CN108077320A - 液体发酵法制备防治植物病毒的农药及其生产工艺 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种液体发酵法制备防治植物病毒的农药及其生产工艺，将食用菌或药用真菌菌种进行液体深层发酵，然后将发酵液进行固液分离、浓缩等工艺制得防治植物病毒农药。它解决了现有技术存在的不能进行产业化生产的缺点。本发明的优点就是可以进行产业化生产，且产品质量稳定。对烟草花叶病毒、辣椒花叶病毒等植物病毒的感染抑制率达98%以上。

Description

液体发酵法制备防治植物病毒的农药及其生产工艺

技术领域

本发明属于微生物技术领域。本发明属于微生物技术领域。

背景技术

辽宁省出口食用菌研究所与北京市农林科学院植物保护环境保护研究所曾于1993年3月共同申请了“食用菌制备防治植物病毒的农药及工艺”的发明专利(专利公开号CN1078094A)，其工艺是将已经发酵的食用菌固体发酵培养物或长过子实体的废固体培养物在50℃--60℃的温水中浸泡，浸泡后分离出浸液，再将浸液进行真空减压蒸发浓缩，制得防治植物病毒的农药，其工艺有一定的可行性，但却有明显的缺点，就是难以形成大规模的产业化大生产，其原因有以下几点：(1)缺乏稳定持久的原料来源。在南方，以栽培规模最大的双孢蘑菇和香菇为例，每年的栽培季节只有春、秋两季，而且总共只有3--4个月，而北方以栽培规模最大的平菇为例，每年总共也只有5--6个月，原料来源集中在不到半年的时间，而且不管是食用菌的固体发酵培养物，还是长过子实体的废固体培养物，在存贮方面都有很多问题，极易受到各种霉菌的感染，导致原料中原有活性成份活性下降。(2)难以保证产品质量的稳定性。原工艺所采用的原料，因受发酵条件或存贮条件的客观差异，导致每一次的原料中活性成份地含量及活性都不尽相同，因使产品质量，包括产品外观(色泽、含固量等)以及内质量都难以稳定在一个恒定的水平上，同时也限制了在此工艺基础上的技术改进工作的进行。(3)原料杂质多，影响药效的发挥。辽宁省出口食用菌研究所与北京市农林科学院植物保护环境保护研究所曾于1993年3月共同申请了“食用菌制备防治植物病毒的农药及工艺”的发明专利(专利公开号CN1078094A)，其工艺是将已经发酵的食用菌固体发酵培养物或长过子实体的废固体培养物在50℃--60℃的温水中浸泡，浸泡后分离出浸液，再将浸液进行真空减压蒸发浓缩，制得防治植物病毒的农药，其工艺有一定的可行性，但却有明显的缺点，就是难以形成大规模的产业化大生产，其原因有以下几点：(1)缺乏稳定持久的原料来源。在南方，以栽培规模最大的双孢蘑菇和香菇为例，每年的栽培季节只有春、秋两季，而且总共只有3--4个月，而北方以栽培规模最大的平菇为例，每年总共也只有5--6个月，原料来源集中在不到半年的时间，而且不管是食用菌的固体发酵培养物，还是长过子实体的废固体培养物，在存贮方面都有很多问题，极易受到各种霉菌的感染，导致原料中原有活性成份活性下降。(2)难以保证产品质量的稳定性。原工艺所采用的原料，因受发酵条件或存贮条件的客观差异，导致每一次的原料中活性成份地含量及活性都不尽相同，因使产品质量，包括产品外观(色泽、含固量等)以及内质量都难以稳定在一个恒定的水平上，同时也限制了在此工艺基础上的技术改进工作的进行。(3)原料杂质多，影响药效的发挥。

发明内容

本发明的目的就是为了解决现有技术存在的难以形成大规模的产业化大生产的缺点，提出了一种具有稳定持久的原料来源、科学的产品质量控制体系、可形成大规模产业化大生产的抗植物病毒农药的生产工艺。本发明的目的就是为了解决现有技术存在的难以形成大规模的产业化大生产的缺点，提出了一种具有稳定持久的原料来源、科学的产品质量控制体系、可形成大规模产业化大生产的抗植物病毒农药的生产工艺。

本发明的主要内容就是将香菇、平菇、灵芝、灰树花等食用菌或药用真菌菌种进行液体深层发酵，然后将发酵液进行固液分离、浓缩等工艺制得成品，具体生产工艺如下：本发明的主要内容就是将香菇、平菇、灵芝、灰树花等食用菌或药用真菌菌种进行液体深层发酵，然后将发酵液进行固液分离、浓缩等工艺制得成品，具体生产工艺如下：

选香菇、平菇、灵芝、灰树花等食用菌或药用真菌做菌种，在无菌条件下，将食用菌或药用真菌菌种自斜面转移到已经灭菌的克氏瓶中，克氏瓶培养基采用土豆汁培养基，配方如下：选香菇、平菇、灵芝、灰树花等食用菌或药用真菌做菌种，在无菌条件下，将食用菌或药用真菌菌种自斜面转移到已经灭菌的克氏瓶中，克氏瓶培养基采用土豆汁培养基，配方如下：

土豆汁 20％土豆汁 20％

蔗糖 2％蔗糖 2％

琼脂 2％琼脂 2％

PH 自然PH 自然

然后将克氏瓶放置恒温箱中，在温度27-30℃条件下培养5-8天；然后在无菌条件下，将克氏瓶菌种接入已经灭菌的大摇瓶中，在温度25-32℃；转速120--180rpm条件下，摇床制种，采用20％土豆汁培养基；培养100-150小时后转入一级发酵罐，大摇瓶菌种的培养时间不宜过长，以100-150小时为宜，否则菌种容易过老，严重影响下一步的发酵生长，一级发酵罐的发酵配方如下：然后将克氏瓶放置恒温箱中，在温度27-30℃条件下培养5-8天；然后在无菌条件下，将克氏瓶菌种接入已经灭菌的大摇瓶中，在温度25-32℃；转速120--180rpm条件下，摇床制种，采用20％土豆汁培养基；培养100-150小时后转入一级发酵罐，大摇瓶菌种的培养时间不宜过长，以100-150小时为宜，否则菌种容易过老，严重影响下一步的发酵生长，一级发酵罐的发酵配方如下：

碳源 2.5～6％碳源 2.5～6％

(选自马铃薯淀粉.玉米淀粉.玉米粉.蔗糖.葡萄糖(选自马铃薯淀粉.玉米淀粉.玉米粉.蔗糖.葡萄糖

氮源 1～4％氮源 1～4％

(选自豆饼粉.酵母粉、玉米浆.硫铵.氨水等)(选自豆饼粉.酵母粉、玉米浆.硫铵.氨水等)

硫酸镁 0.01～0.6％硫酸镁 0.01～0.6％

碳酸钙 0.3～0.6％碳酸钙 0.3～0.6％

磷酸氢二钾 0.02～0.2％磷酸氢二钾 0.02～0.2％

消泡剂 适量消泡剂 适量

PH 5-6PH 5-6

按种子罐容积60-70％填料，然后在0.12mpa下，蒸汽灭菌30-40分钟，蒸汽灭菌完毕后降温冷却，同时换无菌风，在温度降至25-32℃后将摇瓶菌种接入一级种子罐，在发酵温度25℃-32℃；压力0.03mpa-0.06mpa；转速120-200rpm下发酵40-60小时后，按5～20％的接种比例转入二级种子罐，二级种子罐及发酵罐的填料比、蒸汽灭菌参数同一级种子罐；在发酵配方和发酵参数不变的条件下发酵20-30小时后，按5～20％的接种比例转入发酵罐。一级种子和二级种子的发酵目的主要是促进菌丝体的生长发育，保持菌丝体的旺盛生长是提高菇类蛋白多糖等活性成分得率的前提。转入发酵罐后，在发酵配方和发酵参数不变的条件下发酵35-60小时后放罐。在发酵液中，菇类蛋白多糖是以胞内蛋白多糖和胞外蛋白多糖两种形式存在的，菌丝体生长发育到一定程度后会发生自溶，胞内蛋白多糖随着菌丝体的自溶而释放到发酵液中，有利于下一步的后处理，所以放罐时间不宜过早，若在菌丝体的自溶前放罐，容易导致部分蛋白多糖的损失。但如果放罐时间过迟，菌丝体会将蛋白多糖再次分解利用，同样会导致部分蛋白多糖的损失。放罐时间应在35-60小时内为宜。按种子罐容积60-70％填料，然后在0.12mpa下，蒸汽灭菌30-40分钟，蒸汽灭菌完毕后降温冷却，同时换无菌风，在温度降至25-32℃后将摇瓶菌种接入一级种子罐，在发酵温度25℃-32℃；压力0.03mpa-0.06mpa；转速120-200rpm下发酵40-60小时后，按5～20％的接种比例转入二级种子罐，二级种子罐及发酵罐的填料比、蒸汽灭菌参数同一级种子罐；在发酵配方和发酵参数不变的条件下发酵20-30小时后，按5～20％的接种比例转入发酵罐。一级种子和二级种子的发酵目的主要是促进菌丝体的生长发育，保持菌丝体的旺盛生长是提高菇类蛋白多糖等活性成分得率的前提。转入发酵罐后，在发酵配方和发酵参数不变的条件下发酵35-60小时后放罐。在发酵液中，菇类蛋白多糖是以胞内蛋白多糖和胞外蛋白多糖两种形式存在的，菌丝体生长发育到一定程度后会发生自溶，胞内蛋白多糖随着菌丝体的自溶而释放到发酵液中，有利于下一步的后处理，所以放罐时间不宜过早，若在菌丝体的自溶前放罐，容易导致部分蛋白多糖的损失。但如果放罐时间过迟，菌丝体会将蛋白多糖再次分解利用，同样会导致部分蛋白多糖的损失。放罐时间应在35-60小时内为宜。

发酵过程也可以按照设备和产量要求进行二级发酵，由一级发酵罐直接转入发酵罐，接种比例、发酵配方和发酵参数不变。发酵过程也可以按照设备和产量要求进行二级发酵，由一级发酵罐直接转入发酵罐，接种比例、发酵配方和发酵参数不变。

放罐后将发酵液进行板框压滤，然后将滤清液浓缩，浓缩方式不是采用常压加热、真空减压蒸发等间歇式工艺，而是采用在50-70℃下的薄膜浓缩。薄膜浓缩的温度较低、效率高，而且料液受热时间短，更加有利于保持发酵液中的菇类蛋白多糖等生物活性成份。放罐后将发酵液进行板框压滤，然后将滤清液浓缩，浓缩方式不是采用常压加热、真空减压蒸发等间歇式工艺，而是采用在50-70℃下的薄膜浓缩。薄膜浓缩的温度较低、效率高，而且料液受热时间短，更加有利于保持发酵液中的菇类蛋白多糖等生物活性成份。

浓缩结束后，加入0.5～1.5‰的尼泊金等防腐剂，然后分装制得成品。浓缩结束后，加入0.5～1.5‰的尼泊金等防腐剂，然后分装制得成品。

综上所述，以液体深层发酵技术生产的产品，其产量和质量可通过工程手段控制，而不受自然条件限制，为以食用菌或药用真菌代谢产物制备防治植物病毒的农药提供了产业化大生产的可能，更具有市场竞争力和发展前景，也是该发明优于原技术工艺的最突出特点。综上所述，以液体深层发酵技术生产的产品，其产量和质量可通过工程手段控制，而不受自然条件限制，为以食用菌或药用真菌代谢产物制备防治植物病毒的农药提供了产业化大生产的可能，更具有市场竞争力和发展前景，也是该发明优于原技术工艺的最突出特点。

根据本发明工艺生产出的以菇类蛋白多糖为主要成份的生物农药，在防治烟草、蔬菜花叶病毒的同时，其中所含的其它活性成份对作物的生长发育能起到很好的促进作用。将以本发明工艺生产出的生物农药稀释300-400倍，对烟草、辣椒、黄瓜的花叶病毒感染抑制率都达到了98％以上，而且产量均提高20-25％。根据本发明工艺生产出的以菇类蛋白多糖为主要成份的生物农药，在防治烟草、蔬菜花叶病毒的同时，其中所含的其它活性成份对作物的生长发育能起到很好的促进作用。将以本发明工艺生产出的生物农药稀释300-400倍，对烟草、辣椒、黄瓜的花叶病毒感染抑制率都达到了98％以上，而且产量均提高20-25％。

实施例1.实施例1.

一.菌种：一.菌种：

采用香菇菌种、20％土豆汁培养基，用2L大摇瓶，温度30℃，转速150rpm，培养时间120小时。采用香菇菌种、20％土豆汁培养基，用2L大摇瓶，温度30℃，转速150rpm，培养时间120小时。

二.液体发酵过程：二.液体发酵过程：

1.配方：1.配方：

玉米淀粉 2％玉米淀粉 2％

玉米粉 3％玉米粉 3％

豆饼粉 1.5％豆饼粉 1.5％

玉米桨 2％玉米桨 2％

硫 铵 0.5％硫 铵 0.5％

硫酸镁 0.03％硫酸镁 0.03％

碳酸钙 0.4％碳酸钙 0.4％

磷酸氢二钾 0.1％磷酸氢二钾 0.1％

消泡剂 适量消泡剂 适量

PH 5.5PH 5.5

2.发酵：按种子罐容积60％填料，在转速150rpm，温度30℃，压力0.05mpa，通气量1比0.4下，在200L种子罐中发酵48小时左右后，转入2000L发酵罐，在发酵罐中，发酵60小时左右后，放罐。2.发酵：按种子罐容积60％填料，在转速150rpm，温度30℃，压力0.05mpa，通气量1比0.4下，在200L种子罐中发酵48小时左右后，转入2000L发酵罐，在发酵罐中，发酵60小时左右后，放罐。

三.板框压滤：在放罐的发酵液中加入硅藻土作为助滤剂，进行板框压滤。三.板框压滤：在放罐的发酵液中加入硅藻土作为助滤剂，进行板框压滤。

四.薄膜浓缩：将清液浓缩，加入1‰尼泊金作为防腐剂，制得成品。实施例2.四.薄膜浓缩：将清液浓缩，加入1‰尼泊金作为防腐剂，制得成品。

Claims (1)

1.一种利用液体发酵法制备防治植物病毒的农药的生产工艺，其特征在于：将食用菌或药用真菌菌种进行液体深层发酵，然后将发酵液进行固液分离、浓缩等步骤制得成品，具体生产工艺如下：

(1)摇瓶菌种制备：选香菇、平菇、灵芝、灰树花等食用菌或药用真菌菌种，将食用菌或药用真菌菌种自斜面转移到克氏瓶中，克氏瓶培养基采用土豆汁培养基，配方如下：

土豆汁 20％

蔗糖 2％

琼脂 2％

PH 自然

将克氏瓶放置恒温箱中，在温度27-30℃条件下培养5-8天；然后将克氏瓶菌种接入大摇瓶中，在温度25-32℃；转速120--180rpm条件下，摇床振摇100-150小时后准备接种，大摇瓶培养基采用20％土豆汁培养基，配方如下：

土豆汁 20％

蔗糖 2％

磷酸二氢钾 0.3％

硫酸镁 0.2％

VB1 0.001％

PH 自然

(2)一级种子制备：一级种子罐培养基配方如下：

碳源 2.5～6％

(选自马铃薯淀粉、玉米淀粉、玉米粉、蔗糖、葡萄糖

等)

氮源 1～4％

(选自豆饼粉.玉米浆.硫铵.氨水等)

硫酸镁 0.01～0.6％

碳酸钙 0.3～0.6％

磷酸氢二钾 0.02～0.2％

消泡剂 适量

PH 5-6

按种子罐容积60-70％填料，在0.12mpa下，蒸汽灭菌30-40分钟，然后降温冷却，同时换无菌空气，在温度降至25-32℃后将摇瓶菌种接入一级种子罐，在温度25℃-32℃；压力0.03mpa-0.06mpa；通气量1比0.3-0.6；转速120-200rpm下发酵40-60小时后，转罐；

(3)、发酵过程：将一级种子通过无菌管道按5～20％的接种比例转入二级种子罐；在发酵配方和发酵参数同一级种子罐的条件下发酵20-30小时后转入发酵罐，然后在发酵配方和发酵参数不变的条件下发酵35-60小时后放罐，也可以由一级种子罐直接转入发酵罐，发酵配方和发酵参数不变；然后

(4)、固液分离：在放罐的发酵液中加入硅藻土、轻质碳酸钙等助滤剂，进行板框压滤；然后

(5)、浓缩：将滤清液在50-70℃下进行薄膜浓缩，然后再加入0.5～1.5‰的尼泊金等防腐剂，分装制得成品。