CN107988238A - 观赏羽衣甘蓝花青素相关R2R3-MYB基因BoMYB及其表达载体与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种观赏羽衣甘蓝花青素相关R2R3‑MYB基因BoMYB及其表达载体与应用，所述BoMYB基因的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示，可用于调控花青素的生物合成。本发明通过同源克隆的方法获得羽衣甘蓝紫叶性状调控基因BoMYB，采用实时荧光定量PCR方法对BoMYB基因在不同组织的表达模式进行研究，分析显示，BoMYB表达具有组织特异性，且基因表达量与各组织中花青素含量相关。在拟南芥中异源表达验证表明BoMYB过表达能增加转基因拟南芥植株花青素的积累。

Description

观赏羽衣甘蓝花青素相关R2R3-MYB基因BoMYB及其表达载体 与应用
本研究得到国家自然科学基金(No.31401908)；黑龙江省自然科学基金(No.C2016056)；黑龙江省普通高等学校青年创新人才培养计划项目(No.UNTYSCT-2017155)和黑龙江省教育厅青年学术骨干项目 (No.135209313)的共同资助。
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及一种观赏羽衣甘蓝花青素 MYB基因及其表达载体与应用。
背景技术
羽衣甘蓝原产于地中海和小亚细亚一带，2年生草本植物，为十字花科芸薹属甘蓝种的一个变种，与野生甘蓝、结球甘蓝、紫甘蓝、皱叶甘蓝、苤蓝和抱子甘蓝同属于欧洲西北部沿海地区类群，既可用于城市绿化，也是餐桌上的一道美食，具有赏食兼用的特点。观赏羽衣甘蓝叶形叶色上变异丰富，根据叶形可以分为皱叶、圆叶和羽叶3 种类型；从叶色来分，中心显色叶有纯白、黄白、黄绿、粉色、玫瑰红、紫红等。其中，粉色、玫瑰红、紫红等颜色呈现与叶片中花青素含量有密切关系。
花青素又称为花色素，是类黄酮生物合成途径中最主要的代谢产物之一，是自然界中重要的水溶性黄酮类色素，它赋予植物的花、果实、茎、叶和根等器官红色、粉色、蓝色及紫色甚至黑色等五彩缤纷的色彩。植物中的花青素不稳定，常与糖结合以配糖体的形式存在，形成花色素苷，其基本结构有双键存在，在波长范围分别为465-560 和270-280有最大光吸收。花青素的生物合成受两类基因调控：一类是结构基因，编码花青素生物合成的催化酶；另一类是转录因子，通过调控结构基因的表达，在转录水平上参与植物颜色的形成。转录调节是花青素生物合成途径中调节其结构基因表达的重要环节之一。转录因子与结构基因启动子的被识别顺式作用元件结合，单独或者协同调节花青素生物合成途径中结构基因，从而有效控制植物体内花青素的合成。在多种植物研究中表明，MYB转录因子在花青素苷生物合成途径中起着重要的调控作用。一些关键MYB转录因子在植物体内超表达时可以显著的提高花青素的含量，比如拟南芥的AtMYB75/PAP1、番茄的SlANT1、苹果的MdMYB10和MdMYB10α、花椰菜的BoMYB2 以及甜菜的BvMYB1等(Borevitz et al.，2000；Chagné etal.，2013； Chiu et al.，2010；Espley et al.，2007；Hatlestad et al.，2015；Mathewset al.，2003)，而功能缺失或表达受到抑制，将会导致花青素在植物体内不能正常的积累(El-Sharkawy et al.，2015；Singh et al.，2014； Wang et al.，2013)；另一些MYB基因表达时会抑制花青素的生物合成，当活性丧失时，会上调表达结构基因的表达，花青素苷含量上升 (Albert et al.,2014；Dubos et al.，2008)。
目前，十字花科作物花青素生物合成的研究主要集中在拟南芥、紫甘蓝、紫心大白菜、紫菜薹等植物中，研究了光照、温度等环境因素对花青素合成相关基因表达的影响，并提出了MYB、bHLH及WDR 协同调控花青素合成的模型。至今，羽衣甘蓝花青素的合成研究还处于初步探索阶段(张彬，2014)，对转录因子的基因克隆及调控机制研究尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种观赏羽衣甘蓝花青素相关R2R3-MYB 基因BoMYB，通过BoMYB基因的克隆、组织表达分析、拟南芥遗传转化，获得该基因的基础信息，发现该基因可能参与调控花青素的生物合成，为研究转录因子的功能提供技术和材料基础。
本发明所提供的BoMYB基因的cDNA序列如下所示：
ATGGAGGATTCGTCCAAAGGGTTGACAAAAGGTGCATGGACGGCTGAAGAAGACAGTCTCTTGAGGCGATGCATTGATAAGTATGGAGAAGGCAAATGGCATCAAGTTCCTTTAAGAGCTGGGCTTAATAGGTGTAGGAAGAGTTGTAGACTAAGATGGCTGAACTATTTGAAGCCAACTATCAAGAGAGGAAAACTTAGCTCTGATGAAGTTGATCTTCTTCTCCGTCTTCATAAGCTTTTAGGAAACAGGTGGTCTTTAATTGCTGGTAGACTACCCGGTCGGACCGCTAATGATATCAAGAATTACTGGAACACCCATCTGAGCAAGAAACATGAACCATGTTGTAAGACCAAGATGAAGAAGAGAAACGTTACATTCTCTTCTACCACACCCGCCCAAAAAATCGACGTTTTCAAACCTCGACCTCGACTCTTCACCGTTAGCAATGGCTGCAGCCATCTCCATGGCCTGCCAGAAGTTGACGTTGTTCCTCCATGCCTTGGACTCAACAACATTAATAATGTCTGTGAAAATAGTATGACATATTGTAACAAAGCTGGGGAGAAGTATGAACTTTTTAGTAATTTAATGGATGGAGAGAATATGTGGTGGGAGAGTTTGCTAGAGGAGAGCAAACAGCCTGACGGGCTCGTTCCAAAAGGTACGGCAACAAAAAAGGGGGCAACCTTTGCGTTTGACGTTGAGCAACTTTGGAATATGTTGGATGGAGAGACTGTAGAA CTTGATTAG。
基因cDNA长753bp，相对分子质量为28.5kD，等电点(pI)为 9.08，蛋白质分子式为C1255H1996N360O368S15，理论半衰期为30h，不稳定指数是39.56，脂肪系数为75.64。与其它植物的MYB序列比对分析， BoMYB氨基酸序列与甘蓝型油菜的MYB蛋白聚成一类，在进化上亲缘关系最近；与野生甘蓝、萝卜、拟南芥和亚麻芥的MYB的亲缘关系较近；与烟草和棉花的MYB基因的亲缘关系最远。BoMYB具有两个典型的MYB-DNA-binding结构域，为R2R3MYB转录因子，在氨基酸序列的第13、33、53、85、104位的色氨酸(W)为保守氨基酸。SOPMA 在线预测BoMYB蛋白的二级结构。BoMYB含有35.2％的α-螺40.4％的不规则卷曲、12.4％β-转角和12.0％的延伸链。BoMYB亚细胞定位于细胞核中。
本发明的目的之二是提供一种观赏羽衣甘蓝花青素相关BoMYB 基因表达载体pEalyget-BoMYB，所述载体的结构如图1所示。
本发明的目的之三是提供一种观赏羽衣甘蓝花青素相关BoMYB 基因的应用，所述BoMYB基因可用于调控花青素的生物合成。
本发明具有如下优点：
本发明通过同源克隆的方法获得羽衣甘蓝紫叶性状调控基因 BoMYB，采用实时荧光定量PCR方法对BoMYB基因在不同组织的表达模式进行研究，分析显示，BoMYB表达具有组织特异性，且基因表达量与各组织中花青素含量相关。在拟南芥中验证异源基因BoMYB 表达，表明BoMYB过表达能增加转基因拟南芥植株花青素的积累。
附图说明
图1为载体pEalyget-BoMYB的结构图；
图2为BoMYB基因RT-PCR扩增片段，M:D2000 plus marker， 1～4：RT-PCR扩增产物；
图3为BoMYB系统发育树；
图4为BoMYB蛋白R2，R3结构域的同源性比较；
图5为BoMYB蛋白的二级结构；
图6为羽衣甘蓝各组织表型性状；
图7为羽衣甘蓝各组织花青素含量；
图8为BoMYB在羽衣甘蓝各组织中相对表达量；
图9为BoMYB在转基因拟南芥株系中相对表达量；
图10为转基因拟南芥与野生型拟南芥表型性状；
图11为转基因拟南芥与野生型拟南芥花青素含量。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
本发明拟从紫叶羽衣甘蓝中克隆花青素苷调控相关的 R2R3-MYB蛋白基因，对其不同器官表达特性进行分析，利用农杆菌介导转化拟南芥，探究BoMYB的异源表达对转基因拟南芥的表型变化的影响，进一布验证并探讨该基因功能及与花青素的关系。具体步骤如下：
1材料与方法
1.1材料
紫叶羽衣甘蓝在温度光照可控的温室中种植(温度25/10℃(昼/ 夜)，光照16h)。9月中旬播种于含营养土的营养钵中，长至4叶期移栽到15cm直径花盆中，10月底长至最佳观赏期，取样，-80℃保存备用。
1.2花青素含量测定、总RNA的提取与cDNA合成
对羽衣甘蓝根、茎表皮、内叶、外叶中的花青素含量分别进行测定(参照(Niu etal.，2010)花青素提取方法)。利用Trizol(Invitrogen， USA)试剂盒提取羽衣甘蓝总RNA，NanoDrop 2000分光光度计 (Thermo Scientific，USA)测定浓度及OD260/OD280，利用琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。cDNA第一链合成参照AMV反转录试剂盒 (上海生工)说明书完成。
1.3 BoMYB基因的克隆及序列分析
利用GenBank中已知拟南芥MYB基因(NP_176813.1)的保守序列进行分析，并以此为探针在芸薹属基因组数据库 (http://brassicadb.org/brad/)中找到同源基因，根据BLAST比对结果，运用Primer 5.0软件设计目的基因特异引物F (5’-ATGGAGGATTCGTCCAAAGGGTTGAC-3’和R (5’-ATCAAGTTCTACAGTCTCTCCATCCAAC-3’)，对cDNA进行扩增。PCR产物在1％的琼脂糖凝胶电泳，回收特异产物，并连接到 pGWC-T载体上，转化大肠杆菌DH5α感受态，对阳性克隆测序。
利用ProtParam在线程序分析编码蛋白的理化性质(氨基酸组成、相对分子质量、等电点等)；WoLF PSORT(http://www.genscript. com/wolf-psort.html)进行亚细胞定位预测； IntelPro(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)分析蛋白保守结构域；利用DNA-MAN进行氨基酸序列比对，采用邻接法(Neighbor-Joining，NJ) 生成MYB基因的系统进化树，校验参数Bootstrap重复1000次(分支长度与系统发育距离成正比用)。
1.4表达分析
运用荧光定量PCR检测BoMYB基因在羽衣甘蓝根、茎、心叶及外叶的表达情况，以18S rRNA作为内参，设计特异引物 BoMYB-RT-F(5’-AGGTGTAGGAAGAGTTGTAGAC-3’)/BoMYB-RT-R(5’-AGAAGATCAACTTCATCAGAGC-3’)， 18S-RT-F(5’-CCAGGTCCAGACATAGTAAG-3’)/18S-RT-R(5’-GTACA AAGGGCAGGGACGTA-3’)。采用10μl PCR反应体系：含1μl反转录cDNA，5μl of 2×Green PCR Master Mix (Qiagen,Germany)，10μmol·L-1的上下游引物各0.2μl及3.6μlH2O。扩增条件为95℃预变性5min，95℃变性10s，40个循环后60℃退火 30s,试验进行3次重复，取平均值。使用2–ΔΔCT方法进行相对表达量分析。
1.5植物转化载体构建及拟南芥转化
含有有目的基因的质粒作为入门载体(Entery vector，pEarleyGate 103)，利用Technology with ClonaseTMII试剂盒(上海 Invitrogen公司)进行LR反应，反应产物转化大肠杆菌DH5α(北京 Tiangen公司)，在LB固体培养基(含50μg/mL Kan和50μg/mL HygB)上筛选阳性克隆，验证正确的载体命名为pEalyget-BoMYB，载体结构如图1所示。通过冻融法将构建好的表达载体 pEalyget-BoMYB转化农杆菌中，接下来用沾花法(Dipping)转化到拟南芥野生型Col-0。拟南芥中花青素含量和表达水平按照1.2和1.4方法分析。
2结果与分析
2.1 BoMYB基因cDNA克隆及生物信息学分析
以红叶羽衣甘蓝心叶总RNA反转录获得cDNA为模板，扩增得到大约750bp左右的目的基因片段(图2)。测序结果显示目的基因cDNA 的序列如SEQ ID NO.1所示，基因长753bp，命名为BoMYB。利用 Expasy软件对BoMYB基因编码的氨基酸序列进行理化性质分析，结果表明BoMYB相对分子质量为28.5kD，等电点(pI)为9.08，蛋白质分子式为C1255H1996N360O368S15，理论半衰期为30h，不稳定指数是39.56，脂肪系数为75.64，为稳定蛋白。编码一个含250个氨基酸的蛋白，与其它植物的MYB序列比对分析，构建系统发育树(图3)，BoMYB氨基酸序列与甘蓝型油菜的MYB蛋白聚成一类，在进化上亲缘关系最近；与野生甘蓝、萝卜、拟南芥和亚麻芥的MYB的亲缘关系较近；与烟草和棉花的MYB基因的亲缘关系最远。
InterPro数据库鉴定结果显示，BoMYB具有两个典型的 MYB-DNA-binding结构域，为典型的R2R3MYB转录因子基因，在氨基酸序列的第13、33、53、85、104位的色氨酸(W)为保守氨基酸(图4)。SOPMA在线预测BoMYB蛋白的二级结构，结果如图5 所示。BoMYB含有35.2％的α-螺40.4％的不规则卷曲、12.4％β-转角和12.0％的延伸链。亚细胞定位研究表明，BoMYB蛋白定位于细胞核。综合上述结果分析，BoMYB基因符合MYB类转录因子的特征，属于MYB家族基因成员。
2.2羽衣甘蓝花青素含量测定及BoMYB基因的表达分析
田间观察发现，紫叶羽衣甘蓝的茎表皮呈紫色，新叶呈粉紫色，叶片逐渐长大后呈绿色叶脉呈紫色，根部呈乳白色(图6)。
对各组织花青素含量进行测定，结果如图7所示：茎表皮花青素含量最高，心叶显著高于外叶，根花青素含量极低。为了了解BoMYB 在羽衣甘蓝不同器官组织中的表达情况，采用荧光定量RT-PCR进行基因表达分析，结果表明(图8)：BoMYB在紫叶羽衣甘蓝根、茎表皮、心叶、外叶中都有表达，但表达水平具有组织特异性。该基因在紫色茎表皮中表达量最高，在心叶和老叶中表达量较高，在根中微量表达。由此可以推断，羽衣甘蓝花青素的生物合成可能与BoMYB基因的高表达有关，BoMYB可能参与羽衣甘蓝花青素水平的调控。
2.3 pEalyget-BoMYB载体在拟南芥中的遗传转化与检测
通过农杆菌介导的沾花法将pEalyget-BoMYB载体转化到拟南芥中，经过培养得到T1种子经过50mg/L的卡那霉素培养基筛选后移栽温室生长，自交得到T2，再经自交和筛选后得到纯系用于后续试验。
将野生型Col-0和转BoMYB基因的拟南芥播于MS培养基上，置于22℃、70％相对湿度、120-150μmol.m-2.s-1和16h光照的植物生长箱生长。提取8个生长转基因拟南芥幼苗叶片总RNA，利用荧光定量PCR 检测BoMYB基因在不同转基因株系中的相对表达量，结果如图9所示。在8个株系中均有BoMYB基因表达，基因相对表达量从高到低排序依次为:cn7>cn3>cn5>cn6>cn1>cn8>cn2>cn4，将转基因植株继续培养至开花结籽。
2.4转基因植株形态学观察及花青素含量测定
观察表达量低(cn4)、中(cn6和cn1)和高(cn7)的转基因植株和野生型植株形态特点，其中转基因植株随着表达量的不同呈现出颜色差异，而在野生型中没有发现这些变化。主要表现为整个植株呈现不同程度紫色(图10)，即BoMYB基因表达量高的株系整个植株包括叶片、茎、以及根系均呈现出深紫色，表达量居中的株系表现为植株茎基部及根系呈现出紫色，而BoMYB 基因表达量低的株系只在根系中有颜色的改变。对以上4株转基因植株以及野生型植株进行花青素含量测定，野生型拟南芥中花青素含量为1.03mg.g-1，转基因株系花青素含量从高到低依次为 cn7、cn6、cn1、cn4，其中cn7株系的花青素含量为23.233mg.g-1，是野生型拟南芥的20倍(图11)。
序列表
<110> 齐齐哈尔大学
<120> 观赏羽衣甘蓝花青素相关R2R3-MYB基因BoMYB及其表达载体与应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 753
<212> DNA
<213> 羽衣甘蓝(Brassica oleracea L.var.acephala DC.)
<400> 1
atggaggatt cgtccaaagg gttgacaaaa ggtgcatgga cggctgaaga agacagtctc 60
ttgaggcgat gcattgataa gtatggagaa ggcaaatggc atcaagttcc tttaagagct 120
gggcttaata ggtgtaggaa gagttgtaga ctaagatggc tgaactattt gaagccaact 180
atcaagagag gaaaacttag ctctgatgaa gttgatcttc ttctccgtct tcataagctt 240
ttaggaaaca ggtggtcttt aattgctggt agactacccg gtcggaccgc taatgatatc 300
aagaattact ggaacaccca tctgagcaag aaacatgaac catgttgtaa gaccaagatg 360
aagaagagaa acgttacatt ctcttctacc acacccgccc aaaaaatcga cgttttcaaa 420
cctcgacctc gactcttcac cgttagcaat ggctgcagcc atctccatgg cctgccagaa 480
gttgacgttg ttcctccatg ccttggactc aacaacatta ataatgtctg tgaaaatagt 540
atgacatatt gtaacaaagc tggggagaag tatgaacttt ttagtaattt aatggatgga 600
gagaatatgt ggtgggagag tttgctagag gagagcaaac agcctgacgg gctcgttcca 660
aaaggtacgg caacaaaaaa gggggcaacc tttgcgtttg acgttgagca actttggaat 720
atgttggatg gagagactgt agaacttgat tag 753

Claims (3)

1.一种观赏羽衣甘蓝花青素相关R2R3-MYB基因BoMYB，其特征在于所述BoMYB基因的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种含有权利要求1所述观赏羽衣甘蓝花青素相关R2R3-MYB基因BoMYB的表达载体pEalyget-BoMYB。
3.一种权利要求1所述观赏羽衣甘蓝花青素相关R2R3-MYB基因BoMYB在调控花青素的生物合成中的应用。
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CN110229923A (zh) * 2019-05-22 2019-09-13 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 一种鉴别萝卜肉质根红肉色的分子标记

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