CN108003238A

CN108003238A - 一种能特异识别ctla-4的全人源单克隆抗体或抗体片段及其方法和用途

Info

Publication number: CN108003238A
Application number: CN201711233978.2A
Authority: CN
Inventors: 杨光; 孙金霞
Original assignee: Changzhou Velox Pharmaceutical Science & Technology Co Ltd
Current assignee: Changzhou Velox Pharmaceutical Science & Technology Co Ltd
Priority date: 2017-11-30
Filing date: 2017-11-30
Publication date: 2018-05-08
Anticipated expiration: 2037-11-30
Also published as: CN108003238B

Abstract

本发明公开了一种能特异识别CTLA‑4的全人源单克隆抗体或抗体片段及其方法和用途，该抗体或抗体片段包含：重链和轻链，所述的抗体片段为抗原与所述的抗体结合的片段。其中，重链和轻链均包括可变区，该可变区包括互补决定区；重链的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3分别用HCDR1、HCDR2和HCDR3表示。本发明的抗体或抗体片段能够特异性的与人源CTLA‑4结合，结合的亲和力强，可用于细胞表面标志物的分选和鉴定，且不抑制APC与T细胞的活化途径，不影响CTLA‑4的功能。

Description

一种能特异识别CTLA-4的全人源单克隆抗体或抗体片段及其方法和用途

技术领域

本发明涉及一种识别CTLA-4的抗体，具体涉及一种能特异识别CTLA-4的全人源单克隆抗体或抗体片段及其方法和用途。

背景技术

细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4，cytotoxic T-lymphocyte-associatedprotein 4)是一种白细胞分化抗原，是T细胞上的一种跨膜受体，与CD28共同享有B7分子配体，但与CD28的功能相反，CTLA-4与B7分子结合后，可减缓细胞周期的进程，降低IL2的产生，使人或小鼠T细胞活化增殖受到抑制，从而使免疫达到平衡，保持外周免疫耐受。

抗CTLA-4抗体能够在体内外有效、特异地抑制细胞和体液免疫反应，对移植排斥反应及各种自身免疫性疾病有显著的治疗作用，毒副作用低，是目前被认为较有希望的新的免疫抑制药物。

CTLA-4可以作为一种T细胞的表面标志物，用于分选和鉴定。但是普通的抗体在识别CTLA4的同时会影响CTLA4功能，这样的抗体可以用于癌症治疗，但不适合用于细胞表面标志物的分选和鉴定。

发明内容

本发明的目的是提供一种能特异识别CTLA-4的全人源单克隆抗体或抗体片段及其方法和用途，该抗体或抗体片段的特殊性在于与CTLA-4结合的亲和力强，但不阻断APC(抗原提呈细胞，Antigen Presentation Cell)与T细胞的活化途径，本发明的抗体可用于CTLA-4的检测，特别是用于不影响CTLA4功能的条件下的检测。

为了达到上述目的，本发明提供了一种能特异识别CTLA-4的全人源单克隆抗体或抗体片段，该抗体或抗体片段包含：重链和轻链，所述的抗体片段为抗原与所述的抗体结合的片段。

其中，所述的重链和轻链均包括可变区，该可变区包括互补决定区。

其中，所述重链的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3分别用HCDR1、HCDR2和HCDR3表示。

其中，所述轻链的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3分别用LCDR1、LCDR2和LCDR3表示。

其中，所述的HCDR1的氨基酸序列包括SEQ ID NO：3或该序列内一个或少数几个氨基酸突变的SEQ ID NO：3。

其中，所述的HCDR2的氨基酸序列包括SEQ ID NO：4或该序列内一个或少数几个氨基酸突变的SEQ ID NO：4。

其中，所述的HCDR3的氨基酸序列包括SEQ ID NO：5或该序列内一个或少数几个氨基酸突变的SEQ ID NO：5。

其中，所述的LCDR1的氨基酸序列包括SEQ ID NO：6或该序列内一个或少数几个氨基酸突变的SEQ ID NO：6。

其中，所述的LCDR2的氨基酸序列包括SEQ ID NO：7或该序列内一个或少数几个氨基酸突变的SEQ ID NO：7。

其中，所述的LCDR3的氨基酸序列包括SEQ ID NO：8或该序列内一个或少数几个氨基酸突变的SEQ ID NO：8。

优选地，上述少数几个氨基酸是指1～3个氨基酸；上述突变是指氨基酸置换。

所述的重链可变区氨基酸序列包括SEQ ID NO：1或与SEQ ID NO：1中的氨基酸至少有80％同源性的氨基酸序列；所述的轻链可变区氨基酸序列包括SEQ ID NO：2或与SEQID NO：2中的氨基酸至少有80％同源性的氨基酸序列。

所述的抗体或抗体片段与人CTLA-4结合的KD值小于等于1.0×10^-12摩尔。

所述的抗体或抗体片段为：嵌合抗体或其片段，人源化抗体或其片段，全人源抗体或其片段，或选自以下的抗体片段：Fab、F(ab’)₂、Fv、dAb和scFv。

所述的重链和轻链都还包括恒定区，该恒定区为人lgG的恒定区，优选地为lgG1的恒定区。

本发明还提供了一种核苷酸分子，该核苷酸分子编码如所述的能特异识别CTLA-4的全人源单克隆抗体或抗体片段。

该核苷酸分子的序列选自SEQ ID NO：9和/或SEQ ID NO：10；序列SEQ ID NO：9编码所述的抗体或抗体片段的重链可变区；序列SEQ ID NO：10编码所述的抗体或抗体片段的轻链可变区。

本发明还提供了一种表达载体，该表达载体含有如所述的核苷酸分子。

本发明还提供了一种宿主细胞，该宿主细胞含有如所述的表达载体；所述的宿主细胞为真核宿主细胞，该真核宿主细胞包含293F细胞。

本发明还提供了一种根据所述的能特异识别CTLA-4的全人源单克隆抗体或抗体片段的制备方法，其特征在于，该方法包含：

步骤1：制备含有表达所述的能特异识别CTLA-4的全人源单克隆抗体或抗体片段的核苷酸分子的表达载体；

步骤2：用步骤1的表达载体转染真核宿主细胞；

步骤3：在适合细胞培养的条件下，培养步骤2转染的真核宿主细胞；

步骤4：分离纯化，获得所述的抗体或抗体片段。

其中，所述的真核宿主细胞包含293F细胞，但不限于293F细胞，还可以使用中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、NSO骨髓瘤细胞、非洲绿猴肾细胞(COS)和骨髓瘤细胞(SP2)。在理论上可以在原核或真核宿主细胞中表达本发明的抗体或抗体片段，但是优选在真核细胞中，最优选在哺乳动物宿主细胞中表达该抗体，因为真核细胞(尤其哺乳动物细胞)比原核细胞更容易组装和分泌正确折叠的具有活性的抗体。

在步骤3中，在温度为37℃下，摇床培养细胞。

所述的表达载体含有选自SEQ ID NO：9和/或SEQ ID NO：10的核苷酸序列。

本发明还提供了一种用于细胞表面表达CTLA-4标志物的细胞的分选和鉴定的方法，其特征在于，该方法使用如所述的能特异识别CTLA-4的全人源单克隆抗体或抗体片段进行细胞分选和鉴定。

本发明的能特异识别CTLA-4的全人源单克隆抗体或抗体片段及其方法和用途，具有以下优点：

本发明的抗体或抗体片段与CTLA-4结合的亲和力强，其KD值小于等于1.0×10^-12摩尔，表明了本发明的抗体和抗体片段的特异性高；本发明的抗体或抗体片段可以特异性与CTLA-4结合，但不阻断APC与T细胞的活化途径。

附图说明

图1为实验例1中筛选CTLA-4三轮富集增长倍数条形图。

图2为实验例4中本发明的不同浓度抗体与人CTLA-4结合曲线图。

图3为实验例4中本发明的不同浓度抗体与小鼠CTLA-4结合曲线图。

图4为实验例5中本发明的抗体与人CTLA-4结合的亲和力曲线图。

图5为实验例6中本发明的抗体抑制人CTLA4与其受体CD80结合的影响曲线图。

图6为实验例6中本发明的抗体抑制人CTLA4与其受体CD80(B7-1)和CD86(B7-2)结合的影响曲线图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的说明。

定义

“抗体”是指包含通过二硫键互相连接在一起的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白，或其抗原结合部分。抗体包括完整抗体及其任何抗原结合片段或单链抗体。

“重链”由重链可变区(VH)和重链恒定区组成。

“重链恒定区”由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。

“轻链”由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。

“轻链恒定区”由一个结构域组成。

“重链可变区”和“轻链可变区”可进一步再分为高变区，称为“互补决定区”(CDR)，CDR散布在被称为“构架区”(FR)的更加保守的区域中。每个VH和VL均由三个CDR和四个FR组成，它们从氨基端向羧基端以如下顺序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4，重链和轻链的可变区含有可与抗原相互作用的结合结构域。

“恒定区”可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，该宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(如效应细胞)和经典补体系统的第一成分(C1q)。

“抗原结合部分”是指保留与抗原(如CTLA-4)特异性结合的能力的抗体的一个或多个片段。已证明抗体的抗原结合功能可由全长抗体的片段来行使。“抗原结合部分”中所包括的结合片段包括：(1)Fab片段，即由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(2)F(ab’)₂片段，即包含在铰链区(重链CHl和CH2功能区之间的区域)通过二硫键连接的两个Fab片段的双价片段；(3)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(4)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(5)由VH结构域组成的dAb片段；(6)分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由单独的基因编码，但它们可以利用重组方法连接在一起，能够制成一条蛋白质链，其中VL和VH区配对构成单价分子称为单链Fv(即scFv)，这种单链抗体也包括在术语“抗原结合部分”内。这些抗体片段用本领域技术人员公知的常规技术获得，并用与完整抗体相同的方法对这些片段的实用性进行筛选。

“嵌合抗体”是指其中可变区序列来源于一个物种而恒定区序列来源于另一个物种的抗体(如其中可变区序列来源于小鼠抗体而恒定区序列来源于人抗体的抗体)。

“人源化抗体”是指其中来源于另外一种哺乳动物种系(如小鼠种系)的CDR序列被移植到人构架序列上的抗体，在人构架序列内也可以进行其它的构架区修饰。

“全人源抗体”包括具有如下可变区的抗体，在该可变区中，框架区和CDR区都源自人种系免疫球蛋白序列。而且，如果该抗体含有恒定区，则恒定区也源自人种系免疫球蛋白序列。本发明的人抗体可包含并非由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(如通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。但是，本文使用的术语“全人源抗体”不包括其中源自另一哺乳动物种系(如小鼠种系)的CDR序列被移植到人构架序列上的抗体。

“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指由单一分子组成的抗体分子制剂。单克隆抗体组合物表现出对特定表位(被抗原受体特异性识别的抗原部分)的特异性结合和亲和性。

“人单克隆抗体”是指表现单一结合特异性的抗体，其构架区和CDR区均源自人种系免疫球蛋白序列的可变区。

“ka”是指特定抗体-抗原相互作用的结合，“kd”是指特定抗体-抗原相互作用的解离，“KD”是指解离常数，它是由kd与ka的比值获得(即kd/ka)，用摩尔浓度(M)表示。抗体的KD值能用本领域建立的常规方法测定，测定抗体KD的一种优选方法为表面等离振子共振法，优选使用生物传感器系统。

“药学上可接受的载体”是适用于受试者而无过度不良反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益风险比的载体。

“转染”的各种形式包括常用于将外源DNA导入原核或真核宿主细胞中的各种技术，如电穿孔、磷酸钙沉淀或脂质体转染等。

本发明的能特异识别CTLA-4的全人源单克隆抗体或抗体片段能够用于制备诊断和分选试剂，特别是用于分选表达有CTLA4的细胞时，不影响CTLA4与其受体CD80(B7-1)或CD86(B7-2)的相互作用。

CTLA-4能够表达于活化的T细胞表面，CTLA-4与APC细胞上的CD80或CD86(CTLA-4的两个配体)结合，产生抑制性信号，下调或终止T细胞的活化。本发明的能特异识别CTLA-4的全人源单克隆抗体或抗体片段能够特异性的靶向CTLA-4，但不影响T细胞的活化，以达到特殊鉴定或者分选CTLA4阳性细胞的目的。

现在结合以下附图和实验例对本发明的技术方案做进一步的说明。

部分材料来源说明于此：

人CTLA-4蛋白：Human CTLA-4/CD152Protein(His Tag)，Biotinylated(以下简称抗原，购自Sino Biological Inc.货号为11159-H08H-B)。

小鼠CTLA-4蛋白：小鼠CTLA4/CD152蛋白(His标签)(购自Sino Biological Inc.货号为50503-M08H-100)。

狗EGF/Epidermal Growth Facto蛋白(His标签)：(以下简称对照抗原，购自SinoBiological Inc.货号为11159-H08H-B)

全人单链抗体的噬菌体抗体库：(为常州费洛斯药业科技有限公司构建)。

链霉亲和素磁珠：(购自Invitrogen公司)。

高吸附酶联免疫反应微孔板：(购自康宁公司)。

pComb3载体：购自Addgene(Plasmid#63888)

Anti-M13HRP抗体：(购自赛默飞公司)。

M13辅助噬菌体：(购自Invitrogen公司)。

SOC培养基：(购自生工生物工程(上海)股份有限公司，货号A507009-0250)

XL1-blue细菌：(购自安捷伦公司，货号为200228)。

LB固体培养基平板：将5g酵母提取物，10g蛋白胨，10g氯化钠，10g琼脂粉溶于1L的双蒸水中，在121℃高温下高压灭菌，然后倒在平板上。

显影液ABTS溶液：(购自赛默飞公司，货号为002024)。

Gelred核酸染料：(购自赛默飞公司)。

pFUSE-IgG1表达载体：(购自Invitrogen公司)。

质粒抽提试剂盒：(购自Qiagen公司)。

限制性内切酶：(购自NEB公司)。

重组酶：(购自Novoprotein公司)。

293fectin^TMTransfection Reagent：(购自Invitrogen公司，货号为12347019)。

293Freestyle悬浮细胞：(购自赛默飞公司)。

Pierce^TMBCAProtein Assay Kit：(购自Pierce，货号为23227)。

CBS抗原固定溶液：将1.59g Na2CO3和2.93g NaHCO3溶于1L水中，调整pH值为9.6。

Rabbit Anti-Human(Fc)HRP二抗：(购自洛阳佰奥通实验材料中心，货号：C020221)。

96孔底透板：(购自Corning公司)。

96孔单条可拆酶标板：(购自Corning公司)。

OCTET仪器：(购自Fortebio公司，Octet Q)。

Protein A芯片：(购自GE公司)。

GM-CSF：(购自R&D Biosystems)。

单核细胞负选择试剂盒：(购自MitenyiBiotech)。

多标记微孔板检测仪平台：(购自PerkinElmer公司)。

微孔板：(购自PerkinElmer公司，货号为6008280)。

Ipilimumab抗体：(购自SelleckChem公司，货号A2001)。

实验例1抗CTLA-4抗体的筛选

1.全人单链抗体的噬菌体抗体库：设计引物扩增抗体的重链可变区和轻链可变区，通过重叠延伸PCR的方式用Linker将重链可变区和轻链可变区连接起来，得到全长的PCR产物，用SfiI限制性内切酶切PCR产物和pComb3噬菌粒载体，将连接转化产物电转化入XL1-blue感受态细胞，然后向感受态细胞中加入3mL的SOC培养基，30℃培养1h后，加入终细胞培养条件浓度为50μg/mL的氨苄青霉素，10μg/mL的四环素溶液20mL，37℃振荡培养2h。然后加入浓度为1013/mL的M13辅助噬菌体50μL，室温孵育1h，中间每隔10min轻摇一次。37℃振荡培养2h，再加入终浓度为70μg/mL的卡纳霉素，30℃过夜培养。离心收集上清，加入浓度为10％的PEG-8000/氯化钠溶液(PEG即聚乙二醇)，置于冰浴1h，8000rpm，4℃离心，弃上清液，用2mL浓度为1％的BSA(Albumin from bovine serum，牛血清白蛋白)的PBS溶液(Phosphate Buffer Solution，磷酸缓冲液)充分溶解沉淀，离心收集上清液，即为全人单链抗体的噬菌体抗体库。

2、抗体筛选

取表达全人单链抗体的噬菌体抗体库200μL(含有噬菌体1×10¹²个/mL)与5μgCTLA-4抗原混合，室温孵育30min后加入50μL的链霉亲和素磁珠，与抗原结合的噬菌体被链霉亲和素化的磁珠捕获，未结合的噬菌体经含有0.05％Tween-20的PBS溶液漂洗后被去除，用盐酸甘氨酸(pH 2.2)溶液将与磁珠稳定结合的噬菌体洗脱待用。

接种XL1-Blue细菌(大肠杆菌菌株)200mL，待OD(光密度)达到0.6后，加入上述洗脱的噬菌体，与XL1-Blue细菌在37℃静置30min，菌液涂在氨苄青霉素抗性平板上，第二天洗脱收集氨苄抗性平板上的菌体，再侵染1×10¹²pfu/mL(plaque forming unit/mL，噬菌斑形成单位)的M13辅助噬菌体，扩增后进行下一轮筛选，重复上述筛选步骤3轮。

将第3轮侵染噬菌体的XL1-Blue菌液做几个不同浓度梯度的稀释，然后将这些菌液分别涂布于直径为15cm抗性为氨苄青霉素的LB固体培养基平板，每个平板上有100-500个克隆，挑取单克隆抗体，通过噬菌体酶联免疫反应对淘选后的最后一轮噬菌体库进行验证。

3、噬菌体酶联免疫反应

将转染噬菌体的XL1-Blue单克隆菌接种到2mL的96孔细菌深孔培养板(购自Corning公司)中，加入500μL含有氨苄青霉素与四环素抗性的SB(Super Broth，生工生物工程(上海)股份有限公司，货号A507026)培养基，200rpm转速下37℃摇床4-6h，检测OD₆₀₀(600nm波长处的吸光值)值接近0.6后，加入1μL的辅助噬菌体，在30℃下摇床过夜，第二天3000g离心取上清待用。

取酶联免疫微孔板，包被抗原(包括对照抗原)4℃过夜，第二天，PBST洗脱之后用含有5％脱脂奶粉的PBST(0.05％加入Tween-20的PBS)封闭，然后加入上一步制备好的噬菌体上清，室温孵育2h，再加入Anti-M13HRP抗体孵育30min，后用PBST洗3次，加入50μLABTS显影液。

4、实验结果：

如图1所示，为实验例1中筛选CTLA-4三轮富集增长倍数条形图，CTLA-4抗原在全人抗体噬菌体展示库中进行筛选，经过3轮筛选后，单克隆数增长比例比第1轮增加200多倍，表明经过3轮筛选后能够表达与CTLA-4抗原特异性结合抗体的噬菌体不断的被富集。从第3轮筛选后得到的噬菌体库中挑取96个单克隆进行酶联免疫反应验证，最后确定酶联免疫反应读值是对照抗原两倍以上的单克隆作为阳性单克隆，对阳性单克隆进行测序，获得阳性克隆的核苷酸编码序列，将获得的序列导入Invitrogen公司的BlastX软件比对分析，序列重复出现次数较多的序列即为有效富集的核苷酸编码序列。

实验例2构建抗CTLA-4全长抗体的pFUSE-IgG1表达载体

以实验例1中筛选得到的噬菌体核苷酸编码序列为模板，设计PCR引物，分别扩增出重链可变区和人IgG1的恒定区，通过重叠延伸PCR法将重链可变区和人IgG1恒定区拼接起来，再通过重组的方法将片段接入pFUSE表达载体(pFUSE表达载体通过限制性内切酶EcoRΙ和NheΙ作用于酶切位点)中，由此获得本发明的全长抗体重链的pFUSE-IgG1表达载体。同样，设计PCR引物，分别扩增本发明单克隆抗体的轻链可变区和人Lambda链(IgG1的轻链)的恒定区，通过重叠延伸PCR方法将这两段拼接起来，将拼接的片段重组入pFUSE表达载体，由此获得本发明的全长抗体轻链的pFUSE-IgG1表达载体。

实验结果：

上述构建的全长抗体重链的pFUSE-IgG1表达载体和本发明的全长抗体轻链的pFUSE-IgG1表达载体，其中重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：1，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：2。

实验例3抗CTLA-4全人源单克隆抗体的制备(表达和纯化)

将30μL的293Fectin^TMTransfection Reagent与30μg的上述获得的真核表达载体混合，瞬时转染30mL的293Freestyle悬浮细胞，在125rpm转速下37℃摇床培养72h，离心后收集上清，采用HiTrap Protein AHP columns单抗纯化柱在蛋白纯化仪上进行抗体蛋白纯化，再使用BCA法蛋白定量试剂盒检测抗体浓度，获得的抗体浓度一般高于1mg/ml，抗体名称标记为IgG1-6E2-CTLA-4。

实验例4酶联免疫反应(ELISA)检测IgG1-6E2-CTLA-4抗体分别与人CTLA-4和小鼠CTLA-4的结合

Corning 96孔单条可拆酶标板一条，分别用CBS抗原固定溶液稀释的抗原人CTLA-4(浓度0.2微克/微升)和小鼠CTLA-4(浓度0.2微克/微升)包被板孔，4℃过夜孵育。PBST漂洗三次，加入含脱脂奶粉浓度为5％的PBST封闭液，37℃条件下封闭1h。PBST漂洗三次，加入实验例3获得的不同浓度的IgG1-6E2-CTLA-4抗体，37℃条件下孵育1h，漂洗干燥后加入Rabbit Anti-Human(Fc)HRP二抗(原液1：2000稀释)，室温震荡孵育30min，用PBST漂洗3次，加入显影底物ABST溶液，最后使用酶标仪读取数值。

实验结果：

如图2所示，为实验例4中本发明的不同浓度抗体与人CTLA-4结合曲线图，当IgG1-6E2-CTLA-4抗体浓度达到1ng/μL时，抗体与人CTLA-4结合速率最大，当IgG1-6E2-CTLA-4抗体浓度达到4ng/μL时，抗体与人CTLA-4结合趋于饱和。

如图3所示，为实验例4中本发明的不同浓度抗体与小鼠CTLA-4结合曲线图，IgG1-6E2-CTLA-4抗体与小鼠CTLA-4有明显结合，当IgG1-6E2-CTLA-4抗体浓度达到8ng/μL时，抗体与人CTLA-4的结合仍未饱和。

实验例5检测抗CTLA-4全人源单克隆抗体的结合特异性和结合动力学特征

采用多循环动力学的方法检测抗体与抗原亲和力和动力学特征，抗体固定采用捕获法进行，先将IgG1-6E2-CTLA-4抗体偶联在Protein A芯片上，然后将CTLA-4样品梯度稀释后流过芯片表面，稀释的起始浓度为33nM，稀释倍数为2倍，共稀释7个浓度点，CTLA-4就会被已经偶联的IgG1-6E2-CTLA-4抗体所捕获，抗原与抗体结合后信号被检测并记录，最后用再生试剂(pH1.5的甘氨酸溶液)将Protein A芯片表面的抗体和抗原样品全部洗脱，并进行新一轮检测。

实验结果：

如图4所示，为实验例5中本发明的抗体与人CTLA-4结合的亲和力曲线图，每一条线代表不同的IgG1-6E2-CTLA-4抗体浓度，CTLA-4抗体浓度越高，结合的越快，信号越强，说明IgG1-6E2-CTLA-4抗体与CTLA-4亲和力好，在120秒后置换到PBS溶液中，将抗原与抗体解离，通过OCTET生物分子相互作用仪检测证明IgG1-6E2-CTLA-4抗体与CTLA-4蛋白相互作用，本发明的IgG1-6E2-CTLA-4抗体的KD为1.0×10^-12。

实施例6荧光能量共振转移法(HTRF)检测抗体抑制人CTLA4与其受体CD80(B7-1)、CD86(B7-2)相互作用

荧光共振能量转移技术指在供体和受体相互靠得很近时，光子能从一个受激发的荧光团(供体)转移到另一个荧光团(受体)，并使后者发出荧光。

本检测使用的CTLA4/B7-1检测试剂盒(购自CISBIO(中国)，货号为：64ICP04PEG)，；本检测使用的CTLA4/B7-2检测试剂盒(购自CISBIO(中国)，货号为64ICP05PEG)。

详细注意事项及操作方法请参考说明书，以下试剂均由试剂盒内提供。步骤为：将2微升抗体、4微升Tag1-B7-1/2和4微升Tag2-CTLA4溶液混合，室温孵育15分钟，然后加入10微升的预混anti-Tag1-Tb3+和anti-Tag2-XL665溶液；室温继续孵育2小时或者过夜，最后在Envision(PerkinElmer公司)酶标仪上读取数值。

实验结果：

如图5所示，为实验例6中本发明的抗体抑制人CTLA4与其受体CD80结合的影响曲线图，如图6所示，为实验例6中本发明的抗体抑制人CTLA4与其受体CD80(B7-1)和CD86(B7-2)结合的影响曲线图，图中纵坐标为吸光比值665/615，即在665nm下的吸光比值与在615nm下的吸光比值，横坐标为抗CTLA-4抗体浓度的log值，从图5可以看出抗体(6E2，IgG1-6E2-CTLA-4)不影响CTLA4与其受体CD80(B7-1)的结合，而阳性对照抗体Ipilimumab(SelleckChem,A2001)可以抑制其结合。从图6可以看出抗体(6E2，IgG1-6E2-CTLA-4)不影响CTLA4与其受体CD86(B7-2)的结合，而阳性对照抗体Ipilimumab(SelleckChem,A2001)可以抑制其结合。

综上所述，本发明的能特异识别CTLA-4的全人源单克隆抗体或抗体片段及其方法和用途，该抗体或抗体片段与CTLA-4结合的亲和力强，但不阻断APC与T细胞的活化途径。

尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

序列表

<110> 常州费洛斯药业科技有限公司

<120> 一种能特异识别CTLA-4的全人源单克隆抗体或抗体片段及其方法和用途

<130> 0

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 127

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Glu Thr Ser Glu Ser Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Phe Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Gly Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Pro Leu His Arg Ser Ser Ser Gly Thr Tyr Tyr His Tyr

100 105 110

Phe Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 2

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Ser Leu Thr Cys Thr Leu Arg Ser Gly Ile Asn Val Gly Ala

20 25 30

Tyr Arg Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Pro Pro Gln Phe

35 40 45

Leu Leu Arg Tyr Lys Ser Asp Ser Asp Lys Glu Gln Gly Arg Gly Val

50 55 60

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Asp Ala Ser Ala Asn Ala Gly Ile

65 70 75 80

Leu Leu Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys

85 90 95

Met Ile Trp His Asn Asn Ala Val Phe Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu

100 105 110

Thr Val Leu Gly

115

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Gly

1 5

<210> 4

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Ile Ile Pro Ile Phe Glu Thr Ser

1 5

<210> 5

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Ala Arg Asp Pro Leu His Arg Ser Ser Ser Gly Thr Tyr Tyr His Tyr

1 5 10 15

Phe Met Asp Val

20

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Ser Gly Ile Asn Val Gly Ala Tyr Arg

1 5

<210> 7

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Tyr Lys Ser Asp Ser Asp Lys

1 5

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Met Ile Trp His Asn Asn Ala Val Phe

1 5

<210> 9

<211> 381

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

caggtgcagc tggtgcagtc cggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60

tcctgcaagg cctctggagg caccttcagt agttatggca tcagttgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttgagac atcagagtcc 180

gcacagaagt tccagggcag agtcacattt accgccgaca aatcctcgag cacaggctac 240

atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccatat attactgtgc gagagatccc 300

ctacatagga gttcgtccgg gacatactac cactacttta tggacgtctg gggccaaggg 360

acaatggtca ccgtctcctc a 381

<210> 10

<211> 348

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

caggctgtgc tcactcagcc gtcttccctc tctgcatctc ctggagcatc agtcagtctc 60

acctgcactt tacgcagtgg catcaatgtt ggtgcctaca ggatatactg gtaccagcag 120

aagccaggga gtcctcccca gtttctcctg aggtacaagt cagactcaga taaggagcag 180

ggccgtggag tccccagtcg cttctctgga tccaaagatg cttcggccaa tgcagggatt 240

ttactcatct ctgggctcca gtctgaggat gaggctgact attactgtat gatttggcac 300

aacaatgctg tgttcttcgg cggagggacc aagctgaccg tcctaggt 348

Claims

1.一种能特异识别CTLA-4的全人源单克隆抗体或抗体片段，其特征在于，该抗体或抗体片段包含：重链和轻链，所述的抗体片段为抗原与所述的抗体结合的片段；

所述的重链和轻链均包括可变区，该可变区包括互补决定区；

所述重链的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3分别用HCDR1、HCDR2和HCDR3表示；

所述轻链的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3分别用LCDR1、LCDR2和LCDR3表示；

所述的HCDR1的氨基酸序列包括SEQ ID NO：3或该序列内一个或少数几个氨基酸突变的SEQ ID NO：3；

所述的HCDR2的氨基酸序列包括SEQ ID NO：4或该序列内一个或少数几个氨基酸突变的SEQ ID NO：4；

所述的HCDR3的氨基酸序列包括SEQ ID NO：5或该序列内一个或少数几个氨基酸突变的SEQ ID NO：5；

所述的LCDR1的氨基酸序列包括SEQ ID NO：6或该序列内一个或少数几个氨基酸突变的SEQ ID NO：6；

所述的LCDR2的氨基酸序列包括SEQ ID NO：7或该序列内一个或少数几个氨基酸突变的SEQ ID NO：7；

所述的LCDR3的氨基酸序列包括SEQ ID NO：8或该序列内一个或少数几个氨基酸突变的SEQ ID NO：8。

2.根据权利要求1所述的能特异识别CTLA-4的全人源单克隆抗体或抗体片段，其特征在于，所述的重链可变区氨基酸序列包括SEQ ID NO：1或与SEQ ID NO：1中的氨基酸至少有80％同源性的氨基酸序列；

所述的轻链可变区氨基酸序列包括SEQ ID NO：2或与SEQ ID NO：2中的氨基酸至少有80％同源性的氨基酸序列。

3.根据权利要求2所述的能特异识别CTLA-4的全人源单克隆抗体或抗体片段，其特征在于，所述的抗体或抗体片段与人CTLA-4结合的KD值小于等于1.0×10^-12摩尔。

4.根据权利要求1-3中任意一项所述的能特异识别CTLA-4的全人源单克隆抗体或抗体片段，其特征在于，所述的抗体或抗体片段为：嵌合抗体或其片段，人源化抗体或其片段，全人源抗体或其片段，或选自以下的抗体片段：Fab、F(ab’)₂、Fv、dAb和scFv。

5.一种核苷酸分子，其特征在于，该核苷酸分子编码如权利要求1-3中任意一项所述的能特异识别CTLA-4的全人源单克隆抗体或抗体片段；

该核苷酸分子的序列选自SEQ ID NO：9和/或SEQ ID NO：10；

序列SEQ ID NO：9编码所述的抗体或抗体片段的重链可变区；

序列SEQ ID NO：10编码所述的抗体或抗体片段的轻链可变区。

6.一种表达载体，其特征在于，该表达载体含有如权利要求5所述的核苷酸分子。

7.一种宿主细胞，其特征在于，该宿主细胞含有如权利要求6所述的表达载体；该真核宿主细胞包含293F细胞。

8.一种根据权利要求1-3中任意一项所述的能特异识别CTLA-4的全人源单克隆抗体或抗体片段的制备方法，其特征在于，该方法包含：

步骤2：用步骤1的表达载体转染真核宿主细胞；

步骤3：培养步骤2转染的真核宿主细胞；

步骤4：分离纯化，获得所述的抗体或抗体片段；

所述的真核宿主细胞包含293F细胞。

9.根据权利要求8所述的能特异识别CTLA-4的全人源单克隆抗体或抗体片段的制备方法，其特征在于，所述的表达载体含有选自SEQ ID NO：9和/或SEQ ID NO：10的核苷酸序列。

10.一种用于细胞表面表达CTLA-4标志物的细胞的分选和鉴定的方法，其特征在于，该方法使用如权利要求1-3中任意一项所述的能特异识别CTLA-4的全人源单克隆抗体或抗体片段进行细胞分选和鉴定。