CN108130370B - Psmb8及其抑制剂在制备治疗脂肪肝及其相关疾病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了PSMB8及其抑制剂在制备治疗脂肪肝及其相关疾病药物中的应用。通过分离C57BL/6野生型小鼠、PSMB8敲低的C57BL/6小鼠原代肝细胞，利用棕榈酸酯及油酸刺激诱导肝脏细胞脂质堆积模型研究PSMB8基因的功能。发现，当PSMB8表达下降时，PA+OA刺激诱导的原代肝细胞脂质聚集显著减少，即PSMB8基因能够促进脂肪肝及其相关疾病的发生发展；在高脂高胆固醇饮食（HFHC）诱导的WT小鼠脂肪肝疾病模型中，给以PR‑957可显著抑制HFHC诱导的体重增加、白脂增多及肝脏脂质堆积，抑制脂肪肝及相关疾病的发生发展。因此PSMB8为研制预防、缓解和/或治疗脂肪肝及相关疾病的药物提供靶标。

Description

PSMB8及其抑制剂在制备治疗脂肪肝及其相关疾病药物中的 应用

技术领域

本发明属于基因的功能与应用领域，特别涉及一种免疫蛋白酶体亚基 PSMB8作为药物靶标在筛选治疗脂肪肝药物中的应用，以及PSMB8的抑制剂在制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝及相关疾病的药物中的应用。

背景技术

脂肪肝是指由于各种原因引起的肝细胞内脂肪堆积过多的病变，是一种常见的临床现象。其临床表现轻者无症状，重者病情凶猛。一般而言，脂肪肝属可逆性疾病，早期诊断并及时治疗常可恢复正常。脂肪肝包括酒精性肝病和非酒精性脂肪性肝病，两者都是全球常见的慢性肝病。非酒精性脂肪性肝病是一种与胰岛素抵抗及遗传易感性密切相关的代谢应激性疾病。随着人们生活水平的不断提高，非酒精性脂肪肝患病率呈不断上升趋势。非酒精性脂肪肝性肝病不仅可导致转氨酶持续异常、失代偿期肝硬化、肝功能衰竭等严重肝病，也与心血管疾病、 2型糖尿病、代谢综合征的发生存在密切联系，严重威胁着人们的健康。因此，非酒精性脂肪性肝病的治疗越来越受到重视。

PSMB8是26S免疫蛋白酶体复合物的关键的β催化亚基之一，分子量是 30.354kDa，具有糜蛋白酶样的催化活性[1]。26S蛋白酶体由催化核心20S蛋白酶体和2个19S的帽子组成。20S蛋白酶体是由2条外环α链和2条内环β链相互堆积形成的桶状结构，每条链分别由7个α亚单位和β亚单位组成。外环无催化活性，内环是催化中心所在的位置，20S蛋白酶体对底物作用的特异性取决于β1、β2、β5亚单位N2末端苏氨酸(Thr)残基上肽键的剪切方式。与β1、β2 和β5亚单位相对应的蛋白酶活性分别为半胱天冬酶活性、胰蛋白酶活性、糜蛋白酶活性。20S蛋白酶体在IFN-γ[2]、TNF[3,4]、氧化应激[5]、炎症反应[6]和一氧化氮[7]等刺激诱导下，其β亚单位的β1、β2和β5可相应被psmb9(β1i)、 psmb10(β2i)和PSMB8(β5i)取代，组装成新的20S免疫蛋白酶体。免疫蛋白酶体的功能主要是抗原的呈递、降解氧化损害的蛋白和将前体蛋白加工成成熟的蛋白。研究认为PSMB8参与了多种自身免疫性疾病、脂代谢综合征、炎症性肠病、肝炎等疾病过程。目前针对蛋白酶体的抑制剂有多种，包括硼替佐米(Bortezomib)、卡啡佐咪(Carfilzomib)、马瑞佐咪(Marizomib)、黛蓝佐咪 (Delanzomib)、奥普若佐咪(Oprozomib)、艾沙佐米(Ixazomib)，其中硼替佐米和卡啡佐咪已获得FDA批准，应用于多发性骨髓瘤的临床治疗。而目前筛选出特异性抑制免疫蛋白酶体的抑制剂为PR-957、PR-924、UK-101、YU-102等。研究表明PR-957特异性针对PSMB8亚基，并且在小鼠胶原抗体诱导性关节炎 (CAIA)模型中PR-957可有效抑制炎症因子的产生、减轻细胞浸润，抑制抗原呈递，缓解实验性关节炎[6]。然而，到目前为止，尚未见报道发现PSMB8及其抑制剂在脂肪肝病中的作用。

参考文献

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发明内容

本发明的目的在于提供免疫蛋白酶体亚基PSMB8及其抑制剂在制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝及其相关疾病的药物中的应用。

上述目的是通过如下技术方案实现的：

本发明通过分离C57BL/6野生型(WT)小鼠、PSMB8敲低的C57BL/6 (PSMB8-KO)小鼠原代肝细胞，利用棕榈酸酯(PA)及油酸(OA)刺激诱导肝脏细胞脂质堆积模型研究PSMB8基因的功能。发现，当PSMB8表达下降时， PA+OA刺激诱导的原代肝细胞脂质聚集显著减少，即PSMB8基因能够促进脂肪肝及其相关疾病的发生发展。

本发明的实验研究还发现，在高脂高胆固醇饮食(HFHC)诱导的WT小鼠脂肪肝疾病模型中，给以PR-957可显著抑制HFHC诱导的体重增加、白脂增多及肝脏脂质堆积，抑制脂肪肝及相关疾病的发生发展。

在此基础上，本发明第一方面，提供PSMB8作为药物靶标在筛选预防、缓解和/或治疗脂肪肝及其相关疾病的药物中的应用。

本发明第二方面，提供PSMB8的抑制剂在制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝及其相关疾病药物中的应用。

优选的，所述PSMB8的抑制剂是抑制PSMB8蛋白质活性或蛋白质水平的抑制剂、或者抑制PSMB8的mRNA水平的抑制剂，其抑制活性是可逆的或不可逆的。

优选的，所述抑制PSMB8蛋白质活性或蛋白质水平的抑制剂包括PSMB8的抗体、抑制PSMB8蛋白质活性或蛋白质水平的蛋白质、多肽、酶、天然化合物、合成化合物、有机物、无机物；所述抑制PSMB8蛋白质活性或蛋白质水平的抑制剂是指可以结合PSMB8但在结合时不产生生物应答的物质，或者所述抑制剂可以阻断、抑制或减弱由激动剂介导的应答，并可与激动剂竞争结合PSMB8。

优选的，所述PSMB8的抑制剂是PR-957或其药学上可接受的盐、或其溶剂化物、或其代谢产物。

本文所用术语“药学上可接受的盐”是指药物活性化合物的衍生物，其中通过制备其酸式盐或碱式盐来修饰母体化合物。药学上可接受的盐的实例包括但不限于，碱性残基(如胺类)的无机酸盐或有机酸盐，酸性残基(如羧酸)的碱性盐或有机盐，等。药学上可接受的盐包括由诸如无毒性的无机或有机酸形成的母体化合物的常规无毒性的盐或季铵盐。例如，这些常规的无毒性盐包括那些源自无机酸的盐，如盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等；以及由有机酸制备的盐，如，乙酸、丙酸、琥珀酸、羟基乙酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、延胡索酸、甲磺酸、甲苯磺酸、水杨酸、对氨基苯磺酸等。

本发明的药学上可接受的盐可以通过常规的化学方法从含有碱性或酸性部分的母体化合物合成。通常，这种盐可以通过使这些化合物的游离酸或碱形式与化学计量的适当的碱或酸在水或有机溶剂或二者的混合物中反应制备。

优选的，所述PSMB8的抑制剂是PR-957及药学上可接受的辅料。

优选的，所述药学上可接受的辅料是制药领域中常用或已知的各种辅料，包括但不限于：稀释剂、粘合剂、抗氧化剂、pH调节剂、防腐剂、润滑剂、崩解剂等。

所述稀释剂例如：乳糖、淀粉、纤维素衍生物、无机钙盐、山梨醇等。所述粘合剂例如：淀粉、明胶、羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮等。所述抗氧化剂例如：维生素E、亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、丁羟基茴香醚等。所述pH调节剂例如：盐酸、氢氧化钠、柠檬酸、酒石酸、Tris、乙酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠等。所述防腐剂例如：对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、间甲酚、苯扎氯铵等。所述润滑剂例如：硬脂酸镁、微粉硅胶、滑石粉等。所述崩解剂例如：淀粉、甲基纤维素、黄原胶、交联羧甲基纤维素钠等。

优选的，所述PSMB8的抗体包括但不限于单克隆抗体、合成抗体、多克隆抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链Fv(scFv)(包括双特异性scFv)、单链抗体、Fab片段、F(ab')片段、二硫键连接的Fv(sdFv)和任何上述的表位结合片段。特别地，用于本发明的抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分。用于本发明的免疫球蛋白分子可以是免疫球蛋白分子的任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，IgG1、IgG2、 IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。优选地，抗体是人或人源化单克隆抗体。

如本文所用，“人”抗体包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体，并且包括从人免疫球蛋白文库或从由人基因表达抗体的小鼠或其它动物分离的抗体。

优选的，抑制PSMB8的mRNA水平的抑制剂可以是其反义核酸序列、siRNA、miRNA、shRNA、dsRNA，或者其它能够抑制PSMB8的mRNA水平的蛋白质、多肽、酶、化合物。

本发明药物的剂型可以是口服剂的形式，例如片剂、胶囊、丸剂、粉剂、颗粒剂、悬浮剂、糖浆剂等；也可以是注射给药的剂型，例如注射液、粉针剂等，通过静脉内、腹膜内、皮下或肌肉内的途径。所有使用的剂型形式都是药学领域普通技术人员所熟知的。

本发明的药物可施用于会发生或已经发脂肪肝及相关疾病的任何动物。这些动物包括人类和非人类的动物，例如宠物或牲畜等。

本发明的药物可以本领域已知的途径施用于受试者，包括但不限于口服，胃肠外，皮下，肌内，静脉内，腹腔内，肝内，心肌内，肾内，阴道，直肠，颊，舌下，鼻内，透皮方式等。

施用的剂量将取决于接受者的年龄、健康和体重，联用药物的种类，治疗频率，给药途径等。药物可以单一日剂量施用，或者总日剂量以每天两次，三次或四次的分开剂量施用。剂量可以施用一次或多次，施药时间可以单日至几个月或更长时间。

所述脂肪肝及相关疾病包括但不限于：胰岛素抵抗、代谢综合征、肥胖、糖尿病、高血糖、高血脂症、单纯性肝脏脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎，肝纤维化、肝硬化、肝癌等。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明发现PSMB8的新功能，即PSMB8具有恶化脂肪肝及相关疾病的作用。

(2)基于PSMB8在恶化脂肪肝及相关疾病中的功能，其为研制预防、缓解和/或治疗脂肪肝及相关疾病的药物提供靶标。

(3)PSMB8的抑制剂可用于制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝及相关疾病的药物。

(4)本发明发现PSMB8特异性抑制剂PR-957的新功能，其可用于制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝及相关疾病的药物。

附图说明

图1是WT和PSMB8-KO小鼠原代肝细胞经棕榈酸酯及油酸刺激不同时间后油红O染色结果。

图2是HFHC饲养的WT小鼠经腹腔注射PR-957以及对照组体重检测结果 (n.s.代表p>0.05；*代表0.01≤p<0.05)。

图3是HFHC饲养的WT小鼠经腹腔注射PR-957以及对照组白脂检测结果(** 代表p<0.01)。

图4是HFHC饲养的WT小鼠经腹腔注射PR-957以及对照组白脂体重比检测结果(**代表p<0.01)。

图5是HFHC饲养的WT小鼠经腹腔注射PR-957以及对照组肝脏PAS染色结果图。

图6是HFHC饲养的WT小鼠经腹腔注射PR-957以及对照组肝脏HE染色结果图。

图7是HFHC饲养的WT小鼠经腹腔注射PR-957以及对照组肝脏油红O染色结果图。

图8是HFHC饲养的WT小鼠经腹腔注射PR-957以及对照组肝脏PSR染色结果图。

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

以下实施例所用化学试剂都是常规试剂，均可商购获得。未做特殊说明的实验方法都是采用本领域已知的常规方法。

实验动物及培养

实验动物：选用8-10周龄、体重在24g-27g、背景为雄性C57BL/6品系的野生型(WT)小鼠(购自北京华阜康生物科技股份有限公司)及PSMB8基因敲除 (PSMB8-KO)小鼠(RIKEN，RBRC03950)为实验对象。

实验动物饲料配方：高脂高胆固醇饲料(HFHC)(42％脂肪；0.1％胆固醇)。

动物饲养及环境条件：所有的实验小鼠均饲养在武汉大学心血管病研究所 SPF级动物房(许可证号：SYXK(鄂)：2009-0053)。每12小时交替照明，温度24±2℃，湿度40％-70％，小鼠自由饮水进食。

PR-957：MedChem Express，货号960374-59-8，腹腔注射给药剂量：10mg/kg。

动物实验时，PR-957溶解于sodium citrate(10mM，pH 6.0，sigma，货号：E302600-SAMPLE-K)+sulfobutylether-β-cyclodextrin(10％，wt/vol，BoMei，货号：HS7169)中。

原代肝细胞的分离：

采用IV型胶原酶消化分离小鼠原代肝细胞。小鼠乙醚吸入麻醉，留置针穿刺门静脉，肝脏原位灌流(SC-1和SC-2轮流灌注)至肝脏消化完全，取下肝脏，反复吹打并过滤，收集肝细胞悬液。

原代肝细胞的培养：

①培养皿包被(以六孔板为例)

配适量的1×鼠尾胶(用灭菌的超纯水将无水乙醇稀释为30％乙醇后，0.22μm 滤器过滤，然后将100×的鼠尾胶稀释为1×)。在六孔板中每孔加入稀释后鼠尾胶 200μl，旋转六孔板，使胶铺满整个板底。开盖，在超净台吹风过夜。

②铺板

铺细胞之前，细胞板紫外照射30min。细胞用台盼蓝染色计数，进行细胞铺板，铺满为1×10⁶个(油红O染色实验需要细胞密度为50％)。细胞大约6～8h贴壁，铺板后2h换液。

油红O染色具体操作：

取出细胞观察细胞状态和细胞密度→吸出培养基，加PBS漂洗3次，洗净后尽量吸干PBS→4％多聚甲醛固定细胞，37℃，15min→固定结束后，吸弃甲醛溶液。加入PBS漂洗3次，每次3min，使用平动的摇床→准备60％异丙醇，异丙醇：PBS＝3:2→加入60％异丙醇作用30s→用PBS洗3次→超净台内吹干水分，水分完全干透后，皿底呈白色→准备油红O的工作液(Red Oil：PBS＝3:2配置。油红配置好后室温静置10min，然后用0.45μm滤器过滤，即可使用)→吹干后加工作液，染色过程中及时观察，达到要求后吸弃染色液→用PBS洗3次→加PBS浸润拍照观察。

小鼠空腹体重测定方法

1)禁食：上午8:00将待实验小鼠禁食(不禁水)，下午2:00即禁食6小时后开始实验操作。

2)称重：将测完血糖水平的小鼠放入置于电子秤上的称量小桶内以获取小鼠体重数据并做记录。

PAS染色：

将肝脏组织石蜡切片放入65℃烘箱(30min)→二甲苯中(5min×3次)→100％酒精(1min)→90％酒精(1min)→70％酒精(1min)→蒸馏水洗→高碘酸(10min)→自来水洗去切片上的浮色→雪夫试剂浸染(10-15min)→自来水洗数下→苏木素(1min)→蒸馏水洗去切片上的浮色→70％酒精一下→90％酒精一下→100％酒精(30秒×3次)→二甲苯(2min×3次)→在二甲苯未干时封片，拍照。

苏木精-伊红(H&E)染色：

主要步骤为：取石蜡标本切片55℃烘烤30min→二甲苯5min，3次→100％酒精1min→95％酒精1min→70％酒精1min→双蒸水1min→苏木素溶液(珠海贝索，BA-4021)5min→水洗1min→1％盐酸酒精(取3mL浓盐酸与297mL 70％酒精充分混合均匀)1-3s→水洗1min→Scott液(碳酸氢钠0.35g，七水硫酸镁2g，两者溶于100mL蒸馏水)1min→水洗1min→伊红溶液(珠海贝索，BA-4024) 3-5min→蒸馏水洗去浮色→70％酒精1s→95％酒精1s→100％酒精30s，3次→二甲苯2min，3次→趁二甲苯未干立即封片→通风橱内吹干，显微镜拍照。

天狼腥红(PSR)染色：

主要步骤为：取石蜡标本切片55℃烘烤30min→二甲苯2min，3次→100％酒精1min→95％酒精1min→70％酒精1min→流水冲洗10min→双蒸水1min→质量分数0.2％磷钼酸2min→0.1％天狼猩红苦味酸溶液滴于组织上，湿盒中染色90min→去除残液→0.01N盐酸4s→70％酒精1次→90％酒精1次→100％酒精 30s，3次→二甲苯2min，3次→趁二甲苯未干立即盖玻片封片，显微镜拍照。

冰冻切片油红O染色：

①将冰冻肝脏组织切片在通风橱中风干30min，4％多聚甲醛固定10min。置于双蒸水中稍洗10min，以除去组织表明的多聚甲醛。

②以60％异丙醇处理1min。

③用油红O(公司sigma，货号O0625，浓度0.5g/100mL 100％异丙醇)染色30min。

④之后以60％异丙醇漂洗1min×3次，直至背景干净。

⑤用Mayer’s苏木素染液(5滴)淡染细胞核。

⑥水漂洗，稀碳酸锂水溶液中促蓝，充分水洗，水洗至细胞核蓝化。

⑦用甘油明胶封片，拍照。

【实施例1】PSMB8敲除对小鼠原代肝细胞脂质堆积的影响。

将从WT小鼠和PSMB8-KO小鼠分别分离得到原代肝细胞各分为3组，即 WT原代肝细胞0h组、WT原代肝细胞12h组、WT原代肝细胞24h组、KO原代肝细胞0h组、KO原代肝细胞12h组、KO原代肝细胞24h组。待细胞贴壁，细胞密度为30％左右时，向12h组及24h组细胞中加入0.6mmol/l棕榈酸和1.2 mmol/l油酸进行联合刺激，向0h组加入同等体积的BSA作为对照。在刺激时间达到后，收集各组的细胞样品进行油红O染色，拍照观察脂滴积累情况。

油红O染色结果如图1所示，棕榈酸和油酸刺激后，KO组小鼠原代肝细胞脂肪滴的面积明显低于WT组。该结果说明PSMB8基因敲除可降低棕榈酸和油酸联合诱导产生的肝脏细胞脂质堆积。

【实施例2】PR-957可显著抑制HFHC诱导的脂肪肝的发生发展

WT小鼠分为两组，一组为对照组，一组为PR-957给药组。两组小鼠经HFHC 饮食饲养6W后，PR-957给药组通过腹腔注射PR-957，连续注射6W，每周3 次(周一、周三、周五)；对照组于相同的时间点注射同等量的溶剂，注射过程中同样给以HFHC饮食。在注射前以及6W给药完成后，分别称取两组小鼠空腹体重；给药完成后取材，取白脂称重，取肝脏组织进行PAS、HE、油红O及 PSR染色。以评价PR-957对HFHC诱导的脂肪堆积以及肝脏脂肪变性的影响。

体重检测结果如图2所示，给药前，经HFHC饲养6W后，两组小鼠体重无明显差异，给药6W后，PR-957组小鼠体重相比于对照组显著降低。终点取材后，白脂重量检测及白脂体重比结果如图3、4所示，PR-957给药后，显著抑制了小鼠体内白脂的堆积。肝脏组织PAS染色如图5所示，相比于对照组，PR-957 给药组着色面积较大，肝脏组织结构相对完整，说明该组肝脏组织中糖原储存含量较对照组多。HE染色结果如图6所示，对照组HE染色可见明显空泡，说明肝脏组织脂肪变性及气球样变明显，而PR-957给药后，空泡结构明显减少，说明PR-957可显著抑制肝脏组织脂肪变性。油红O染色结果如图7所示，对照组脂滴大且明显，而PR-957组脂滴面积显著减少，说明PR-957可抑制HFHC诱导的肝脏脂质堆积。PSR染色结果如图8所示，对照组除血管周围外，细胞间已弥漫明显纤维化，PR-957组肝脏组织纤维化程度则明显降低。

上述结果均表明，PR-957可显著增强肝脏糖原储存能力，降低肝脏脂肪变性，缓解肝脏纤维化的进程。即PR-957能抑制脂肪肝的发生发展，同时可抑制脂肪肝进一步发展为肝硬化、肝癌的进程。

上述结果说明PSMB8基因敲除可显著抑制肝细胞脂质堆积，抑制脂肪肝及相关疾病的发生发展，即PSMB8基因对脂肪肝及相关疾病具有显著的恶化作用。 PSMB8的特异性抑制剂PR-957可显著抑制脂肪肝及相关疾病的进程，有望用于制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝及相关疾病的药物中。

Claims (4)

1.小鼠免疫蛋白酶体亚基PSMB8作为药物靶标在筛选预防和/或治疗单纯性脂肪肝的药物中的应用，其特征在于，所述的预防和/或治疗单纯性脂肪肝药物是抑制免疫蛋白酶体亚基PSMB8 mRNA水平或蛋白活性的药物，所述的药物具有抑制肝脏脂质蓄积的功能。

2.小鼠免疫蛋白酶体亚基PSMB8的抑制剂在制备预防和/或治疗单纯性脂肪肝药物中的应用，其特征在于，所述PSMB8的抑制剂是抑制PSMB8蛋白质活性或者抑制PSMB8的mRNA水平的抑制剂，其抑制活性是可逆的或不可逆的。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述PSMB8的抑制剂是PR-957或其药学上可接受的盐或其溶剂化物。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述抑制PSMB8的mRNA水平的抑制剂是siRNA、miRNA、shRNA或dsRNA，或者其它能够抑制PSMB8的mRNA水平的多肽。

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