CN108101901A - 活性氧依赖性的硫化氢荧光探针及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种活性氧依赖性的硫化氢荧光探针及其制备方法与应用，该硫化氢荧光探针由以苯并噻二唑为母核的把手分子与以罗丹明为母核的定位分子通过炔键连接而成；其制备方法包括先制备NB‑PMP，将NB‑PMP与5‑炔基‑TMRH偶联反应得到前体分子，之后前体分子经二价铜盐催化，水解开环即得。本发明的优点是通过BTD把手片段响应分子，可实现H2O2依赖的硫化氢荧光增幅响应，且本发明制备的硫化氢荧光探针具有斯托克斯位移大、响应灵敏度高、选择性好等优点；同时可在细胞水平上对线粒体中低浓度的H2S进行检测，在活细胞中线粒体靶向的硫化氢/过氧化氢的成像方面具有广泛应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物分析检测领域，具体涉及一种活性氧依赖性的硫化氢荧光探针及其制备方法与应用。
背景技术
硫化氢(H2S)是继一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)后被证实的第三个气体信号分子。自身作为内源性分子，H2S在生理功能调节中的研究被广泛关注，此外越来越多的研究表明，其与另外两种信号分子之间还可通过各种交互作用调控生物体的某些生理和病理学过程。例如，在生物化学方面，H2S和NO在血管调节方面有着潜在的协同作用。而就化学方面而言，在特殊的条件下，它们可以形成一系列的生物活性物种，如亚硝基硫醇(SNOs)，硝酰离子(HNO-)，和亚磺酰基亚硝酸盐[HS(O)NO]等，而这些活性物种也可通过自身独特的性质调节着生命体的生物化学过程。H2S和CO的相互作用方面则在血红素氧合酶-1/CO途径的上行调控中有所体现。但是，这几种信号分子之间交互作用的机制依旧不是很清晰。这在H2S和活性氧(ROS)体系中也面临着相同的问题。H2S被认为是一种抗氧化剂，可削弱细胞中的氧化应激响应。尤其是在线粒体中，H2S被用于清除对细胞具有毒性的高活性ROS，如羟基自由基(OH·)、过氧亚硝酸自由基(ONOO·)和单线态氧(1O2)。对于这些活性较高的ROS，硫化氢自身可能就可以和它们很快的发生反应。
过氧化氢(H2O2)是细胞内浓度最高的ROS，H2S与它的反应速率常数仅有0.7M-1S-1，远低于和其他活性氧和活性氮的反应水平。考虑到细胞内广泛分布的H2O2和H2S，不难推测它们之间可能同样存在交互作用来介导某些重要的生理活动。利用荧光探针检测法无疑是目前最为方便的对于一些活性物种进行实时原位检测的方法。目前，单独用于H2S检测的荧光探针分子已有广泛报道，但是对H2O2-H2S交互响应的荧光探针分子却没有报道。类似于氧气依赖的邻苯二胺类探针分子，H2O2-H2S交互响应的荧光探针仅当在H2O2和H2S共存情况下，通过H2O2和H2S交互作用才可实现荧光增幅响应。因此，寻找设计这种H2O2-H2S交互响应的探针分子对研究这两种活性物种可能参与的生化调控就显得尤为重要。
发明内容
发明目的：本发明的第一目的是提供一种对H2O2和H2S交互响应的活性氧依赖性的硫化氢荧光探针；本发明的第二目的是提供该硫化氢荧光探针的制备方法；本发明的第三目的是提供该活性氧依赖性的硫化氢荧光探针的细胞成像应用。
技术方案：一种活性氧依赖性的硫化氢荧光探针，它由以苯并噻二唑为母核的把手分子与以罗丹明为母核的定位分子通过炔键连接而成。
所述把手分子的结构式为
式中，R1＝O、S、NH或Se；R2＝H、Cl、Br、I、NO2、OMe、OCH4OMe、OC2H4OC2H4OMe、OC2H4OC2H4OC2H4OMe或OC2H4OC2H4OC2H4OC2H4OMe；
所述定位分子为四甲基罗丹明、罗丹明B或罗丹明110。
其中，R1、R2及定位分子的选择是主要考虑到探针选择性、探针反应速率、分子的合成难易程度和合成产率等方面。
优选的，所述硫化氢荧光探针的结构式为
本发明制备活性氧依赖性的硫化氢荧光探针的方法包括以下步骤：
(1)将NB-Br和4-甲氧基苯酚溶于乙腈、DMF或DMSO中，加入三乙胺或碳酸钾进行，分离即得以苯并噻二唑为母核的把手分子NB-PMP；
(2)所述NB-PMP与5-炔基-TMRH偶联反应得到前体分子TMRH-BTD；
(3)所述前体分子经二价铜盐催化，水解开环即得探针分子TMR-BTD。
步骤(1)中，采用三种极性较大的溶剂纯溶液乙腈、DMF或DMSO，是为了让原料NB-Br充分溶解，反应处于均相体系，利于反应的进行；三乙胺或碳酸钾作为反应的敷酸剂，可以提高反应的速率，如果没有敷酸剂，反应进行很慢甚至不反应。同时，反应温度控制在45～60℃，反应时间4～12h，其中，温度高于60℃时，影响产物稳定性，降低产率；温度低于45℃时，反应时间大大延长，甚至不反应。反应时间高于12h，产物稳定性受影响，造成产率降低；反应时间低于4h，反应不充分，造成原料剩余，反应产率低。
步骤(2)中，NB-PMP为4-(4-甲氧苯氧基)-7-溴-5-硝基苯并[c][1,2,5]噻二唑的缩写，即为以苯并噻二唑为母核的把手分子，BTD为苯并噻二唑的缩写；5-炔基-TMRH为5-乙炔基-四甲基罗丹明螺内酰肼的缩写，即为以罗丹明为母核的定位分子。其中，5-炔基-TMRH与NB-PMP的摩尔比例为1：1～2；当5-炔基-TMRH与NB-PMP的摩尔比低于1：1时，造成合成复杂的原料5-炔基-TMRH消耗不完，同时造成产物分离困难，影响反应效率；当5-炔基-TMRH与NB-PMP的摩尔比高于1：2时，造成NB-PMP原料剩余，影响产物分离。
偶联反应使用四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺或乙腈作为溶剂，偶联反应温度为60～85℃，当温度高于80℃时，影响产物稳定性，降低产率；当温度低于60℃反应时间大大延长，甚至不反应。偶联反应时间为2～4h，当反应时间高于4h，产物稳定性受影响，造成产率降低；当反应时间低于2h，反应不充分，造成原料剩余，反应产率低。
步骤(3)中，所述二价铜盐为氯化铜或高氯酸铜，这两种铜盐在有机溶剂中都有一定的水溶性，其中，高氯酸铜在有机溶剂中的溶解度较氯化铜的高，反应效率更好；但高氯酸铜含有氧化性的高氯酸根，也会影响产物的稳定性，因此，如果要追求反应速率可选择使用高氯酸铜，追求反应产率的话可选用氯化铜。
水解反应使用四氢呋喃与水或丙酮与水作为混合溶剂，丙酮较四氢呋喃对铜盐具有更高的溶解度对产物生成更有利，但四氢呋喃较丙酮对原料具有更好的溶解度，同样也有助于反应的进行；优选的，四氢呋喃与水或丙酮与水的体积比为5～9：1，低于该比例降低了有机原料的溶解度，高于该比例降低了铜盐的溶解度，二者都不利于反应的发生。
水解反应的温度为40～50℃，当温度高于50℃时，影响产物稳定性，降低产率；当温度低于40℃时，反应时间大大延长，甚至不反应。水解反应时间为1～3h，当反应时间高于3h，产物稳定性受影响，造成产率降低；当反应时间低于1h，反应不充分，造成原料剩余，反应产率低。
本发明所述活性氧依赖性的硫化氢荧光探针在活细胞中线粒体靶向的硫化氢/过氧化氢的成像应用。
发明原理：探针分子的设计上则是通过高效的交叉偶联反应将把手片段共轭连接至罗丹明荧光分子上，构建的分子结构中强烈的光诱导电子转移(PET)过程将罗丹明的荧光绝大部分猝灭。随后，探针把手片段部分通过在过氧化氢协同参与下，专一、高效的与H2S发生反应，得到特定的转化产物。转化结束后，PET过程得以解除，罗丹明强烈荧光实现恢复，由此可实现探针分子对H2O2-H2S高效荧光响应。探针分子中罗丹明一方面作为高亮度荧光团外，另一方面还可提供线粒体的定位靶向作用，以其作为母核的线粒体靶向试剂，可实现商品化。本发明中，利用具有线粒体靶向的罗丹明和具有H2O2-H2S响应的把手分段，可实现在线粒体中对H2O2-H2S的荧光响应，这一响应过程的实现仅有在H2O2-H2S共同存在于同一区域内方可发生，这点对于使用单独响应的H2S荧光探针和H2O2荧光探针无法实现的。
有益效果：与现有技术相比，本发明的显著优点为：(1)通过以苯并噻二唑为母核的把手分子，可实现H2O2依赖的H2S依赖的荧光增幅响应，同时确定响应把手片段与H2O2-H2S交互响应后，得到邻位为磺酸基的氨基BTD的稳定结构。(2)利用跨键能量转移(TBET)机制，可在417nm作为激发波长下，实现荧光在590nm处的单一响应，同时荧光增幅响应在30分钟内高达60倍以上。(3)本发明制备的硫化氢荧光探针具有斯托克斯位移大、响应灵敏度高、选择性好等优点；此外，探针分子具有模拟正常生理活性氧水平下，对细胞线粒体低浓度的H2S进行荧光检测。
附图说明
图1为探针片段及探针分子对H2O2-H2S响应的示意图；
图2为片段分子NB-PMP在H2S和H2O2作用下的转化图；
图3为探针分子TMR-BTD的合成路线图；
图4a为NB-PMP在H2S和H2O2作用下的荧光随时间的变化图；
图4b为NB-PMP在H2S和H2O2作用下的紫外随时间的变化图；
图5a为AB-SO3H在氘代DMSO中的核磁氢谱图；
图5b为AB-SO3H在氘代DMSO中的核磁碳谱图；
图6为AB-SO3H的高分辨质谱图；
图7a为TMR-BTD在氘代DMSO中的核磁氢谱图；
图7b为TMR-BTD在氘代DMSO中的核磁碳谱图；
图8为TMR-BTD的高分辨质谱图；
图9为TMR-BTD在H2S和H2O2作用下的荧光随时间的变化图；
图10为TMR-BTD在H2S和H2O2作用下的UPLC跟踪图；
图11a为TMR-BTD在一定浓度的H2S下H2O2浓度依赖随时间变化图；
图11b为TMR-BTD在一定浓度的H2O2下H2S浓度依赖随时间变化图；
图12为TMR-BTD在各还原物中有无过氧化氢条件下的荧光随时间的变化图；
图13为TMR-BTD的Hela细胞毒性测试图；
图14为TMR-BTD在Hela细胞中对AP39和H2O2的成像图；
图15为Hela细胞中TMR-BTD-p与Mito-tracker细胞中线粒体共定位情况图；
图16a为四甲基罗丹明的结构；
图16b为罗丹明B的结构；
图16c为罗丹明110的结构。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
本发明中，合成、测试和生物应用中如无特殊说明，均为常规方法；所用到的实验材料，如无特殊说明，均为市售的常规试剂和耗材。
实施例1
本实施例先进行以苯并噻二唑为母核的把手分子NB-PMP的合成与响应测试，之后进行探针分子的合成、响应和细胞成像应用，如图1所示。
步骤1：NB-PMP的合成与性能测试
NB-PMP经过两步法制备，如图2所示，然后通过荧光、紫外测试以苯并噻二唑为母核的把手分子NB-PMP对H2S和H2O2响应情况。
制备方法包括如下步骤：
(1)4,7-二溴-5-硝基苯并[c][1,2,5]噻二唑(NB-Br)的合成
机械搅拌下，将发烟硝酸(1.9g,30mmol)缓慢滴加到三氟甲烷磺酸(13.3mL，150mmol)中，0℃反应10分钟。随后，分批加入4,7-二溴苯并噻二唑(4.4g，15mmol)。反应恢复至室温20℃，继续反应2小时。加入冰水淬灭反应后，过滤出析出的黄色固体，硅胶柱层析分离(石油醚：乙酸乙酯＝10：1，v/v)得淡黄色目标产物3.66g，产率为72％。
(2)4-(4-甲氧苯氧基)-7-溴-5-硝基苯并[c][1,2,5]噻二唑(NB-PMP)的合成
将NB-Br(340mg，1mmol)和4-甲氧基苯酚(250mg，2mmol)溶于干燥的乙腈(30mL)中，加入三乙胺(0.27mL，2mmol)，45℃反应12小时。反应结束后，减压浓缩反应液。向浓缩液中加入50mL乙酸乙酯，然后依次用水(50mL)和饱和氯化钠(50mL)洗涤，收集有机相，用无水Na2SO4干燥，减压浓缩。柱层析分离(石油醚：乙酸乙酯＝4：1，v/v)得黄色固体280mg，产率为74％。
性能检测1NB-PMP对H2O2-H2S的荧光响应情况
将NB-PMP分子以少量乙腈溶解，加入含20％乙腈的PBS溶液中，使NB-PMP的终浓度为20μM。使用的H2O2和H2S终浓度分别为3mM和200μM。在荧光光谱仪上记录反应在0-30分钟内的荧光变化情况。测试中，温度控制为37℃，激发波长为389nm。测试结果谱图参见图4a，体系荧光在510nm处随时间变化显著增强，30分钟内荧光增幅达2200倍，测试结果确定以苯并噻二唑为母核的把手分子NB-PMP与H2O2-H2S作用后荧光强度变化显著增强，且荧光物种单一。
性能检测2NB-PMP对H2O2-H2S的紫外响应情况
将NB-PMP分子以少量乙腈溶解，加入含20％乙腈的PBS溶液中，使NB-PMP的终浓度为20μM。使用的H2O2和H2S终浓度分别为3mM和200μM。在紫外光谱仪上记录反应在0-30分钟内的荧光变化情况。测试中，温度控制为37℃，测试间隔时间为5分钟，测试结果参见图4b，原料NB-PMP在0分钟时最大吸收波长在350nm，随后，在与H2O2-H2S作用过程中，首先5分钟490nm出现一明显吸收峰，表明中间体NB-SH很快生成，之后，490nm处吸收逐步降低，同时389nm处出现一新的吸收峰，表明产物AB-SO3H在逐步生成。
性能检测3NB-PMP对H2O2-H2S响应后荧光产物的确定
将NB-PMP(38mg，1mmol)溶于干乙腈(4mL)和PBS缓冲溶液(2mL)的混合溶液中，加入九水硫化钠(120mg，0.5mmol)，40℃反应10分钟。随后，加入10M的过氧化氢(0.1mL，1mmol)继续搅拌反应1小时。反应结束后，加入乙酸淬灭反应。随后，减压浓缩反应液。柱层析分离(二氯甲烷：甲醇＝7：1，v/v含0.5％三乙胺)得黄色固体20mg，产率为49％。产物表征：核磁氢谱(400MHz，DMSO-d6):δ(ppm)7.61(s,1H)，7.11(br,2H)，3.09(q,J＝7.3Hz,6H)，1.16(t,J＝7.3Hz,9H)。核磁碳谱(100MHz，DMSO-d6):δ(ppm)153.0，147.5，146.5，128.9，113.6，111.9，45.8，8.6。高分辨质谱:m/z C6H3BrN3O3S2([M-H]-)计算值307.8805，实测307.8800。上述表征数据表明荧光产物结构确定无误，表征谱图见图5-6。
步骤2：探针分子TMR-BTD的合成与性能测试
如图3所示，利用NB-PMP片段分子为原料两步反应得到目标探针分子(TMR-BTD)。首先经一步交叉偶联反应将NB-PMP与5-炔基-TMRH通过炔键共价偶联，得到探针前体分子TMRH-BTD。随后，TMRH-BTD在氯化铜催化下，发生水解开环反应，得到TMR-BTD。探针分子表征无误后，通过紫外、荧光、UPLC测试其对H2S和H2O2响应情况。最后，通过细胞成像实验，表明探针分子可用于线粒体细胞器中H2S和H2O2的成像，证明在H2O2存在下，可检测线粒体中低浓度的H2S。
(1)前体分子TMRH-BTD的合成：
5-炔基-TMRH依据肖义等人文献(Org.Lett.2012,14,2014)公开的方法制备，将制得的5-炔基-TMRH(42mg，0.1mmol)和NB-PMP(38mg，0.1mmol)溶于无氧的N,N-二甲基甲酰胺(10mL)中，加入PdCl2(dppf)(7mg，0.01mmol)、氯化亚铜(3mg，0.015mmol)和三乙胺(0.042mL，0.3mmol)，氩气保护下，80℃反应2小时。反应结束后，减压浓缩反应液。向浓缩液中加入50mL二氯甲烷，然后依次用水(50mL)和饱和氯化钠(50mL)洗涤，收集有机相，用无水Na2SO4干燥，减压浓缩。柱层析分离(石油醚：乙酸乙酯＝1：1，v/v)得黄色固体TMRH-BTD47mg，产率为65％。
(2)硫化氢荧光探针TMR-BTD的合成
将TMRH-BTD(72mg，0.1mmol)溶于四氢呋喃(9mL)和水(1mL)的混合溶液中，加入二水氯化铜(17mg，0.1mmol)，40℃反应1小时。反应结束后，减压浓缩反应液。向浓缩液中加入50mL二氯甲烷，然后依次用水(50mL)和饱和氯化钠(50mL)洗涤，收集有机相，用无水Na2SO4干燥，减压浓缩。柱层析分离(二氯甲烷：甲醇＝10：1，v/v)得暗黄色固体TMR-BTD 32mg，产率为43％。
产物表征：核磁氢谱(400MHz，DMSO-d6)：δ(ppm)8.63(s,1H)，8.21(d,1H)，8.01(dd,1H)，7.40(d,J＝7.5Hz,1H)，7.09(m,2H)，6.90(m,2H)，6.56(m,6H)，3.74(s,3H)，2.97(s,12H)。核磁碳谱(100MHz，DMSO-d6):δ(ppm)156.9，156.0，152.8，152.6，151.7，148.6，141.6，141.5，138.6，129.1，128.9，118.2，115.2，112.2，109.7，106.2，98.4，95.0，86.1，55.9，40.5。高分辨质谱:m/z C39H30N5O7S([M]+)计算值712.1860，实测712.1864。上述表征数据表明探针分子结构确定无误，表征谱图见图7-8。
性能检测1探针分子TMR-BTD对H2O2-H2S的荧光响应情况
将TMR-BTD分子以少量乙腈溶解，加入含20％乙腈的PBS溶液中，使TMR-BTD的终浓度为5μM。使用的H2O2和H2S终浓度分别为3mM和200μM。在荧光光谱仪上记录反应在0-30分钟内的荧光变化情况。测试中，温度控制为37℃，激发波长为417nm。测试结果参见图9，并没有观察到510nm处把手分子BTD的荧光发射峰，仅在590nm处，出现单一的TMR的发射峰显著提高，表明产物分子内部发生了高效的能量转移。此外，在30分钟内，探针分子的荧光增幅响应高达60倍以上，表明荧光发射峰单一，分子内部发生了高效的能量转移。
性能检测2探针分子TMR-BTD和H2O2-H2S响应体系超高液相色谱分析情况
将TMR-BTD分子以少量乙腈溶解，加入含20％乙腈的PBS溶液中，使TMR-BTD的终浓度为5μM。使用的H2O2和H2S终浓度分别为3mM和200μM。在超高液相色谱仪上记录反应在0-30分钟内的体系组分变化情况。测试中，温度控制为37℃，测试间隔时间为5分钟。紫外检测波长为567nm，荧光检测器波长为590nm。测试结果如参见图10，反应在短时间内首先发生了硫化氢取代PMP基团得到TMR-BTD-SH，随后TMR-BTD-SH产物峰逐步消失，荧光产物TMR-BTD-p不断生成，且荧光产物峰单一，反应转化率很高。
性能检测3探针分子TMR-BTD对H2O2-H2S的荧光响应浓度依赖情况
将TMR-BTD分子以少量乙腈溶解，加入含20％乙腈的PBS溶液中，使TMR-BTD的终浓度为5μM。加入H2S使其终浓度为200μM。当加入H2O2终浓度为0.1mM，0.5mM，1mM，2mM，3mM依次增加时，在荧光仪上记录反应在0-30分钟内的体系荧光变化情况。另外测试，加入H2O2使其终浓度为3mM，当H2S终浓度为10μM，50μM，100μM，200μM依次增加时，在荧光仪上记录反应在0-30分钟内的体系荧光变化情况。测试使用温度为37℃，测试间隔时间为5分钟。荧光检测器波长为590nm。测试结果参见图11，固定H2S浓度，随着H2O2浓度逐步增强，探针荧光响应趋势也逐步增强；同时如图11b所示，固定H2O2浓度，探针的荧光变化趋势也相同，且H2S浓度达到200μM，荧光响应基本达到饱和。由此可见，探针分子的荧光变化受到H2O2和H2S二者浓度共同影响。
性能检测4探针分子TMR-BTD响应选择性测试情况
将TMR-BTD分子以少量乙腈溶解，加入含20％乙腈的PBS溶液中，使TMR-BTD的终浓度为5μM。加入其他还原物种使其终浓度为500μM(无特殊标明下)。在荧光仪上记录反应在0-30分钟内的体系荧光变化情况。测试中，同样测试了各还原物种在终浓度为3mM的过氧化氢条件下，荧光变化情况。测试使用温度为37℃，测试间隔时间为5分钟。荧光检测器波长为590nm。测试结果表明，其他还原物种在有无过氧化氢条件下，都不会对探针分子产生明显的荧光干扰，结果参见图12。各实验组分别为：1.Na2S2O3；2.Na2S2O5；3.Na2SO3；4.NaSCN；5.NADH；6.Ascorbate；7.Cys；8.GSH(5mM)；9.Na2S2O3+H2O2；10.Na2S2O5+H2O2；11.Na2SO3+H2O2；12.NaSCN+H2O2；13.NADH+H2O2；14.Ascorbate+H2O2；15.Cys+H2O2；16.GSH(5mM)+H2O2；17.H2S(200μM)+H2O2。
性能检测5探针分子TMR-BTD细胞毒性测试
将Hela细胞(人类宫颈癌细胞)铺于96-孔细胞培养皿上，皿上含有10％胎牛血清的DMEM培养基。培养皿在5％的二氧化碳环境中37℃培养24小时后，用移液器吸除培养基，PBS缓冲溶液洗涤细胞3次。随后，加入新配制的各浓度的TMR-BTD探针培养基溶液。各浓度值分别为0.2、0.5、1、2、4μM，培养24小时后，细胞再用PBS缓冲溶液洗涤3次。之后，加入20μL的MTT的DMSO溶液，37℃最后培养4小时。通过酶标仪测试562nm处生成的甲瓒吸收峰来判断细胞的存活情况。根据图13表明，TMR-BTD浓度在0～2μM范围内，细胞24小时存活率高达95％以上。
性能检测6探针分子TMR-BTD与商业化Mito-tracker在细胞中的共定位成像
将Hela细胞铺于4-孔的玻底培养皿上，皿上含有10％胎牛血清的DMEM培养基。培养皿在5％的二氧化碳环境中37℃培养24小时后，加入500nM AP39(一种线粒体靶向的硫化氢供体)继续培养1小时。随后加入2μM TMR-BTD探针分子和50μM H2O2额外再培养1小时。最后，加入Mito-tracker 100nM共同培养45分钟。结束后，用移液器洗掉培养基，PBS缓冲液洗涤细胞3次，再做成像观察。对照组共三组：第一组不加AP39和H2O2，其他操作相同；第二组不加AP39，其他操作相同；第三组不加H2O2，其他操作相同。激光共聚焦显微镜采用500-540nm(绿色通道)和550-700nm(红色通道)双通道采集观察。探针分子选用405nm激发，Mito-tracker选用488nm激发。图14表明，探针分子仅有在H2O2和AP39同时存在下，才可在红色通道中观察到明亮的荧光。如图15所示，探针分子和商用化的线粒体定位探针具有很好的重叠区域，它们的皮尔森系数达0.91。
实施例2
步骤1中(1)4,7-二溴-5-硝基苯并[c][1,2,5]噻二唑(NB-Br)的合成与实施例1相同。
(2)4-(4-甲氧苯氧基)-7-溴-5-硝基苯并[c][1,2,5]噻二唑(NB-PMP)的合成
将NB-Br(340mg，1mmol)和4-甲氧基苯酚(250mg，2mmol)溶于干燥的N,N-二甲基甲酰胺DMF(30mL)中，加入碳酸钾(276mg，2mmol)，50℃反应8小时。反应结束后，减压浓缩反应液。向浓缩液中加入50mL乙酸乙酯，然后依次用水(50mL)和饱和氯化钠(50mL)洗涤，收集有机相，用无水Na2SO4干燥，减压浓缩。柱层析分离(石油醚：乙酸乙酯＝4：1，v/v)得黄色固体246mg，产率为65％。
NB-PMP的性能检测符合要求。
步骤2：探针分子TMR-BTD的合成与性能测试
(1)前体分子TMRH-BTD的合成：
5-炔基-TMRH依据肖义等人文献(Org.Lett.2012,14,2014)公开的方法制备，将制得的5-炔基-TMRH(42mg，0.1mmol)和NB-PMP(57mg，0.15mmol)溶于无氧的四氢呋喃(10mL)中，加入PdCl2(dppf)(7mg，0.01mmol)、氯化亚铜(3mg，0.015mmol)和三乙胺(0.042mL，0.3mmol)，氩气保护下，60℃反应4小时。反应结束后，减压浓缩反应液。向浓缩液中加入50mL二氯甲烷，然后依次用水(50mL)和饱和氯化钠(50mL)洗涤，收集有机相，用无水Na2SO4干燥，减压浓缩。柱层析分离(石油醚：乙酸乙酯＝1：1，v/v)得黄色固体TMRH-BTD 49mg，产率为67％。
(2)硫化氢荧光探针TMR-BTD的合成
将TMRH-BTD(72mg，0.1mmol)溶于四氢呋喃(5mL)和水(1mL)的混合溶液中，加入六水高氯酸铜(37mg，0.1mmol)，50℃反应1小时。反应结束后，减压浓缩反应液。向浓缩液中加入50mL二氯甲烷，然后依次用水(50mL)和饱和氯化钠(50mL)洗涤，收集有机相，用无水Na2SO4干燥，减压浓缩。柱层析分离(二氯甲烷：甲醇＝10：1，v/v)得暗黄色固体TMR-BTD28mg，产率为38％。
探针分子TMR-BTD的性能检测符合要求。
实施例3
步骤1中(1)4,7-二溴-5-硝基苯并[c][1,2,5]噻二唑(NB-Br)的合成与实施例1相同。
(2)4-(4-甲氧苯氧基)-7-溴-5-硝基苯并[c][1,2,5]噻二唑(NB-PMP)的合成
将NB-Br(340mg，1mmol)和4-甲氧基苯酚(250mg，2mmol)溶于干燥的二甲基亚砜DMSO(30mL)中，加入三乙胺(0.27mL，2mmol)，60℃反应4小时。反应结束后，减压浓缩反应液。向浓缩液中加入50mL乙酸乙酯，然后依次用水(50mL)和饱和氯化钠(50mL)洗涤，收集有机相，用无水Na2SO4干燥，减压浓缩。柱层析分离(石油醚：乙酸乙酯＝4：1，v/v)得黄色固体234mg，产率为62％。
其性能检测复合要求。
步骤2：TMR-BTD探针分子的合成与性能测试
(1)前体分子TMRH-BTD的合成：
5-炔基-TMRH依据肖义等人文献(Org.Lett.2012,14,2014)公开的方法制备，将制得的5-炔基-TMRH(42mg，0.1mmol)和NB-PMP(76mg，0.2mmol)溶于无氧的乙腈(10mL)中，加入PdCl2(dppf)(7mg，0.01mmol)、氯化亚铜(3mg，0.015mmol)和三乙胺(0.042mL，0.3mmol)，氩气保护下，85℃回流反应2小时。反应结束后，减压浓缩反应液。向浓缩液中加入50mL二氯甲烷，然后依次用水(50mL)和饱和氯化钠(50mL)洗涤，收集有机相，用无水Na2SO4干燥，减压浓缩。柱层析分离(石油醚：乙酸乙酯＝1：1，v/v)得黄色固体TMRH-BTD 43mg，产率为60％。
(2)硫化氢荧光探针TMR-BTD的合成
将TMRH-BTD(72mg，0.1mmol)溶于丙酮(9mL)和水(1mL)的混合溶液中，加入六水高氯酸铜(17mg，0.1mmol)，40℃反应3小时。反应结束后，减压浓缩反应液。向浓缩液中加入50mL二氯甲烷，然后依次用水(50mL)和饱和氯化钠(50mL)洗涤，收集有机相，用无水Na2SO4干燥，减压浓缩。柱层析分离(二氯甲烷：甲醇＝10：1，v/v)得暗黄色固体TMR-BTD 33mg，产率为45％。
探针分子TMR-BTD的性能检测符合要求。
实施例4
基本步骤同实施例1，所不同之处在于：前体分子TMRH-BTD的合成步骤中，偶联反应的条件为70℃回流反应3小时。
最终制得的探针分子TMR-BTD的性能检测符合要求。
实施例5
基本步骤同实施例1，所不同之处在于：硫化氢荧光探针TMR-BTD的合成步骤中，水解反应的条件为45℃反应2小时。
最终制得的探针分子TMR-BTD的性能检测符合要求。
实施例6
基本步骤同实施例1，所不同之处在于：硫化氢荧光探针TMR-BTD的合成步骤中，将TMRH-BTD(72mg，0.1mmol)溶于丙酮(5mL)和水(1mL)的混合溶液。
最终制得的探针分子TMR-BTD的性能检测符合要求。
实施例7
基本步骤同实施例1，所不同之处在于：硫化氢荧光探针TMR-BTD的合成步骤中，将TMRH-BTD(72mg，0.1mmol)溶于丙酮(7mL)和水(1mL)的混合溶液。
最终制得的探针分子TMR-BTD的性能检测符合要求。
实施例8
基本步骤同实施例1，所不同之处在于：硫化氢荧光探针TMR-BTD的合成步骤中，将TMRH-BTD(72mg，0.1mmol)溶于四氢呋喃(7mL)和水(1mL)的混合溶液。
最终制得的探针分子TMR-BTD的性能检测符合要求。
当R1的取代基换为S、NH或Se，R2的取代基换为H、Cl、Br、I、NO2、OCH4OMe、OC2H4OC2H4OMe、OC2H4OC2H4OC2H4OMe或OC2H4OC2H4OC2H4OC2H4OMe的时候，同样可实现本发明的目的，因为：就生理环境下硫化氢反应性来看，苯并噻二唑上处于强吸电基硝基邻位的取代基很容易受到硫氢负离子的亲核进攻。基于本发明的探针响应机制，首步过程就是利用硫化氢的亲核性，得到硝基巯基苯并噻二唑中间体，随后才有与硫化氢/过氧化氢交互作用的过程。
当定位分子为罗丹明B或罗丹明110时，同样可实现本发明目的，所制得探针分子的性能检测符合要求，图16a为四甲基罗丹明的结构、图16b为罗丹明B的结构、图16c为罗丹明110的结构。
本发明中，“把手”片段分子NB-PMP在H2S存在下，可发生取代反应生成邻巯基-硝基BTD(NB-SH)活性分子，该活性分子没有荧光；随后，NB-SH在H2O2和H2S共同作用下，通过以活性自由基为中间体，最终转化为结构单一且稳定荧光产物分子，即为邻磺酸基-氨基BTD(AB-SO3H)。对片段分子响应后的荧光分子AB-SO3H的结构鉴定，可以确定以该“把手”作为开关的探针分子与H2O2和H2S交互作用后的荧光产物结构。探针分子的合成则是通过将把手片段共价偶联至罗丹明荧光分子上，分子结构中强烈的光诱导电子转移(PET)过程将罗丹明的荧光绝大部分淬灭，之后再在H2O2和H2S交互作用下，通过把手片段部分的转化，产物分子的荧光得以恢复，实现对H2O2-H2S的荧光响应。
由此可见，本发明的活性氧依赖性的硫化氢荧光探针在417nm作为激发波长下，实现荧光在590nm处的单一响应，且具有斯托克斯位移大、响应灵敏度高、选择性好等优点；可在细胞水平上对线粒体中低浓度的H2S进行检测，在活细胞中线粒体靶向的硫化氢/过氧化氢的成像方面具有广泛应用前景。
Claims (10)
1.一种活性氧依赖性的硫化氢荧光探针，其特征在于：由以苯并噻二唑为母核的把手分子与以罗丹明为母核的定位分子通过炔键连接而成。
2.根据权利要求1所述的硫化氢荧光探针，其特征在于：所述把手分子的结构式为
式中，R1＝O、S、NH或Se；R2＝H、Cl、Br、I、NO2、OMe、OCH4OMe、OC2H4OC2H4OMe、OC2H4OC2H4OC2H4OMe或OC2H4OC2H4OC2H4OC2H4OMe；
所述定位分子为四甲基罗丹明、罗丹明B或罗丹明110。
3.根据权利要求1所述的硫化氢荧光探针，其特征在于：所述硫化氢荧光探针的结构式为
4.一种制备权利要求1所述硫化氢荧光探针的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将NB-Br和4-甲氧基苯酚溶于乙腈、DMF或DMSO中，加入三乙胺或碳酸钾进行反应，分离即得以苯并噻二唑为母核的把手分子NB-PMP；
(2)所述NB-PMP与5-炔基-TMRH偶联反应得到前体分子TMRH-BTD；
(3)所述前体分子经二价铜盐催化，水解开环即得探针分子TMR-BTD。
5.根据权利要求4所述硫化氢荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述5-炔基-TMRH与NB-PMP的摩尔比例为1：1～2。
6.根据权利要求4所述硫化氢荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述偶联反应使用四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺或乙腈作为溶剂。
7.根据权利要求4所述硫化氢荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述偶联反应的温度为60～85℃，反应时间为2～4h。
8.根据权利要求4所述硫化氢荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，所述二价铜盐为氯化铜或高氯酸铜；所述水解反应的温度为40～50℃，反应时间为1～3h。
9.根据权利要求4所述硫化氢荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，所述水解反应使用四氢呋喃与水或丙酮与水作为混合溶剂，且四氢呋喃与水或丙酮与水的体积比均为5～9：1。
10.权利要求1～3任一所述活性氧依赖性的硫化氢荧光探针或权利要求4～9任一所述制备方法制得的活性氧依赖性的硫化氢荧光探针在活细胞中线粒体靶向的硫化氢/过氧化氢的成像应用。
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Address after: 210008 Nanjing, Gulou District, Jiangsu, No. 22 Hankou Road Applicant after: NANJING University Address before: No. 163 Qixia Xianlin Avenue District of Nanjing City, Jiangsu province 210046 Applicant before: NANJING University |
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| GR01 | Patent grant | ||
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