CN108017653B

CN108017653B - 香豆素衍生物及在检测g-四链体dna和细胞内荧光标记溶酶体中的应用

Info

Publication number: CN108017653B
Application number: CN201711256732.7A
Authority: CN
Inventors: 郭媛; 王少静; 贾健波; 李锦�
Original assignee: Northwestern University
Current assignee: Northwestern University
Priority date: 2017-12-04
Filing date: 2017-12-04
Publication date: 2020-10-27
Anticipated expiration: 2037-12-04
Also published as: CN108017653A

Abstract

香豆素衍生物及在检测G‑四链体DNA和细胞内荧光标记溶酶体中的应用。本发明公开了结构式（I）所示的化合物，其中R₁为C1～C18的烷基，R₂为C1～C18的烷氧基、C1‑C18的烷氨基、

，X=C、N、O、Si或S，

，n=1‑18;X=C、N、O、Si或S。本发明开发了可实现比率型检测G4 DNA的香豆素类荧光探针，从而实现对G4 DNA精准检测。本发明通过共聚焦显微镜，成功实现了结构式（I）所示的化合物作为溶酶体标记物在活细胞中的荧光成像。

。

Description

香豆素衍生物及在检测G-四链体DNA和细胞内荧光标记溶酶体中的应用

技术领域

本发明涉及一类化学生物学传感器的制备方法及其应用，属于化学、生物学传感器技术领域。

背景技术

溶酶体是细胞中重要的亚细胞器。通过溶酶体，大分子可由水解酶进行降解，这些酶包括各种负责蛋白降解的蛋白酶，降解后细胞也能获得相应的营养成分。而且溶酶体参与了多种细胞生命过程，如物质代谢、细胞膜循环、细胞凋亡以及信号转导等。在肿瘤细胞中的溶酶体体积比在正常细胞中更大。一项近期的研究表明，溶酶体可以作为理想的药物靶标，可用于选择性摧毁癌细胞（Petersen N H T, Olsen O D, Groth-Pedersen L, etal. Cancer Cell, 2013, 24, 379）。因此，在细胞内原位、实时、准确检测和标记溶酶体，不仅有助于理解溶酶体参与生命活动的分子机制，而且对癌症的早期筛查具有重要的指导意义。

G-四链体（G4）DNA是一种非传统的核酸结构，是由富含串联重复鸟嘌呤（G）的DNA折叠形成的高级结构。2016年，剑桥大学的研究团队通过对癌变前的人类细胞系进行研究，检测到了差不多一万个G4。该项研究指出G4主要位于调控基因开关的DNA区域，特别是与癌症有关的基因， G4 DNA现也已成为癌症诊疗研究的新型靶标（Hänsel-Hertsch R,Beraldi D, Lensing S V, et al. Nature Genetics, 2016, 48, 1267）。因此，检测G4DNA对癌症的早期精准筛查具有重要的意义。

香豆素类化合物是自然界重要的一类天然有机化合物，存在于不同种属的植物中。这类化合物一般情况下生物相容性好、毒性低。

发明内容

本发明的第一个目的是开发一类新型香豆素衍生物。

本发明的第二个目的是将上述香豆素衍生物作为荧光探针应用于G4 DNA的比率型检测。

本发明的第三个目的是将上述香豆素衍生物作为溶酶体标记物应用于活细胞荧光成像。

本发明实现过程如下，结构式（I）所示的化合物，

其中 R₁为C1～C18的烷基，R₂为C1～C18的烷氧基、C1- C18的烷氨基、

，X= C、N、O、Si或S，

，n = 1-18; X = C、N、O、Si或S。

优选地，R₁为C1～C6的烷基，R₂为C1～C6的烷氧基或C1- C6的烷氨基。

上述化合物的制备方法：化合物（A）与化合物（B）发生缩合反应，得到结构式（I）所示的化合物，反应式为：

上述反应温度为60～115 °C，使用醇类或芳香烃作溶剂，在有机碱类存在下，通过缩合反应得到结构式（I）所示的化合物。

所述的醇包括但不限于甲醇、乙醇、异丙醇；芳香烃包括但不限于甲苯、苯；有机碱包括但不限于六氢吡啶、三乙胺、吡啶。

本发明所述化合物作为荧光探针在检测G-四链体 DNA中的应用。

本发明所述化合物作为溶酶体标记物在活细胞荧光成像中的应用。

本发明的优点：（1）开发了可实现比率型检测G4 DNA的香豆素类荧光探针。比率型检测不受底物和探针浓度、外部环境和仪器条件变化等影响，可有效避免检测时的背景干扰和假阳性，从而实现对G4 DNA精准检测。（2）通过共聚焦显微镜，成功实现了结构式（I）所示的化合物作为溶酶体标记物在活细胞中的荧光成像。因为这类分子能对溶酶体进行比率型标记，具有良好的抗干扰能力，可实现对溶酶体的精准标记。

附图说明

图1为荧光探针HAN-1在缓冲溶液中对C-myc G4 DNA不同浓度的荧光光谱；

图2为荧光探针HAN-1在缓冲溶液中对C-myc G4 DNA不同浓度的工作曲线图；

图3为荧光探针HAN-1在缓冲溶液中对G4 DNA、单链DNA和双链DNA的选择性柱状图；

图4为荧光探针HAN-1在缓冲溶液中对C-myc G4 DNA不同浓度的紫外光谱；

图5为荧光探针HAN-1在缓冲溶液中与C-myc G4 DNA的圆二色谱；

图6为荧光探针HAN-1定位癌细胞中溶酶体的荧光成像图（蓝通道为457 nm，红通道为619 nm）；

图7为荧光探针HAN-3定位癌细胞中溶酶体的荧光成像图（蓝通道为458 nm，红通道为627 nm）；

图8为荧光探针HAN-2和HAN-3定位活的HepG2（肝癌细胞）细胞中溶酶体的荧光成像图（HAN-2蓝通道为457 nm，红通道为628 nm；HAN-3蓝通道为458 nm，红通道为627 nm）。

具体实施方式

下面实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所使用的材料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1 荧光探针HAN-1的制备

在干燥的50 mL圆底烧瓶中，加入3-乙氧酰基-7-羟基-8-甲酰基香豆素（0.0865g，0.33 mmol），1, 2, 3, 3-四甲基-3H-吲哚碘盐（0.0993 g，0.33 mmol），50 μL哌啶和20mL乙醇。装上冷凝管，加热回流14 h。冷却，有黄色晶体析出，抽滤，收集固体，干燥得产物，即为荧光探针HAN-1，产量为0.1162 g，产率为65%。¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ: 163.5,160.1, 156.8, 151.9, 149.4, 147.7, 136.2, 130.5, 127.8, 122.1, 121.6, 120.0,119.7, 113.4, 113.3, 111.1, 107.0, 106.9, 106.5, 61.7, 52.2, 28.8, 25.9,19.9, 14.3. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 8.46 (s, 1H), 7.47 (d, J = 12.0 Hz,1H), 7.34 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.20 (t, J =8 .0 Hz, 1H), 7.10 (d, J = 8.0 Hz,1H), 6.88 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 6.71 (d, J = 8.0 Hz,1 H), 6.57 (d, J = 8.0 Hz,1H), 5.86 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 4.42 (q, J = 4.0 Hz, 2H), 2.75 (s, 3H), 1.40(t, J = 8.0 Hz, 3H), 1.31 (s, 3H), 1.20 (s, 3H). HRMS (ESI) calcd. forC₂₅H₂₄NO₅ (M+H)⁺: 418.1649, Found: 418.1633; FT-IR (KBr, cm^-1): 3440, 2963,2363, 2251, 1765, 1644, 1594, 1481, 1365, 1304, 1238, 1087, 1021, 930, 737,646, 544, 488.

荧光探针HAN-1对C-myc G4 DNA不同浓度的荧光光谱测试：在5 mL的比色管中加入50 μL 10^-3 M的HAN-1母液，1 mL Tris-HCl缓冲溶液（pH = 7.6, 20 mM KCl），再用超纯水稀释至5 mL刻度。取250 μL 10^-5 M的HAN-1加入微量比色皿中，向其中分别加入体积为0,1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25 μL的10^-3 M C-myc G4 DNA溶液，测定各组的荧光光谱，如图1所示。由图1可知，随着C-myc G4 DNA浓度增大，HAN-1在长波长615 nm处的荧光强度逐渐增强，说明HAN-1在C-myc G4 DNA的作用下发生了开环。

荧光探针HAN-1对C-myc G4 DNA不同浓度的工作曲线测定：由HAN-1对C-myc G4DNA不同浓度的荧光光谱得到在615 nm处荧光响应强度随C-myc G4 DNA浓度工作曲线图，如图2所示。由图2可知，当体系中逐渐加入C-myc G4 DNA 时，610 nm处的荧光强度与C-mycG4 DNA浓度呈现良好的线性关系，线性方程为y = 27.669 x + 15.724，相关系数为0.9905。

荧光探针HAN-1在G4 DNA、单链DNA和双链DNA中选择性荧光光谱测试：在5 mL的比色管中加入50 μL 10^-3 M的HAN-1母液，1 mL Tris-HCl缓冲溶液（pH = 7.6, 20 mM KCl），再用超纯水稀释至5 mL刻度。取250 μL 10^-5 M的HAN-1加入微量比色皿中，再向其中分别加入25 μL的100 µM G4 DNA (C-myc DNA、C-kit DNA、bcl2、22AG和HIV-PRO-1)、单链DNA(ss-DNA1、ss-DNA2、ss-DNA3和ss-DNA4)、双链DNA (ds-DNA1、ds-DNA2和ct-DNA)，测定各组的荧光光谱，如图3所示。由图3可知，HAN-1与G4 DNA作用后，在615 nm处均出现发射峰，荧光强度均有较明显地增加，而与单、双链DNA作用后并无明显变化。当加入C-myc G4 DNA时，该波长处的强度变化最大，说明HAN-1对C-myc G4 DNA的检测具有良好的选择性。

荧光探针HAN-1对C-myc G4 DNA不同浓度的紫外光谱测试：在5 mL的比色管中加入50 μL 10^-3 M的HAN-1母液，1 mL Tris-HCl缓冲溶液（pH = 7.6, 20 mM KCl），再用超纯水稀释至5 mL的刻度。取250 μL 10^-5 M的HAN-1加入微量比色皿中，向其中依次加入体积为0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25 μL的10^-3 M C-myc G4 DNA溶液，测定相应的紫外-可见吸收光谱，如图4所示。由图4可知HAN-1在381 nm和495 nm有吸收峰，随着C-myc G4 DNA浓度的增加，HAN-1在495 nm处的吸收峰出现了明显的减色效应，并且红移了40 nm。

荧光探针HAN-1与C-myc G4 DNA的圆二色谱测试：配制总体积为400 μL的C-mycG4 DNA和HAN-1溶液，其中固定待测样品中C-myc G4 DNA的终浓度为5 μM，用HAN-1进行滴定测试，即HAN-1的浓度分别为0、5、10、15 μM，如图5所示。由图5可知，HAN-1在该条件下不改变C-myc G4 DNA的平行结构，当HAN-1的浓度逐渐增加时，210 nm和265 nm处的峰越来越正，而240 nm处的峰越来越负。

荧光探针HAN-1在细胞中溶酶体荧光成像研究：分别在HepG2（人肝癌细胞）、SMMC-7721（人肝癌细胞）、A375（人皮肤黑色素瘤细胞）和MCF-7（人乳腺癌细胞）中加入75 nM的LysoTracker Green DND-26（商品化的溶酶体标记物）培养10 min，PBS清洗三次细胞后，再加入100 µM的HAN-1，孵育10 min，PBS清洗三次细胞后，采用激光共聚焦拍摄荧光成像图片（激发波长分别为405 nm、488 nm和516 nm，对应收集435-485 nm、500-545 nm和570-640nm波段的信号），得到荧光成像图6。如图6所示，HAN-1在活的癌细胞核外，均能定位溶酶体，并且复染率高达90%以上，说明HAN-1可以实现活细胞中实时、原位检测溶酶体。

实施例2 荧光探针HAN-2的制备

在干燥的25 mL圆底烧瓶中，加入3-(N, N-二乙氨基)酰基-7-羟基-8-甲酰基香豆素（0.0520 g，0.18 mmol），1, 2, 3, 3-四甲基-3H-吲哚碘盐（0.0542 g，0.18 mmol），0.014 mL哌啶（0.20 mmol）和10 mL乙醇。装上冷凝管，加热回流11 h。冷却，有浅粉色固体析出，抽滤，收集固体，干燥得产物，即为荧光探针HAN-2，产量为0.0561 g，产率为70%。¹HNMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 7.71 (s, 1H), 7.45 (d, J = 10.48 Hz, 1H), 7.21 (m,2H), 7.09 (d, J = 7.04 Hz, 1H), 6.87 (t, J = 7.28 Hz, 1H), 6.68 (d, J = 8.52Hz, 1H), 6.55 (d, J = 7.64 Hz, 1H), 5.84 (d, J = 10.52 Hz, 1H), 3.55 (q, J =6.76 Hz, 2H), 3.31(q, J = 6.76 Hz, 2H), 2.75 (s, 3H), 1.25 (t, J = 7.0 Hz,6H), 1.18 (s, 6H); HRMS (ESI) calcd. for C₂₇H₂₈N₂O₄Na (M+Na)⁺: 467.1941, Found:467.1925.

实施例3 荧光探针HAN-3的制备

在干燥的25 mL圆底烧瓶中，加入3-(吗啉-N-)酰基-7-羟基-8-甲酰基香豆素（0.0545 g，0.18 mmol)，1, 2, 3, 3-四甲基-3H-吲哚碘盐（0.0542 g，0.18 mmol），哌啶（0.014 mL，0.20 mmol）和10 mL乙醇。装上冷凝管，加热回流6 h。冷却，有淡蓝色固体，抽滤，收集固体，干燥得产物，即为荧光探针HAN-3，产量为0.0561 g，产率为70%。¹H NMR (400MHz, CDCl₃) δ: 7.89 (s, 1H), 7.44 (d, J =10.48 Hz, 1H), 7.28 (d, J = 8.50 Hz,1H), 7.20 (t, J = 7.52 Hz, 1H), 7.09 (d, J = 7.12 Hz, 1H), 6.88 (t, J = 7.28Hz, 1H), 6.70 (d, J = 8.52 Hz, 1H), 6.55 (d, J = 7.68 Hz, 1H), 5.85 (d, J =10.52 Hz, 1H), 3.78 (m, 4H), 3.72 (m, 2H), 3.41 (m,2H), 2.74 (s,3H), 1.30 (s,3H), 1.19 (s, 3H); HRMS (ESI) calcd. for C₂₇H₂₆N₂O₅Na (M+Na)⁺: 481.1734, Found:481.1721.

荧光探针HAN-3在细胞中溶酶体荧光成像研究：分别在HepG2（人肝癌细胞）、MCF-7（人乳腺癌细胞）和PC-3（胰腺癌细胞）中加入75 nM的LysoTracker Green DND-26培养10min，PBS清洗三次细胞后，再加入100 µM的HAN-3，孵育10 min，PBS清洗三次细胞后，采用激光共聚焦拍摄荧光成像图片（激发波长分别为405 nm、488 nm和516 nm，对应收集435-485nm、500-545 nm和570-640 nm波段的信号），得到荧光成像图7。如图7所示，HAN-3在活的癌细胞核外，均能定位溶酶体，并且复染率高达90%以上，说明HAN-3可以实现活细胞中实时、原位检测溶酶体。

荧光探针HAN-2和HAN-3在细胞中溶酶体荧光成像研究：分别在种有癌细胞HepG2的三个培养皿中，加入75 nM的LysoTracker Green DND-26培养10 min，PBS清洗三次细胞后，再分别加入100 µM的HAN-2和HAN-3，孵育10 min，PBS清洗三次细胞后，采用激光共聚焦拍摄荧光成像图片（激发波长分别为405 nm、488 nm和516 nm，对应收集435-485 nm、500-545 nm、570-640 nm波段的信号），得到荧光成像图8。如图8所示，这两种荧光探针在活的癌细胞核外，均能定位溶酶体，并且复染率高达90%以上，说明HAN可以实现活细胞中实时、原位检测溶酶体。

序列表

<110> 西北大学

<120> 香豆素衍生物及在检测G-四链体DNA和细胞内荧光标记溶酶体中的应用

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgagggtggg tagggtgggt aa 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agggagggcg ctgggaggag gg 22

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gggcgcggga ggaagggggc ggg 23

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agggttaggg ttagggttag gg 22

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tggcctgggc gggactggg 19

<210> 6

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aaaaaaaaaa aaaaa 15

<210> 7

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tttttttttt ttttt 15

<210> 8

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggagggttgg gttt 14

<210> 9

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aaacccaacc ctcc 14

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aaaaaaaaaa aaaaattttt tttttttttt 30

<210> 11

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggagggttgg gtttaaaccc aaccctcc 28

Claims

1.结构式（I）所示的化合物，

其中 R₁为甲基，R₂为C1～C6的烷氧基、C1- C6的烷胺基、

或

。

2.权利要求1所示化合物的制备方法，其特征在于：化合物（A）与化合物（B）发生缩合反应，得到结构式（I）所示的化合物，反应式为：

。

3.根据权利要求2所示化合物的制备方法，其特征在于：反应温度为60～115℃，使用醇类或芳香烃作溶剂，在有机碱类存在下，通过缩合反应得到结构式（I）所示的化合物。

4.根据权利要求3所示化合物的制备方法，其特征在于：所述的醇为甲醇、乙醇或异丙醇；芳香烃为甲苯或苯；有机碱为六氢吡啶、三乙胺或吡啶。

5.权利要求1所述化合物在制备检测G-四链体 DNA荧光探针中的应用。

6.权利要求1所述化合物在制备活细胞荧光成像中的溶酶体标记物的应用。