CN108030809A - 一种连翘抗炎抗氧化成分的提取方法 - Google Patents

一种连翘抗炎抗氧化成分的提取方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于中药制药技术领域，提供一种连翘抗炎抗氧化成分的提取方法，基于DES制得提取溶剂，提取液中含有连翘主要成分，经实验表明提取溶剂对细胞无毒，连翘提取液具有抗炎抗氧化的作用。该提取溶剂可应用于连翘口服制剂制备。采用多元醇与胆碱类季铵盐按摩尔比4‑1:1混合，90℃加热反应获得的DES液体，将DES液体稀释作为提取溶剂提取连翘果实粉末抗炎抗氧化成分。连翘提取液无细胞毒性且具有良好的抗炎抗氧化作用。本发明使用了新型溶剂提取传统中药，优化了提取工艺，并在细胞层面评价了提取液的生物活性。对连翘口服液体制剂的开发和应用有重要意义。

Description

一种连翘抗炎抗氧化成分的提取方法
技术领域
本发明属于中药制药技术领域，具体涉及一种连翘抗炎抗氧化成分的提取方法。
背景技术
连翘（Forsythia suspensa (Thunb.) Vahl），落叶灌木，木犀科连翘属植物。根据2015版《中华人民共和国药典》记载，连翘具有清热解毒，消肿散结，疏散风热等功效，用于治疗风热感冒，温病初起等。
目前，低共熔溶剂（DES）作为提取溶剂的相关研究已有多篇文献报道。Kristina等使用DES提取葡萄皮中的三种主要成分且成功提高了提取率；Chen等使用DES提取丹参中的五种主要成分且成功提高了提取率；Cvjetko等证明了DES的细胞毒性较低。由此可知，DES作为提取溶剂具有广阔的应用前景，可将其作为一种潜在的口服液体制剂使用，在连翘口服液体制剂的开发中具有实用价值。
申请号为201310052192.6，发明名称为从连翘叶中复合提取连翘苷、连翘酯苷A和芦丁的方法，该专利公开了一种从连翘叶中复合提取连翘苷、连翘酯苷A和芦丁的方法，其是利用连翘叶中的连翘苷为非极性化合物，易溶于甲醇、乙醇等有机溶剂，难溶于水，连翘酯苷A为极性化合物，易溶于水、甲醇、乙醇等，芦丁易溶于甲醇、热乙醇，不易溶于水的特性，综合考虑，通过乙醇浸提、大孔吸附树脂分离、反相硅胶柱层析连续提取工艺，从连翘叶中复合提取连翘苷、连翘酯苷A和芦丁，能把连翘叶的有效活性成分提取完全，合理利用了连翘叶资源；同时，本发明使用大孔吸附树脂的吸附和解吸附，可分离连翘苷、连翘酯苷A和芦丁，用反相硅胶纯化连翘酯苷A，分离完全，而且纯度较高，工艺条件简单，适合工业化生产。但是该方法采用的甲醇、乙醇对于细胞具有毒副作用，因此采用该方法并不能直接用于连翘口服制剂的制备。
发明内容
本发明目的在于提供一种连翘抗炎抗氧化成分的提取方法，基于DES制得提取溶剂，提取液中含有连翘主要成分，经实验表明提取溶剂对细胞无毒，连翘提取液具有抗炎抗氧化的作用。该提取溶剂可应用于连翘口服制剂制备。
本发明由如下技术方案实现的：一种连翘抗炎抗氧化成分的提取方法，采用多元醇与胆碱类季铵盐按摩尔比4—1：1混合，90℃加热反应获得的DES液体，将DES液体稀释作为提取溶剂提取连翘果实粉末抗炎抗氧化成分。
所述多元醇为乙二醇，1,2-丙二醇，丙三醇、1,4-丁二醇中的任意一种，所述胆碱类季铵盐为氯化胆碱。多元醇优选1,2-丙二醇，多元醇与胆碱类季铵盐的摩尔比优选3:1。90℃加热搅拌得到透明DES液体，将DES液体与水按体积比为2.4—4:1混合均匀即为提取溶剂。用提取溶剂提取连翘的具体方法为：连翘果实粉末与提取溶剂按照0.5g : 15 mL的比例混合，然后微波辅助提取，微波功率800—1000 W，提取温度为85—95 ℃，提取4.5—5.5min，过滤滤液即为连翘提取液。
采用本发明所述方法获得的提取溶剂使用MTT法进行细胞毒性的检测，结果表明提取溶剂对细胞存活率没有影响，可证明提取溶剂对细胞没有毒性；DES在室温下为液体溶剂，几乎没有蒸汽压，具有良好的热稳定性和化学稳定性，可作为药物载体。此外，由于DES生产成本较低，且大多数在使用剂量内无毒副作用，原料来源广泛，可应用于医药领域。
对所获得的连翘提取液进行抗炎抗氧化等生物活性评估，结果证明连翘提取液具有良好的抗炎抗氧化的作用，并具有剂量依赖性。
本发明基于DES制得提取溶剂，并经实验证明提取溶剂对细胞无毒性，可作为潜在口服液溶剂。DES作为提取溶剂挥发性低，热稳定性高，经实验表明连翘提取液具有很好的抗炎抗氧化的作用，因此在连翘口服液体制剂的开发中具有实用价值。
附图说明
图1为连翘提取液色谱图；图2为1200—30000 mg/L提取溶剂对PC12细胞毒性的检测结果；图3为连翘提取液对β-淀粉样蛋白（Aβ）诱导PC12细胞损伤的改善作用；图4为连翘提取液对Aβ诱导PC12细胞炎症的改善作用，其中：（a）一氧化氮含量，（b）小鼠肿瘤坏死因子-α含量；图5为连翘提取液对Aβ诱导PC12细胞脂质过氧化的改善作用。
具体实施方式
为更好地理解本发明，下面结合实施例对本发明作进一步地说明，本发明要求保护的范围并不局限于实施例表述的范围。
实施例1：一种连翘抗炎抗氧化成分的提取方法，采用干燥处理的多元醇与胆碱类季铵盐按摩尔比3:1混合，90℃加热搅拌得到均一透明的液体，即低共熔混合物（DES）。将DES液体稀释作为提取溶剂提取连翘果实粉末抗炎抗氧化成分。多元醇为1,2-丙二醇，所述胆碱类季铵盐为氯化胆碱。将DES与水按体积比2.4:1混合均匀，得到提取溶剂。精密称取连翘果实粉末0.5g溶于15 mL提取溶剂中，微波辅助提取，微波功率1000W，提取温度为95℃，提取5.5min，过滤滤液即为连翘提取液。所得到的连翘提取液采用色谱检测，结果见表1和图1，表1为不同提取溶剂对连翘酯苷A的提取率。检测结果显示连翘提取液中成分包括但不局限于：a：连翘酯苷I；b：连翘酯苷B；c：β-D-葡萄糖苷；d：连翘酯苷A；e：芦丁；f：连翘苷；g：连翘脂素，等。
表1
实施例2：一种连翘抗炎抗氧化成分的提取方法，采用干燥处理的多元醇与胆碱类季铵盐按摩尔比2:1混合，多元醇为乙二醇，胆碱类季铵盐为氯化胆碱，90℃加热搅拌获得DES液体，将DES液体与水按体积比为3:1混合均匀即为提取溶剂，称取连翘果实粉末0.5 g溶于15 mL提取溶剂中，微波辅助提取，微波功率800 W，提取温度为90 ℃，提取5 min，过滤滤液即为连翘提取液。
实施例3：一种连翘抗炎抗氧化成分的提取方法，采用干燥处理的多元醇与胆碱类季铵盐按摩尔比1:1混合，多元醇为丙三醇，90℃加热搅拌获得DES液体，将DES液体与水按体积比为4:1混合均匀即为提取溶剂，称取连翘果实粉末0.5 g溶于15 mL提取溶剂中，微波辅助提取，微波功率900 W，提取温度为95 ℃，提取4.5 min，过滤滤液即为连翘提取液。
实施例4：一种连翘抗炎抗氧化成分的提取方法，采用干燥处理的多元醇与胆碱类季铵盐按摩尔比4:1混合，多元醇为1,4-丁二醇，90℃加热搅拌获得DES液体，将DES液体与水按体积比为3.5:1混合均匀即为提取溶剂，称取连翘果实粉末0.5 g溶于15 mL提取溶剂中，微波辅助提取，微波功率1000 W，提取温度为85 ℃，提取5.5 min，过滤滤液即为连翘提取液。
选取DES-4（ChCl:1,2-丙二醇 1:3）进行细胞实验研究。
取指数生长期的小鼠肾上腺嗜铬瘤细胞（PC12）。通过MTT实验方法检测细胞的存活率(%)=(A 实验组- A 调零孔)/(A 正常对照组- A 调零孔)×100%。结果表明，1200—30000 mg/L提取溶剂对细胞存活率没有影响，即对细胞没有毒性（图2）。
MTT实验结果表明，与Aβ组相比，提取溶剂组对细胞存活率没有影响（图3）。一氧化氮试剂盒购于南京建成生物工程研究所（S0021），小鼠肿瘤坏死因子-α（TNF-α）试剂盒购于上海西唐生物科技有限公司（F11630），按照说明书进行操作。结果表明，与Aβ组相比，连翘提取液减少细胞中一氧化氮和TNF-α的含量，说明连翘提取液可以改善细胞炎症；与Aβ组相比，提取溶剂组对一氧化氮和TNF-α的含量没有影响（图4）。
细胞丙二醛（MDA）试剂盒购于南京建成生物工程研究所（A003-4），按照说明书进行操作。结果表明，与Aβ组相比，连翘提取液减少细胞中MDA的含量，说明连翘提取液可以改善细胞内脂质过氧化程度，保护细胞；与Aβ组相比，提取溶剂组对MDA的含量没有影响（图5）。实验数据表示mean±SEM，与对照组相比，### p<0.001；与Aβ组相比，***p<0.001，**0.001＜p<0.01，*0.01＜p<0.05，NS：p>0.05。

Claims (5)

1.一种连翘抗炎抗氧化成分的提取方法，其特征在于：采用多元醇与胆碱类季铵盐按摩尔比4—1：1混合，90℃加热反应获得DES液体，将DES液体稀释作为提取溶剂提取连翘果实粉末抗炎抗氧化成分。
2.根据权利要求1所述的一种连翘抗炎抗氧化成分的提取方法，其特征在于：所述多元醇为乙二醇，1,2-丙二醇，丙三醇、1,4-丁二醇中的任意一种，所述胆碱类季铵盐为氯化胆碱。
3.根据权利要求2所述的一种连翘抗炎抗氧化成分的提取方法，其特征在于：所述多元醇为1,2-丙二醇，多元醇与胆碱类季铵盐的摩尔比为3:1。
4.根据权利要求1所述的一种连翘抗炎抗氧化成分的提取方法，其特征在于：90℃加热搅拌得到透明DES液体，将DES液体与水按体积比为2.4—4:1混合均匀即为提取溶剂。
5.根据权利要求1所述的一种连翘抗炎抗氧化成分的提取方法，其特征在于：用提取溶剂提取连翘的具体方法为：连翘果实粉末与提取溶剂按照0.5g : 15 mL的比例混合，然后微波辅助提取，微波功率800—1000 W，提取温度为85—95 ℃，提取4.5—5.5 min，过滤滤液即为连翘提取液。
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