CN114736827B - 一种食酸菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种食酸菌，其特征在于：它是由中国典型培养物保藏中心保藏的保藏号：CCTCCNO：M2021276的食酸菌CCYZU‑2555T(Acidovoraxsp.CCYZU‑2555T)。本发明还公开了前述食酸菌的用途。本发明食酸菌为食酸菌属的一个新种，该新种的发现和利用，丰富了人类可利用的微生物资源，为环保、化工等领域应用提供了新的菌种资源。

Description

一种食酸菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及一种食酸菌及其应用。
背景技术
食酸菌属(Acidovorax)，是1990年由Willems等将假单胞菌属中的2个种分出来新建的一个属，菌体杆状，直或微弯，革兰氏染色阴性，最适生长温度为30-35℃。这个属在Bergey细菌分类手册中收录7个种，至今，食酸菌属共计发布18个种，食酸菌属的功能也在被陆续报道，如，A.delftia FZUL-63可去除电镀废水和电子垃圾消解液中的金离子，Acidovorax sp.NO1可氧化三价砷以降低环境中的砷毒性，Acidovorax sp.NO1 SHS-01可降解四环素等。
多相分类是由Colwell于1970年提出的细菌分类学术语，指综合利用包括表型、基因型、系统发育学研究等微生物多种信息进行分类的方法，被认为现代各级分类单元最有效的手段。利用多相分类鉴别食酸菌属新种类，可增强人们对食酸菌多样性的了解，对食酸菌的科学研究和实际应用具有重要意义。
发明内容
本发明提供了一种食酸菌新种及其应用。
本发明提供了一种食酸菌，它是由中国典型培养物保藏中心保藏的保藏号：CCTCCNO：M2021276的食酸菌CCYZU-2555T(Acidovorax sp.CCYZU-2555T)。
其中，它的16s RDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了上述食酸菌的培养方法，将其接种于LB培养基，在30℃、pH7.0的条件下生长。
本发明还提供了一种细菌培养物，它含有上述食酸菌。
本发明还提供了保藏号：CCTCC NO：M2021276的食酸菌CCYZU--2555T在制备硝酸盐还原微生物制剂中的用途。
本发明还提供了保藏号：CCTCC NO：M2021276的食酸菌CCYZU--2555T在治理硝酸盐污染中的用途。
其中，所述硝酸盐污染包括水体、土壤的硝酸盐污染。
本发明保藏号为CCTCC NO：M2021276的食酸菌CCYZU--2555T(Acidovoraxsp.CCYZU-2555T)，经多相分类鉴定为食酸菌属新种，命名为扬州食酸菌(Acidovoraxyangzhouensis sp.nov)。于2021年3月25日，将本发明菌株保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其地址为：中国·武汉·武汉大学，保藏号为CCTCC NO：M2021276。
本发明提供了一种食酸菌属新种，该新种的发现和利用，丰富了人类可利用的微生物资源，有利于对食酸菌属的科学研究及开发利用。本发明的食酸菌，能实现硝酸盐的生物转化，可应用于污水、土壤的生物脱氮，可应用于土壤固氮，对于治理环境、保护人类健康具有重要意义。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1本发明菌株CCYZU-2555T极性脂薄层色谱结果。
图中，a：5％w/v乙醇磷钼酸；b：钼蓝喷雾；c：0.2％w/v茚三酮；PE,磷脂酰乙醇胺；DPG,二磷酸甘油酯；PL,不明磷脂；AL,氨基脂质；L,未知极性脂质。
图216SrRNA基因邻接法系统发育树图。星号(*)和加号(+)分别表示使用最大似然法和最大简约法获得的节点。节点上的数字是基于1000次复制的百分比引导值(仅显示大于50％的值)。单位长度，每个核苷酸位置0.005个替换。
图316SrRNA最大似然法系统发育树图。节点上的数字是基于1000次复制的百分比引导值(仅显示大于50％的值)。单位长度，每个核苷酸位置0.010个替换。
图416SrRNA最大简约法系统发育树图。节点上的数字是基于1000次复制的百分比引导值(仅显示大于50％的值)。
具体实施方式
本发明涉及到的参考菌株及试剂均为购买获得。其中，A.valerianellae(DSM16619T)和A.anthurii(CFBP 3232T)购自the German Collection of Microorganisms andCell Cultures(DSMZ)，A.monticola(K-4-16T)购自the Biological Resource Center,NITE(NBRC)。
实施例1本发明食酸菌CCYZU-2555T的分离鉴定
从江苏扬州茱萸湾动物园细尾獴饲养区的洞穴土壤中，采用LB平板稀释法分离得到本发明菌株，使用多相分类法对该菌株进行鉴定分类，具体如下：
1、形态学特征鉴定
对菌株CCYZU-2555T进行形态学特征鉴定，肉眼观察CCYZU-2555T在LB培养基上的菌落形态为：灰白色、圆形菌落，表面光滑，菌落不透明，有完整的边界。投射电镜观察显示CCYZU-2555T宽9–1.2μm、长2.0–2.2μm，两端有鞭毛。符合食酸菌属的特征。
2、生理生化特征鉴定
考察菌株CCYZU-2555T在LB培养基中，在不同温度(4、10、20、30、35、37、40、42、45℃)、pH(4.0～10.0，30℃)和NaCl浓度(0～4％NaCl，w/v，30℃)下培养3d的最佳条件。
结果表明，CCYZU-2555T在4-42℃、pH4.0-9.0和0-3％NaCl条件下生长。菌株CCYZU-2555T在不添加NaCl的条件下，在30℃、ph7.0条件下生长最适。
采用GEN-III微板(Biolog)测试碳源利用率和化学敏感性。其他生化特性和酶活性采用API20NE试剂盒(bioMérieux)进行测试。将菌株CCYZU-2555T(即A.yangzhouensisCCYZU-2555T))与近缘菌株进行比较，差异特性见表1。
表1菌株CCYZU-2555T的与近缘菌株的特征比较
Figure BDA0003601432570000031
Figure BDA0003601432570000041
注：表中所有数据均来自本申请人的实验研究，+表示阳性，-表示阴性，w表示弱阳性。
结果表明，本发明菌株CCYZU-2555T的生理生化特征如下：CCYZU-2555T能够还原硝酸盐，同化己二酸，能够耐受1％NaCl，能够利用乳酸钠和丙三醇作为碳源，符合食酸菌属的特征。
3、细胞化学分析
(1)脂肪酸分析
使用气相色谱仪(安捷伦(Agilent)6890N)对细胞壁脂肪酸组分进行分析,通过微生物脂肪酸快速鉴定系统(MIDI)检测菌株的全细胞脂肪酸组成。
经分析，菌株CCYZU-2555T与食酸菌属内邻近种的细胞脂肪酸谱见表2。
表2菌株CCYZU-2555T的与近缘菌株的脂肪酸比较
Figure BDA0003601432570000051
Summed feature 3为(C16:1ω7c和/或C16:1ω6c)；Summed feature 5为(C8:0ante和/或C18:2ω6,9c.)；
Summed feature 8为(C18:1ω7c和/或C18:1ω6c)。
注：表中所有数据均来自本申请人的实验研究，表中数值是总脂肪酸的百分比。ND表示未检出，tr表示微量(<0.1％)。
结果显示，CCYZU-2555T的主要细胞脂肪酸为summed feature 3(C16:1ω7c和/或C16:1ω6c)(32.02％),C16:0(30.20％)，C17:0cyclo(15.98％)和summed feature 8(C18:1ω7c和/或C18:1ω6c)(10.14％)。
CCYZU-2555T与Acidovorax属内参考菌株的脂肪酸谱不完全相同，比如C17:0cyclo的比例就表现出差异，相较于参考菌株，CCYZU-2555T含有更高比例的C17:0cyclo。同时，CCYZU-2555T中summedfeature3(C16:1ω7c和/或C16:1ω6c)的比例也明显高于参考菌株。CCYZU-2555T含有C8:03-OH,C19:0,C17:1ω7c,and summed feature 5(C8:0ante和/或C18:2ω6,9c)，而这些组分在参考菌株中是缺失的。CCYZU-2555T没有检测到C18:0和C15:1ω6c，而这些组分在参考菌株中却是存在的。
(2)呼吸醌和极性脂分析
根据Minnikin等人的方法【Minnikin DE,O'Donnell AG,Goodfellow M,AldersonG,Athalye M et al.An integrated procedure for the extraction of bacterialisoprenoid quinones and polar lipids.Journal of Microbiological Methods 1984；2(5):233-241】，从冷冻干燥细胞中分析呼吸醌和极性脂。
CCYZU-2555T中唯一的呼吸醌为泛醌8(Q-8)，主要极性脂为磷脂酰乙醇胺(PE)和二磷酸甘油(DPG)。此外，还检测到3种不明氨基脂质(AL1-AL3)、两种未知极性脂质(L1-L2)和两种未识别磷脂(LP1-PL2)(图1)。
4、分子生物学特征鉴定
(1)16S rRNA基因序列分析
使用天根细菌DNA试剂盒(TIANamp Bacteria DNA Kit)提取菌株CCYZU-2555T的基因组DNA。采用通用引物：正向引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和反向引物1492R(5’-GGYTACCTTGTTACGACTT-3’)扩增菌株的16SrRNA基因。测序获得16SrDNA序列后，将其在NCBI网站进行Blast比对，分析菌株分类地位。应用EZBioCloud服务器，确定16SrRNA序列的系统发育近邻。
结果显示，本发明菌株的16SrDNA基因序列长度为1529bp，序列如下(SEQ IDNO.1)：
TATAGAGTTTGATCCTGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCATGCCTTACACATGCAAGTCGAACGGTAACAGCTCTTCGGAGGCTGACGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATACATCGGAACGTGCCCGATCGTGGGGGATAACGGAGCGAAAGCTTTGCTAATACCGCATACGATCTACGGATGAAAGCAGGGGACCCTCGGGCCTTGCGCGAACGGAGCGGCCGATGGCAGATTAGGTAGTTGGTGGGATAAAAGCTTACCAAGCCGACGATCTGTAGCTGGTCTGAGAGGACGACCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGCAGGATGAAGGCCTTCGGGTTGTAAACTGCTTTTGTACGGAACGAAAAGTCTCGGGATAATACCCTGGGACCATGACGGTACCGTAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTTATATAAGACAGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTTGTGACTGTATAGCTAGAGTACGGTAGAGGGGGATGGAATTCCGCGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGATATGCGGAGGAACACCGATGGCGAAGGCAATCCCCTGGACCTGTACTGACGCTCATGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAACTGGTTGTTGGGTCTTCACTGACTCAGTAACGAAGCTAACGCGTGAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGATGATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCCACCTTTGACATGTACGGAAGTTACCAGAGATGGTTTCGTGCTCGAAAGAGAACCGTAACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGCCATTAGTTGCTACATTTAGTTGGGCACTCTAATGGGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTATAGGTGGGGCTACACACGTCATACAATGGCTGGTACAGAAGGTTGCCAACCCGCGAGGGGGAGCTAATCCTATAAAGCCAGTCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGAATGTCGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGCGGGTCTCGCCAGAAGTAGGTAGCCTAACCGCAAGGAGGGCGCTTACCACGGCGGGGTTCGTGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTATCGGAAGGTGCGGCTGGATCACCTCCTTT
经Blast序列比对，菌株CCYZU-2555T的16SrRNA基因序列与A.anthurii CFBP3232T的相似性最高(97.5％)，其次是A.valerianellae DSM 16619T(97.2％)，A.radicisN35T(97.1％)、A.temperans CCUG 11779T(97.1％)、A.facilis CCUG 2113T(97.0％)和A.monticola K-4-16T(97.0％)，与食酸菌属内其他菌种的相似性均低于97.0％，这些值均低于细菌新种鉴定的阈值98.7％，表明CCYZU-2555T为食酸菌属的新种。
使用MEGA-X软件，采用MUSCLE算法进行序列比对，采用邻接、最大似然和最大简约算法重建基于16SrRNA基因序列的进化树。对于NJ方法，使用Jukes和Cantor模型计算进化距离矩阵。对于ML分析，选择了最佳模型(GTR+G+I)。所有的系统发育树都是基于1000次重新采样的bootstrap分析。基于16SrRNA基因序列分析菌株CCYZU-2555T与相关物种之间的关系。结果见图2-4。
可知，基于16S rRNA基因分析的邻接树(图2)显示，菌株CCYZU-2555T在食酸菌菌属内形成了一个单独的谱系，并与A.valerianellae CFBP 4730T、Acidovorax anthuriiCFBP 3232T、A.monticola K-4-16T和A.lacteus M36T聚类在一起。最大似然树(图3)和最大简约树(图4)也支持这种拓扑结构。三种方法构建的系统发育树均表明菌株CCYZU-2555T在系统上属于食酸菌属(Acidovorax)，但与Acidovorax属已知种的序列相似度较低，表明CCYZU-2555T是一个新种。
(2)基因组测序及生物信息学分析
利用Illumina平台对CCYZU-2555T进行了基因组测序，使用A5 MiSeq和SPAdes进行从头组装，并通过Pilon软件进行碱基校正。用PGCGAP软件对全基因组序列进行注释。
结果表明，CCYZU-2555T基因组全长为5765020bp，基因组DNAG+C含量为65.4mol％，符合食酸菌属基因组DNAG+C含量62.0～66.0mol％的变化范围。
为了确定基因组的相关性，通过
JSpeciesWS(http://jspecies.ribohost.com/jspeciesws)计算ANIb和ANIm。利用Genome-to Genome Distance Calculator(GGDC；http://ggdc.dsmz.de/ggdc.php)计算DDH值。
表3菌株CCYZU-2555T的与近缘菌株的平均核苷酸一致性比较
Figure BDA0003601432570000081
可知，菌株CCYZU-2555T与近缘菌株之间的ANIb和ANIm值均小于85％(表3)，低于临界值(将菌株分类为不同物种的标准值95-96％)；而且菌株CCYZU-2555T与A.valerianellae DSM 16619T、A.anthurii CFBP 3232T、A.monticolaK-4-16T的DDH值分别为21.3％、21.2％、21.8％，也低于种界阈值(70％)。支持菌株CCYZU-2555T为食酸菌属的一个新种。
综合形态学特征、生理生化特征、细胞化学组分分析以及系统发育和遗传数据，将菌株CCYZU-2555T鉴定为食酸菌属的一个新种，并命名为扬州食酸菌(Acidovoraxyangzhouensis sp.nov)。于2021年3月25日，将本发明菌株保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCCNO：M2021276。
实施例2本发明食酸菌CCYZU-2555T的用途
经API鉴定系统测定，本发明食酸菌CCYZU-2555T具有硝酸盐还原能力，能够降解硝酸盐，实现硝酸盐的生物转化。
硝酸盐作为环境污染物，广泛存在于海水、土壤中，硝酸盐污染已成为全球关注的问题之一。硝酸盐还原，在微生物中是以硝酸盐为氮源加以利用和同化的第一阶段反应，对于整个氮素循环极为关键，其将环境中的硝酸盐还原成亚硝酸盐，生成的亚硝酸盐可进一步还原为氮气或一氧化二氮(即反硝化作用)而进入大气得以循环，或还原为氨态氮，降低土壤氮素流失。
本发明食酸菌CCYZU-2555T能实现硝酸盐的生物转化，可应用于生物脱氮，为环保、化工等领域提供了新的微生物资源。
综上，本发明保藏号：CCTCC NO：M2021276的食酸菌CCYZU-2555T能实现硝酸盐的生物转化，可应用于污水、土壤的环境治理，对于保护生态环境、保护人类健康具有重要意义，应用前景良好。
序列表
<110> 扬州大学
<120> 一种食酸菌及其应用
<130> ZL2104008101.1
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1529
<212> DNA
<213> Acidovorax
<400> 1
tatagagttt gatcctggct cagattgaac gctggcggca tgccttacac atgcaagtcg 60
aacggtaaca gctcttcgga ggctgacgag tggcgaacgg gtgagtaata catcggaacg 120
tgcccgatcg tgggggataa cggagcgaaa gctttgctaa taccgcatac gatctacgga 180
tgaaagcagg ggaccctcgg gccttgcgcg aacggagcgg ccgatggcag attaggtagt 240
tggtgggata aaagcttacc aagccgacga tctgtagctg gtctgagagg acgaccagcc 300
acactgggac tgagacacgg cccagactcc tacgggaggc agcagtgggg aattttggac 360
aatgggcgaa agcctgatcc agcaatgccg cgtgcaggat gaaggccttc gggttgtaaa 420
ctgcttttgt acggaacgaa aagtctcggg ataataccct gggaccatga cggtaccgta 480
agaataagca ccggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggg tgcaagcgtt 540
aatcggaatt actgggcgta aagcgtgcgc aggcggttat ataagacaga tgtgaaatcc 600
ccgggctcaa cctgggaact gcatttgtga ctgtatagct agagtacggt agagggggat 660
ggaattccgc gtgtagcagt gaaatgcgta gatatgcgga ggaacaccga tggcgaaggc 720
aatcccctgg acctgtactg acgctcatgc acgaaagcgt ggggagcaaa caggattaga 780
taccctggta gtccacgccc taaacgatgt caactggttg ttgggtcttc actgactcag 840
taacgaagct aacgcgtgaa gttgaccgcc tggggagtac ggccgcaagg ttgaaactca 900
aaggaattga cggggacccg cacaagcggt ggatgatgtg gtttaattcg atgcaacgcg 960
aaaaacctta cccacctttg acatgtacgg aagttaccag agatggtttc gtgctcgaaa 1020
gagaaccgta acacaggtgc tgcatggctg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt 1080
aagtcccgca acgagcgcaa cccttgccat tagttgctac atttagttgg gcactctaat 1140
gggactgccg gtgacaaacc ggaggaaggt ggggatgacg tcaagtcctc atggccctta 1200
taggtggggc tacacacgtc atacaatggc tggtacagaa ggttgccaac ccgcgagggg 1260
gagctaatcc tataaagcca gtcgtagtcc ggatcgcagt ctgcaactcg actgcgtgaa 1320
gtcggaatcg ctagtaatcg cggatcagaa tgtcgcggtg aatacgttcc cgggtcttgt 1380
acacaccgcc cgtcacacca tgggagcggg tctcgccaga agtaggtagc ctaaccgcaa 1440
ggagggcgct taccacggcg gggttcgtga ctggggtgaa gtcgtaacaa ggtagccgta 1500
tcggaaggtg cggctggatc acctccttt 1529

Claims (7)

1.一种食酸菌，其特征在于：它是由中国典型培养物保藏中心保藏的保藏号：CCTCCNO：M2021276的食酸菌CCYZU-2555T(Acidovorax sp.CCYZU-2555T)。
2.根据权利要求1所述的食酸菌，其特征在于，它的16s RDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
3.权利要求1或2所述食酸菌的培养方法，其特征在于，将其接种于LB培养基，在30℃、pH7.0的条件下生长。
4.一种细菌培养物，其特征在于：它含有权利要求1或2所述的食酸菌。
5.保藏号：CCTCC NO：M2021276的食酸菌CCYZU--2555T在制备硝酸盐还原微生物制剂中的用途。
6.保藏号：CCTCC NO：M2021276的食酸菌CCYZU--2555T在治理硝酸盐污染中的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：所述硝酸盐污染包括水体、土壤的硝酸盐污染。
CN202210403789.XA 2021-04-19 2022-04-18 一种食酸菌及其应用 Active CN114736827B (zh)

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CN110467274A (zh) * 2019-08-27 2019-11-19 广东省生物工程研究所（广州甘蔗糖业研究所） 食酸菌ls-1的新应用以及用于修复砷污染的试剂盒及其应用

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