CN108017609B

CN108017609B - 一种黄烷类单体化合物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN108017609B
Application number: CN201711305150.3A
Authority: CN
Inventors: 李竣; 龚韦凡; 莫童; 黄先菊; 刘向明
Original assignee: Wuhan Huayitong Biotechnology Co ltd
Current assignee: Hubei Yaosheng traditional Chinese Medicine Technology Co.,Ltd.
Priority date: 2017-12-11
Filing date: 2017-12-11
Publication date: 2020-04-10
Anticipated expiration: 2037-12-11
Also published as: CN108017609A

Abstract

一种黄烷类单体化合物及其制备方法和应用，涉及中药提取技术领域。该黄烷类单体化合物为(2S)‑6,4'‑二羟基‑5‑甲基黄烷，制备方法是将龙血竭提取物与聚酰胺混合，装入聚酰胺柱中，以乙醇溶液梯度洗脱，依次得到不同的洗脱物：第一组分、第二组分、第三组分、第四组分和第五组分；将第三组分用硅胶拌样，装入硅胶柱中，以石油醚‑乙酸乙酯梯度洗脱，再经过硅胶柱反复层析，最后经过高效液相色谱仪分离，得到黄烷类单体化合物。该黄烷类单体化合物是从龙血竭中提取得到的新化合物，制备方法操作简便、易于控制；该黄烷类单体化合物可用于制备抗糖尿病作用、肝保护作用和抗肿瘤作用药物。

Description

一种黄烷类单体化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及中药提取技术领域，且特别涉及一种黄烷类单体化合物及其制备方法和应用。

背景技术

龙血竭，拉丁文名RESINADRACONIS，其为百合科剑叶龙血树含脂木材的提取物，种植范围主要分布在我国云南、广西及东南亚国家。据《本草纲目》记载，龙血竭性温、平，味甘、咸，无毒，入血分，归肺、脾、肾三经，具有活血化瘀、消肿止痛、收敛止血，软坚散结、生肌敛疮等显著功效。

龙血竭中的酚类成分的类别较多，包括黄酮类、二氢查耳酮类、二苯乙烯类、高异黄烷酮类和黄酮寡聚体类等。而黄烷类化合物(flavans)是广泛存在于自然界中的一类化合物，具有多种重要的生理活性，如降低血液中的胆甾醇的含量、抗细菌、抗病毒、以及拒食等。

目前，对龙血竭的化学成分研究多集中在龙血素A、龙血素B、剑叶龙血素B等成分，对龙血竭这种药材中的其他成分的提取和研究还不充分。

发明内容

本发明的目的在于提供一种黄烷类单体化合物，其是从龙血竭中提取得到的新化合物。

本发明的另一目的在于提供一种黄烷类单体化合物的制备方法，该方法操作简便、易于控制。

本发明的另一目的在于提供一种黄烷类单体化合物的应用，该黄烷类单体化合物可用于制备抗糖尿病作用、肝保护作用和抗肿瘤作用药物。

本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。

本发明提出一种黄烷类单体化合物，其为(2S)-6,4'-二羟基-5-甲基黄烷，结构式为：

一种上述的黄烷类单体化合物的制备方法，其包括以下步骤：

将龙血竭提取物与聚酰胺混合，装入聚酰胺柱中，以乙醇溶液梯度洗脱，依次得到不同的洗脱物：第一组分、第二组分、第三组分、第四组分和第五组分；

将第三组分用硅胶拌样，装入硅胶柱中，以石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，再经过硅胶柱反复层析，最后经过高效液相色谱仪分离，得到黄烷类单体化合物。

进一步地，在本发明较佳实施例中，龙血竭提取物的制备方法是：将龙血竭药材粉碎成细粉，先用质量浓度为0.3％-0.8％的NaOH溶液溶解，再用HCl溶液调节pH至1.5-3.5，抽滤、干燥，得龙血竭提取物。

进一步地，在本发明较佳实施例中，龙血竭提取物与聚酰胺的质量比为1-2：1-2。

进一步地，在本发明较佳实施例中，以乙醇溶液梯度洗脱时，顺次收集m份洗脱物，m为正整数，m≥10，采用薄层色谱法检测每份洗脱物，合并相同组分的洗脱物，分别得到第一组分、第二组分、第三组分、第四组分和第五组分。

进一步地，在本发明较佳实施例中，梯度洗脱采用的乙醇溶液的质量浓度分别为30％-45％、50％-65％、70％-85％、100％。

进一步地，在本发明较佳实施例中，梯度洗脱采用的石油醚-乙酸乙酯的石油醚和乙酸乙酯的质量比分别为(35-50：1)、(8-15：1)、(3-7：1)、(1：1)。

一种上述的黄烷类单体化合物的应用，黄烷类单体化合物用于制备抗糖尿病作用药物。

一种上述的黄烷类单体化合物的应用，黄烷类单体化合物用于制备肝保护作用药物。

一种上述的黄烷类单体化合物的应用，黄烷类单体化合物用于制备抗肿瘤作用药物。

本发明实施例的黄烷类单体化合物及其制备方法和应用的有益效果是：本发明实施例的黄烷类单体化合物为(2S)-6,4'-二羟基-5-甲基黄烷，制备方法是将龙血竭提取物与聚酰胺混合，装入聚酰胺柱中，以乙醇溶液梯度洗脱，依次得到不同的洗脱物：第一组分、第二组分、第三组分、第四组分和第五组分；将第三组分用硅胶拌样，装入硅胶柱中，以石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，再经过硅胶柱反复层析，最后经过高效液相色谱仪分离，得到黄烷类单体化合物。该黄烷类单体化合物是从龙血竭中提取得到的新化合物，制备方法操作简便、易于控制；该黄烷类单体化合物可用于制备抗糖尿病作用、肝保护作用和抗肿瘤作用药物。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例1提供的一种黄烷类单体化合物的氢谱；

图2为本发明实施例1提供的一种黄烷类单体化合物的碳谱；

图3为本发明实施例1提供的一种黄烷类单体化合物的HMBC谱；

图4为本发明实施例1提供的一种黄烷类单体化合物的圆二色谱图；

图5为本发明实施例1提供的一种黄烷类单体化合物的高分辨质谱；

图6为本发明实施例1提供的一种黄烷类单体化合物的红外图谱；

图7为本发明实施例1提供的一种黄烷类单体化合物的紫外图谱。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本发明实施例的黄烷类单体化合物及其制备方法和应用进行具体说明。

本发明实施例提供一种黄烷类单体化合物，其为(2S)-6,4'-二羟基-5-甲基黄烷，结构式为：

本发明实施例还提供一种黄烷类单体化合物的制备方法，其包括以下步骤：

S1、将龙血竭药材粉碎成细粉，先用质量浓度为0.3％-0.8％的NaOH溶液溶解，再用HCl溶液调节pH至1.5-3.5，抽滤、干燥，得龙血竭提取物。

S2、将龙血竭提取物与聚酰胺按质量比为1-2：1-2混合，装入聚酰胺柱中，以质量浓度分别为30％-45％、50％-65％、70％-85％、100％的乙醇溶液梯度洗脱，依次得到不同的洗脱物：第一组分、第二组分、第三组分、第四组分和第五组分。

具体方法是在以乙醇溶液梯度洗脱时，顺次收集m份洗脱物，m为正整数，m≥10，采用薄层色谱法TLC检测每份洗脱物，合并相同组分的洗脱物，分别得到第一组分、第二组分、第三组分、第四组分和第五组分。

S3、将第三组分用硅胶拌样，装入硅胶柱中，以质量比分别为(35-50：1)、(8-15：1)、(3-7：1)、(1：1)的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，再经过硅胶柱反复层析，最后经过高效液相色谱仪分离，得到黄烷类单体化合物。

本发明实施例还提供一种上述的黄烷类单体化合物的应用，黄烷类单体化合物作为淀粉酶抑制剂，用于制备抗糖尿病作用药物。

本发明实施例还提供一种上述的黄烷类单体化合物的应用，黄烷类单体化合物用于制备肝保护作用药物。

本发明实施例还提供一种上述的黄烷类单体化合物的应用，黄烷类单体化合物用于制备抗肿瘤作用药物。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供一种黄烷类单体化合物，其采用以下提取工艺制得：

将240g龙血竭药材粉碎成细粉，先用质量浓度为0.4％的NaOH溶液溶解后，再用HCl溶液调pH至2.0，抽滤，干燥，得167.2g龙血竭提取物。

称量150g上述龙血竭提取物，与150g聚酰胺混合，装入聚酰胺柱中，以质量浓度分别为40％、60％、80％、100％的乙醇溶液梯度洗脱，TLC检测合并相同组分，分别得到5个组分的洗脱物：10.87g第一组分Fr.1、30.93g第二组分Fr.2、30.08g第三组分Fr.3、42.72g第四组分Fr.4、26.21g第五组分Fr.5。

取30g第三组分Fr.3用硅胶拌样，装入硅胶柱中，以质量比分别为(40：1)、(10：1)、(5：1)、(1：1)的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，再经过反复硅胶柱层析，最后经过高效液相色谱仪分离，得到红色油状液体，即黄烷类单体化合物。

以下对实施例1中的黄烷类单体化合物进行检测。

分别对实施例1中的黄烷类单体化合物进行检测，对应得到该黄烷类单体化合物的氢谱H-NMR、碳谱C-NMR、HMBC谱、圆二色谱图、高分辨质谱、红外图谱和紫外图谱，具体如图1-图7所示，其中，¹H-与¹³C-NMR数据(氘代试剂：(CD₃)₂CO-d₆)如下表所示：

表1 ¹H-与¹³C-NMR数据

上述检测结果分析如下：

EI-MS显示分子离子峰为256[M]^-，图5所示的高分辨质谱HREI-MS显示256.1095[M]^-(calcd for C₁₆H₁₆O₃,256.1099)，结合图2所示的碳谱和DEPT谱确定其分子式：C₁₆H₁₆O₃。

¹H-NMR(600MHz,CO(OD₃)₂-d₆)中显示四个芳香质子信号：δ6.85(2H,d,J＝8.4Hz)，δ7.30(2H,d,J＝8.4Hz)构成AA'BB'耦合系统，可推断出该结构存在一个对位取代的苯环，此外还有δ6.39(1H，d,J＝7.8Hz)，δ6.71(1H,d,J＝7.8Hz)为苯环上邻位位耦合的2个氢。

图1所示的氢谱高场区质子：1.90(1H,m)，2.12(1H,m)，2.65(1H,m)，2.86(1H,m)为2个亚甲基信号。

¹³C-NMR(150MHz,CO(OD₃)₂-d₆)显示出16个碳信号：157.6(C-4')，154.8(C-8a)，154.5(C-6)，134.1(C-1')，127.8(C-2'，6')，126.9(C-8)，115.7(C-3',5')，113.3(C-5),111.8(C-4a)，107.9(C-7)，77.9(C-2)，30.7(C-3)，25.3(C-4)，8.4(5-CH₃)。综合以上信息可以推断出该化合物的母核结构为黄烷。

在图3所示的HMBC谱中，H-2与C-2'相关，H-3和C-CH₃相关由此推断-CH₃与C5相连；图4所示的圆二色谱(CD)显示：在287nm处呈现负的Cotton效应，故可以推测C-2为S构型。

综合以上信息，推断实施例1中的黄烷类单体化合物为(2S)-6,4'-二羟基-5-甲基黄烷，结构式为：

实施例2

将240g龙血竭药材粉碎成细粉，先用质量浓度为0.3％的NaOH溶液溶解后，再用HCl溶液调pH至1.5，抽滤，干燥，得166.5g龙血竭提取物。

称量150g上述龙血竭提取物，与200g聚酰胺混合，装入聚酰胺柱中，以质量浓度分别为45％、65％、85％、100％的乙醇溶液梯度洗脱，TLC检测合并相同组分，分别得到5个组分的洗脱物：10.52g第一组分Fr.1、30.41g第二组分Fr.2、30.12g第三组分Fr.3、42.62g第四组分Fr.4、26.16g第五组分Fr.5。

取30g第三组分Fr.3用硅胶拌样，装入硅胶柱中，以质量比分别为(50：1)、(15：1)、(7：1)、(1：1)的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，再经过反复硅胶柱层析，最后经过高效液相色谱仪分离，得到红色油状液体，即黄烷类单体化合物。

经检测，该黄烷类单体化合物为(2S)-6,4'-二羟基-5-甲基黄烷。

实施例3

将240g龙血竭药材粉碎成细粉，先用质量浓度为0.8％的NaOH溶液溶解后，再用HCl溶液调pH至3.5，抽滤，干燥，得168.5g龙血竭提取物。

称量150g上述龙血竭提取物，与100g聚酰胺混合，装入聚酰胺柱中，以质量浓度分别为30％、50％、70％、100％的乙醇溶液梯度洗脱，TLC检测合并相同组分，分别得到5个组分的洗脱物：11.25g第一组分Fr.1、30.46g第二组分Fr.2、30.418g第三组分Fr.3、42.23g第四组分Fr.4、26.02g第五组分Fr.5。

取30g第三组分Fr.3用硅胶拌样，装入硅胶柱中，以质量比分别为(35：1)、(8：1)、(3：1)、(1：1)的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，再经过反复硅胶柱层析，最后经过高效液相色谱仪分离，得到红色油状液体，即黄烷类单体化合物。

经检测，该黄烷类单体化合物为(2S)-6,4'-二羟基-5-甲基黄烷。

以下对实施例1-3中的黄烷类单体化合物的应用及效果进行验证。

一、抗糖尿病作用：

取实施例1中的黄烷类单体化合物进行抗糖尿病实验(α-淀粉酶抑制实验)，淀粉酶抑制剂是糖苷水解酶抑制剂中的一种，它能阻碍食物中碳水化合物在人体内的水解，减少糖分的摄入，降低血糖含量，因此被广泛应用于治疗II型糖尿病。

具体试验过程为：首先把淀粉天青加入0.05M的Tris–HCl缓冲液(pH＝6.9，包含0.01M的CaCl₂)，煮沸5分钟得到10mg/mL底物，放置备用。然后把α-淀粉酶(0.6μg/ml)先与不同浓度的样品一起预孵育20min，再加入200μL底物开始反应，混合物在37℃孵育10min。接着加入500μL醋酸终止反应。最后在3000rpm、4摄氏度条件下离心5分钟，150μL上清液转移至96孔板放入酶标仪，在595nm测定吸收强调。

α-淀粉酶抑制活性计算公式如下：

其中：

A_c+：0.1mlDMSO₄+0.1ml酶+0.1ml缓冲液+0.2ml底物+0.5ml冰醋酸；

A_c-：0.1mlDMSO₄+0.1ml缓冲液+0.1ml缓冲液+0.2ml底物+0.5ml冰醋酸；

A_s+：0.1ml样品+0.2ml酶+0.1ml缓冲液+0.2ml底物+0.5ml冰醋酸；

A_b-：0.1ml样品+0.2ml缓冲液+0.1ml缓冲液+0.2ml底物+0.5ml冰醋酸。

结果表明：该黄烷类单体化合物作为淀粉酶抑制剂对于α-淀粉酶有抑制作用，IC50达到40.25±2.12mg/mL。

二、肝保护作用：

本试验探讨实施例2中的黄烷类单体化合物对叔丁基过氧化氢(t-BHP)引起的小鼠急性肝损伤的保护作用。

具体试验过程为：选择采用ICR雄性小鼠，共计45只，分为5组：空白对照组、模型组、低剂量组、中剂量组和高剂量组，每组9只。称取黄烷类单体化合物，用生理盐水溶解至适当浓度，并按分组灌胃给药7天，空白对照组和模型组的动物则给予生理盐水，剂量为15mL/kg体重。治疗组动物给予化合物溶液，低、中、高剂量分别为100mL/kg、200mL/kg、400mL/kg体重。第8天灌胃4h后，模型组和治疗组小鼠腹腔注射t-BHP(1.5mmol/kg)，空白对照组小鼠腹腔注射同体积的生理盐水。24h后从小鼠眼眶取血，3000r/min离心10min，取上清液，-20℃保存待测。最后，断颈处死小鼠取肝。

血清指标的检测：取小鼠血清检测天冬氨酸氨基转移酶(AST)和丙氨酸氨基转氨酶(ALT)，具体方法参考南京建成试剂盒说明。肝组织其它相关指标超氧化物歧化酶(SOD)、还原型谷胱甘肽(GSH)和谷胱甘肽S转移酶(GST)的检测方法参照南京建成试剂盒说明。

结果表明：该黄烷类单体化合物具有抑制损伤小鼠肝脏的脂质过氧化作用，能够增加肝脏中GSH含量，提高SOD和GST水平，减少肝脏氧化损伤。该黄烷类单体化合物具有很好的肝保护作用，可作为食品和药品进行开发利用。

三、抗肿瘤作用：

取实施例3中的黄烷类单体化合物进行抗肿瘤抑制试验，具体试验过程为：建立U14宫颈癌移植瘤小鼠模型，40只615近交系小鼠均于右侧背部皮下注射瘤细胞1×10⁷个/只(0.2mL)，每天观察小鼠及局部成瘤情况，肿瘤直径≥2.0mm时为成瘤。皮下接种肿瘤后第6天，40只小鼠皮下移植处均成瘤，将小鼠随机分成4组随机分为4组，每组10只，分别设为低剂量组、高剂量组、阴性对照组和环磷酰胺阳性对照组。将低、高剂量组中每天每只小鼠的量定为2.0mg/kg、8mg/kg，并溶解于0.1mL、0.9％的氯化钠溶液中，每天灌胃1次；对照组每天用同体积的0.9％氯化钠溶液灌胃；环磷酰胺组小鼠则给予3mg/kg注射液腹腔注射，连续给药20天。第26天处死全部小鼠进行指标检测，并将肿瘤组织分为3部分，分别用于RT-PCR检测、Westernblot检测。接种前和接种后每两天称1次小鼠的体重，按体重变化调整给药。接种后每两天测量1次小鼠皮下肿瘤最长径(a)和最短径(b)，计算肿瘤体积(V＝a×b²/2)。第26天完整剥离肿瘤称重，计算抑瘤率：

抑瘤率＝(1-治疗组平均瘤质量/对照组平均瘤质量)×100％。

结果表明：连续灌胃15天后，小鼠的肿瘤组织受到明显的抑制。低、高剂量均能明显地抑制U14宫颈癌肿瘤的生长(p<0.05)，肿瘤抑制率分别为32.45％和61.97％。该黄烷类单体化合物具有很好的抗肿瘤作用，可作为食品和药品进行开发利用。

综上所述，本发明实施例的黄烷类单体化合物是从龙血竭中提取得到的新化合物；黄烷类单体化合物的制备方法操作简便、易于控制；黄烷类单体化合物的应用是用于制备抗糖尿病作用、肝保护作用和抗肿瘤作用药物。

以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims

1.一种黄烷类单体化合物的制备方法，其特征在于，黄烷类单体化合物为(2S)-6,4'-二羟基-5-甲基黄烷，结构式为：

制备方法包括以下步骤：

将龙血竭提取物与聚酰胺混合，装入聚酰胺柱中，以乙醇溶液梯度洗脱，梯度洗脱采用的乙醇溶液的质量浓度分别为30％-45％、50％-65％、70％-85％、100％，依次得到不同的洗脱物：第一组分、第二组分、第三组分、第四组分和第五组分；

将所述第三组分用硅胶拌样，装入硅胶柱中，以石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，梯度洗脱采用的石油醚-乙酸乙酯的质量比分别为(35-50：1)、(8-15：1)、(3-7：1)、(1：1)，再经过硅胶柱反复层析，最后经过高效液相色谱仪分离，得到所述黄烷类单体化合物；

所述龙血竭提取物的制备方法是：将龙血竭药材粉碎成细粉，先用质量浓度为0.3％-0.8％的NaOH溶液溶解，再用HCl溶液调节pH至1.5-3.5，抽滤、干燥，得龙血竭提取物。

2.根据权利要求1所述的黄烷类单体化合物的制备方法，其特征在于，所述龙血竭提取物与所述聚酰胺的质量比为1-2：1-2。

3.根据权利要求1所述的黄烷类单体化合物的制备方法，其特征在于，以乙醇溶液梯度洗脱时，顺次收集m份洗脱物，m为正整数，m≥10，采用薄层色谱法检测每份洗脱物，合并相同组分的洗脱物，分别得到第一组分、第二组分、第三组分、第四组分和第五组分。