CN108060260A - 与大豆种子蛋氨酸含量相关的snp标记、区间、引物及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于大豆分子生物学技术领域，具体涉及一种与大豆种子蛋氨酸含量相关的SNP标记、区间、引物及应用。所述SNP标记位于大豆第10号染色体的3233657位，所述分子标记的核苷酸为G或A；含有所述标记序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述标记区间是大豆第10号染色体的3223657位‑3243657位区间。该SNP标记属于共显性的标记，可靠且使用方便，这为大豆高蛋氨酸含量品系选育提供了极大的便利，可应用于大豆种子蛋氨酸含量改良中的分子标记辅助选择以及在种子蛋氨酸含量相关基因的精细定位以及图位克隆中的应用，从而加速大豆种子蛋氨酸含量性状的改良进程。

Description

与大豆种子蛋氨酸含量相关的SNP标记、区间、引物及应用

技术领域

本发明属于大豆分子生物学技术领域，具体涉及一种与大豆种子蛋氨酸含量相关的SNP标记、区间、引物及应用。

背景技术

大豆蛋白是人类以及禽畜的重要营养源之一，氨基酸组成与牛奶蛋白相近，是一种比较完全的蛋白质，唯独缺乏人体必需的蛋氨酸。大豆蛋白品质影响大豆产品的市场竞争力，蛋氨酸含量是首要限制因素。大豆中蛋氨酸含量一般仅为12mg/g蛋白，这与世界卫生组织和中国营养学会推荐的、符合人体营养健康需求的26mg/g差距甚远。为满足人们日益提高的营养需求，提高栽培大豆蛋氨酸组分已成为大豆品质改良的重要目标之一。通过常规育种手段来提高大豆蛋氨酸组分存在诸多难题，如分析成本高、育种效率低等。因此，分子辅助选育高蛋氨酸大豆品种是大豆品质育种的重要课题之一。分子生物学和现代生物育种技术的发展与完善为高蛋氨酸大豆分子育种提供了必要的技术支撑和保障。

近十余年，伴随测序技术的发展，使研究者对大豆基因组有了较全面的认识。对17株野生大豆和14株栽培大豆的基因组重测序研究表明，发现了630多万个SNPs，分析表明，大豆存在较高程度的连锁不平衡(linkage disequilibrium，LD)，有利于对目标性状进行关联分析。1996年，首次利用LD定位了躁郁症相关基因。关联分析是LD应用的一种，其检测的是某群体内处于LD状态的一些标记或候选基因的遗传变异与特定表型显著关联的频率是否比期望的高。目前关联分析已广泛应用于植物研究，如大豆籽粒蛋白质含量，水稻氨基酸组分，黑小麦铝毒抗性等。近年利用关联分析法开发目标性状功能标记，已成为分子生物学研究的热点之一。SNP标记辅助选择可显著提高种子蛋氨酸含量遗传改良进程。

迄今为止，通过连锁分析对大豆种子蛋氨酸含量相关基因进行数量性状基因位点(Quantitative trait locus，QTL)定位研究的较多，现发现10余个大豆种子蛋氨酸含量相关QTL，主要分布在F、G、M、C2、I等连锁群上，相关的作用机理及其应用研究还尚未充分进行。然而并未发现与大豆种子蛋氨酸含量性状相关的SNP(Single nucleotidepolymorphism，单核苷酸的多态性)分子标记，给大豆种子蛋氨酸含量性状的遗传改良和分子标记辅助选择育种带来了困难。

发明内容

本发明提供的一种与大豆种子蛋氨酸含量相关的SNP标记、区间、引物及应用，该SNP标记与大豆种子蛋氨酸含量性状密切相关，可以更有效反应大豆种子蛋氨酸含量，可用于大豆分子标记辅助选择育种和遗传改良，显著提高种子蛋氨酸含量较大材料的选择效率。

本发明的第一个目的是提供一种与大豆种子蛋氨酸含量相关的SNP标记，所述SNP标记位于大豆第10号染色体的3233657位，所述分子标记的核苷酸为G或A。

本发明的第二个目的是提供一种含有所述的与大豆种子蛋氨酸含量相关的SNP标记的标记序列，所述标记序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第三个目的是提供一种含有所述的与大豆种子蛋氨酸含量相关的SNP标记的标记区间，所述标记区间是大豆第10号染色体的3223657位-3243657位区间。

本发明的第四个目的是提供一种扩增所述的标记序列的引物，所述引物为：

M10-1F：5’-ACTCAGCAAGACGATTTCTG-3’，如SEQ ID NO.2所示，

M10-1R：5’-GGAGAGATGCCCACTATGA-3’，如SEQ ID NO.3所示。

本发明的第五个目的是提供一种所述的SNP标记在大豆蛋氨酸含量品质育种中的应用。

本发明的第六个目的是提供一种所述的标记序列在大豆蛋氨酸含量品质育种中的应用。

本发明的第七个目的是提供一种所述的标记区间在大豆蛋氨酸含量品质育种中的应用。

本发明的第八个目的是提供一种所述的引物在大豆蛋氨酸含量品质育种中的应用。

与现有技术相比，本发明提供的一种与大豆种子蛋氨酸含量相关的SNP标记及其应用，具有以下有益效果：

(1)本发明提供的一种与大豆种子蛋氨酸含量相关的SNP标记，且属于共显性的标记，可靠且使用方便，这为大豆高蛋氨酸含量品系选育提供了极大的便利。本发明提供的分子标记可应用于大豆种子蛋氨酸含量组分改良中的分子标记辅助选择以及在种子蛋氨酸含量相关基因的精细定位以及图位克隆中的应用，从而加速大豆种子蛋氨酸含量性状的改良进程。

与大豆种子蛋白蛋氨酸含量关联位点的开发方法，其原理是大豆存在较高程度的连锁不平衡，因此可以开展重要性状关联作图。大豆优于其他豆科的主要特点在于蛋白含量高，氨基酸组成均衡，蛋氨酸含量也较其他豆科。大豆蛋氨酸含量由多基因调控，利用蛋氨酸含量变异丰富的自然群体，为本发明标记开发的关键植物学样本。在具备产生了大量明显的遗传变异的大豆自然群体的前提下，可有效开展与蛋氨酸含量变异显著相关的标记开发。

(2)本发明的大豆10号染色体的3233657±100Kb的区间都是大豆种子蛋氨酸含量的理想标记区间，其中3233657位SNP的贡献率为18.23％，加性效应为5.58。用该位点的SNP标记在高世代育种群体进行选择，可筛选到蛋氨酸含量高于17.35mg/g蛋白的材料，精确度约为70％，大大减少了选择成本，提高了品质改良的效率。

附图说明

图1为280个大豆关联群体种子蛋氨酸含量分布图；

图2为基于SNP、通过admixture软件分析得到的关联群体的群体结构图；

图3为大豆种子蛋氨酸含量的MLM关联分析结果曼哈顿图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中，在我国40°N以北广泛收集大豆种质资源3000份，利用高效液相色谱测定大豆种子蛋氨酸含量，根据蛋氨酸在资源中的分布情况，在每个分布群抽样，然后比较抽样群体和总群体的遗传多样性，当一致时，及确定抽样样本数，共计280份种质作为关联群体。这些大豆种质资源均由吉林省农业科学院大豆研究所栽培大豆种质资源研究团队组收集、评价，并保存于吉林省农业科学院种质资源库。280份大豆种质资源来源地涵盖我国高纬度大豆主产区的大部分，包括黑龙江省、吉林省、辽宁省、内蒙古、新疆等。

本发明提供的一种与大豆种子蛋氨酸含量相关的SNP标记，所述SNP标记是与大豆蛋氨酸含量极显著相关的SNP标记，该SNP标记位于大豆第10号染色体的3233657位(参考基因组为Wm82.a2.v1)，核苷酸基因型为G或A，属于共显性的标记，可靠且使用方便，这为大豆高蛋氨酸含量品系选育提供了极大的便利；含有所述SNP标记的标记序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，为：

ACTCAGCAAGACGATTTCTGAATTGATTTGCAGATATTGGCAGGGATTTAATGATTGTCTTTGCATGAAAATTGAAAACTGAAAGCAAATATATTTACATTACCATTAATTTTGTGTGTATGTCATTTGTTTTTTGAGTTCAGATCGTGATATCTTTTGCATTTTCTCGTGGCAGCAGCGCTAGTTTATCATATATGAATTCACCTGTACCTGTTTGTTCTCTTATGTCCTGGTCTTCTTTCTAAAGGACATATTTGTTCGATTACAATTTTTCCCAATGAATTTTGGTACATCT[G/A]AAGCATACTTTTTCATTTTTTCTCCCTCATACGTTTCCCCTTCGGAGGCAATCCTATTTGAGGTACTGATGGGCACTCATAGTG GGCATCTCTCC；

含有所述的与大豆种子蛋氨酸含量相关的SNP标记的标记区间为3223657位-3243657位(即3233657±100Kb)区间。

上述SNP标记具体按照以下方法获得：

一、大豆关联群体的种子蛋氨酸含量测定

在我国40°N以北广泛收集大豆种质资源3000份，田间种植这3000份资源，待种子完全成熟后，收获种子，提取种子蛋白质，通过水解制备氨基酸，利用高效液相色谱测定种子蛋氨酸含量，根据蛋氨酸在资源中的分布情况，在每个分布群抽样，然后比较抽样群体和总群体的遗传多样性，当一致时，及确定抽样样本数，共计280份种质作为关联群体。

其操作步骤如下：

(1)10g大豆种子用烘箱80℃烘烤12h至恒重。

(2)种子粉碎后，过60目筛子，再称取0.3g豆粉放入50ml离心管中，加入蛋白提取液，放置在摇床上200rpm，16h。

(3)静置2分钟，取1mL上清液，加热水解酶，37℃，水浴1h，制备氨基酸。

(4)利用Agilent1200液相色谱仪按照GB 5009.124-2016方法测定蛋氨酸含量。

(5)根据群体蛋氨酸含量平均值(X)和标准差(δ)分为10类群，1类<X-2δ，10类≥X+2δ，中间每类相差0.5δ。各性状的遗传多样性采用Shannon's信息指数(H')进行评价，H'＝-ΣPilnPi，Pi表示第i种变异出现的频率，通过计算3000份资源蛋氨酸含量的遗传多样性为2.11。

(6)在每个类群随机抽取28份资源，计算280份资源的遗传多样指数H'，当等于2.11时，即确定这280资源为关联群体，该280份群体的蛋氨酸含量呈正态分布，属于数量性状，遗传多样指数为2.11，如图1所示，图1为280个大豆关联群体种子蛋氨酸含量分布图，图1中纵坐标表示样品个数，横坐标表示大豆种子的蛋氨酸含量。

二、大豆种子蛋氨酸含量全基因组关联分析

利用SLAF-seq(Specific-Locus Amplified Fragment Sequencing)技术对280份种质进行全基因组测序，利用BWA将测序reads比对到参考基因组上，并使用GATK和Samtools两种方法开发SNP，以两种方法得到的SNP标记交集作为最终可靠的SNP标记数据集。具体步骤如下：

1、用CTAB法提取上述280份种子单株叶片DNA，用Thermo nanodrop 2000检测DNA浓度达100ng/μL，并用1％琼脂糖电泳检测DNA的纯度及完整性，要求DNA无降解，DNA中无蛋白质、多糖等污染。

2、利用北京百迈客生物科技有限公司自主研发的SLAF-seq技术对280份种子单株叶片DNA进行群基因组测序，具体步骤如下：

(1)基因组酶切：利用酶切预测软件对已公布大豆参考基因组进行酶切预测，选择内切酶RsaI和HaeIII对检测合格的各样品基因组进行酶切，然后选择基因组片段范围在364～414bp的SLAF片段。

(2)基因测序：对得到的SLAF片段用Klenow Fragment(3′→5′exo–)(NEB)和dATP在37℃下进行3′端加A处理，连接Dual-index测序接头，然后进行PCR扩增及PCR扩增产物的纯化、混样、切胶回收目的片段，并对回收的目的片段进行cDNA文库质检，cDNA文库质检合格后用Illumina HiSeqTM 2500进行测序。共获得713.59M reads数据，测序平均Q30为95.80％，平均GC含量为43.21％。为评估建库实验的准确性，选用水稻(Oryza sativa)作为对照(Control)进行相同的处理参与建库和测序。

其中，所述PCR扩增使用的引物为F：5’-AATGATACGGCGACCACCGA-3’(SEQ ID NO.4)和R：5’-CAAGCAGAAGACGGCATACG-3’(SEQ ID NO.5)。

其中，利用Agencourt AMPure XP beads(Beckman Coulter,High Wycombe，UK)进行PCR扩增产物的纯化。

(3)SNP标签与基因分型：根据测序Reads在参考基因组上的定位结果，利用GATK软件进行局部重比对(Local Realignment)和变异检测，同时采用samtools软件进行变异检测，取GATK软件和samtools软件两种方法得到的交集变异位点等步骤，以保证检测得到的SNP(single nucleotide polymorphism，单核苷酸多态性)的准确性，最终筛选可用的SNP标签为1819858个。得到SNP数据集。

3、系统发育树用来表示物种之间的进化关系，根据各类生物间的亲缘关系的远近，把各类生物安置在有分枝的树状的图表上，简明地表示生物的进化历程和亲缘关系。基于上述1819858个SNP，通过MEGA5软件，neighbor-joining算法，构建样品的群体进化树。

4、获得遗传结构数据：群体遗传结构分析能够提供个体的血统来源及其组成信息，是一种重要的遗传关系分析工具。基于1819858个SNP，通过admixture软件，分析样品的群体结构，分别假设样品的分群数(K值)为1～20，进行聚类，聚类结果如图2所示。图2为基于SNP、通过admixture软件分析得到的关联群体的群体结构图，分别假设样品的分群数(K值)为1-20，进行聚类，并对聚类结果进行交叉验证，根据交叉验证错误率的谷值确定最优分群数为12。

5、基于1819858个SNP，通过EIGENSOFT软件，进行主成分分析(Principalcomponents analysis，PCA)分析，得到样品的主成分聚类情况。通过PCA分析，能够得知哪些样品相对比较接近，哪些样品相对比较疏远，可以辅助进化分析。

6、获得亲缘关系Kinship矩阵数据：使用SPAGeDi软件可以对自然群体两两个体间的亲缘关系(relative kinship)进行估计，获得亲缘关系Kinship矩阵数据。亲缘关系本身是定义两特定材料之间的遗传相似度与任意材料之间的遗传相似度的相对值，因此当结果出现两材料之间的亲缘关系值小于0时，则直接定义为0。

7、基于关联群体SNP标记数据、遗传结构数据、亲缘关系Kinship矩阵数据以及蛋氨酸含量数据，利用TASSEL5.0软件的混合线性模型(M ixed linear model，MLM)进行全基因组关联分析(Genome wide association study，GWAS)。X为基因型，Y为表型，最终每个SNP位点都能得到一个关联结果，图3为大豆种子蛋氨酸含量的MLM关联分析结果曼哈顿图，纵坐标为p-value的负对数，横坐标为染色体，一个点代表一个SNP位点；红色虚线(图3中位于下方的虚线)为0.1/SNP数目的负对数，蓝色虚线(图3中位于上方的虚线)为0.01/SNP数目的负对数，高于蓝线的点，表明对应的SNP标记与蛋氨酸含量显著相关，其中10号染色体蓝线上的最高的绿点对应的是3233657位SNP。以LOD≥8为筛选标准，在10号染色体的3233657位得到与蛋氨酸含量显著关联的SNP标记(G/A)，该SNP标记详细信息如表1所示。

表1大豆种子蛋氨酸含量显著关联的SNP标记信息

三、种子蛋氨酸含量显著关联SNP标记的应用

与大豆种子蛋氨酸含量紧密连锁的SNP标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，命名为M10-1，其中具有多态性的位点基因型为G/A(在序列表的SEQ ID NO.1序列的第296位以[g/a])表示，该基因型位于大豆第10号染色体的3233657位，其是以待鉴定材料的基因组DNA作为模板，以M10-1引物进行PCR扩增所得的片段。

其中，扩增引物为：

M10-1F：5’-ACTCAGCAAGACGATTTCTG-3’(SEQ ID NO.2)

M10-1R：5’-GGAGAGATGCCCACTATGA-3’(SEQ ID NO.3)

利用上述SNP标记辅助判断大豆蛋氨酸含量的具体步骤如下：

1.利用CTAB法提取待鉴定材料基因组DNA

1)取大豆新鲜叶片加入液氮研磨成粉状，取适量放入1.5mL离心管中。

2)加入0.6mL预热的CTAB提取液，颠倒混匀几次，在65℃的温度下水浴一小时，每15min混匀一次，12000rpm离心15min。

3)加入0.6mL 24：1(V/V)的氯仿：异戊醇溶液，颠倒混匀5-10次，10000rpm离心15min。

4)取上清溶液转移到另外一个空的离心管中，用24:1(V/V)的氯仿：异戊醇溶液重新抽提一次，然后加50μL RNase(10mg/mL)室温下放置30min。

5)加等体积-20℃预冷的异丙醇，于-20℃冰箱中30min，5000rpm离心10min去上清。

6)用70％乙醇清洗两次。吹干后用灭菌水溶解，得到基因组模板DNA，将基因组模板DNA放入4℃冰箱保存备用。

7)用0.8％的琼脂糖检测DNA的浓度，稀释到工作浓度用于PCR扩增。

2.利用M10-1F/M10-1FR的引物进行PCR扩增，得到M10-1扩增产物。

1)PCR扩增体系：总体积为20μL，包括10ng基因组模板DNA 2μL，2×Es TaqMasterMix 10μL，10mM的引物各2μL和ddH₂O 4μL。

2)PCR扩增条件：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火45s，72℃延伸45s；循环35次；72℃终延伸10min。

3.根据序列比对结果判断耐盐性

将M10-1扩增产物进行测序分析，扩增产物自5’端第296位为G的品系亚群蛋氨酸含量均值显著高于该位点为A的品系亚群均值。280份样品中有61.23％的样品的第296位为G的品系蛋氨酸含量高于17.35mg/g蛋白，这表明该SNP标记用于辅助选择是切实有效的。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<120> 与大豆种子蛋氨酸含量相关的SNP标记、区间、引物及应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 391

<212> DNA

<213> 大豆

<400> 1

actcagcaag acgatttctg aattgatttg cagatattgg cagggattta atgattgtct 60

ttgcatgaaa attgaaaact gaaagcaaat atatttacat taccattaat tttgtgtgta 120

tgtcatttgt tttttgagtt cagatcgtga tatcttttgc attttctcgt ggcagcagcg 180

ctagtttatc atatatgaat tcacctgtac ctgtttgttc tcttatgtcc tggtcttctt 240

tctaaaggac atatttgttc gattacaatt tttcccaatg aattttggta catct[g/a]aagc 300

atactttttc attttttctc cctcatacgt ttccccttcg gaggcaatcc tatttgaggt 360

actgatgggc actcatagtg ggcatctctc c 391

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

actcagcaag acgatttctg g 21

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggagagatgc ccactatga 19

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aatgatacgg cgaccaccga 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

caagcagaag acggcatacg 20

Claims (8)

1.一种与大豆种子蛋氨酸含量相关的SNP标记，其特征在于，所述SNP标记位于大豆第10号染色体的3233657位，所述分子标记的核苷酸为G或A。

2.一种含有权利要求1所述的与大豆种子蛋氨酸含量相关的SNP标记的标记序列，其特征在于，所述标记序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.一种含有权利要求1所述的与大豆种子蛋氨酸含量相关的SNP标记的标记区间，其特征在于，所述标记区间是大豆第10号染色体的3223657位-3243657位区间。

4.一种扩增权利要求2中所述的标记序列的引物，其特征在于，所述引物为：

M10-1F：5’-ACTCAGCAAGACGATTTCTG-3’，如SEQ ID NO.2所示，

M10-1R：5’-GGAGAGATGCCCACTATGA-3’，如SEQ ID NO.3所示。

5.根据权利要求1所述的SNP标记在大豆蛋氨酸含量品质育种中的应用。

6.根据权利要求2所述的标记序列在大豆蛋氨酸含量品质育种中的应用。

7.根据权利要求3所述的标记区间在大豆蛋氨酸含量品质育种中的应用。

8.根据权利要求4所述的引物在大豆蛋氨酸含量品质育种中的应用。