CN108130303A - 一株沃氏食酸菌tcp2011036及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株沃氏食酸菌TCP2011036，沃氏食酸菌TCP2011036的分类命名为沃氏食酸菌(Acidovorax wautersii)TCP2011036，菌株的16S rDNA基因序列表如SEQ ID NO.1所述，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2017年06月19日，保藏号：CGMCC No.14252。本发明菌株对甘蔗幼苗的生长具有显著促进作用；本发明菌株可应用于生产具有促进植物生长以及抑制植物病害的微生物菌剂和生物有机肥，对于减少化肥农药的使用、保护生态环境具有重要意义，具有广阔的应用前景。

Description

一株沃氏食酸菌TCP2011036及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一株沃氏食酸菌TCP2011036及其应用。
背景技术
全球每年因病害导致的大田农作物减产达20％，严重为害时可造成50％的损失，甚至绝收。目前，控制植物病害的主要手段是使用化学杀菌剂，但它在作物中以及环境中的残留毒性对人类健康有潜在危险，已成为全社会关心的问题。随着科学技术的不断发展进步，减少使用化学农药，保护人类生存环境的呼声日益高涨。为了保护环境，维护生态平衡和人类健康安全，开发和使用具有生防作用的农业微生物资源已成为现代农业发展的一个方向。随着我国绿色农业的发展，研发能够提高植物抗病能力、克服土传微生物病害同时又具有增进土壤肥力的微生物制剂越来越受到重视。
辣椒青枯病是由青枯劳尔氏菌引起的一种土传病害，为害时通常可造成 20％～30％的辣椒死亡，严重时高达50％及其以上，甚至绝收。目前该病在我国各地普遍发生且危害严重，已成为辣椒生产中的主要障碍。针对辣椒青枯病的防治主要有作物轮作、化学防治和选育抗病品种等方法，但至今为止这些方法的防治效果均不够理想。由于辣椒青枯病为土传的维管束病害，目前在化学防治中仍然没有较好的农药防治，且存在着容易产生抗药性，农药残留污染环境等缺点，因此国内外研究者着力于研究绿色无污染的生物防治技术。目前对辣椒青枯病的防治重点已逐渐转向以生物防治为主的综合防治，而筛选获得高效拮抗菌株是进行生物防治的核心。
随着现代生物技术的不断进步，微生物作为一种重要的资源，由于其生长周期短，易于大规模培养等优点，已经被运用于农业生产的方方面面，通过调控植物的微生态环境而达到防治植物病害和促进植物生长的微生态调控技术是近年的研究热点。如农业微生物产业中的微生物农药、微生物肥料、微生物饲料和微生物环境保护剂等产业的兴起以及产品与技术的推广应用, 对实现绿色食品生产和生态安全具有重要作用。拮抗细菌在植物病害生物防治中起到非常重要的作用，无论是自然发生的生物防治现象还是人们在生物防治的研究中，拮抗细菌的作用效果都是非常明显的。同时，由于细菌种类繁多，易于人工培养，因此细菌是较理想的生物防治筛选对象。
广西是我国最大的蔗糖生产产区，甘蔗及蔗糖产量占全国60％以上。但是，一直以来我国甘蔗生产成本高，缺乏国际竞争力。在甘蔗生产的各项农资投入中，化肥尤其是氮肥所占比重最大，其对甘蔗产量的影响也最为显著。此外，我国甘蔗主产区蔗地90％以上为旱坡地，土壤保水、保肥能力差，化肥利用率很低。充分发挥蔗地生态系统中有益微生物的植物促生长潜力，对提高我国甘蔗的生产能力，保护和改善甘蔗的生态环境，促进经济可持续发展具有重要的经济和社会意义。广西也是我国生物资源最丰富的省区之一。但是我区在微生物资源方面的研究工作基础还相对比较薄弱，许多工作仍处于起步阶段，可利用的微生物资源较少。因此，对广西重要特色经济作物甘蔗的微生物资源开展系统的菌种资源搜集、保存、鉴定与评价，功能基因库，防止资源流失和灭绝，以适应新形势下对农业微生物菌种的需求，是目前亟待解决的问题。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一株沃氏食酸菌TCP2011036及其应用，从而能有效的防治农作物细菌性青枯病，提高农作物产量以及质量。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：
一株沃氏食酸菌TCP2011036，沃氏食酸菌TCP2011036的分类命名为沃氏食酸菌(Acidovorax wautersii)TCP2011036，菌株的16S rDNA基因序列表如SEQ ID NO.1所述，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期：2017年06月19日，保藏号：CGMCCNo.14252。
本发明沃氏食酸菌TCP2011036菌株是从广西壮族自治区南宁市郊种植的甘蔗品种材料CP85-1508的茎基部组织分离筛选出来的，通过选择性培养基筛选和验证，确定其为甘蔗内生细菌，菌株具有拮抗植物病原菌和溶磷、解钾、分泌IAA等植物促生长特性。通过分析菌株形态、16S rDNA序列分析、生理生化测定，把该菌株鉴定为食酸菌属的沃氏食酸菌(Acidovorax wautersii)，菌株命名为TCP2011036，其最适生长温度为28-30℃，最适生长pH为7-8。
优选的是，所述的沃氏食酸菌TCP2011036在防治农作物青枯病中的应用。
优选的是，所述的沃氏食酸菌TCP2011036在防治辣椒青枯病中的应用，操作为：将苗龄40d的农作物苗移栽到含相应农作物青枯病菌的土壤中，移栽后每盆(单株种植)接种沃氏食酸菌TCP2011036在NB培养液中28℃条件下培养48h的发酵液50mL，即得。
优选的是，所述的NB培养液由蛋白胨10.0g、牛肉膏5.0g、氯化钠5.0g，加水至1000mL组成，pH值7.0。
优选的是，所述的农作物为辣椒或烟草。
优选的是，所述的沃氏食酸菌TCP2011036在防治水稻纹枯病菌、香蕉枯萎病菌和柑桔炭疽病中的应用。
优选的是，所述的沃氏食酸菌TCP2011036在促进农作物生长中的应用。
优选的是，所述的沃氏食酸菌TCP2011036在促进农作物生长中的应用，操作为：将活化后的沃氏食酸菌TCP2011036在NB液体培养基上培养过夜，离心收集菌体，用无菌水悬浮离心清洗2次后稀释到每毫升1×108～2×108个细胞，即得沃氏食酸菌TCP2011036悬菌液，将100mL上述所得悬菌液浇入每株作物中，即得。
优选的是，所述的农作物为辣椒或甘蔗。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明沃氏食酸菌(Acidovorax wautersii)菌株TCP2011036能抑制辣椒青枯病菌、水稻纹枯病菌、香蕉枯萎病菌、柑桔炭疽病菌等植物病原菌的生长，利用其发酵菌液进行辣椒青枯病防治试验，该菌株对辣椒青枯病的防治效果达到82.8％，同时对辣椒生长具有显著的促进作用；进一步的，本发明菌株对甘蔗幼苗的生长具有显著促进作用；本发明菌株可应用于生产具有促进植物生长以及抑制植物病害的微生物菌剂和生物有机肥，对于减少化肥农药的使用、保护生态环境具有重要意义，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1是本发明沃氏食酸菌TCP2011036的菌落形态。
图2是本发明沃氏食酸菌TCP2011036的解钾特征。
图3是本发明沃氏食酸菌TCP2011036对辣椒青枯病的抑制效果。
图4是本发明沃氏食酸菌TCP2011036对甘蔗生长的促进作用。
具体实施方式
下面结合附图具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。实施例中除特别声明以外的培养基(即给出了组分配方的)，其余皆为市售所得。
实施例1
菌株的分离、鉴定
一、菌株的分离
供试材料：采自广西壮族自治区南宁市郊种植的甘蔗品种材料CP85-1508 的茎基部组织。
取甘蔗蔗茎，在超净工作台上先用70％酒精浸30s，无菌水洗3次，再用0.1％升汞浸1min，70％酒精浸30s，无菌水洗5次。称取1g表面灭菌的组织块浸于10mL磷酸盐缓冲液在无菌的研钵中研碎后静置5min，取上清液用无菌水做10倍系列稀释，分别取原液和稀释液100μL铺在无氮富集培养基(成份为葡萄糖10.0g，KH2PO4 0.2g，MgSO4·7H2O 0.2g，NaCl0.2g， CaSO4·2H2O 0.2g，CaCO3 5.0g，琼脂14.0g，去离子水1000mL，pH 7.0-7.2) 平板上，在28℃培养2-3d至长出单菌落。菌落长出后，在上述相同无氮培养基平板上用划线法进行菌种纯化。
二、鉴定
(一)菌株形态特征
菌落形态特征观察：待鉴定的菌株在牛肉蛋白胨培养基上形成淡黄色圆形菌落，大小3-5mm，边缘整齐，光滑湿润，中间具乳状突起，如图1所示。
(二)菌株16S rDNA序列及其系统发育学分析
菌株的16S rDNA序列分析：制备菌株PCR扩增的DNA模板后，利用细菌16S通用引物27F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)如SEQ ID NO.2所述和1492R(GGTTACCTTGTTACGACTT)如SEQID NO.3所述扩增细菌的16S rDNA基因。
PCR反应程序为：94℃3min预变性，然后进行94℃55s，50℃50s， 72℃1min，35个循环，最后72℃10min。PCR扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物回收以后克隆到T载体上，选择阳性克隆送上海生工生物工程公司测序，测序结果在GenBank登录和比对分析。
16S rDNA序列分析结果表明本发明菌株与沃氏食酸菌(Acidovorax wautersii)同源性达99％以上。该菌株的16S rDNA序列已在NCBI网上登录注册，登录号为LT883472。
本发明菌株的生理生化测定：以食酸菌属8个不同种食酸菌作为对照菌，测定了所有供试菌的生理生化指标，结果表明菌株TCP2011036的革兰氏染色为阴性，吡咯烷酮酰氨基肽酶反应阳性，菌株对硝酸还原、亚硝酸还原以及明胶反应为阴性，而对葡萄糖、乳糖、鼠李糖、柠檬酸、甘露醇、木糖、阿拉伯糖和尿素均表现阳性。结果显示本发明菌株的生理生化指标与Acidovorax wautersii的基本一致，而与食酸菌属其它种，如Acidovoraxcattleyae、 Acidovorax defluvii和Acidovorax temperans等则存在显著差异。
因此，综合菌株的菌落形态、生理生化测定、16S rDNA的序列分析结果，将本发明菌株鉴定为沃氏食酸菌(Acidovorax wautersii)。
实施例2
沃氏食酸菌TCP2011036菌株的植物促生长特性
(1)菌株分泌IAA的能力的测定
制作纯IAA的标准曲线，PC比色液和S2比色液
将沃氏食酸菌TCP2011036菌株接种在NB液体培养基中培养16h(28℃、 120r/min)后，用无菌水调节OD600值为0.05，取沃氏食酸菌TCP2011036菌悬浮液100μL分别接种到不含色氨酸的King培养液(成分为蛋白胨20g，磷酸氢二钾1.5g，硫酸镁1.5g，蒸馏水1000mL，pH 7.0)和含有100mg/L色氨酸的King培养液中，重复4次，以加100μL无菌水的培养液为空白对照，一起置于28℃、转速为120r/min的控温振荡器中培养10d。将经King培养液培养10d的菌悬液和空白对照8000r/min离心6min，取上清液4mL加等量比色液，在黑暗中静置0.5h，取出，立即用分光光度计测定OD 530值，每个样品重复测3次，以加了比色液的空白对照进行调零。对照相应的标准曲线计算出菌株分泌IAA的量，并根据PC比色液和S2比色液的测定范围对结果进行选择，最终测定本发明菌株的在含色氨酸培养条件下菌液中IAA的含量达128.74mg/L，而不含色氨酸培养条件下菌液中IAA的含量为42.09 mg/L。
(2)菌株对无机磷的降解特性
将沃氏食酸菌TCP2011036供试菌株的菌悬液20μl点接种到盛有 Pikovaskaia's培养基(葡萄糖10g，Ca3(PO4)2 5g，(NH4)SO4 0.5g，NaCl 0.2g， KCl 0.2g，MgSO4·7H2O0.3g，MnSO4 0.03g，FeSO4·7H2O 0.03g，酵母膏0.5g，琼脂14g，蒸馏水1000mL，pH值7.0)的平板上，恒温培养箱28℃培养4d 后观察菌株的生长情况以及菌落周围有无透明圈形成，测量透明圈直径(D) 与菌落直径(d)的大小。测定结果显示菌株的D/d为1.95，证明沃氏食酸菌 TCP2011036菌株具有较好的无机磷降解能力。
(3)菌株解钾能力的测定
将沃氏食酸菌TCP2011036供试菌株点接种到解钾菌筛选培养基上(葡萄糖10.0g，Na2HPO4 0.2g，MgSO4·7H2O 0.2g，NaCl 0.2g，CaSO4·2H2O 0.2g， CaCO3 5.0g，琼脂14.0g，钾长石粉(150目)2.5g，去离子水1000mL，pH 7.0-7.2)，根据菌株的生长情况以及菌落周边是否形成透明圈来确定菌株的解钾能力。结果显示本发明菌株在含钾长石粉的培养基上生长良好，并产生较大的透明圈，如图2所示。
实施例3
沃氏食酸菌TCP2011036菌株对辣椒青枯病的防治效果
将苗龄40d的辣椒苗移栽到含辣椒青枯病菌的土壤中，每盆单株种植，移栽后每盆接种沃氏食酸菌TCP2011036在NB培养液中培养48h的发酵液 50mL(接种TCP2011036组)，对照接种等量无菌培养液(CK组)，7d后再接种等量发酵液1次，接种后持续观察和记录辣椒的发病情况。结果表明接种沃氏食酸菌TCP2011036发酵液的辣椒生长良好，该菌株对辣椒青枯病的防治效果达到82.8％，同时对辣椒生长具有显著的促进作用，如图3和表1所示。
采用平板对峙法测定了沃氏食酸菌TCP2011036菌株对烟草青枯病菌、辣椒青枯病菌、水稻纹枯病菌、香蕉枯萎病菌以柑桔炭疽病菌生长的抑制作用，结果显示该菌株对5种供试病原菌都有抑菌作用，其中对辣椒青枯病菌的拮抗作用较强。
表1沃氏食酸菌TCP2011036菌株对盆栽辣椒青枯病的防治效果
实施例4
沃氏食酸菌TCP2011036菌株对甘蔗生长的促进作用
将沃氏食酸菌TCP2011036菌株活化后在NB液体培养基上培养过夜，离心收集菌体，用无菌水悬浮离心清洗2次后稀释到每毫升1-2×108个细胞，即得沃氏食酸菌TCP2011036菌株悬浮液。将炼苗后生长一致的甘蔗组培苗(甘蔗品种为新台糖22号)移栽到装有栽培基质的塑料盆中(每盆单株种植)，每盆浇入上述沃氏食酸菌TCP2011036菌株的菌悬液100mL(接种 TCP2011036组)，置于28℃、光周期14h光-10h暗光照培养箱培养。10d后再以100mL同样浓度的菌悬液灌根接种，继续在限菌条件下培养，对照接种等量无菌水(CK组)。60d后对甘蔗组培苗的生长情况进行记录，收获植株并洗净栽培基质，冷冻干燥后测定植株干重、含氮量及含磷量，计算植株的氮、磷素累积量。
试验结果见图4和表2：接种沃氏食酸菌TCP2011036能显著促进甘蔗组培苗的生长，甘蔗幼苗的株高和干重分别比对照增加了31.78％和138.32％，植株的氮素含量和磷素含量差异不显著，但接种该菌的甘蔗株氮素和磷素累积量均比对照增加121.48％和169.23％。
表2沃氏食酸菌TCP2011036菌株对甘蔗生长的促进作用
本发明所述的沃氏食酸菌(Acidovorax wautersii)菌株TCP2011036，保藏号CGMCC No.14252，具有拮抗植物病原菌和溶磷、解钾以及分泌植物生长激素IAA等植物促生长特性。
本发明菌株能抑制辣椒青枯病菌、水稻纹枯病菌、香蕉枯萎病菌、柑桔炭疽病菌等植物病原菌的生长，利用其发酵菌液进行辣椒青枯病防治试验，盆栽接种结果显示该菌株对辣椒青枯病的防治效果达到82.8％，同时对辣椒生长具有显著的促进作用。
本发明菌株对甘蔗幼苗的生长具有显著促进作用。利用本发明菌株接种甘蔗组培苗，移栽并接种90d后甘蔗植株的干重、总氮素累积量以及磷素累积量分别比无接菌对照增加了138.32％、121.48％和169.23％。
本发明菌株可应用于生产具有促进植物生长以及抑制植物病害的微生物菌剂和生物有机肥，对于减少化肥农药的使用、保护生态环境具有重要意义，并有广阔的应用前景。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
。
SEQUENCE LISTING
<110> 广西壮族自治区农业科学院微生物研究所
<120> 一株沃氏食酸菌TCP2011036及其应用
<130> 北京中誉威圣知识产权代理有限公司
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1372
<212> DNA
<213> Acidovorax wautersii
<400> 1
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ggttaccttg ttacgactt 19

Claims (9)

1.一株沃氏食酸菌TCP2011036，其特征在于，沃氏食酸菌TCP2011036的分类命名为沃氏食酸菌(Acidovorax wautersii)TCP2011036，菌株的16S rDNA基因序列表如SEQ IDNO.1所述，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期：2017年06月19日，保藏号：CGMCC No.14252。
2.根据权利要求1所述的沃氏食酸菌TCP2011036，其特征在于：所述的沃氏食酸菌TCP2011036在防治农作物青枯病中的应用。
3.根据权利要求2所述的沃氏食酸菌TCP2011036，其特征在于：所述的沃氏食酸菌TCP2011036在防治辣椒青枯病中的应用，操作为：将苗龄40d的农作物苗移栽到含相应农作物青枯病菌的土壤中，移栽后每盆(单株种植)接种沃氏食酸菌TCP2011036在NB培养液中28℃条件下培养48h的发酵液50mL，即得。
4.根据权利要求3所述的沃氏食酸菌TCP2011036，其特征在于：所述的NB培养液由蛋白胨10.0g、牛肉膏5.0g、氯化钠5.0g，加水至1 000mL组成，pH值7.0。
5.根据权利要求2所述的沃氏食酸菌TCP2011036，其特征在于：所述的农作物为辣椒或烟草。
6.根据权利要求1所述的沃氏食酸菌TCP2011036，其特征在于：所述的沃氏食酸菌TCP2011036在防治水稻纹枯病菌、香蕉枯萎病菌和柑桔炭疽病中的应用。
7.根据权利要求1所述的沃氏食酸菌TCP2011036，其特征在于：所述的沃氏食酸菌TCP2011036在促进农作物生长中的应用。
8.根据权利要求7所述的沃氏食酸菌TCP2011036，其特征在于：所述的沃氏食酸菌TCP2011036在促进农作物生长中的应用，操作为：将活化后的沃氏食酸菌TCP2011036在NB液体培养基上培养过夜，离心收集菌体，用无菌水悬浮离心清洗2次后稀释到每毫升1×108～2×108个细胞，即得沃氏食酸菌TCP2011036悬菌液，将100mL上述所得悬菌液浇入每株作物中，即得。
9.根据权利要求7所述的沃氏食酸菌TCP2011036，其特征在于：所述的农作物为辣椒或甘蔗。
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