CN108138110A - 模块流动池和测序方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及进行测序的模块流动池，具有模块流动池的装置，和使用模块流动池进行测序的方法，以及包括模块流动池的系统和试剂盒，其中期望少于全体测序能力。

Description

模块流动池和测序方法
【技术领域】
本发明涉及模块流动池，具有模块流动池的装置，和使用模块流动池进行测序的方法，以及包括模块流动池及其他组分的系统和试剂盒，其无限制地包括，试剂、混合物、数据处理步骤、算法、计算机可读介质、及计算机程序，这些用于使用，例如，由通过合成的测序、通过连接的测序及其他核酸测序方法获得的数据来测定核苷酸序列中的核酸的同一性。在一实施方式中，本发明提供用于更小测序工程(即以更小批对核酸进行测序)的方法和装置。
【背景技术】
在过去的25年，创建并登记到Genbank的DNA序列信息的量指数地增长。许多下一代测序技术使用通过合成的测序(SBS)形式，其中特别设计的核苷酸和DNA聚合酶被用于以受控制的方式读取DNA模板的序列。其他下一代测序技术可使用天然核苷酸和/或聚合酶或标记的寡核苷酸和连接酶而测定核酸序列。为了达到高通量，使用好几百万的该模板(各为单个或多个分子)，跨表面形成阵列，及独立地读取和记录它们的序列。期望实施高通量测序源于对于更快的处理和减少的成本的需求。但是，商业化的高通量系统尽管减少大规模测序(例如，100～200GB)的成本，却使得小规模测序(例如，10、20、25等GB)变得昂贵和不便利。因此，对于服务于一般科学家的实际日常测序工作的改良的核酸测序方法和装置有持续的需求。
【发明概述】
本发明涉及模块流动池，具有模块流动池的装置，和使用模块流动池进行测序的方法，以及包括模块流动池及其他组分的系统和试剂盒，其无限制地包括，试剂、混合物、数据处理步骤、算法、计算机可读介质、及计算机程序，这些用于使用，例如，由通过合成的测序、通过连接的测序及其他核酸测序方法获得的数据来测定核苷酸序列中的核酸的同一性。在一实施方式中，本发明提供用于更小测序工程(即以更小批对核酸进行测序)的方法和装置。所述概念可通过嵌套流动池或模块流动池实现。模块流动池允许期望少于全体测序能力的弹性的量的测序。
目前，最高度并行的商业化的测序仪无论什么规模的研究或需要有多少分离的样品都要求用户运行整个大流动池。这是由于采用单流动池或双流动池的当前设计，其中对于各流动池而言，全部试剂和洗涤在单个站发生，并用阀改变递送到流动池的试剂。这种缺乏弹性的做法有许多不利的结果。首先，这表示要耐受废弃物、及更小测序作业的更高成本，或等到许多更小测序作业可组合到更大的运行中。其次，这表示大的测序工程因它们更成本有效而会是有利的(例如，在核心设备)，导致具有更小工程的一般研究者被排除在外，或(最好是)被迫等待数天至数周以得到机会使用共享的机器。
在一实施方式中，本发明在测序系统中提供导致更大弹性的重要特征。就是说，想要运行相对小的测序研究(例如，10、20、25GB)的研究者无需等待数天至数周以“迎合”更大运行而也能进行该研究。由此，研究者可选择他们的工程规模和他们的试剂利用规模，因此导致更小运行更成本有效。例如，在一实施方式中，预填充的试剂盒(或者，另一试剂源)匹配流动池输出容量(无论25、50、75或100GB)，由此允许每GB固定的成本。
在一实施方式中，此弹性由模块流动池(即，具有多于一个测序用过道或通道的流动池)提供，各过道或通道在模块中处于活动状态或不活动状态。在一实施方式中，多个模块预组装在一起。本发明不旨在限制模块数；2、3、4、5、6、7、8、9和10个或更多模块可预组装在一起。在另一实施方式中，模块是可被导入流动池的室内的插入件，各插入件提供用于实施测序的过道或通道。在一实施方式中，这些插入件(优选地)是可移动的和可移除的。
可以该方式由各种方法制造处于非活动状态的过道或通道(“虚过道”)，所述方法包括但不限于，不对它们进行表面修饰，不向它们导入测序试剂，或通过阻断与测序试剂的任何相互作用(例如，用防止试剂到达过道的塞子)。处于活动状态的过道被表面修饰而含有测序用原材料，例如，附接的引物、模板或两者。各过道或通道可与其自身流体通道输入和输出连接，或它们可共享共同的输入和输出。
本发明不旨在限制过道或通道的尺寸。但是，宽度在1和5mm之间，长度在5和100mm之间；其中过道或通道具有优选在10～300μm之间，更优选在10和150μm之间的深度。所述尺寸可基于反应室的尺寸和期望的待成像面积而调整。例如，在一实施方式中，反应室或流动池的尺寸定为待成像面积小于标准显微镜载玻片的尺寸(即，小于75mm×25mm)，及优选显著地更小(例如，35mm×2.5mm，或更小)。
本发明也不旨在限制特定的试剂体积。但是，优选的是，各模块中的各过道或通道使用的试剂体积在1和100μl之间，更普遍地在10和40μl之间，且更优选大致20μl，以减少成本。此外，减小成像面积的量(允许更快的成像时间和欠昂贵的成像设备)。由此，不同于持续增大测序规模，本发明，在一实施方式中，采取了以更小批实施测序的方法。
这些变化也在基因组分析和诊断测试的情况中提供优势，包括但不限于，基因组中与疾病连锁的多态性区的测序。不同于在单个流动池中使用组合了多个受试者(包括但不限于人患者)的核酸的相对大的单阵列或芯片，在一实施方式中，本发明涵盖使用多个模块，其中各模块含有单个受试者(包括但不限于单个人患者)的核酸。以此方式，测序可相比更大的流动池系统而更快且更成本有效地完成。
【附图说明】
如上所述，本发明提供在单个流动池中使用相对大的单阵列或芯片的替代方案。所述概念可由嵌套流动池或模块流动池实现。图1A示意性地显示嵌套方案的一实施方式，其中小的流动池或阵列(A)嵌套进更大的流动池或阵列(B)，其又进一步嵌套进再更大的流动池或阵列(C)。用户选择采用哪个尺寸的流动池或阵列取决于测序运行或工程的尺寸，及接收试剂和被成像的面积。当然，可使用其他几何形状和另外的流动池(无论更大或更小)；图1A简单提供3个该流动池的一例。各流动池或阵列可具有不共享的专用的试剂输入。或者，如显示于图1A，小的流动池或阵列(A)具有输入导管(1)，更大的流动池或阵列(B)具有输入导管(2)，而最大的流动池或阵列(C)具有输入导管(3)，各来自共享的试剂源或贮器(4)，其中通过切换阀(5)或其他机构来达到试剂输入的控制。当然，可采用其他连接方案(例如，T-样连接器)。
图1B示意性地显示模块流动池概念的一实施方式。模块流动池概念提供弹性的输出。尽管最大输出可为100GB(“GB”)，更常见的或期望的输出范围将小于100GB，例如，10、20、25、50或75GB。实践中，将流动池以相等的增量“分割”是合理的，如25、50、75和100GB。所述概念可由嵌套流动池(如显示于图1A)或模块流动池(如显示于图1B)实现。在一实施方式中，模块流动池具有过道，其处于活动状态(表面经DNA，例如，引物、模板或两者修饰)或处于非活动状态(例如，虚位、其中无DNA，或虚位、其中有DNA，但无试剂流过)。在优选的实施方式中，流动池盒或其他试剂源具有调节改变的处于活动状态的(以白色显示于图1B)和虚的过道(以条纹显示于图1B)数的能力。图1B显示具有多至4个处于活动状态的过道(A、B、C、和D)的一实施方式；但是，处于活动状态的过道(例如，D)是模块，且可被虚的过道(条纹)插入件或适配体取代(见箭标)。再次，各种模块的过道或通道可共享单个试剂源(如显示于图1B)，其用切换阀(5)控制以提供通过与模块(A、B、C和D)连接的导管(1、2、3和4)的期望的试剂输入。另一方面，各过道可与个别的、专用的(未共享的)试剂输入连接。当然，可采用其他连接方案(例如，T-样连接器)。试剂流动可以许多方式实现，包括(但不限于)通过使用注射器泵(6、7、8和9)。
图1C示意性地显示具有少至一个处于活动状态的过道(A)的一实施方式，即，具有0、1、2和3个虚过道(条纹)的实施方式。在一实施方式中，预填充的试剂盒(或者，另一试剂源)匹配流动池输出容量(无论25、50、75或100GB)，由此允许每GB固定的成本。例如，当仅有一个处于活动状态的过道(25GB)时，减少试剂量(例如，至100GB所用的量的1/4)，以匹配一个过道的需求。
图2以2-维图示意性地显示模块流动池的单模块的一实施方式(侧视图)。在一实施方式中，模块包含具有表面的过道或通道。在一实施方式中，表面经，例如，一种或更多测序用的起始试剂(例如，表面上的斑中的附接的引物)修饰。表面也可经其他分子或生物分子，例如，锚定分子修饰。尽管斑显示在通道的顶表面，它们也可在下表面(或者在双表面)。在一些实施方式中，斑可含有珠，即，珠的表面经引物、模板或两者修饰。一般而言，在实现反应和/或洗涤的条件下，将生物分子(例如，引物、模板或两者)定位在流体通道内，使得缓冲剂溶液和测序试剂可导到表面。箭标表示流体流通的优选的方向，具有入口(输入)和出口(输出)，以及一种优选的密封方法(O-密封环)。使用流体管道连接将输入和输出口附接于流体系统的试剂源。任选地，各模块可具有热源，例如，筒形加热器。重要的是，各模块可附接于之前测序中的另一模块(或者在载体或支架中简单并排定位)，例如，预组装进模块流动池。
图3示意性地显示流体系统的一实施方式，其包含与流动池模块的一实施方式(包含侧入口和一个或更多任选的加热器)连通(经连到包含阀的歧管的管道或其他通道)的各种例证性试剂和缓冲剂贮器，其中所述阵列或芯片倒置，且出口在底部，由此允许流体通道至少部分由重力排空，从而可容易将废弃物收集到贮器中。流体系统递送产生各测序步骤需要的荧光信号需要的核酸、酶、缓冲剂等，然后递送需要的试剂，为下一循环而移除制备中的荧光信号。由检测器的测量在这2个步骤之间发生。测序，成像和分析在美国专利No.8,612,161(通过引用并入本文)中更详细地描述。在一实施方式中，个别模块或模块流动池包含成像用的透明部分或“窗”。
在另一实施方式中可使用加热器，其中在流动池的2个不同模块中发生不同处理。在此“分隔的流动池”概念中，一部分流动池(例如，一个或2个模块)被成像，而第二部分(例如，一个或2个模块)经历化学处理。提供热绝缘而使成像的部分和化学处理的部分具有独立的温度控制，例如，珀耳帖单元。
【发明详述】
在一实施方式中，本发明涵盖在装置中实施核苷酸合并，所述装置包括包含模块流动池的自动化的装置。涵盖包含生物分子的各种组合的溶液；在一实施方式中，该溶液可便利地存储在与模块流动池流体连通的贮器中。可实施一系列步骤而将这些溶液(及它们所含有的试剂)导入(例如，通过阀)反应室而实施所述反应。
由此，在一实施方式中，本发明涵盖将经标记的核苷酸合并入核酸的方法，其包括：(a)提供(i)模块流动池，其包含多个模块，各模块包含结合于(例如过道，流体通道，或过道或通道内的珠)表面的生物分子(例如，引物、核酸模板或两者)，所述多个模块共享输入和输出口，(ii)第一溶液，其包含聚合酶和多种核苷酸类似物，其中至少一种核苷酸类似物被独特标记物标记(其他核苷酸类似物可被标记或不被标记)，且各核苷酸含有封闭所述3'-OH基团的可移除的化学部分，(iii)第二溶液，其包含切割剂；(b)在由所述聚合酶合并第一核苷酸类似物的条件下，将所述第一溶液导入所述多个模块的至少一个模块(并且，任选地，不将所述第一溶液导入全部模块)；(c)检测合并的核苷酸类似物的标记物；及(d)在使封闭所述3'-OH基团的合并的核苷酸类似物的化学部分被所述切割剂移除的条件下，将所述第二溶液导入所述至少一个模块。在此方法的一实施方式中，各模块包含流体通道，且至少一个模块的流体通道被阻断，从而无溶液进入所述被阻断的流体通道。在一实施方式中，所述一个模块的流体通道被塞子阻断。
在一实施方式中，本发明涵盖将经标记的核苷酸合并入核酸的方法，其包括：(a)提供(i)模块流动池，其包含多个模块，各模块包含结合于流体通道的表面的生物分子(例如，引物、核酸模板或两者)，各流体通道具有分开的输入和输出口，(ii)第一溶液，其包含聚合酶和多种核苷酸类似物，其中至少一种核苷酸类似物被独特标记物标记(其他核苷酸可再被标记或不被标记)，且含有封闭所述3'-OH基团的可移除的化学部分，(iii)第二溶液，其包含切割剂；(b)在由所述聚合酶合并第一核苷酸类似物的条件下，将所述第一溶液导入所述多个模块的至少一个模块(并且，任选地，不将所述第一溶液导入全部模块)；(c)检测合并的核苷酸类似物的标记物；及(d)在使封闭所述3'-OH基团的合并的核苷酸类似物的化学部分被所述切割剂移除的条件下，将所述第二溶液导入所述至少一个模块。在此方法的一实施方式中，各模块包含流体通道，且至少一个模块的流体通道被阻断，从而无溶液进入所述被阻断的流体通道。在一实施方式中，所述一个模块的流体通道被塞子阻断。
在另一实施方式中，本发明涵盖将经标记的核苷酸合并入核酸的方法，其包括：(a)提供(i)模块流动池，其包含4个模块，其中至少一个(且至多3个)包含结合于流体通道的表面的生物分子(例如，引物、核酸模板或两者)；(ii)第一溶液，其包含聚合酶和多种核苷酸类似物，其中各核苷酸类似物被独特标记物标记，且含有封闭3'-OH基团的可移除的化学部分，(iii)第二溶液，其包含切割剂；(b)在由所述聚合酶合并第一核苷酸类似物的条件下，将所述第一溶液导入所述4个模块(或者，至少具有生物分子的一个)；(c)检测合并的核苷酸类似物的标记物；及(d)在使封闭所述3'-OH基团的合并的核苷酸类似物的化学部分被所述切割剂移除的条件下，将所述第二溶液导入所述至少一个模块。在此方法的一实施方式中，至少一个模块(且至多3个模块)在流体通道内不包含生物分子，即，通道缺乏测序用原材料(例如，引物、模板，或两者)，且无测序发生。
在再一实施方式中，本发明涵盖用于实施核酸测序用处理步骤的方法，其包括：(a)提供(i)模块流动池，其包含第一和第二模块，各模块包含流体通道，(ii)待测序的核酸，(iii)核酸测序试剂，及(iv)照相机；及(b)在当所述第一模块经历一个或更多反应步骤时，所述第二模块经所述照相机扫描和成像的条件下，向所述模块流动池的所述第一和第二模块导入所述待测序的核酸和所述核酸测序试剂。
在一实施方式中，本发明涵盖试剂盒，其包含模块流动池及其他组分，无限制地包括，试剂和试剂混合物。试剂盒与使用，例如，通过合成的测序、通过连接的测序及其他核酸测序方法来测定核苷酸序列中的核酸的同一性的自动化的装置一起使用。

Claims (10)

1.将经标记的核苷酸合并入核酸的方法，其包括：
(a)提供
(i)模块流动池，其包含多个模块，各模块包含结合于过道或流体通道的表面的生物分子，所述多个模块共享输入和输出口，
(ii)第一溶液，其包含聚合酶和多种核苷酸类似物，其中至少一种核苷酸类似物被独特标记物标记，且含有封闭3'-OH基团的可移除的化学部分，
(iii)第二溶液，其包含切割剂；
(b)在由所述聚合酶合并第一核苷酸类似物的条件下，将所述第一溶液导入所述多个模块的至少一个模块；
(c)检测合并的核苷酸类似物的标记物；及
(d)在使封闭所述3'-OH基团的合并的核苷酸类似物的化学部分被所述切割剂移除的条件下，将所述第二溶液导入所述至少一个模块。
2.权利要求1的方法，其中各模块包含流体通道，且一个模块的所述流体通道被阻断，从而无溶液进入所述被阻断的流体通道。
3.权利要求2的方法，其中所述一个模块的所述流体通道被塞子阻断。
4.权利要求1的方法，其中所述生物分子包含测序用引物。
5.将经标记的核苷酸合并入核酸的方法，其包括：
(a)提供
(i)模块流动池，其包含多个模块，各模块包含结合于流体通道的表面的生物分子，各流体通道具有分开的输入和输出口，
(ii)第一溶液，其包含聚合酶和多种核苷酸类似物，其中至少一种核苷酸类似物被独特标记物标记，且含有封闭3'-OH基团的可移除的化学部分，
(iii)第二溶液，其包含切割剂；
(b)在由所述聚合酶合并第一核苷酸类似物的条件下，将所述第一溶液导入所述多个模块的至少一个模块；
(c)检测合并的核苷酸类似物的标记物；及
(d)在使封闭所述3'-OH基团的合并的核苷酸类似物的化学部分被所述切割剂移除的条件下，将所述第二溶液导入所述至少一个模块。
6.权利要求5的方法，其中一个模块的所述流体通道被阻断，从而无溶液进入所述被阻断的流体通道。
7.权利要求6的方法，其中所述一个模块的所述流体通道被塞子阻断。
8.权利要求5的方法，其中所述生物分子包含引物。
9.将经标记的核苷酸合并入核酸的方法，其包括：
(a)提供
(i)模块流动池，其包含4个模块，其中至少一个包含结合于流体通道的表面的生物分子；
(ii)第一溶液，其包含聚合酶和多种核苷酸类似物，其中各核苷酸类似物被独特标记物标记，且含有封闭3'-OH基团的可移除的化学部分，
(iii)第二溶液，其包含切割剂；
(b)在由所述聚合酶合并第一核苷酸类似物的条件下，将所述第一溶液导入所述4个模块；
(c)检测合并的核苷酸类似物的标记物；及
(d)在使封闭所述3'-OH基团的合并的核苷酸类似物的化学部分被所述切割剂移除的条件下，将所述第二溶液导入所述至少一个模块。
10.权利要求9的方法，其中一个模块在流体通道内不包含生物分子，且在该通道内不发生测序。
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