数值孔径、图像扫描格式或像素大小、图像扫描宽度或物理图像大小、以及缩放值。根据优选实施例，显微镜的当前设置的至少一个参数的函数是以下中的至少一个：与像素驻留时间成反比，与激光扫描速度成正比，与载物台扫描速度成正比，与物镜的放大倍率成反比，与物镜的数值孔径成正比，与图像扫描格式或像素大小成正比，与图像扫描宽度或物理图像大小成正比，以及与缩放值成反比。使用这些参数允许容易地将测量带宽适配至当前显微镜设置。
优选地，动态带宽控制器单元被适配为根据解调信号中的潜在最高时间频率来控制锁定放大器的低带宽频率值和/或高带宽频率值，即，将锁定放大器的低带宽频率值和/或高带宽频率值设置为依赖于潜在最高时间频率的值。优选地，该值等于潜在最高时间频率或者与潜在最高时间频率相差至多10％、20％、30％、40％或50％。因此，获得了合适的带宽频谱。
优选地，动态带宽控制器单元被适配为根据如下中至少之一控制所述锁定放大器的低带宽频率值和/或高带宽频率值：聚焦到物体上的光的波长λ，显微镜物镜的数值孔径NAMO，取决于显微镜光学器件的放大倍率的系统相关长度FSys，显微镜物镜的放大倍率MMO，表示显微镜的光束路径的附加(优选地能够可变地设置的)放大倍率的值Zoom，激光扫描的占空比fill，扫描频率f扫描。这允许精确地调节带宽。
根据优选实施例，动态带宽控制器单元包括控制电路功能，其根据显微镜的当前设置的至少一个参数来计算低带宽频率值和/或高带宽频率值，其中，在锁定放大器中设置所计算的低带宽频率值和/或高带宽频率值，并且进行至少一次图像采集以及分析所采集的信号的测量带宽频谱。
所述动态带宽控制器单元可以被形成为硬件和/或软件模块，特别地被形成为ASIC(专用集成电路)或被形成在FPGA(现场可编程门控阵列)或DSP(数字信号处理器)中。
根据说明书和附图，本发明的其它优点和实施例将变得显而易见。
应该注意的是，在不脱离本发明的范围的前提下，前面提到的特征以及将在下面进一步描述的特征不仅可以以分别指示的组合使用，而且可以以其他组合使用或单独使用。
附图说明
图1示出可用于本发明的SRS显微镜系统的优选实施例。
图2示出可用于本发明的SRS显微镜系统中的输入和输出激光束强度。
图3示出可用于本发明的锁定放大器的优选实施例。
图4示出可用于本发明的锁定放大器中的示例性信号。
图5示出根据本发明的锁定放大器和动态带宽控制器单元的优选实施例。
具体实施方式
在下文中，基于如图1至3所示的SRS显微镜系统示例性地描述本发明。
对于SRS成像，基于由于激光扫描或者载物台扫描而调制的SRS信号的带宽来选择正确的带宽是非常有利的；选择比信号带宽大得多的锁定输出滤波器带宽会产生噪声图像，另一方面，设置窄的滤波器带宽会产生模糊的图像。
首先，考虑激光扫描系统的情况。调制信号的带宽由辐照/激发激光束在物体上扫描的速度决定。如果w像素被定义为所采集的图像中的单个点或像素所表示的样品物体中的长度，则激光束在像素上的经过速度由下式给出：
其中，t像素是像素驻留时间。
像素宽度w像素由(a)物镜和(b)共焦扫描仪中的中继光学器件的放大倍率以及激光扫描的长度来确定，在典型的商业激光扫描显微镜系统中，激光扫描的长度由“Zoom”参数给出。
另一方面，像素驻留时间t像素由激光扫描的频率、单行中的像素数量以及扫描单行所用的时间确定。像素驻留时间可以表示为如下：
其中，fill是激光扫描的占空比(激光器开启用于成像/激发的单个扫描周期的因子)，
f扫描是扫描频率，以及
N像素是图像的单行中的像素数量。
像素大小由如下给出：
Fsys是系统相关长度，其取决于中继光学器件和扫描透镜/管透镜组合的放大倍率，
MMO是物镜的放大倍率，以及
Zoom是表示显微镜光束路径的附加(优选可变可设定的)放大倍率的值。
基于上述公式，激光光斑在像素上的经过速度由下式给出：
由于聚焦的光斑尺寸由艾里直径D艾里决定，所以由于激光光斑在样品上的扫描而产生的最大时间频率可以估算为：
其中，是艾里直径，λ是被聚焦到样品上的光的波长，以及
NAMO是物镜的数值孔径。
因此，解调信号中潜在的最高时间频率(例如，图2中的混频器301的输出)由下式给出：
因此，解调信号的频率组成取决于各种系统和扫描参数。如果这些参数中的任何一个改变，信号中的频率组成必然会改变。因此，输出低通滤波器应该具有足够宽的带宽以使f高通过；但它不能太宽，否则会产生噪声图像，噪声来自超过f高的频谱。
在典型的激光扫描实验中，人们希望改变“Zoom”因子以放大图像的某个部分，以更接近地显示特定区域。在商用显微镜系统中，这种缩放可能会高达64倍。类似地，在商用显微镜系统中，在所有其他参数恒定的情况下，扫描频率f扫描可以改变高达1200倍。这意味着f高可能会改变三个数量级。
图4示出了信号带宽对扫描参数的依赖性的代表性示例。图4是安捷伦频谱分析仪(型号E7401A)测量的频域信号的屏幕截图。线401对应于在检测器上没有光入射的基线噪声曲线。线402对应于在zoom参数设置为0.75时生成的信号。线403对应于zoom参数设置为1.0的信号。
用于生成这三条曲线的其余扫描参数为：
MMO＝20，NAMO＝0.75，f扫描＝600Hz以及N像素＝512。
人们可以清楚地注意到线402和403之间的区别；对于较大的缩放，激光会略微慢一些地穿越每个像素。因此，这导致较大缩放的信号带宽减小。当“zoom”增加时，具有固定带宽的低通滤波器会导致图像的信噪比变坏。相反，如果根据本发明的滤波器的带宽是可调谐的，则可以保持图像质量，而不管任何扫描/显微参数的变化。
因此，建议使用电路或软件模块或硬件/软件模块的组合，其考虑可能由显微镜的用户发起的扫描参数的变化，并且修改输出低通滤波器的带宽以使得最高的可能的信号频率通过，以用于进一步处理或显示或存储。
图5示出了本发明的概念的图形表示。在本发明的特定实施例中，使用了来自瑞士苏黎世的Zurich Instruments AG的商用锁定UHFLI以及软件模块500；后者确定扫描参数P，计算带宽值BW并将该值设置在锁定放大器单元300中。
可以对载物台扫描显微镜执行类似的分析，同时注意像素驻留时间t像素和像素宽度w像素分别由载物台扫描仪的速度和焦点的艾里直径给出。但上述基本思想仍然有效，并且可以很容易地应用于这种情况。
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Claims (10)

1.一种包括锁定放大器(300)的用于显微镜(20)的电路，其中，所述锁定放大器(300)包括：
输入信号(s)的输入端，
参考信号(r)的输入端，
输出信号(o)的输出端，以及
带宽滤波器设备(302)，
其中，所述带宽滤波器设备(302)被适配为使得能够可变地设置低带宽频率值和/或高带宽频率值，其中，所述电路包括动态带宽控制器单元(500)，其中，所述显微镜(20)的当前设置的至少一个参数(P)被输入所述动态带宽控制器单元(500)，其中，所述动态带宽控制器单元(500)被适配为以所述显微镜(20)的当前设置的所述至少一个参数(P)的函数来控制所述锁定放大器(300)的低带宽频率值和/或高带宽频率值。
2.根据权利要求1所述的电路，其中，所述显微镜(20)的当前设置的至少一个参数(P)是以下中的至少一个：
像素驻留时间，
激光扫描速度，
载物台扫描速度，
物镜的放大倍率，
物镜的数值孔径，
图像扫描格式或像素大小，
图像扫描宽度或物理图像大小，
缩放值。
3.根据权利要求2所述的电路，其中，所述显微镜(20)的当前设置的所述至少一个参数(P)的函数是以下中的至少一个：
与像素驻留时间成反比，
与激光扫描速度成正比，
与载物台扫描速度成正比，
与物镜的放大倍率成反比，
与物镜的数值孔径成正比，
与图像扫描格式或像素大小成正比，
与图像扫描宽度或物理图像大小成正比，
与缩放值成反比。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的电路，其中，所述动态带宽控制器单元(500)被适配为根据解调信号中潜在的最高时间频率来控制所述锁定放大器(300)的所述低带宽频率值和/或所述高带宽频率值。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的电路，其中，所述动态带宽控制器单元(500)被适配为根据如下中至少之一控制所述锁定放大器(300)的所述低带宽频率值和/或所述高带宽频率值：
聚焦到物体上的光的波长λ，
显微镜物镜的数值孔径NAMO，
取决于显微镜光学器件的放大倍率的系统相关长度FSys，
显微镜物镜的放大倍率MMO，
表示显微镜的光束路径的附加放大倍率的值Zoom，
激光扫描的占空比fill，
扫描频率f扫描。
6.根据权利要求5所述的电路，其中，所述动态带宽控制器单元(500)被适配为以作为如下中至少之一的函数来控制所述锁定放大器(300)的所述低带宽频率值和/或所述高带宽频率值：
与聚焦到物体上的光的波长λ成反比，
与显微镜物镜的数值孔径NAMO成正比，
与取决于显微镜光学器件的放大倍率的系统相关长度FSys成正比，
与显微镜物镜的放大倍率MMO成反比，
与表示显微镜的光束路径的附加放大倍率的值Zoom成反比，
与激光扫描的占空比fill成反比，
与扫描频率f扫描成正比。
7.根据权利要求4和5所述的电路，其中，所述解调信号中潜在的最高时间频率由如下公式给出：
8.根据权利要求1至7中任一项所述的电路，其中，所述动态带宽控制器单元(500)具有控制电路功能，所述控制电路功能根据所述显微镜的当前设置的所述至少一个参数(P)来计算所述低带宽频率值和/或所述高带宽频率值，其中，在所述锁定放大器(300)中设置所计算的低带宽频率值和/或高带宽频率值，并且进行至少一次图像采集，以及分析所采集的信号的测量带宽频谱。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的电路，其中，所述动态带宽控制器单元(500)被形成为硬件和/或软件模块。
10.一种显微镜(20)，包括根据权利要求1至9中任一项所述的电路。
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