CN107980059A - 用于修饰基因组dna的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

组合物和方法涉及对内源基因组DNA区域进行序列修饰。某些方面涉及对细胞中的靶基因组DNA区域进行位点特异性序列修饰的方法，其包括：使细胞与活化组合物接触；用包含(a)供体DNA和(b)DNA消化剂的转染组合物转染所述细胞；其中所述供体DNA包含：(i)包含与所述靶基因组DNA区域同源之核酸序列的同源区域；以及(ii)序列修饰区域；并且其中在所述靶基因组DNA区域处特异性修饰所述基因组DNA序列。

Description

用于修饰基因组DNA的方法和组合物
背景技术
1.技术领域
本发明一般地涉及生物技术领域。更特别地，其涉及用于修饰基因组DNA的新方法和组合物。
2.相关领域的描述
靶向基因组修饰具有治疗疾病的巨大潜力。在靶位点修饰DNA或位点特异性转基因整合可提供更有效的基因治疗方法。然而，目前的基因组工程方法提供非常低的修复或编辑效率，并且具有引入有害或不期望的DNA序列和后果的潜在可能。
目前的基因治疗的治疗方法利用了病毒载体进行基因转移的用途。然而，涉及病毒载体的基因治疗方法具有以下缺点：将病毒序列引入人宿主中，这可能触发宿主免疫原性。尽管存在用于基因治疗的非病毒方法，但是由于这些方法的低效率、毒性或缺乏特异性，其在临床环境中的使用受到阻碍。
用于基因组工程的更有效的方法还提供了离体治疗上的进步，因为其可以从患者中分离细胞，修饰基因组以校正突变或位点特异性地整合转基因，并将患者自己的细胞移植回体内以达到治疗效果。目前的方法过于无效或过于有毒而无法达到这些效果。在本领域中需要高效、无毒且稳定的允许定点基因组DNA修饰的技术。
发明内容
组合物和方法涉及对内源靶基因组DNA序列进行序列修饰。某些方面涉及对细胞中的靶基因组DNA区域进行位点特异性序列修饰的方法，其包括：使细胞与活化组合物接触；用包含(a)供体DNA和(b)DNA消化剂的转染组合物转染细胞。供体DNA包含两个区域。一个区域是包含与靶基因组DNA区域同源的核酸序列的同源区域，另一个区域是序列修饰区域。在上述方法中，在靶基因组DNA区域特异性修饰基因组DNA序列。
术语“序列修饰”是对DNA序列的改变，并且可包括内源基因组DNA序列的添加、改变或缺失。就添加而言，序列修饰可以是将转基因整合到靶基因组位点。例如，对于靶基因组序列，供体DNA包含序列修饰区域和与靶基因组序列互补、相同或同源的序列。序列修饰区域通常位于同源端之间。序列修饰不与靶基因组序列互补，并且包含靶基因组序列的变更。
本文中所述的供体DNA包含靶基因组DNA序列的序列修饰和与靶基因组DNA序列同源、相同或互补的序列。
本文中所使用的术语“互补”是指核苷酸之间的Watson-Crick碱基配对，并且具体地是指相互氢键键合的核苷酸，其中胸腺嘧啶或尿嘧啶残基通过两个氢键与腺嘌呤残基连接，胞嘧啶和鸟嘌呤残基通过三个氢键连接。通常，核酸包括被描述为与指定的第二核苷酸序列具有“百分比互补性”的核苷酸序列。例如，核苷酸序列可与指定的第二核苷酸序列具有80％、90％或100％的互补性，表示序列的10个核苷酸中的8个、10个核苷酸中的9个、10个核苷酸中的10个与指定的第二核苷酸序列互补。例如，核苷酸序列3′-TCGA-5′与核苷酸序列5′-AGCT-3′100％互补。此外，核苷酸序列3′-TCGA-与核苷酸序列5′-TTAGCTGG-3′的一个区域100％互补。本领域技术人员将认识到两个互补的核苷酸序列包括有义链和反义链。
“同源性”或“同一性”或“相似性”是指两个肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性。术语“同源区域”是指供体DNA上与靶基因组DNA序列具有一定程度的同源性的区域。同源性可以通过比较各个序列中的位置来确定，为了比较目的，可进行比对。当所比较序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则分子在该位置是同源的。序列之间的同源性程度是序列共有的匹配或同源位置的数目的函数。“不相关的”或“非同源的”序列与本发明的序列之一具有小于40％的同一性，尽管优选小于25％的同一性。
多核苷酸或多核苷酸区域(或者多肽或多肽区域)与另一序列具有一定百分比(例如，60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％)的“序列同一性”或“同源性”，意味着在比对时，在比较两个序列中该百分比的碱基(或氨基酸)是相同的。该比对和百分比同源性或序列同一性可以使用本领域已知的软件程序来确定，例如在Ausubel等编辑(2007)Current Protocols in Molecular Biology中描述的那些。
术语“转染”是指用于将生物活性物质(例如核酸、蛋白质、酶或小分子)引入细胞中的方法。核酸可以是DNA(作为质粒或寡聚体递送)和/或RNA或其组合。
术语“电穿孔”是指向细胞施加外部施加的电场的转染方法。在某些实施方案中，所使用的电穿孔方法为静电穿孔。
在某些实施方案中，所使用的转染方法是电穿孔。在另一个实施方案中，电穿孔方法是流式电穿孔。流式电穿孔是指如下方法，其包括：将细胞和负载分子的混悬液转移到包含流体室或流体流路的装置中；所述流体室或流体流路包含沿着流体室或流体流路的侧面设置的电极，并且被配置成使流体室或流体流路内的生物颗粒经历适用于电穿孔的电场；以及将经电穿孔的细胞混悬液转移出该装置。该方法对大规模体积的细胞是特别有效的。相比之下，静电穿孔涉及一组有限体积的细胞的电穿孔，这是由于与跨过液体移动电流和相对电极之间的距离相关的限制。
在某些方面中，将表达构建体转染到细胞中包括使细胞的混悬液流动通过流动室中的电场，电场是由至少部分地限定流动室的相对的带相反电荷的电极产生的，其中流动室的热阻小于约10℃/瓦。在另一些某些方面中，转染细胞包括使用这样的流式电穿孔仪器，其包含用于容纳待电穿孔的细胞的混悬液的室；该室至少部分地由相对的带相反电荷的电极限定；并且其中该室的热阻小于约10℃/瓦。
在某些方面中，将表达构建体转染到细胞中包括将细胞混悬液电穿孔或使其暴露于室中的电场，电场是由至少部分地限定室的相对的带相反电荷的电极产生的，其中该室的热阻小于约10℃/瓦。在另一些某些方面中，转染细胞包括使用这样的电穿孔仪器，其包含用于容纳待电穿孔的细胞的混悬液的室；该室至少部分地由相对的带相反电荷的电极限定；并且其中该室的热阻小于约10℃/瓦。
在某些方面中，室的热阻为约0.1℃每瓦至10℃每瓦。例如，室的热阻可为约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5或10℃/瓦，或者其中可推导出的任何热阻。
相对的带相反电荷的电极可彼此间隔至少1mm、至少2mm、至少3mm，或者其中可推导出的任何距离或范围。在所公开的任意实施方案中，室的与缓冲液接触的组合电极表面与电极之间的距离之比可为约1至100cm。例如，比例可为约1至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100cm，或者其中可推导出的任何值或范围。在某些方面中，室的与缓冲液接触的组合电极表面与电极之间的距离之比为约1至100cm，并且相对的带相反电荷的电极彼此间隔至少1mm。在另一些方面中，室的与缓冲液接触的组合电极表面与电极之间的距离之比为约1至100cm，并且相对的带相反电荷的电极彼此间隔至少3mm。在甚至另外的一些方面中，室的与缓冲液接触的组合电极表面与电极之间的距离之比为约1至100cm，并且相对的带相反电荷的电极彼此间隔约3mm至约2cm。例如，相对的带相反电荷的电极可彼此间隔约3、4、5、6、7、8、9或10mm，或者其中可推导出的任何距离，或者相对的带相反电荷的电极可彼此间隔约1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2.0cm，或者其中可推导出的任何距离。在这些实施方案的一些方面中，被电穿孔的细胞基本上不被此热降解。
在所公开的任意实施方案中，室的与缓冲液接触的组合电极表面与电极之间的距离之比可为约1至100cm。例如，比例可为约1至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100cm，或者其中可推导出的任何值或范围。在某些方面中，室的与缓冲液接触的组合电极表面与电极之间的距离之比为约1至100cm，并且相对的带相反电荷的电极彼此间隔至少1mm。在另一些方面中，室的与缓冲液接触的组合电极表面与电极之间的距离之比为约1至100cm，并且相对的带相反电荷的电极彼此间隔至少3mm。在甚至另外的一些方面中，室的与缓冲液接触的组合电极表面与电极之间的距离之比为约1至100cm，并且相对的带相反电荷的电极彼此间隔约3mm至约2cm。例如，相对的带相反电荷的电极可彼此间隔约3、4、5、6、7、8、9或10mm，或者其中可推导出的任何距离，或者相对的带相反电荷的电极可彼此间隔约1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2.0cm，或者其中可推导出的任何距离。在这些实施方案的一些方面中，被电穿孔的细胞基本上不被此热降解。
在所公开的任意实施方案中，仪器还可包含冷却元件以散热。例如，冷却元件可包括热电冷却元件。作为另一个实例，冷却元件可包括与电极流动接触的冷却流体。作为又一个实例，冷却元件可包括与电极有效相连的散热器。室的热阻可小于约3℃/瓦。在一些实施方案中，室的热阻为约0.5℃/瓦至4℃/瓦，或者室的热阻为约1℃/瓦至3℃/瓦。例如，室的热阻可为约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9或4.0℃/瓦，或者其中可推导出的任何值。
在某些涉及通过电穿孔转染细胞的方法中，该方法涉及使细胞混悬液暴露于强度大于0.5kV/cm的电场。例如，电场的强度可大于约3.5kV/cm。在某些方面中，电场的强度大于约0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0或3.5kV/cm，或者其中可推导出的任何值。
在一些实施方案中，转染细胞包括使用流式电穿孔仪器，该仪器包含：限定流动通道的壁，所述流动通道具有电穿孔区，其被配置成接收并短暂容纳连续流动的待电穿孔的细胞的混悬液；与流动通道流体连通的流入口，由此可以将混悬液通过流入口引入流动通道中；与流动通道流体连通的流出口，由此可以将混悬液通过出口从流动通道取出；在电穿孔区内限定流动通道的壁，其包含形成流动通道的第一壁的主要部分的第一电极和形成流动通道的与第一壁相对的第二壁的主要部分的第二电极，如此设置第一电极和第二电极使得当与电能来源电连通时，在其间形成电场，混悬液可以流动通过该电场；并且其中流动通道的热阻小于约10℃/瓦。
在某些这样的实施方案中，第一电极和第二电极或相对的带相反电荷的电极彼此间隔至少1mm。此外，室的与缓冲液接触的组合电极表面与电极之间的距离之比可为约1至100cm。在一些特定实施方案中，室的与缓冲液接触的组合电极表面与电极之间的距离之比可为约1至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100cm，或者其中可推导出的任何值或范围。在某些实施方案中，通过本文中所述的电穿孔方法电穿孔的细胞基本上不被由此热降解。在本文中所述的某些实施方案中，室是流动室。
在一些方面中，电穿孔仪器包括用于容纳待电穿孔的细胞的混悬液的室；该室至少部分地由相对的带相反电荷的电极限定；并且其中该室的与缓冲液接触的组合电极表面与电极之间的距离之比为约1至100cm。在一些特定方面中，比例为约1至70cm。在另一些特定方面中，比例为约1至50cm。例如，比例可为约1至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100cm，或者其中可推导出的任何值。在本文中所述的某些实施方案中，室是流动室。
在一些实施方案中，流式电穿孔仪器包含限定流动通道的壁，所述流动通道被配置成接收并暂时容纳连续流动的待电穿孔的细胞的混悬液；与流动通道流体连通的流入口，由此可以将混悬液通过流入口引入流动通道中；与流动通道流体连通的流出口，由此可以将混悬液通过出口从流动通道取出；限定流动通道的壁，其包含形成流动通道的第一壁的至少一部分的第一电极，和形成流动通道的与第一壁相对的第二壁的至少一部分的第二电极，如此设置第一电极和第二电极使得当与电能来源电连通时，在其间形成电场，混悬液可以流动通过该电场；并且其中流动通道的热阻小于约10℃/瓦。在某些方面中，流动通道的热阻为约0.1℃/瓦到10℃/瓦。例如，流动通道的热阻可为约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5或10℃/瓦，或者其中可推导出的任何热阻。第一电极和第二电极可彼此间隔至少1mm、至少2mm、至少3mm，或者其中可推导出的任何距离或范围。在所公开的任意实施方案中，流动室的与缓冲液接触的组合电极表面与电极之间的距离之比可为约1至100cm。例如，比例可为约1至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100cm，或者其中可推导出的任何值或范围。在某些方面中，流动室的与缓冲液接触的组合电极表面与电极之间的距离之比为约1至100cm，并且第一电极和第二电极彼此间隔至少1mm。在另一些方面中，流动室的与缓冲液接触的组合电极表面与电极之间的距离之比为约1至100cm，并且第一电极和第二电极彼此间隔至少3mm。在甚至另外的一些方面中，流动室的与缓冲液接触的组合电极表面与电极之间的距离之比为约1至100cm，并且第一电极和第二电极彼此间隔约3mm至约2cm。例如，第一电极和第二电极可彼此间隔约3、4、5、6、7、8、9或10mm，或者其中可推导出的任何距离，或者第一电极和第二电极可彼此间隔约1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2.0cm，或者其中可推导出的任何距离。在这些实施方案的一些方面中，在流动通道中被电穿孔的细胞基本上不被由此热降解。
在某些所公开的方法和仪器中，室的热阻为约0.1℃/瓦至约4℃/瓦。在一些方面中，室的热阻为约1.5℃/瓦至约2.5℃/瓦。例如，室的热阻可为约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9或4.0℃/瓦，或者其中可推导出的任何热阻。
在某些所公开的方法和仪器中，流式电穿孔仪器包含：限定流动通道的壁，所述流动通道被设置成接收并暂时容纳连续流动的包含颗粒的混悬液；与流动通道流体连通的流入口，由此可以将混悬液通过流入口引入流动通道中；与流动通道流体连通的流出口，由此可以将混悬液通过流出口从流动通道取出；限定流动通道的壁，包含形成流动通道的第一壁的第一电极板和形成流动通道的与第一壁相对的第二壁的第二电极板；其中选择接触混悬液的电极的面积和电极之间的距离使得流动通道的热阻小于约4℃/瓦；成对电极设置成与电能来源电连通，由此在电极之间形成电场；由此流动通过流动通道的颗粒混悬液可以经历在电极之间形成的电场。在某些方面中，限定流动通道的电极板还包括由非导电材料制成的并且设置在第一电极板和第二电极板之间以维持电极板处于间隔关系的垫片，垫片限定通道，在那里形成流动通道的相对侧壁。垫片可例如与第一电极板和第二电极板中的每一个形成密封。在一些实施方案中，仪器包含多个流动通道，并且垫片包含形成该多个通道中的每一个的相对侧壁的多个通道。在一些方面中，流入口和流出口之一包含有形成在电极板之一中并且与流动通道流体连通的孔。流入口和流出口中的另一个可包含有形成在电极板之一中并且与流动通道流体连通的孔。在某些方面中，流入口和流出口包含在电极板中的另一个中形成的并且与流动通道流体连通的孔。在所公开的任意实施方案中，仪器还可包含与流动通道有效相连的冷却元件以散热。例如，冷却元件可包含热电冷却元件。作为另一个实例，冷却元件可包含与电极接触的流动的冷却流体。作为又一个实例，冷却元件可包括与电极有效相连的散热器。流动通道的热阻可小于约3℃/瓦。在一些实施方案中，流动通道的热阻为约0.5℃/瓦至4℃/瓦，或者流动通道的热阻为约1℃/瓦至3℃/瓦。例如，流动通道的热阻可为约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9或4.0℃/瓦，或者其中可推导出的任何值。
在某些所公开的方法和仪器中，第一电极可包含长形的导电结构，其中第二电极包含管状的导电结构；其中电极同心地布置成使得第二管状电极以与第一电极间隔开的关系围绕第一电极；并且其中流动通道设置在第一电极和第二电极之间所限定的环形空间内。电极可形成限定流动通道的壁的至少一部分。在一些实施方案中，用于保持第一电极和第二电极的同心环形间隔件是间隔开的同心关系。在某些方面中，仪器布置成与第二类似仪器串联或并联。
在某些涉及通过流式电穿孔转染细胞的方法中，流动通道的热阻小于约10℃/瓦。在一些涉及通过流式电穿孔转染细胞的方法中，该方法涉及使待电穿孔的细胞的混悬液流动通过流动通道，并在流动通过流动通道的同时使混悬液暴露于电场，电场的强度大于0.5kV/cm。例如，电场的强度可大于约3.5kV/cm。在某些方面中，电场的强度大于约0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0或3.5kV/cm，或者其中可推导出的任何值。
在所公开的关于流式电穿孔仪器的实施方案中，特别考虑到流式电穿孔所述的参数和参数范围可用于本文中所述的方法中使用的静电穿孔仪器。在一些具体实施方案中，使用流式电穿孔，并排除静电穿孔或非流式电穿孔。在另一个具体实施方案中，使用静电穿孔并排除流式电穿孔。
本文中所述的方法还包括使用本领域已知的其他转染方法，例如基于化学的转染方法和基于非化学的转染方法。基于化学的转染方法包括例如磷酸钙、树枝状聚合物、脂质体转染(lipofection)和阳离子聚合物(例如DEAE-右旋糖或聚乙烯亚胺)。非化学方法包括细胞挤压、超声穿孔、光学转染、穿刺转染(impalefection)和流体动力学递送。还包括基于粒子的方法，例如使用基因枪、磁转染(即磁辅助的转染)和粒子轰击。
本文中所述的方法使用细胞活化步骤。在一些实施方案中，该细胞活化步骤在转染细胞之前。在一些实施方案中，在使细胞与活化组合物接触后少于七天的时间转染细胞。在一些实施方案中，在使细胞与活化组合物接触后少于3天的时间转染细胞。在一些实施方案中，在使细胞与活化组合物接触后2天或更短的时间转染细胞。在一些实施方案中，在使细胞与活化组合物接触后两天转染细胞。在一些实施方案中，在使细胞与活化组合物接触后少于14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4或3天的时间转染细胞。在一些实施方案中，在使细胞与活化组合物接触后10、9、8、7、6、5、4、3、2或1天的时间转染细胞。
在一些实施方案中，DNA消化剂选自TALEN、转座酶、整合酶和核酸酶。在一些实施方案中，DNA消化剂在一个或更多个RNA上编码。在一些实施方案中，DNA消化剂是核酸酶。在一些实施方案中，DNA消化剂是Cas9。在一些实施方案中，转染组合物还包含CRISPR RNA。在一些实施方案中，转染组合物还包含引导RNA。在一些实施方案中，核酸酶是位点特异性核酸酶。
在一些实施方案中，供体DNA是质粒。在一些实施方案中，供体DNA是寡核苷酸。在一些实施方案中，供体DNA是单链寡核苷酸。转染组合物中供体DNA的浓度可为约10至约1000μg/mL或者约10至约900、800、700、600、500、400、300、200、100或50μg/mL，或者其中任何可推导出的范围。
任意所公开的方法可包括使用限制性稀释经转染细胞来获得单个细胞集落的步骤。如本文中所用，术语“限制性稀释”是指大量稀释细胞培养物的过程，目的是在各个培养物中获得单个细胞。当这样的经分离的单个细胞增殖时，所得培养物仅包含原始细胞的克隆。例如，可使用多孔板来获得单个细胞培养物或集落。例如，限制性稀释可用于源自患者细胞的iPS研究(例如，用于镰状细胞患者的修复)。使用限制性稀释方法，可以将iPS细胞修饰成经校正的表达血红蛋白的细胞，将其分离并扩增以向患者施用。
在所公开的任意方法中，可采用包括扩增经分离和选择的克隆细胞以产生具有特定基因组DNA序列修饰的克隆细胞的步骤。
在所公开的涉及扩增经分离的克隆细胞的方法中，扩增可以是用于大规模制造的。例如，可以以大于1L的体积扩增细胞，或者可以以大于3L的体积扩增细胞。在某些方面中，以大于1.0、1.5、2.0、2.5或3.0L(或者其中可推导出的任何值)的体积扩增细胞。
在所公开的任意方法中，可采用另外的步骤，其包括冷冻经转染的和选择或筛选的细胞。还可采用甚至另外的步骤，其中扩增先前被冷冻的经转染的和选择/筛选的细胞。
在所公开的一些方法中，细胞培养物可包含本领域普通技术人员已知的任何另外的成分，如本领域普通技术人员基于培养的细胞的类型容易选择的。例如，可在丁酸钠或相当的盐中培养细胞。在一些实施方案中，在无血清培养基中培养细胞。
在所公开的一些方法中，可采用另外的步骤，其包括扩增经分离和选择或筛选的克隆细胞以产生具有基因组DNA序列修饰的克隆细胞。
另外的一些方面涉及用于产生包含靶基因组DNA序列的基因组DNA序列修饰的稳定细胞系的方法，所述方法包括：使细胞与活化组合物接触；用包含(a)供体DNA和(b)DNA消化剂的转染组合物转染细胞；其中供体DNA包含：(i)包含与靶基因组DNA区域同源的核酸序列的同源区域；和(ii)序列修饰区域；以及针对在靶基因组DNA区域处基因组DNA序列修饰来筛选经转染的细胞；通过限制性稀释分离筛选的经转染细胞以获得克隆细胞；扩增分离的经转染细胞以产生包含基因组DNA序列修饰的稳定细胞系。
本公开内容还提供了通过本文中所述的方法产生的细胞系或经转染细胞。
另一个方面涉及治疗患有或怀疑患有疾病或病症的对象的方法，其通过施用有效量的通过本文中所述的方法产生的细胞系或经转染细胞来进行。
另一个方面涉及临床研究方法，其包括施用有效量的通过本文中所述的方法产生的细胞系或经转染细胞。
特别考虑到可以排除本文中所述的一些实施方案。还考虑到当描述范围时，可以排除某些范围。
另外的一些方面涉及在有此需要的对象中治疗癌症的方法，其包括使细胞与活化组合物接触；用包含(a)供体DNA和(b)DNA消化剂的转染组合物转染细胞；其中所述供体DNA包含：(i)包含与靶基因组DNA区域同源的核酸序列的同源区域；和(ii)嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)；并且其中在靶基因组DNA区域特异性修饰基因组DNA序列以整合CAR；以及向患者施用细胞。在一些实施方案中，转染组合物是非病毒的。
在一些实施方案中，细胞是自体的。在一些实施方案中，细胞是T细胞或NK细胞。或者，如在整个申请中限定的，细胞可以是宿主细胞。在一些实施方案中，癌症是B细胞恶性肿瘤。在一些实施方案中，癌症是白血病。在一些实施方案中，癌症是急性成淋巴细胞白血病。在一些实施方案中，细胞分离自患者的血液。在一些实施方案中，细胞分离自遗传上匹配的供体。在一些实施方案中，细胞是供体细胞。在一些实施方案中，细胞通过采集术(apheresis)分离。在一些实施方案中，所述方法还包括从患者分离细胞。
另外的一些方面涉及用于对细胞中的靶基因组DNA区域进行位点特异性序列修饰的方法，其包括：使细胞与活化组合物接触；用包含(a)供体DNA和(b)DNA消化剂的非病毒转染组合物转染细胞；其中供体DNA包含：(i)包含与靶基因组DNA区域同源的核酸序列的同源区域；和(ii)序列修饰区域；并且其中在靶基因组DNA区域特异性修饰基因组DNA序列。在一些实施方案中，细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是T细胞。在一些实施方案中，T细胞是原代T细胞(primary T cell)。在一些实施方案中，活化组合物包含抗CD3和抗CD28抗体。在一些实施方案中，转染细胞包括对细胞进行流式电穿孔。
基于本文中所述的方法，可采用使用一种或更多种组合物。根据本文中所述的方法，可使用一种或更多种组合物以用于制备用于治疗的药物。贯穿本申请，讨论了另一些实施方案。关于本发明的一个方面所讨论的任何实施方案也适用于本发明的另一些方面，反之亦然。实施例部分中的实施方案被理解为可用于本文中所述技术的所有方面的实施方案。
如本说明书中所用，当使用没有数量词修饰的名词时，其可意指一个/种或更多个/种。如权利要求书中所用，当与词组“包含/包括”连用时，当使用没有数量词修饰的名词时，可意指一个/种或多于一个/种。
本公开内容的方法在本文中被描述为包含/包括所记载的要素或步骤，但也可以由所记载的要素或步骤组成。当方法由所记载的要素或步骤组成时，所述方法排除未记载的要素或步骤。本公开内容的方法还可以“基本上由”所记载的要素或步骤“组成”。当所述方法“基本上由”所记载的要素或步骤“组成”时，该方法排除改变组合物性质的要素或活性成分或者改变方法结果的步骤。
权利要求书中使用术语“或”用于意指“和/或”，尽管本公开内容支持所指的仅仅是“或者”和“和/或”的定义，除非明确指明，否则是指“或者”，或是供选择的方案是相互排斥的。如本文中所用，“另一个/种”可以意指至少第二个/种或更多个/种。
贯穿本申请，术语“约”用于表示值包括确定该值所用的设备、方法的误差所允许的固有差异，或者研究主题之间存在的差异。
从以下详细描述中，本发明的其他目的、特点和优点将变得明显。然而，应理解，尽管详细描述和具体实施例表示本发明的一些优选实施方案，但其仅仅以举例说明的方式给出，因为通过该详细描述，在本发明的精神和范围内的多种改变和修改对本领域技术人员变得将明显。
附图说明
以下附图形成本说明书的一部分并且被包括以进一步证明本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一个或更多个结合本文中给出的一些具体实施方案的详细描述可以更好地理解本发明。
图1：通过mRNA-CRISPR(gRNA/Cas9-AAVS1)和质粒GFP DNA在K562中靶向整合GFP。图1示出了用质粒GFP DNA(DNA-CRISPR)或用靶向整合到AAVS1位点中的质粒GFP DNA和gRNA/Cas9CRISPR复合物(DNA+CRISPR)通过电穿孔(或没有电穿孔的对照(-EP))转染后1、5和12天的表达GFP的细胞百分比(R2)。如图1所示，37％的用DNA+CRISPR转染的细胞在转染后12天维持GFP的表达，而只有0.8％的用DNA-CRISPR转染的细胞在转染后12天维持GFP的表达。
图2A至图2C：在电穿孔前扩增10天的T细胞的由DNA质粒诱导的显著的细胞毒性。图2示出了未经转染的对照细胞(-EP)或用质粒GFP DNA、mRNA-GFP或Cas9/gRNA通过电穿孔转染的细胞的生存力(图2A)、增殖(图2B)和GFP表达(图2C)。图2证明了质粒DNA的转染诱导扩增的T细胞中的细胞毒性。
图3A至图3C：活化后扩增的T细胞的转染窗口。通过人T-活化剂CD3/CD28(可商购自Life Technologies)活化T细胞，然后在活化后一天、两天或三天用质粒DNA通过电穿孔进行转染。图3示出了在活化后一天(图3A)、两天(图3B)和三天(图3C)转染的细胞的生存力。
图4A至图4C：活化后扩增的T细胞的转染窗口。通过人T-活化剂CD3/CD28活化T细胞，然后在活化后一天、两天或三天用质粒DNA通过电穿孔进行转染。图4示出了在活化后一天(图4A)、两天(图4B)和三天(图4C)转染后的表达GFP的细胞的百分比。
图5：通过人T-活化剂CD3/CD28活化T细胞，然后在活化后一天、两天或三天用质粒DNA通过电穿孔进行转染。图5示出了在活化后一天(图5A)、两天(图5B)和三天(图5C)的经转染细胞的平均荧光强度(mean fluorescent intensity，MFI)。
图6A至图6C：活化后扩增的T细胞的转染窗口。通过人T-活化剂CD3/CD28活化T细胞，然后在活化后一天、两天或三天用质粒DNA通过电穿孔进行转染。图6示出了在活化后一天(图6A)、两天(图6B)和三天(图6C)转染后的细胞的增殖(结果来自三次独立的转染实验和一次没有质粒DNA的对照实验)。
图7：通过mRNA-CRISPR(gRNA/Cas9-AAVS1)和质粒GFP DNA在扩增的T细胞中靶向整合GFP。根据先前所述的方法活化扩增的T细胞并在活化后两天进行电穿孔。图7示出了用质粒GFP DNA(DNA-CRISPR)或用靶向整合到AAVS1位点中的质粒GFP DNA和gRNA/Cas9CRISPR复合物(DNA+CRISPR)通过电穿孔(或没有电穿孔的对照(-EP))转染后1、4或11天的表达GFP的细胞的百分比(R2)。如图7所示，4％的用DNA+CRISPR转染的细胞在转染后11天维持GFP的表达，而只有0.3％的用DNA-CRISPR转染的细胞在转染后11天维持GFP的表达。
图8：通过mRNA-CRISPR(gRNA/Cas9-AAVS1)和质粒GFP DNA在扩增的T细胞中靶向整合GFP。根据先前所述的方法活化扩增的T细胞并在活化后两天进行电穿孔。图8示出了用质粒GFP DNA(DNA-CRISPR)或用靶向整合到AAVS1位点中的质粒GFP DNA和gRNA/Cas9CRISPR复合物(DNA+CRISPR)通过电穿孔(或没有电穿孔的对照(-EP))转染后6天的表达GFP的细胞的百分比(R2)。如图8所示，2.3％的用DNA+CRISPR转染的细胞在转染后6天维持GFP的表达，而0％的用DNA-CRISPR转染的细胞在转染后6天维持GFP的表达。
图9A至图9D：通过靶向AAVS1位点的mRNA-CRISPR(gRNA/Cas9)和GFP质粒DNA(供体DNA)在扩增的T细胞中靶向整合GFP。如前所述地活化细胞，并在活化后一、二、三和四天进行转染。如这些实验所示，使用50、100或200μg/ml GFP质粒DNA。测量在活化后三、六、十和十四天经转染细胞的增殖(图9A)、表达GFP的细胞的百分比(图9B)、整合事件的相对数量(图9C)和细胞生存力(图9D)。整合事件的相对数量计算为细胞数量乘以GFP阳性细胞的百分比。
图10A至图10B：具有序列修饰区域(大写且不加阴影的)和同源区域(小写并加阴影的)的供体DNA寡核苷酸实例。图10A示出了其中将终止密码子作为添加插入靶基因组DNA中的一个实例。图10B示出了其中在靶基因组DNA中改变单个碱基的一个实例。
图11：靶向转基因整合的实例：描绘了如下实例，其中供体DNA是具有2000bp转基因X的序列修饰区域和同源区域(其被描绘为小写并加阴影的序列)的双链质粒(为了简单起见，仅描绘了一条链的序列)。质粒还可包含另外的质粒序列，例如标志物、复制起点等。
图12：通过mRNA-CRISPR和供体质粒DNA在人原代成纤维细胞的AAVS1位点中靶向整合PGK-eGFP-PolyA(未选择)：示出了用PGK-eGFP-PolyA并用(+Cas9/gRNA)或不用(-Cas9/gRNA)mRNA-CRISPR系统转染的人原代成纤维细胞的FACS分析。如该图所示，只有用供体质粒DNA和CRISPR系统转染的细胞在转染后超过15天显示出稳定的GFP表达(将转染后23天GFP的表达的第4行第一图至第二图与转染后26天GFP的表达的第4行第三图至第四图比较)。
图13A至图13C：通过mRNA-CRISPR和供体质粒DNA在K562的AAVS1位点中靶向整合SA-2A-eGFP-PolyA(未选择)：示出了用供体质粒DNA(SA-2A-eGFP-PolyA)和(+)或(-)CRISPR系统(其使整合靶向K562细胞的AAVS1位点)转染的细胞的生存力(图13A)、GFP表达(图13B)和平均荧光强度(图13C)的分析。只有用供体DNA和CRISPR系统转染的细胞在转染后延长的时间段内表现出稳定的GFP表达和平均荧光强度。
图14：通过mRNA-CRISPR和供体质粒DNA在K562的AAVS1位点中靶向整合PGK-eGFP-PolyA(未选择)：示出了用PGK-eGFP-PolyA并用(+CRISPR，第二行和第四行)或不用(-CRISPR，第一行和第三行)mRNA-CRISPR系统转染的K562细胞的FACS分析。FACS分析在转染后一、五、六、十一、十四、十九、二十三和二十九天的细胞上进行。如该图所示，只有用供体质粒DNA和CRISPR系统转染的细胞在转染后超过六或十一天显示出稳定的GFP表达。
图15：通过mRNA-CRISPR和供体质粒DNA在扩增的T细胞的AAVS1位点中靶向整合PGK-eGFP-PolyA(未选择；在活化后第2天EP，100ug/ml质粒DNA)：示出了用PGK-eGFP-PolyA并用(+CRISPR，第二行和第四行)或不用(-CRISPR，第一行和第三行)mRNA-CRISPR系统转染的人扩增的T细胞的FACS分析。在活化细胞后两天对细胞进行电穿孔(如先前所述)，对转染后一、四、六、七、九、十、十二和十四天的细胞进行FACS分析。如该图所示，只有用供体质粒DNA和CRISPR系统转染的细胞在转染后超过四或六天显示出稳定的GFP表达。
图16：通过mRNA-CRISPR和供体质粒DNA在K562的AAVS1位点中靶向整合PGK-CAR-aCD19BBz-PolyA(未选择)。示出了用PGK-CAR-aCD19BBz-PolyA并用(+CRISPR)或不用(-CRISPR)mRNA-CRISPR系统(使转基因靶向AAVS1位点)转染的K562细胞的FACS分析。对转染后一和八天的细胞进行FACS分析。如该图所示，只有用供体质粒DNA和CRISPR系统转染的细胞在转染后8天显示出大量的GFP表达(44％)。
具体实施方式
组合物和方法涉及内源靶基因组DNA序列的序列修饰。某些方面涉及对细胞中的靶基因组DNA区域进行位点特异性序列修饰的方法，其包括：使细胞与活化组合物接触；用包含(a)供体DNA和(b)DNA消化剂的转染组合物转染细胞。供体DNA包含两个区域。一个区域是包含与靶基因组DNA区域同源的核酸序列的同源区域，另一区域是序列修饰区域。在上述方法中，在靶基因组DNA区域特异性修饰基因组DNA序列。
申请人发现在细胞转染前增加活化步骤克服了传统基因组工程方法中与质粒DNA递送相关的毒性。该方法另外的一个优点是没有转基因序列的随机整合。靶序列的随机整合可能由于无法控制整合位点而导致不期望的效果。这些不期望的效果包括宿主基因的失活，足够的转基因的表达沉默或缺乏，以及需要大量筛选程序来确定转基因的整合位点。考虑到该方法可以用作用于对质粒DNA显示出毒性的细胞的独特的基因治疗方法。这样的细胞包括原代细胞、干细胞、原代T细胞、造血祖细胞及本领域已知的并且在本文中被描述为难以转染的细胞其他一些细胞。
核酸
B.供体DNA
一些实施方案涉及通过用包含供体DNA和DNA消化剂的组合物转染细胞来对靶基因组DNA序列进行序列修饰。
术语“内源基因组DNA”是指细胞的染色体DNA。术语“靶基因组DNA序列”是指DNA序列修饰所针对的内源基因组DNA位点。DNA序列修饰可以是在一个特定位点或多个特定位点改变靶基因组DNA序列的一个或更多个碱基的修饰。改变可包括将靶基因组DNA序列的1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40或更多个碱基对改变成不同的1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40或更多个碱基对。缺失可以是缺失1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、40、50、75、100、150、200、300、400或500个碱基对。添加可以是添加1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40或更多个碱基对。如果序列修饰以多种方式改变靶基因组DNA，则序列修饰可分类为改变与缺失、改变与添加等。在一个实施方案中，序列修饰是终止密码子。在另一个实施方案中，DNA序列修饰是一个或更多个终止密码子。在另外的一些实施方案中，DNA序列修饰是1、2、3、4、5或10个终止密码子。当序列修饰是终止密码子时，基因编辑的效率和/或可靠性可以提高。
当序列修饰是整合转基因时，转基因可以是通常基因序列的长度或基因编码区的通常长度。在一些实施方案中，序列修饰区域的转基因的长度为100至10000个核酸。在另外的一些实施方案中，转基因的长度为500至5000个核酸。在一些实施方案中，转基因的长度为1000至3000或1000至5000个核酸。
DNA序列修饰还可以是转基因的位点特异性整合。术语转基因是指通过基因工程转移到宿主基因组中的基因或遗传物质。转基因可表达宿主中突变或缺乏的治疗基因。转基因还可包含标志物，例如GFP或允许在体内或体外追踪经转染细胞的细胞表面标志物。
供体DNA可为质粒DNA、线性化DNA片段或寡核苷酸。质粒DNA是指环状DNA片段。质粒可包含一个或更多个转基因。例如，质粒可编码使内源基因组DNA位点特异性断裂的DNA消化剂和整合到基因组DNA断裂点处或附近的转基因。
术语“寡核苷酸”是指多核苷酸，例如脱氧核糖核酸(DNA)，以及在适当的情况下的核糖核酸(RNA)。该术语还应理解为包括作为等同方案的由核苷酸类似物制成的RNA或DNA的衍生物、变体和类似物，以及作为适用于所述的实施方案的单链(有义或反义)和双链多核苷酸。脱氧核糖核苷酸包括脱氧腺苷、脱氧胞苷、脱氧鸟苷和脱氧胸苷。为了清楚起见，当在本文中提及核酸(可以是DNA或RNA)的核苷酸时，使用术语“腺苷”、“胞苷”、“鸟苷”和“胸苷”。应理解，如果核酸是RNA，则具有尿嘧啶碱基的核苷酸是尿苷。在一些实施方案中，术语寡核苷酸用于限定具有150个碱基或更少的核酸。在一些实施方案中，术语寡核苷酸用于限定具有100或50或25个碱基或更少的核酸。
术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用，并且是指任何长度的核苷酸的聚合物形式，其是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或者其类似物。多核苷酸可以具有任何三维结构并且可执行任何已知或未知的功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段(例如，探针、引物、EST或SAGE标签)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、dsRNA、siRNA、miRNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、分离的任何序列的DNA、分离的任何序列的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可以包含经修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸及核苷酸类似物。如果存在的话，可以在多核苷酸组装之前或之后对核苷酸结构进行修饰。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。还可以在聚合后修饰多核苷酸，例如通过与标记组分缀合。该术语还是指双链和单链分子二者。除非另有说明或要求，否则本发明的多核苷酸的任何实施方案包括二者：双链形式和已知或预测构成双链形式的两个互补单链形式中的每一个。
生物学上等同的多核苷酸是具有特定百分比同源性的并且编码具有相同或相似生物活性的多肽的那些。
在某些实施方案中，供体DNA的同源区域是100％同源的。在另外的一些实施方案中，供体DNA的同源区域是85％、90％、95％或99％同源的。
在某些实施方案中，供体DNA包含与靶基因组DNA序列同源的至少约10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、100、200、300、400、500、600、700、800、1000、1200、1400或1600个(或者其中可推导出的任何范围)核酸的序列。在一些实施方案中，供体DNA包含与基因组DNA序列相同的至少约20个核酸的序列。在该上下文中，术语“相同序列”是指完全匹配基因组DNA序列的序列。相同的序列可以在DNA序列修饰的5’末端上的区域中和在DNA序列修饰的3’末端上的区域中。通过示例性实例，当供体DNA包含至少20个核酸的同源序列时，供体DNA可在序列修饰的每一侧上包含例如10个核酸的同源序列。类似地，包含10个核酸的同源序列的供体DNA可在序列修饰的每一侧上包含例如5个核酸的互补序列。在一些实施方案中，同源区域包含与靶基因组序列同源的1600个核酸。在一些实施方案中，供体DNA在序列修饰区域的5’末端包含800个核酸的同源区域，在序列修饰区域的3’末端包含800个核酸的同源区域。
当供体DNA是单链DNA寡核苷酸时，其长度可为约10、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550或600个核酸至约50、75、100、125或150个核酸，或者其任何可推导出的范围。在某些实施方案中，寡核苷酸大于20个核酸，或者大于21、22、23、24、25、30或40个核酸。在一些具体实施方案中，寡核苷酸是约30至150个核酸、约25至约150个核酸、约25至约150个核酸、约25至约100个核酸或约40至约100个核酸。
在转染程序期间供体DNA的浓度可以是供体DNA在转染组合物和/或转染样品容器中的最终浓度。供体DNA浓度可为约10、20、30、50、75、100、150、200、250、300至约350、400、500、1000、1500、2000、3000、4000或5000μg/mL或者其中可推导出的任何范围。在某些实施方案中，供体DNA的浓度为至少30μg/mL。在另外的一些实施方案中，供体DNA的浓度为至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150或200μg/mL。
C.DNA消化剂
本发明提供了通过使用供体DNA和DNA消化剂的转染进行转染细胞来修饰靶基因组DNA序列的方法。术语“DNA消化剂”是指能够切割核酸的核苷酸亚单元之间的键(即磷酸二酯键)的试剂。在一个具体实施方案中，DNA消化剂编码于RNA上。在另一些实施方案中，DNA消化剂为具有酶活性的蛋白质、酶或小分子模拟物。在一些实施方案中，DNA消化剂编码于DNA上。在一个具体实施方案中，DNA消化剂编码于质粒DNA上。在一些实施方案中，DNA消化剂和供体DNA编码于同一质粒上。
在一个实施方案中，DNA消化剂是转座酶。例如，可以使用设计成用于将所精确限定的DNA序列引入脊椎动物染色体中的合成DNA转座子(例如“睡美人(Sleeping Beauty)”转座子系统)。睡美人转座子系统由睡美人(Sleeping Beauty，SB)转座酶和设计成用于将特定的DNA序列插入脊椎动物的基因组中的转座子构成。DNA转座子以简单的剪切粘贴方式从一个DNA位点易位到另一个DNA位点。转座是一个精确的过程，其中将所限定的DNA片段从一个DNA分子中切除并移动到同一或不同DNA分子或基因组中的另一个位点。
与所有其他Tc1/mariner型转座酶一样，SB转座酶将转座子插入受体DNA序列的TA二核苷酸碱基对中。插入位点可以是同一DNA分子的其他位置，也可以是在另一DNA分子(或染色体)中。在哺乳动物(包括人)基因组中，存在约2亿个TA位点。在转座子整合过程中TA插入位点复制。该TA序列的复制是转座的标志，并在一些实验中用于确定机制。转座酶可以编码于转座子内，或者转座酶可以由另外的来源提供，在这种情况下转座子成为非自主要素。非自主转座子是最有用的遗传工具，因为在插入后它们无法独立地继续切除和再次插入。人基因组和其他哺乳动物基因组中鉴定的所有DNA转座子都是非自主的，因为尽管它们包含转座酶基因，但是这些基因是非功能性的并且不能产生可以移动转座子的转座酶。
在另一个实施方案中，DNA消化剂是整合酶。例如，phiC31整合酶是编码于噬菌体phiC31的基因组内的序列特异性重组酶。phiC31整合酶介导被称为附着位点(att)的两个34个碱基对序列之间的重组，一个是在噬菌体中得到，另一个是在细菌宿主中得到的。已经表明该丝氨酸整合酶在许多不同的细胞类型(包括哺乳动物细胞)中高效地起作用。在phiC31整合酶的存在下，通过在具有与天然attP位点相似的序列的位点(被称为假attP位点)处重组可以将含attB的供体质粒单向整合到靶基因组中。phiC31整合酶可以整合任何尺寸的质粒，作为单一拷贝，并且不需要辅因子。经整合的转基因稳定表达并且是可遗传的。
在一个具体实施方案中，DNA消化剂是核酸酶。核酸酶是水解核酸的酶。核酸酶可分类为内切核酸酶或外切核酸酶。内切核酸酶是催化在DNA或RNA分子内部的核酸之间的键水解的任何一组酶。外切核酸酶是从DNA或RNA链的末端催化单个核苷酸水解的任何一组酶。核酸酶还可根据它们是否特异性消化DNA或RNA进行分类。特异性催化DNA水解的核酸酶可被称为脱氧核糖核酸酶或DNA酶，而特异性催化RNA水解的核酸酶可被称为核糖核酸酶或RNA酶。一些核酸酶对单链或双链核酸序列具有特异性。一些酶具有外切核酸酶和内切核酸酶特性二者。此外，一些酶能够消化DNA和RNA序列二者。在本文中术语“核酸酶”通常用于指水解核酸序列的任何酶。
在不同的核酸酶中，最佳反应条件不同。应考虑的因素包括温度、pH、酶辅因子、盐组成、离子强度和稳定剂。可商购的核酸酶的供应商(例如，Promega Corp.；New EnglandBiolabs，Inc.)提供关于各种酶的最佳条件的信息。如在孵育温度下测量的，大多数核酸酶在pH 7.2至pH 8.5之间使用。此外，大多数核酸酶在37℃下显示出最大活性；然而，少数酶需要更高或更低的温度以获得最佳活性(例如，Taq I，65℃；Sma I，25℃)。DNA浓度也可以是一个因素，因为高DNA浓度可以降低酶活性，而太稀释的DNA浓度可以低于酶的Km并且还影响酶活性。
核酸酶的非限制性实例包括DNA酶I、Benzonase、外切核酸酶I、外切核酸酶III、绿豆核酸酶(Mung Bean Nuclease)、核酸酶BAL 31、RNA酶I、S1核酸酶、λ外切核酸酶(LambdaExonuclease)、RecJ和T7外切核酸酶。DNA酶I是非特异性切割DNA以释放具有5′-磷酸化和3′-羟基化末端的二核苷酸、三核苷酸和寡核苷酸产物的内切核酸酶。DNA酶I对单链和双链DNA、染色质和RNA:DNA杂交体起作用。外切核酸酶I催化核苷酸从单链DNA中沿着3′至5′方向去除。外切核酸酶III催化单核苷酸从双螺旋DNA的3′-羟基末端逐步去除。外切核酸酶III还作用于双螺旋DNA的切口以产生单链缺口。单链DNA对外切核酸酶III具有抗性。绿豆核酸酶从DNA末端降解单链延伸。绿豆核酸酶也是RNA内切核酸酶。核酸酶BAL 31降解双螺旋DNA的3′和5′末端二者。核酸酶BAL 31也是在双螺旋DNA和RNA的切口、缺口和单链区域处切割的高度特异性的单链内切核酸酶。RNA酶I是在所有RNA二核苷酸处切割的单链特异性RNA内切核酸酶。S1核酸酶通过内切核酸降解单链DNA和RNA以获得5′-磷酰基-末端的产物。双链核酸(DNA:DNA、DNA:RNA或RNA:RNA)对S1核酸酶降解具有抗性，除非是极高浓度的酶。λ外切核酸酶催化5′单核苷酸从双螺旋DNA上去除。其优选的底物为5′-磷酸化双链DNA，尽管λ外切核酸酶还会以大大降低的速率降解单链和非磷酸化的底物。λ外切核酸酶不能在切开或缺口处引发DNA消化，RecJ是单链DNA特异性外切核酸酶，其催化脱氧核苷酸单磷酸酯从DNA中沿着5′至3′方向去除。T7外切核酸酶催化5′单核苷酸从双螺旋DNA中去除。T7外切核酸酶催化从5′末端或在双链DNA的切口和缺口处的核苷酸去除。
限制性内切核酸酶是可结合本发明的方法使用的核酸酶的另一个实例。表1中提供了限制性内切核酸酶及其识别序列的非限制性实例。
表1.限制性内切核酸酶的识别序列。
其中R＝A或G，K＝G或T，S＝G或C，Y＝C或T，M＝A或C，W＝A或T，B＝非A(C、G或T)，H＝非G(A、C或T)，D＝非C(A、G或T)V＝非T(A、C或G)，并且N＝任何核苷酸。
本领域普通技术人员将能够根据靶基因组序列和供体DNA的特点选择合适的核酸酶。在一个实施方案中，核酸酶是位点特异性核酸酶。在一个相关实施方案中，核酸酶具有至少8个、至少10个、至少12个、至少14个、至少16个、至少18个、至少20个或至少25个碱基对的识别序列。
在一个实施方案中，位点特异性核酸酶是Cas核酸酶。在一个相关实施方案中，Cas核酸酶是Cas9。在另一个实施方案中，核酸酶是cas9并且组合物还包含引导RNA。可以与本文中所述的方法和组合物一起使用的序列特异性核酸酶系统的另一个实例包括Cas9/CRISPR系统(Wiedenheft，B.等Nature 482，331-338(2012)；Jinek，M.等Science 337，816-821(2012)；Mali，P.等Science 339，823-826(2013)；Cong，L.等Science 339，819-823(2013))。Cas9/CRISPR(集群的规律间隔短回文重复序列，Clustered Regularlyinterspaced Short Palindromic Repeat)系统利用了RNA指导的DNA结合和序列特异性的靶DNA切割。引导RNA/Cas9组合赋予核酸酶位点特异性。引导RNA(guide RNA，gRNA)包含约20个与靶基因组DNA序列互补的核苷酸，该靶基因组DNA序列在基因组PAM(原间隔序列邻近基序(protospacer adjacent motif))位点(NNG)和恒定RNA支架区域上游。Cas(CRISPR相关)9蛋白与gRNA和与gRNA结合的靶DNA结合并且在PAM位点上游的限定位置中引入双链断裂。Cas9具有与HNH和RuvC内切核酸酶同源的两个独立的核酸酶结构域，并且通过突变两个结构域中任一个，Cas9蛋白可以转化成引入单链断裂的切口酶(Cong，L.等Science 339，819-823(2013))。特别考虑到本发明的方法和组合物可以与Cas9的单链或双链诱导形式以及与其他RNA引导的DNA核酸酶(例如其他细菌的Cas9样系统)一起使用。本文中所述的方法和组合物的序列特异性核酸酶可以是经改造的、嵌合的或分离自生物体的。序列特异性核酸酶可以以编码序列特异性核酸酶的RNA的形式(例如mRNA)引入细胞中。
在一个实施方案中，DNA消化剂是位点特异性核酸酶，例如锌指核酸酶。锌指核酸酶通常包含DNA结合结构域(即，锌指)和切割结构域(即，核酸酶)。锌指结合结构域可被改造成识别并结合任何所选的核酸序列。参见，例如，Beerli等(2002)Nat.Biotechnol.20：135-141；Pabo等(2001)Ann.Rev.Biochem.70：313-340；Isalan等(2001)Nat.Biotechnol.19：656-660；Segal等(2001)Curr.Opin.Biotechnol.12：632-637；Choo等(2000)Curr.Opin.Struct.Biol.10：41 1-416；Zhang等(2000)J.Biol.Chem.275(43)：33850-33860；Doyon等(2008)Nat.Biotechnol.26：702-708；和Santiago等(2008)Proc.Natl.Acad.Sci.USA105：5809-5814。与天然存在的锌指蛋白相比，经改造的锌指结合结构域可具有新的结合特异性。改造方法包括但不限于合理设计和多种类型的选择。合理设计包括例如使用包含二联体、三联体和/或四联体核苷酸序列和单个锌指氨基酸序列的数据库，其中每个二联体、三联体和/或四联体核苷酸序列与一个或更多个锌指氨基酸序列相关联，所述锌指与特定的三联体或四联体序列结合。参见，例如，美国专利No.6,453,242和6,534,261，其公开内容通过引用整体并入本文。作为一个实例，可使用美国专利6,453,242中所述的算法来设计靶向预选序列的锌指结合结构域。
还可使用替代方法(例如使用非简并的识别码表的合理设计)来设计靶向特定序列的锌指结合结构域(Sera等(2002)Biochemistry 41：7074-7081)。用于鉴定DNA序列中的潜在靶位点和设计锌指结合结构域的公众可用的基于网络的工具分别可在http：//www.zincfingertools.org和http：//bindr.gdcb.iastate,edu/ZiFiT/上找到(Mandell等(2006)Nuc.Acid Res.34：W516-W523；Sander等(2007)Nuc.Acid Res.35：W599-W605)。
锌指结合结构域可被设计成识别并结合长度为约3个核苷酸至约21个核苷酸，或优选长度为约9个至约18个核苷酸的DNA序列。通常，锌指结合结构域包含至少三个锌指识别区域(即，锌指)。在一个实施方案中，锌指结合结构域可包含四个锌指识别区域。在另一个实施方案中，锌指结合结构域可包含五个锌指识别区域。在又一个实施方案中，锌指结合结构域可包含六个锌指识别区域。锌指结合结构域可被设计成与任何合适的靶DNA序列结合。参见例如，美国专利No.6,607,882；6,534,261和6,453,242，其公开内容通过引用整体并入本文。
选择锌指识别区域的示例性方法可包括噬菌体展示系统和双杂交系统，并且在美国专利No.5,789,538；5,925,523；6,007,988；6,013,453；6,410,248；6,140,466；6,200,759和6,242,568；以及WO 98/37186；WO 98/53057；WO 00/27878；WO 01/88197和GB 2,338,237中被公开，其各自通过引用整体并入本文。此外，锌指结合结构域的结合特异性的增强已经例如在WO 02/077227中被描述。
用于设计和构建融合蛋白(及编码其的多核苷酸)的锌指结合结构域和方法是本领域技术人员已知的，并且在美国专利申请公开No.20050064474和20060188987中被详细描述，各自通过引用整体并入本文。锌指识别区域和/或多指锌指蛋白可使用合适的接头序列(包括例如长度为五个或更多个氨基酸的接头)连接在一起。对于长度为六个或更多个氨基酸的接头序列的非限制性实例参见，美国专利No.6,479,626；6,903,185和7,153,949，其公开内容通过引用整体并入本文。本文中所述的锌指结合结构域可包含该蛋白的单独的锌指之间的合适接头的组合。
在一些实施方案中，锌指核酸酶还可包含核定位信号或序列(Nuclearlocalization sequence，NLS)。NLS是有利于使锌指核酸酶蛋白靶向核以在染色体的靶序列处引入双链断裂的氨基酸序列。核定位信号是本领域已知的。参见，例如，Makkerh等(1996)Current Biology 6：1025-1027。
锌指核酸酶还包含切割结构域。锌指核酸酶的切割结构域部分可以是从任何内切核酸酶或外切核酸酶获得的。切割结构域可来源于其的内切核酸酶的非限制性实例包括但不限于限制性内切核酸酶和归巢内切核酸酶。参见，例如2002-2003 Catalog，New EnglandBiolabs，Beverly，Mass.；和Belfort等(1997)Nucleic Acids Res.25：3379-3388或www.neb.com。另外的切割DNA的酶是已知的(例如，S1核酸酶；绿豆核酸酶；胰腺DNA酶I；微球菌核酸酶；酵母菌HO内切核酸酶)。另参见Linn等(编辑)Nucleases，Cold Spring HarborLaboratory Press，1993。这些酶(或其功能片段)中的一种或更多种可用作切割结构域的来源。
切割结构域还可来源自如上所述的酶或其部分，其需要二聚化以获得切割活性。对于切割可需要两个锌指核酸酶，因为每个核酸酶包含活性酶二聚体的单体。或者，单个锌指核酸酶可包含产生活性酶二聚体的两个单体。如本文中所用，“活性酶二聚体”是能够切割核酸分子的酶二聚体。两个切割单体可来源自同一内切核酸酶(或其功能片段)，或者每个单体可来源自不同的内切核酸酶(或其功能片段)。
当使用两个切核单体来形成活性酶二聚体时，两个锌指核酸酶的识别位点优选地这样设置，以使得两个锌指核酸酶与其各自的识别位点的结合将切割单体以这样的彼此空间取向设置：该空间取向允许切割单体例如通过二聚化形成活性酶二聚体。结果是，识别位点的近边缘可相隔约5个至约18个核苷酸。例如，近边缘可相隔约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个核苷酸。然而，应理解任何整数数目的核苷酸或核苷酸对可介于两个识别位点之间(例如，约2个至约50个核苷酸对或更多个)。锌指核酸酶的识别位点的近边缘(例如，如本文中详细描述的那些)可相隔6个核苷酸。通常，切割的位点位于识别位点之间。
限制性内切核酸酶(限制酶)存在于许多物种中，其能够与DNA(在识别位点处)序列特异性结合，并在结合位点处或附近切割DNA。某些限制酶(例如，IIS型)在远离识别位点的位点处切割DNA并且具有可分离的结合和切割结构域。例如，IIS型酶Fok1催化在一条链上的离其识别位点9个核苷酸处和在另一条链上的离其识别位点的13个核苷酸处的DNA双链切割。参见，例如，美国专利No.5,356,802；5,436,150和5,487,994；以及Li等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：4275-4279；Li等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：2764-2768；Kim等(1994a)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：883-887；Kim等(1994b)J.Biol.Chem.269：31，978-31，982。因此，锌指核酸酶可包含来自至少一种IIS型限制酶的切割结构域和一种或更多种锌指结合结构域，其可被改造或可不被改造。示例性IIS型限制酶例如在国际公开WO 07/014，275中被描述，其公开内容通过引用整体并入本文。另外的限制酶还包含可分离的结合和切割结构域，并且这些也在本发明考虑内。参见，例如，Roberts等(2003)Nucleic Acids Res.31：418-420。
在另一个实施方案中，靶向内切核酸酶可以是大范围核酸酶(meganuclease)。大范围核酸酶是特征在于大的识别位点的内切脱氧核糖核酸酶，即，识别位点通常为约12个碱基对至约40个碱基对。作为该要求的结果，识别位点通常在任何多给定的基因组中仅出现一次。天然存在的大范围核酸酶识别15至40个碱基对切割位点，并且通常分为四个家族：LAGLIDADG家族、GIY-YIG家族、His-Cyst盒家族和HNH家族。大范围核酸酶可以通过使用本领域技术人员熟知的技术修饰其识别序列来靶向特定的染色体序列。
在另一个实施方案中，靶向内切核酸酶可以是转录活化子样效应因子(transcription activator-like effector，TALE)核酸酶。TALE是来自植物病原体黄单胞菌属(Xanthomonas)的转录因子，其可以容易地被改造成结合新的DNA靶标。TALE或其截短形式可与内切核酸酶(例如Fok1)的催化结构域连接，以产生被称为TALE核酸酶或TALEN的靶向性内切核酸酶。
在又一个实施方案中，靶向内切核酸酶可以是位点特异性核酸酶。特别地，位点特异性核酸酶可以是其识别序列在基因组中很少出现的“罕见切割剂(rare-cutter)”内切核酸酶。优选地，位点特异性核酸酶的识别序列在基因组中仅出现一次。
在又一个实施方案中，靶向内切核酸酶可以是人工靶向DNA双链断裂诱导剂(也被称为人工限制性DNA切割剂)。例如，人工靶向DNA双链断裂诱导剂可包含切割DNA的金属/螯合剂络合物和至少一个与靶向切割位点互补的寡核苷酸。因此，人工靶向DNA双链断裂诱导剂不包含任何蛋白质。金属/螯合剂络合物的金属可为铈、镉、钴、铬、铜、铁、镁、锰、锌等。金属/螯合剂络合物的螯合剂可为EDTA、EGTA、BAPTA等。在一个优选实施方案中，金属/螯合剂络合物可为Ce(IV)/EGTA。在另一个优选实施方案中，人工靶向DNA双链断裂诱导剂可包含Ce(IV)/EGTA络合物和两条假互补肽核酸(peptide nucleic acid，PNA)链(Katada等，Current Gene Therapy，2011，11(1)：38-45)。
在另一个实施方案中，核酸酶可以是归巢核酸酶。归巢内切核酸酶包括1-5′cel、l-Ceul、l-Pspl、Vl-Sce、l-SceTV、I-Csml、l-Panl、l-Scell、l-Ppol、l-Scelll、l-Crel、l-Tevl、1-Tev和I-7evIII。其识别序列是已知的。另参见美国专利No.5,420,032；美国专利No.6,833,252；Belfort等(1997)Nucleic Acids Res.25：3379-3388；Ou on等(1989)Gene82：115-118；Perler等(1994)Nucleic Acids Res.22，1 125-1 127；Jasin(1996)TrendsGenet.12：224-228；Gimble等(1996)J.Mol.Biol.263：163-180；Argast等(1998)JMol.Biol.280：345-353和New England Biolabs目录。
在某些实施方案中，核酸酶包含经改造的(非天然存在的)归巢内切核酸酶(大范围核酸酶)。归巢内切核酸酶和大范围核酸酶(例如l-Scel、l-Ceul、VI-Pspl、Vl-Sce、l-ScelN、l-Csml、l-Panl、l-Scell、l-Ppol、l-Scelll、l-Crel、l-Tevl、l-Tevll和I-7evIII)的识别序列是已知的。另参见美国专利No.5,420,032；美国专利No.6,833,252；Belfort等(1997)Nucleic Acids Res.25：3379-3388；Dujon等(1989)Gene 82：115-118；Perler等(1994)Nucleic Acids Res.22，1125-1127；Jasin(1996)Trends Genet.12：224-228；Gimble等(1996)J.Mol.Biol.263：163-180；Argast等(1998)J.Mol.Biol.280：345-353和New England Biolabs目录。此外，归巢内切核酸酶和大范围核酸酶的DNA结合特异性可以被改造成结合非天然靶位点。参见，例如，Chevalier等(2002)Molec.Cell 10：895-905；Epinat等(2003)Nucleic Acids Res.31：2952-2962；Ashworth等(2006)Nature 441：656-659；Paques等(2007)Current Gene Therapy 7：49-66；美国专利公开No.20070117128。归巢内切核酸酶和大范围核酸酶的DNA结合结构域可在核酸酶的背景下作为一个整体被改变(即，使得核酸酶包含同源切割结构域)或可以融合到异源切割结构域。
在一个实施方案中，DNA消化剂是由omega、锌指、TALE和CRISPR/Cas9组成的组的或选自该组的位点特异性核酸酶。
D.标志物
在本发明的某些实施方案中，包含基因组DNA序列修饰的细胞或已经用本发明组合物转染的细胞可通过在组合物中包含标志物来在体外或体内鉴定。标志物可在与供体DNA相同的质粒或线性化DNA上，或者标志物可在单独的一段DNA上。这样的标志物赋予细胞可鉴定的变化，允许容易地鉴定已经用组合物转染的细胞。通常，选择性标志物是赋予允许选择的特性的标志物。阳性选择性标志物是其中标志物的存在允许其被选择的标志物，而阴性选择性标志物是其中其存在阻止其被选择的标志物。阳性选择性标志物的实例为药物抗性标志物或抗生素抗性基因/标志物。
通常，包含药物选择标志物会帮助转化体的克隆和鉴定，例如赋予对新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、zeocin、G418、福来霉素、杀稻瘟素和组氨醇的抗性的基因是有用的选择性标志物。除了赋予允许基于实施条件来区分转化体的表型的标志物之外，还考虑其他类型的标志物，包括可筛选标志物，例如GFP，其基于比色分析。或者，可使用可筛选酶，例如单纯疱疹病毒胸苷激酶(thymidine kinasc，tk)或氯霉素乙酰转移酶(chloramphenicol acetyltransferase，CAT)。本领域技术人员也知道如何使用免疫学标志物，其可结合FACS分析。选择性标志物和可筛选标志物的另外的实例是本领域技术人员熟知的。在某些实施方案中，标志物为荧光标志物、酶标志物、发光标志物、可光活化标志物、光转化性标志物或比色标志物。荧光标志物包括例如GFP和变体(例如YFP、RFP等)以及其他荧光蛋白(如DsRed、mPlum、mCherry、YPet、Emerald、CyPet、T-Sapphire和Venus)。可光活化标志物包括例如KFP、PA-mRFP和Dronpa。光转化性标志物包括例如mEosFP、KikGR和PS-CFP2。发光蛋白包括例如Neptune、FP595和phialidin。筛选标志物的非限制性实例包括。
用于本发明的标志物可编码于RNA或DNA上。在一个具体实施方案中，标志物编码于质粒DNA上。在一些实施方案中，标志物和供体DNA在同一质粒上。
在某些方面中，在电穿孔后，通过阴性选择来选择已经将电穿孔组合物内化的细胞。在另一些方面中，在电穿孔后，通过阳性选择来选择已经将电穿孔构建体内化的细胞。在一些方面中，选择包括使细胞暴露于多种浓度的选择剂，该选择剂损害不表达选择抗性基因或在电穿孔期间不接受选择抗性基因的细胞的生存力。在一些方面中，选择涉及使细胞暴露于条件性致死浓度的选择剂。在某些方面中，选择剂或化合物是抗生素。在另一些方面中，选择剂是单独或组合的G418(也被称为遗传霉素和G418硫酸盐)、嘌呤霉素、zeocin、潮霉素、福来霉素或杀稻瘟素。在某些方面中，选择剂的浓度为0.1μg/L至0.5μg/L、0.5μg/L至1μg/L、1μg/L至2μg/L、2μg/L至5μg/L、5μg/L至10μg/L、10μg/L至100μg/L、100μg/L至500μg/L、0.1mg/L至0.5mg/L、0.5mg/L至1mg/L、1mg/L至2mg/L、2mg/L至5mg/L、5mg/L至10mg/L、10mg/L至100mg/L、100mg/L至500mg/L、0.1g/L至0.5g/L、0.5g/L至1g/L、1g/L至2g/L、2g/L至5g/L、5g/L至10g/L、10g/L至100g/L或100g/L至500g/L，或者其中可推导出的任何范围。在某些方面中，选择剂的浓度为(y)g/L，其中“y”可以是任何值，包括但不限于0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100，或者其中可推导出的任何范围。在一些实施方案中，选择剂以约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10g/L，或者其中可推导出的任何范围的条件性致死浓度存在于培养基中。
在某些实施方案中，不管编码序列自身的长度，核酸片段可与其他核酸序列(例如启动子、多腺苷酸化信号、另外的限制酶位点、多克隆位点、其他编码片段等)组合，使得其总长度可根据考虑而改变。
E.载体
多肽(例如供体DNA)可通过例如组合物中的核酸分子来编码。在某些实施方案中，核酸分子可以是核酸载体的形式。术语“载体”是用于指其中可以插入异源核酸序列的用于引入到其可以被复制和表达的细胞中的载体核酸分子。核酸序列可以是“异源的”，这意味着核酸序列在对其中已引入载体的细胞或向其中掺入的核酸而言是外来的环境中，其包含与该细胞的序列或该核酸同源的但在宿主细胞或核酸内通常不被发现的位置中的序列。载体包括DNA、RNA、质粒、黏粒、病毒(噬菌体、动物病毒和植物病毒)和人工染色体(例如，YAC)。本领域技术人员很好地具备通过标准重组技术(例如，Sambrook等，2001；Ausubel等，1996，二者都通过引用并入本文)构建载体。载体可用于宿主细胞以产生抗体。
术语“表达载体”是指包含编码至少部分基因产物的核酸序列的载体，该核酸序列能够被转录或稳定地整合到宿主细胞的基因组中并随后被转录。在一些情况下，然后将RNA分子翻译成蛋白质、多肽或肽。表达载体可以包含多种“控制序列”，其是指在特定宿主生物体中转录并可以翻译有效连接的编码序列所需的核酸序列。除了控制转录和翻译的控制序列之外，载体和表达载体可包含还用于其他功能的本文中所述的核酸序列。考虑到表达标志物的表达载体可用于本发明。在另一些实施方案中，标志物编码于mRNA上而不是表达载体中。
“启动子”是控制序列。启动子通常是核酸序列中控制转录起始和速率的区域。启动子可包含可结合调节蛋白和分子(例如RNA聚合酶和其他转录因子)的基因元件。短语“有效地设置”、“有效地连接”、“在控制下”和“在转录控制下”意指启动子对于核酸序列处在正确功能位置和/或取向中以控制转录起始和该序列的表达。启动子可与或可不与“增强子”结合使用，所述“增强子”是指参与核酸序列的转录活化的顺式作用调节序列。
用于控制肽或蛋白质表达的编码多核苷酸的特定启动子不被认为是关键的，只要其能够在靶细胞，优选细菌细胞中表达多核苷酸即可。在靶向人细胞的情况下，优选将多核苷酸编码区域设置在能够在人细胞中表达的启动子附近并在其控制下。一般而言，这样的启动子可包括细菌、人或病毒启动子。
特异性起始信号也可以是编码序列的有效翻译所需要的。这些信号包括ATG起始密码子或相邻序列。可能需要提供外源翻译控制信号，包括ATG起始密码子。本领域普通技术人员将容易地能够确定特异性起始信号并提供所需信号。
载体可包含多克隆位点(multiple cloning site，MCS)，其是包含多个限制酶位点的核酸区域，其中任一个可以与标准重组技术结合使用来消化载体。(参见Carbonelli等，1999，Levenson等，1998和Cocea，1997，通过引用并入本文)。
大多数经转录的真核RNA分子经历RNA剪接以从初始转录物中除去内含子。包含基因组真核序列的载体可需要供体和/或受体剪接位点以确保正确处理转录物用于蛋白质表达。(参见Chandler等，1997，通过引用并入本文)。
载体或构建体一般会包含至少一个终止信号。“终止信号”或“终止子”由通过RNA聚合酶参与RNA转录物的特异性终止的DNA序列构成。因此，在某些实施方案中，考虑终止RNA转录物产生的终止信号。终止子可以是在体内必需的以达到期望的信息水平。在真核系统中，终止子区域还可包含允许对新转录物进行位点特异性切割以暴露多腺苷酸化位点的特异性DNA序列。这向专门的内源性聚合酶发出向转录物的3’末端添加约200个A残基(polyA)的一段延伸序列的信号。用该polyA尾修饰的RNA分子看起来更加稳定并且被更有效地翻译。因此，在另一些涉及真核生物的实施方案中，优选该终止子包含用于切割RNA的信号，更优选地终止子信号促进多腺苷酸化信息。
在表达，特别是真核表达中，其通常包括影响合适的转录物多腺苷酸化的多腺苷酸化信号。
为了在宿主细胞中增殖载体，其可包含一个或更多个复制起始位点(通常被称为“ori”)，其是在此处起始复制的特异性核酸序列。或者，如果宿主细胞是酵母，则可以使用自主复制序列(autonomously replicating sequence，ARS)。
一些载体可利用允许其在原核和真核细胞二者中复制和/或表达的控制序列。本领域技术人员还理解孵育所有上述的宿主细胞以维持它们和允许载体复制的条件。还理解和已知允许大规模生产载体以及生产由载体编码的核酸及其同源多肽、蛋白质或肽的技术和条件。
在某些具体实施方案中，通过电穿孔转染到细胞中的组合物是非病毒的(即，不包含任何病毒组分)。考虑到非病毒方法会降低毒性和/或提高方法的安全性。考虑到使用小单链DNA寡核苷酸和作为RNA提供的DNA消化剂的组合提供了降低的细胞毒性和提高的基因组DNA序列修饰效率的优点。
F.核酸序列修饰
在本公开内容的上下文中，术语“未经修饰的供体DNA”通常指核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)的寡聚物或聚合物。在一些实施方案中，核酸分子包含未经修饰的DNA。该术语包括由天然存在的核碱基、糖和共价核苷间连接构成的DNA。术语“DNA类似物”是指具有一个或更多个非天然存在部分(其以与寡核苷酸类似的方式起作用)的DNA。由于所期望的特性(例如增强的细胞摄取、提高的对其他寡核苷酸或核酸靶标的亲和力以及提高的在核酸酶存在下的稳定性)，相比于天然存在形式，经常选择这样的非天然存在的寡核苷酸。术语“寡核苷酸”可用于指未经修饰的寡核苷酸或寡核苷酸类似物。
核酸分子的具体实例包括含有经修饰的(即非天然存在的核苷间连接的)核酸分子。由于所期望的特性，例如增强的细胞摄取、提高的对其他寡核苷酸或核酸靶标的亲和力以及提高的在核酸酶存在下的稳定性，经常选择这样的非天然存在的核苷间连接超过天然存在形式。在一个具体实施方案中，修饰包括甲基。
核酸分子可以具有一个或更多个经修饰的核苷间连接。如本说明书中所限定，具有经修饰的核苷间连接的寡核苷酸包括保留磷原子的核苷间连接和不具有磷原子的核苷间连接。为了本说明书的目的并且如在本领域中有时参考的，在其核苷间骨架中不具有磷原子的经修饰的寡核苷酸也可被认为是寡核苷酸。
对核酸分子的修饰可以包括其中修饰一个或两个末端核苷酸的修饰。
一种合适的含磷的经修饰的核苷间连接是硫代磷酸酯核苷间连接。许多其他经修饰的寡核苷酸骨架(核苷间连接)是本领域已知的，并且可用于该实施方案的情况中。
教导制备含磷的核苷间连接的代表性美国专利包括但不限于美国专利No.3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,306；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；5,194,599；5,565,555；5,527,899；5,721,218；5,672,697；5,625,050；5,489,677和5,602,240，其各自通过引用并入本文。
其中不包含磷原子的经修饰的DNA骨架(核苷间连接)具有通过短链烷基或环烷基核苷间连接、混合杂原子的烷基或环烷基核苷间连接、或者一个或更多个短链杂原子的或杂环的核苷间连接形成的核苷间连接。这些包括具有酰胺骨架的那些；和包含具有混合N、O、S和CH2组分部分的那些。
教导制备上述非含磷的寡核苷的代表性美国专利包括但不限于美国专利No.5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；5,792,608；5,646,269和5,677,439，其各自通过引用并入本文。
DNA化合物还可以包括模拟物。当用于DNA时，术语模拟物旨在包括其中仅呋喃糖环或呋喃糖环和核苷酸间连接二者被新的基团替代的DNA化合物，仅呋喃糖环被例如吗啉代环替代在本领域中还被称为糖替代(sugar surrogate)。维持杂环碱基部分或经修饰的杂环碱基部分以与合适的靶核酸杂交。
DNA模拟物可以包括化合物，例如肽核酸(PNA)和环己烯基核酸(被称为CeNA，参见Wang等，J.Am.Chem.Soc.，2000，122，8595-8602)。教导制备寡核苷酸模拟物的代表性美国专利包括但不限于美国专利No.5,539,082；5,714,331和5,719,262，其各自通过引用并入本文。另一类模拟物被称为磷酸单酯核酸，其在骨架中掺入磷基团。据报道该类模拟物在抑制基因表达领域中具有有用的物理学和生物学和药理学特性(反义寡核苷酸、核酶、有义寡核苷酸和形成三联体的寡核苷酸)，作为检测核酸的探针和作为用于分子生物学的辅助物。已经报道了其中呋喃糖基环被环丁基部分替代的另外的模拟物。
核酸分子还可以包含一个或更多个经修饰或经取代的糖部分。维持碱基部分以与合适的核酸靶化合物杂交。糖修饰可以赋予寡聚化合物核酸酶稳定性、结合亲和力或一些其他有益生物学特性。
代表性经修饰的糖包括碳环或非环糖，糖在其2′、3′或4′位置中的一个或更多个处具有取代基，糖具有替代糖中的一个或更多个氢原子的取代基，并且糖具有在糖中的任何两个其他原子之间的连接。许多糖修饰是本领域已知的，在2′位置处被修饰的糖和在糖的任何2个原子之间具有桥联(使得糖是双环的)的那些特别可用于该实施方案中。在该实施方案中有用的糖修饰的实例包括但不限于包含选自以下的糖取代基的化合物：OH；F；O-、S-或N-烷基；或者O-烷基-O-烷基，其中烷基、烯基和炔基可以是经取代或未经取代的C1至C10烷基或C2至C10烯基和炔基。特别合适的是：2-甲氧基乙氧基(也被称为2′-O-甲氧基乙基、2′-MOE或2′-OCH2CH2OCH3)、2′-O-甲基(2′-O-CH3)、2′-氟(2′-F)或具有连接4′碳原子与2′碳原子的桥基团的核苷修饰的双环糖，其中示例性桥基团包括--CH2--O--、--(CH2)2--O--或--CH2--N(R3)--O，其中R3为H或C1至C12烷基。
赋予提高的核酸酶抗性和对核苷酸非常高的结合亲和力的一种修饰是2′-MOE侧链(Baker等，J.Biol.Chem.，1997，272，11944-12000)。2′-MOE取代的直接优点之一是结合亲和力的提高，其大于许多类似的2′修饰，例如O-甲基、O-丙基和O-氨基丙基。还已经表明具有2′-MOE取代基的寡核苷酸是用于体内使用有前途特征的基因表达的反义抑制剂(Martin，P.，Helv.Chim.Acta，1995，78，486-504；Altmann等，Chimia，1996，50，168-176；Altmann等，Biochem.Soc.Trans.，1996，24，630-637和Altmann等，NucleosidesNucleotides，1997，16，917-926)。
2′-糖取代基可以在阿拉伯糖(arabino)(上)位置或核糖(ribo)(下)位置中。一种2′-阿拉伯糖修饰是2′-F。也可在寡聚化合物的其他位置处进行类似的修饰，特别是3′末端核苷上或2′-5′连接的寡核苷酸中的糖的3′位置和5′末端核苷酸的5′位置。寡聚化合物还可具有糖模拟物，例如环丁基部分替代戊呋糖基糖。教导制备这样的经修饰的糖结构的代表性美国专利包括但不限于美国专利No.4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；5,792,747和5,700,920，其各自通过引用整体并入本文。
代表性的糖取代基在题为“Capped 2′-Oxyethoxy Oligonucleotides”的美国专利No.6,172,209中公开，在此通过引用整体并入。
代表性的环状糖取代基在题为“RNA Targeted 2′-Oligomeric compounds thatare Conformationally Preorganized”的美国专利No.6,271,358中公开，在此通过引用整体并入。
代表性的胍基取代基在题为“Functionalized Oligomers”的美国专利No.6,593,466中公开，在此通过引用整体并入。
代表性的乙酰氨基取代基在美国专利No.6,147,200中公开，其在此通过引用整体并入。
核酸分子还可包含一种或更多种核碱基(在本领域中通常简称为“碱基”)修饰或取代，其与天然存在或合成的未经修饰的核碱基在结构上可区分，但在功能上可互换。这样的核碱基修饰可以赋予寡聚化合物核酸酶稳定性、结合亲和力或一些其他有益的生物学特性。如本文中所用，“未经修饰的”或“天然的”核碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。在本文中还被称为杂环碱基部分的经修饰的核碱基包括其他合成和天然的核碱基，其许多实例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤等。
杂环碱基部分还可以包括其中嘌呤或嘧啶碱基被其他杂环替代的那些，例如7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮鸟苷、2-氨基吡啶和2-吡啶酮。一些核碱基包括在美国专利No.3,687,808中公开的那些、在The Concise Encyclopedia Of Polymer Science AndEngineering，第858-859页，Kroschwitz，J.I.，编辑John Wiley&Sons，1990中公开的那些、由Englisch等，Angewandte Chemie，International Edition，1991，30，613公开的那些，以及由Sanghvi，Y.S.，第15章，Antisense Research and Applications，第289-302页，Crooke，S.T.和Lebleu，B.编辑，CRC Press，1993公开的那些。这些核碱基中的某些特别可用于提高寡聚化合物的结合亲和力。这些包括5-取代的嘧啶，6-氮杂嘧啶及N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。
对核酸分子的另外的修饰在美国专利公开2009/0221685中公开，其在此通过引用并入。本文还公开了另外的针对核酸分子的合适的缀合物。
II.细胞培养
A.宿主细胞
如本文中所用，术语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用。所有这些术语还包括新鲜分离的细胞和离体培养，活化或扩增的细胞二者。所有这些术语也包括其子代，即任何和所有的后代。应理解的是由于有意或无意的突变，所有子代可能不相同。在表达异源核酸序列的情况中，“宿主细胞”是指原核或真核细胞，其包括能够复制载体或表达载体编码的异源基因的任何可转化生物体。宿主细胞可以并已经用作载体或病毒的接受者。宿主细胞可以是“经转染的”或“经转化的”，这是指通过其将外源核酸(例如编码重组蛋白的序列)转移或引入宿主细胞中的过程。经转化的细胞包括原代对象细胞及其子代。
在某些实施方案中，转染可以在任何原核或真核细胞上进行。在一些方面中，电穿孔涉及转染人细胞。在另一些方面中，电穿孔涉及转染动物细胞。在某些方面中，转染涉及转染细胞系或杂交细胞型。在一些方面中，要转染的细胞是癌细胞、肿瘤细胞或永生化细胞。在一些情况下，肿瘤、癌、永生化细胞或细胞系被诱导，在另一些情况下，肿瘤、癌、永生化细胞或细胞系自然地进入其各自的状态或条件。在某些方面中，细胞或细胞系可以为A549、B细胞、B16、BHK-21、C2C12、C6、CaCo-2、CAP/、CAP-T、CHO、CHO2、CHO-DG44、CHO-K1、COS-1、Cos-7、CV-1、树突细胞、DLD-1、胚胎干(Embryonic Stem，ES)细胞或衍生物、H1299、HEK，293、293T、293FT、Hep G2、造血干细胞、HOS、Huh-7、诱导性多能干细胞(inducedpluripotent stem cell，iPS)或衍生物、Jurkat、K562、L5278Y、LNCaP、MCF7、MDA-MB-231、MDCK、间充质细胞、Min-6、单核细胞、Neuro2a、NIH 3T3、NIH3T3L1、K562、NK-细胞、NS0、Panc-1、PC12、PC-3、外周血细胞、浆细胞、原代成纤维细胞、RBL、Renca、RLE、SF21、SF9、SH-SY5Y、SK-MES-1、SK-N-SH、SL3、SW403、刺激性触发多能性获得(Stimulus-triggeredAcquisition of Pluripotency，STAP)细胞或衍生物SW403、T-细胞、THP-1、肿瘤细胞、U2OS、U937、外周血淋巴细胞、扩增的T细胞、造血干细胞或Vero细胞。在一些具体实施方案中，细胞是外周血淋巴细胞、扩增的T细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)、干细胞、造血干细胞或原代细胞。在一个具体实施方案中，细胞是造血干细胞。在另一个具体实施方案中，细胞是外周血淋巴细胞。
在某些实施方案中，细胞是本领域已知的难以转染的细胞。这样的细胞是本领域已知的，包括例如原代细胞、昆虫细胞、SF9细胞、Jurkat细胞、CHO细胞、干细胞、缓慢分裂细胞、T细胞和非分裂细胞。在一些实施方案中，细胞是T细胞。在一些实施方案中，细胞是原代细胞。在一些实施方案中，细胞是干细胞。在一些实施方案中，细胞是造血干细胞，包括骨髓和淋巴祖细胞。在一些实施方案中，细胞是间充质干细胞。在一些实施方案中，细胞是生殖细胞，例如卵细胞或精细胞。在一些实施方案中，细胞是受精胚胎。在一些实施方案中，细胞是人受精胚胎。
在一些实施方案中，细胞可进行限制性稀释法以使克隆的细胞群扩增。限制性稀释克隆的方法是本领域技术人员熟知的。这样的方法已经被描述例如用于杂交瘤细胞，但其可以应用于任何细胞。这样的方法在(Cloning hybridoma cells by limitingdilution，Journal of tissue culture methods，1985，第9卷，第3期，第175-177页，JoanC.Rener，Bruce L.Brown和Roland M.Nardone)中被描述，其通过引用并入本文。
在一些实施方案中，在转染前或在转染后培养细胞。在另一些实施方案中，在转染后的选择阶段期间培养细胞。在又一些实施方案中，在维持和克隆选择和初始扩增阶段期间培养细胞。在又一些实施方案中，在筛选阶段期间培养细胞。在另一些实施方案中，在大规模生产阶段期间培养细胞。培养悬浮和贴壁细胞的方法是本领域技术人员熟知的。在一些实施方案中，使用可商购的细胞培养容器和细胞培养基悬浮培养细胞。可用于一些实施方案的可商购的培养容器的实例包括ADME/TOX板、细胞室玻片和盖玻片、细胞计数设备、细胞培养表面、康宁HYPERFlask细胞培养容器、包被的培养皿、Nalgene Cryoware、培养室、培养皿、玻璃培养瓶、塑料培养瓶、3D培养形式、培养多孔板、培养板插入物、玻璃培养管、塑料培养管、可叠放的细胞培养容器、低氧培养室、培养皿(Petri dish)和瓶载体、快速培养容器、使用转瓶的大规模细胞培养、旋转烧瓶、3D细胞培养或细胞培养袋。
在另一些实施方案中，培养基可使用本领域技术人员熟知的组分来配制。培养细胞的配方和方法在以下参考文献中详细地被描述：Short Protocols in Cell BiologyJ.Bonifacino，等，编辑，John Wiley&Sons，2003，第826页；Live Cell Imaging：ALaboratory Manual D.Spector&R.Goldman，编辑，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，2004，第450页；Stem Cells Handbook S.Sell，编辑，Humana Press，2003，第528页；Animal Cell Culture：Essential Methods，John M.Davis，John Wiley&Sons，3月16日，2011；Basic Cell Culture Protocols，Cheryl D.Helgason，Cindy Miller，HumanaPress，2005；Human Cell Culture Protocols，Series：Methods in Molecular Biology，第806卷，Mitry，Ragai R.；Hughes，Robin D.(编辑)，第三版2012，XIV，435第89页，HumanaPress；Cancer Cell Culture：Method and Protocols，Cheryl D.Helgason，CindyMiller，Humana Press，2005；Human Cell Culture Protocols，Series：Methods inMolecular Biology，第806卷，Mitry，Ragai R.；Hughes，Robin D.(编辑)，第三版2012，XIV，435第89页，Humana Press；Cancer Cell Culture：Method and Protocols，SimobP.Langdon，Springer，2004；Molecular Cell Biology.第四版，Lodish H，Berk A，Zipursky SL，等，New York：W.H.Freeman；2000.，第6.2部分Growth of Animal Cells inCulture，其所有都通过引用并入本文。
在一些实施方案中，在筛选和扩增阶段期间和/或在大规模生产阶段(也被称为补料分批和比较)期间，通过选择或筛选产生的扩增的经电穿孔的细胞可包含经修饰的基因组DNA序列。
B.活化组合物
本文中所述的方法涉及在转染细胞前使细胞与活化组合物接触。可根据本领域已知的方法和/或本文中所述的方法活化细胞。例如，可根据以下方式活化T细胞：
用于活化T细胞的试剂盒也可商购获得。示例性试剂盒包含抗生物素颗粒(例如，MACSiBead或)和针对人CD2、CD3和CD28的生物素化抗体。负载有生物素化抗体的抗生物素颗粒用于模拟抗原呈递细胞并活化来自PBMC的静息T细胞以及经纯化的T细胞。通过培养并在培养的第14天再次活化实现T细胞扩增。
例如，T细胞还可通过促分裂原(例如ConA、PHA和PWM)来活化。
III.治疗和药物开发应用
在某些实施方案中，通过本文中所述的方法产生的细胞和细胞系是在修饰基因组DNA后提供治疗效果的细胞和细胞系。可通过本文中所述的方法分离、修饰原代细胞，并将其离体用于再引入待治疗的对象中。合适的原代细胞包括外周血单核细胞(peripheralblood mononuclear cell，PBMC)、外周血淋巴细胞(peripheral blood lmyphocyte，PBL)和其他血细胞亚群(例如但不限于CD4+T细胞或CD8+T细胞)。其他合适的原代细胞包括祖细胞，例如骨髓或淋巴祖细胞。合适的细胞还包括干细胞，例如，作为示例，胚胎干细胞、诱导性多能干细胞、造血干细胞、神经元干细胞、间充质干细胞、肌肉干细胞和皮肤干细胞。例如，iPSC可以是从患有已知的基因突变相关的患者中离体获得的，并且该突变可以使用本文中所述的方法修饰为野生型等位基因。然后经修饰的iPSC可以分化成多巴胺能神经元并重新植入患者中。在另一个离体治疗应用中，可以从患有已知的基因突变的患者中分离出造血干细胞，其然后可以被修饰以校正基因突变。然后可以将HSC施用回到患者用于获得治疗效果，或者可以在向患者施用之前在培养物中分化成更成熟的造血细胞。
在一些实施方案中，经修饰的基因组DNA序列和/或供体DNA包含疾病相关基因。在一些实施方案中，序列修饰区域包含疾病相关基因。疾病相关基因是本领域已知的。考虑到疾病相关基因是在万维网genecards.org/cgi-bin/listdiseasecards.pl？type＝full&no_limit＝1上公开的基因。基因的完整列表及其相关疾病通过引用整体并入本文。
在一个实施方案中，所述方法包括修饰造血干细胞(又称成血细胞)或骨髓祖细胞中的基因组DNA。
可在治疗上使用所公开的方法的另一个实例是嵌合抗原受体(chimeric antigenreceptor，CAR)的位点特异性整合。术语“嵌合抗原受体”或“CAR”是指这样的经改造的受体，其将任意特异性移植到免疫效应细胞上。这些受体用于将单克隆抗体的特异性移植到T细胞上。该受体被称为嵌合体，因为它们由来自不同来源的部分构成。这些分子的最常见形式是衍生自单克隆抗体的单链可变片段(single-chain variable fragment，scFv)与以下融合的融合体：CD3-ζ跨膜和胞内结构域(endodomain)；CD28或41BB细胞内结构域；或其组合。这样的分子响应于通过其靶标的scFv的识别而导致信号的传输。这样的构建体的实例是14g2a-ζ，其是衍生自杂交瘤14g2a的scFv的融合体(其识别二唾液酸神经节苷脂GD2)。当T细胞表达该分子时，它们识别并杀伤表达GD2的靶细胞(例如成神经细胞瘤的细胞)。为了靶向恶性B细胞，研究人员已经使用对B谱系分子CD19具有特异性的嵌合免疫受体重新定向T细胞的特异性。免疫球蛋白重链和轻链的可变部分通过柔性接头融合形成scFv。该scFv前有信号肽以指导初始蛋白到内质网以及随后的表面表达(这是切割的)。柔性间隔区允许scFv以不同方向取向来实现抗原结合。跨膜结构域是通常的疏水性α螺旋，其通常来源自突入细胞中并传递期望信号的信号传导胞内结构域的原始分子。CAR是允许T细胞识别肿瘤细胞上的特异性蛋白(抗原)的蛋白质。CAR是经改造的受体，其将任意特异性移植到免疫效应细胞上。通常，这些受体用于将单克隆抗体的特异性移植到T细胞上。
正在研究人工T细胞受体作为癌症的治疗，其使用所谓的过继性细胞转移的技术。从患者中移出T细胞并进行修饰使得它们表达对特定形式的癌症具有特异性的受体。将然后可以识别并杀伤癌细胞的T细胞重新引入患者中。源自除了患者之外的供体的T细胞的修饰也正在研究中。
这些经改造的CAR T细胞可在体外扩增，然后可以将扩增的CAR T细胞群输注到患者中。在输注后，T细胞在患者机体中增殖，并且在其经改造的受体的指导下，识别并杀伤其表面上具有抗原的癌细胞。目前的治疗方法涉及通过病毒感染的CAR引入。然而，当在治疗方法中使用病毒感染时总是存在安全问题。因此，本文中所述的方法是基因治疗和基因组工程的非病毒方法。先前，不可能用质粒DNA转染免疫细胞，因为这样做导致细胞的毒性。申请人发现在细胞转染之前的活化步骤克服了生存力问题，并且允许将长段DNA(和/或高浓度)转染到细胞中同时维持高水平的生存力。使用本文中所述的方法，可以将CAR整合到免疫细胞的特定位点中。在一些实施方案中，细胞是自体免疫细胞。在T细胞或自然杀伤(natural killer，NK)细胞中CAR的长期表达可用于白血病治疗或治疗与某些抗原相关的肿瘤。可对具有CAR的位点特异性整合的细胞使用非选择或选择。对于选择方法，可将选择性标志物整合在与CAR相同的位点处和与CAR相同的质粒上，或者可将选择性标志物整合在另一位点特异性位置。对于非选择方法，考虑到抗原(肿瘤)的存在用作天然选择压力，使得CAR阳性细胞群在体内进一步被刺激并扩增，而CAR阴性细胞自然耗尽，因为不存在活化。用于治疗目的的T细胞或NK细胞可以通过采集术经或不经过纯化而获得。如本公开内容的方法中所述，然后可将细胞活化，转染并注射回到患者中。如图16所示，本文中所述的数据证明了CAR成功地位点特异性整合到K562细胞中。
如何可在治疗上使用所公开的方法的另一个实例是CFTR(囊性纤维化跨膜传导调节蛋白)转基因在由于CFTR功能丧失而患有囊性纤维化的患者的上皮细胞中的表达。已经探索了基因治疗作为囊性纤维化的潜在疗法。理想情况下，基因治疗将正常的CFTR基因拷贝放置到受影响的细胞中。将正常的CFTR基因转移到受影响的上皮细胞中导致在所有靶细胞中产生功能性CFTR而没有不良反应或炎症反应。研究已经表明，为了预防囊性纤维化的肺表现，仅需要5％至10％的正常量的CFTR基因表达。已经在动物模型和临床试验中测试了基因转移的多种方法，例如脂质体和病毒载体。然而，发现这两种方法均是相对低效的治疗选择。主要原因是非常少的细胞接受载体并表达基因，所以治疗效果小。考虑到可将功能性CTFR转基因位点特异性地整合到在转染供体DNA前已经活化的上皮细胞或肠干细胞类器官中。然后可以将细胞移植到患者的气道中，在那里它们执行正常的CTFR基因的功能。
在另一个实例中，本文所述的方法可以用于治疗患有血友病的患者。患有血友病的患者不能诱导血凝块，并且遭受可威胁生命的外部和内部出血。可以使用因子VIII或因子IX转基因作为供体DNA进行位点特异性靶向基因组整合。可从患者或供体宿主中分离原代肝、肌肉或血管细胞或者肝祖细胞、肌肉或血管细胞。然后可以活化细胞，并在细胞活化后，然后可将细胞移植到患者中用于获得经整合的因子VIII或因子IX的转基因表达。
在另一个实例中，靶向转基因整合可用于细胞系开发。申请人已经在实施例中证明了使用本文所述的方法在细胞中表达转基因导致转基因的将近40％的表达，这表明该方法的高效率。因此，该方法可以替代传统的随机整合和集落选择的方法。本文中所述的方法可通过将转基因与外部启动子整合以表达用于治疗性或临床前用途的多种细胞因子或抗体，来用于进行蛋白质分泌的细胞系优化。
在某些方面中，本文中所述的方法涉及改进的用于离体治疗的方法。可从对象中分离细胞群，然后可通过本领域已知的方法和/或本文中所述的方法活化细胞，并且可以以校正缺陷或位点特异性整合靶基因的方式修饰细胞的基因组DNA。然后可将细胞群移植到对象中以用于治疗用途。在某些情况下，分离的细胞群可包含对某些体外操作(例如传统的转染和/或电穿孔方法)敏感的细胞亚群，例如，或者细胞亚群可对传统的转染和/或电穿孔方法或基因组DNA操纵具有抗性。考虑到用本文中所述的方法修饰基因组DNA导致在这样的群中更高效率的序列修饰。
本公开内容的一个方面涉及用于在从对象分离的细胞中对靶基因组DNA区域进行位点特异性序列修饰的方法，其包括：从对象中分离细胞；用活化组合物活化细胞；用包含(a)供体DNA和(b)DNA消化剂的转染组合物转染细胞；其中所述供体DNA包含：(i)包含与靶基因组DNA区域同源的核酸序列的同源区域；和(ii)序列修饰区域；并且其中在靶基因组DNA区域特异性修饰基因组DNA序列。
另外地，通过本文中所用的方法产生的细胞和细胞系可用于药物开发和/或反向遗传学研究。这样的细胞和动物可显示出与特定突变或与其序列修饰相关的表型，并且可用于筛选与所讨论的突变或突变蛋白特异性地相互作用的药物或可用于治疗患病动物的疾病的药物。这些细胞系还可以提供研究特异性突变的效果的工具，因为细胞系及其对应的“经修饰的”细胞系代表“遗传上相同的”对照，因此提供了用于修复疾病特异性突变、药物筛选和发现，以及疾病机制研究的强大工具。例如，还考虑到该技术可以提供在科学上优于目前的基因敲低技术(例如RNAi和shRNA)的替代方案。在一个实例中，DNA序列修饰是引入目标基因的终止密码子以研究发育或疾病机制或者用于治疗应用。
本公开内容的组合物可用于体内、体外或离体施用。例如，本公开内容的组合物可用作癌症疫苗。
如本文中所用，术语体外施用是指对从对象移出的细胞或在对象外部进行的操作，包括但不限于培养物中的细胞。术语离体施用是指已经在体外进行操作并且随后施用到对象的细胞。术语体内施用包括所有在对象内进行的操作，包括施用。
在本公开内容的某些方面中，组合物可体外、离体或体内施用。在某些体外实施方案中，用本公开内容的组合物孵育自体T细胞。然后可以将细胞用于体外分析，或替代地用于离体施用。
本公开内容的方法方面还涉及用于为对象免疫接种和/或治疗某些癌症的方法，通过这样的方法包括：使细胞与活化组合物接触；用包含(a)供体DNA和(b)DNA消化剂的转染组合物转染细胞；其中供体DNA包含：(i)包含与靶基因组DNA区域同源的核酸序列的同源区域；和(ii)嵌合抗原受体(CAR)；并且其中在靶基因组DNA区域特异性修饰基因组DNA序列以整合CAR；以及向患者施用细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是自体的。在一些实施方案中，免疫细胞已经与抗原接触。在一些实施方案中，抗原是由对象的癌细胞表达的抗原。在一些实施方案中，抗原是无细胞的。术语“无细胞”是指不具有任何细胞组分的组合物。在一些实施方案中，抗原是来自患者肿瘤的提取物。在一些实施方案中，抗原是多肽。在一些实施方案中，抗原包含肿瘤细胞裂解物、凋亡性肿瘤细胞、肿瘤相关抗原和肿瘤衍生的mRNA中的一种或更多种。
在一些实施方案中，免疫细胞是抗原呈递细胞。抗原呈递细胞的实例包括树突细胞、巨噬细胞、B细胞和肿瘤细胞(假抗原呈递细胞)，其中T细胞刺激因子(例如B7或4-1BBL)等通过例如基因转移强制表达。在一些实施方案中，抗原呈递细胞是树突细胞。
免疫细胞的施用途径可为例如瘤内、皮内、皮下、静脉内、淋巴内和腹膜内施用。在一些实施方案中，施用为瘤内或淋巴内。在一些实施方案中，将免疫细胞直接施用到癌组织或淋巴结中。
在一些实施方案中，免疫细胞是T细胞。T细胞可以是已经与抗原或与抗原呈递细胞接触的细胞。例如，可用对患者癌症具有特异性的肿瘤抗原培养APC以使其分化成例如CD8阳性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)或CD4阳性辅助T细胞。可将由此建立的T细胞施用到患有癌症的个体。
初始T细胞(T cell)的来源不特别限制，并且可以是来源自例如脊椎动物的外周血。所使用的初始T细胞可以是从PBMC级分分离的CD8阳性细胞或CD4阳性细胞。在一些实施方案中，就诱导CTL的效率方面而言，初始T细胞是不经从PBMC级分中分离的与其他细胞和组分混合的CD8阳性细胞或CD4阳性细胞。例如，当在补充有血清和肿瘤抗原的培养基中培养PBMC级分的细胞时，PBMC分化成树突细胞前体。然后树突细胞前体与肽结合并分化成树突细胞作为呈递该肽/肿瘤抗原的抗原呈递细胞。抗原呈递细胞刺激PBMC中的CD8阳性T细胞以使其分化成CTL。因此，可以获得能够识别添加的肽的CTL。可将由此获得的CTL分离并且直接用作癌症疫苗。或者，在用作癌症疫苗前，可将它们在白细胞介素(例如IL-2)、抗原呈递细胞和肿瘤抗原存在下进一步培养。其施用途径不特别限制，实例包括皮内、皮下、静脉内和瘤内施用。
IV.转染
转染是有意将核酸引入细胞的方法。在某些实施方案中，转染是非病毒的，这表示在质粒环境中使用的序列是非病毒的，并且DNA不通过病毒机制进入细胞。动物细胞的转染通常涉及打开细胞膜中的瞬时孔或“孔”以允许摄取材料。转染可以使用本领域已知的方法和以下描述的方法来进行。
非化学的转染方法
2.电穿孔
某些实施方案涉及使用电穿孔来帮助一种或更多种核酸分子进入宿主细胞中。
如本文中所用，“电穿孔”或“电加载(electroloading)”是指向细胞施加电流或电场来帮助核酸分子进入细胞中。本领域技术人员将理解电穿孔的任何方法和技术在本发明考虑内。
在本发明的某些实施方案中，可如美国专利No.5,612,207(通过引用具体地并入本文)、美国专利No.5,720,921(通过引用具体地并入本文)、美国专利No.6,074,605(通过引用具体地并入本文)；美国专利No.6,090,617(通过引用具体地并入本文)；美国专利No.6,485,961(通过引用具体地并入本文)；美国专利No.7,029,916(通过引用具体地并入本文)、美国专利No.7,141,425(通过引用具体地并入本文)、美国专利No.7,186,559(通过引用具体地并入本文)、美国专利No.7,771,984(通过引用具体地并入本文)和美国公开No.2011/0065171(通过引用具体地并入本文)中所述的，进行电加载。
可用于本发明的情况中的其他电加载方法和仪器还在例如公开的PCT申请No.WO03/018751和WO 2004/031353；US专利申请No.10/781,440、10/080,272和10/675,592；及US专利No.6,773,669、6,090,617、6,617,154中被描述，其所有都通过引用并入。
在本发明的某些实施方案中，可如于2002年8月21日提交的美国专利申请序列No.10/225,446中所述的进行电穿孔，其全部公开内容通过引用具体地并入本文。
在本发明的另一些实施方案中，使用MaxCyteMaxCyte或MaxCyte流式电穿孔仪器进行流式电穿孔。在一些具体实施方案中，采用在整个本公开内容中所述的参数使用静电穿孔或流式电穿孔。
所要求保护的通过电穿孔(优选流式电穿孔)转染细胞的方法能够达到大于40％，大于50％和大于60％、70％、80％或90％(或其中可推导出的任何范围)的转染效率。转染效率可以通过表达基因产物的细胞的百分比或通过由基因表达的产物的分泌水平来测量。在电穿孔过程期间和之后，细胞维持高的生存力。生存力通常大于50％或更高。生存力或经电穿孔的细胞可以为起始的未经电穿孔的群或用对照构建体转染的经电穿孔的群的生存力的至多或至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％(或其中可推导出的任何范围)。
在一些实施方案中，目前的方法使用了用于电刺激颗粒混悬液的流式电穿孔装置，其包含具有一个或更多个流入口、一个或更多个流出口和一个或更多个流动通道的流式电穿孔池(cell)仪器组，该流动通道包含：两个或更多个壁，其中流动通道还被配置成接收并短暂容纳来自流入口的连续流动的在混悬液中的颗粒；和相对于流动通道设置的使得每个电极形成流动通道的至少一个壁的成对电极，该电极还包括将电极设置成与电能来源电连通，从而流动通过流动通道的颗粒混悬液可经历在电极之间形成的电场。
在一些实施方案中，目前的方法使用流式电穿孔来克服样品尺寸的限制。通过该方法，使细胞混悬液穿过在流动池(优选一次性的)中容纳的平行棒状电极。
在另一些实施方案中，使用本文中所述的流式或静电穿孔法来克服样品的热降解。应理解，在目前的方法中可使用不同配置的池。在电穿孔期间，使细胞经历具有预定特点的电脉冲。例如，用于制备样品细胞的具体设置为：电压，750V；脉冲宽度，650微秒；脉冲间隔，100微秒；一次突发(burst)中有2个双相脉冲；突发间隔，12秒；流量，0.05mL/秒。目标分子随后可以随着浓度梯度和/或电梯度扩散到细胞中。本发明任选地能够使细胞经历一定范围的电场强度。
目前的流式电穿孔法的另一个优点是可以转染大量细胞群的速度。例如，可以通过在小于5小时，优选小于4小时，最优选在小于3小时并且最优选在小于2小时内电穿孔样品来通过电穿孔转染淋巴细胞群。电穿孔的时间是样品进行流式电穿孔过程的时间。在某些实施方案中，使用流式电穿孔在30分钟或更短时间内转染1E10细胞。在一些另外的实施方案中，可使用流式电穿孔在30分钟或60分钟或更短时间内转染2E11细胞。
对于流式电穿孔，该方法通过将流动池与具有所需流体和样品的容器中的溶液和细胞混悬液相连来启动。通过向控制泵和夹管阀之操作的电穿孔系统提供所需的命令来引入预充溶液(盐水)和细胞混悬液。当细胞通过电极之间的流路时，施加所选定电压、持续时间和频率的电脉冲。在指定的容器中收集产物和废液。
使用者将期望的电压和其他参数输入到本发明的流式电穿孔系统中。如上所述，可任选使用一系列设置。计算机与塔中的电子器件连通以将电容器组充电到期望的电压。然后，在将电压传送到流路以产生电场之前合适的开关操作电压(转换器提供交替的脉冲或突发以使由延长时间暴露于电场引起的电极损耗最小化)。根据由操作员在本发明的流式电穿孔系统中设置的持续时间和频率参数传送电压。现在详细描述本发明的流式电穿孔系统。
流式电穿孔过程可以通过例如设置电穿孔室与容器中的溶液和细胞混悬液流体连通(例如，通过管)来启动，这可在无菌或灭菌环境中进行。可使用一个或更多个泵、真空器、阀、其他改变电穿孔室内的空气压力或体积的机械仪器及其组合(其可以导致细胞混悬液和/或其他试剂以期望的时间和期望的速率流入电穿孔室)来将细胞混悬液和/或其他试剂引入电穿孔室。如果细胞混悬液和/或其他试剂的一部分位于电穿孔室中，则向细胞混悬液和/或其他试剂施加期望的电压、持续时间和/或间隔的电脉冲。在电穿孔后，可以使用一个或更多个泵，真空器，阀，其他改变电穿孔室内的排量(displacement)、压力或体积的电、机械、气动或微流体仪器及其组合从电穿孔室移除经处理的细胞混悬液和/或其他试剂。在某些实施方案中，可使用重力或手动转移来将样品或经处理的样品移入或移出电穿孔室。如果需要的话，可向电穿孔室中引入新的细胞混悬液和/或其他试剂。经电穿孔的样品可以与尚未经电穿孔的样品分开收集。前述的一系列事件可以暂时通过耦联至例如电子电路(例如，提供电脉冲的)、泵、真空器、阀、其组合及影响和控制样品流入和流出电穿孔室的其他部件的计算机来协调。作为一个实例，电穿孔过程可以通过计算机，包括操作者通过监视器上的图形用户界面和/或键盘来实施。合适的阀的实例包括夹管阀、蝶阀和/或球阀。合适的泵的实例包括离心泵或正排量泵。
作为一个实例，流式电穿孔仪器可包含由垫片隔开的至少两个电极，其中垫片和至少两个电极限定室。在一些实施方案中，电穿孔室还可包含至少三个穿过垫片的口，其中第一口用于样品流入室中，第二口用于经处理的样品从室流出，并且第三口用于非样品流体流入室中或从室流出。在一些实施方案中，当样品流入室中时，非样品流体从室流出，并且当经处理的样品流出室时，非样品流体流入室中。作为另一个实例，流式电穿孔仪器可包含具有顶部和底部的包括至少两个平行电极的电穿孔室，该室形成在两个电极之间并且在电穿孔室的底部具有两个室口，在电穿孔室的顶部具有两个室口。这样的仪器还可以包含至少一个样品容器，其通过室的底部中的第一室口与电穿孔室流体连通，并且电穿孔室可以通过室的顶部中的第二室口与样品容器流体连通，形成第一流体路径。此外，至少一个产物容器可以通过室的底部中的第三室口与电穿孔室流体连通，并且电穿孔室可以通过室的顶部中的第四室口与产物容器流体连通，从而形成第二流体路径。在一些实施方案中，可使用单口电穿孔室。在另一些实施方案中，可以使用电极、垫片、口和容器的多种其他合适的组合。电穿孔室可以包含约1至10mL的内部体积；然而，在另一些实施方案中，电穿孔室可以包含更小的内部体积(例如，0.75mL、0.5mL、0.25mL或更小)或更大的内部体积(例如，15mL、20mL、25mL或更大)。在一些实施方案中，电穿孔室及相关部件可以是一次性的(例如，医用级VI级材料)，例如PVC袋、PVC管、连接器、硅酮泵管等。
可以将任何数量的容器(例如，1、2、3、4、5、6或更多)与电穿孔室流体连通。容器可以是可收缩、可膨胀或固定体积的容器。例如，第一容器(例如，样品源或样品容器)可以包含细胞混悬液，并且在电穿孔期间可包含或可不包含进入细胞混悬液的细胞中的物质。如果不包含该物质，则可以包括含有该物质的第二容器使得在进入电穿孔室之前在管线内混合该物质或在电穿孔室中混合该物质。在一个另外的配置中，可以附连另一容器，其可保留待丢弃的流体。可使用一个或更多个另外的容器作为经处理的样品或产物的容器。经处理的样品或产物的容器保留由电穿孔过程产生的细胞或其他产物。此外，一个或更多个另外的容器可以包含可用于将样品分离成分散体积或单位体积的多种非样品流体或气体。非样品流体或气体容器可以通过第三口和/或第四口与电穿孔室流体连通。可以将非样品流体或气体容器并入经处理的样品容器或样品容器(例如，非样品流体容器可以包含一部分经处理的样品容器或样品容器)中；因此，在处理样品期间，非样品流体或气体可以从经处理的样品容器转移到另一容器(其可包括样品容器)。可将非样品流体或气体容器并入室中，只要非样品流体或气体的压缩不影响电穿孔即可。本发明的另外的方面可包括耦联至样品容器并且可向室供应试剂或其他样品的其他容器。
在一些另外的实施方案中，电穿孔仪器是静电穿孔并且不涉及流动的细胞，而是涉及在单个室中的细胞混悬液。当使用这样的仪器时，可使用流式电穿孔所述的参数来限制热降解、提高细胞生存力、提高序列修饰掺入的效率、提高转染效率等。这样的参数包括例如整个申请中所述的流式电穿孔参数和室的热阻、电极间距、与缓冲液接触的组合电极表面与电极之间的距离之比以及电场。
在某些方面中，在电穿孔期间细胞的密度是受控变量。在电穿孔期间细胞的细胞密度可不同或者可根据但不限于细胞类型、期望的电穿孔效率或所得经电穿孔的细胞的期望的生存力而改变。在某些方面中，细胞密度在整个电穿孔期间是恒定的。在另一些方面中，在电穿孔过程期间细胞密度是改变的。在某些方面中，在电穿孔前的细胞密度可为1x104细胞/mL至(y)x104，其中y可以为2、3、4、5、6、7、8、9或10。在另一些方面中，在电穿孔前的细胞密度可为1x105细胞/mL至(y)x105，其中y为2、3、4、5、6、7、8、9或10(或其中可推导出的任何范围)。在又一些方面中，在电穿孔前的细胞密度可为1x10e6细胞/mL至(y)x106，其中y可以为2、3、4、5、6、7、8、9或10。在某些方面中，在电穿孔前的细胞密度可为1x107细胞/mL至(y)x107，其中y可以为2、3、4、5、6、7、8、9或10或者其中可推导出的任何范围。在又一些方面中，在电穿孔前的细胞密度可为1x107细胞/mL至1x108细胞/mL、1x108细胞/mL至1x109细胞/mL、1x109细胞/mL至1x1010细胞/mL、1x1010细胞/mL至1x1011细胞/mL或1x1011细胞/mL至1x1012细胞/mL。在某些方面中，在电穿孔前的细胞密度可为(y)x106，其中y可以为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100中的任一者或者其中可推导出的任何范围。在某些方面中，在电穿孔前的细胞密度可为(y)x1010，其中y可以为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000中的任一者(或者其中可推导出的任何范围)。
在某些方面中，在电穿孔期间细胞的密度是受控变量。在电穿孔期间细胞的细胞密度可不同或者可根据但不限于细胞类型、期望的电穿孔效率或所得经电穿孔的细胞的期望的生存力而改变。在某些方面中，细胞密度在整个电穿孔中是恒定的。在另一些方面中，在电穿孔过程期间细胞密度是改变的。在某些方面中，在电穿孔期间的细胞密度可为1x104细胞/mL至(y)x104，其中y可以为2、3、4、5、6、7、8、9或10(或者其中可推导出的任何范围)。在另一些方面中，在电穿孔期间的细胞密度可为1x105细胞/mL至(y)x105，其中y为2、3、4、5、6、7、8、9或10(或者其中可推导出的任何范围)。在又一些方面中，在电穿孔期间的细胞密度可为1x106细胞/mL至(y)x106，其中y可以为2、3、4、5、6、7、8、9或10(或者其中可推导出的任何范围)。在某些方面中，在电穿孔期间的细胞密度可为1x107细胞/mL至(y)x107，其中y可以为2、3、4、5、6、7、8、9或10(或者其中可推导出的任何范围)。在又一些方面中，在电穿孔期间的细胞密度可为1x107细胞/mL至1x108细胞/mL、1x108细胞/mL至1x109细胞/mL、1x109细胞/mL至1x1010细胞/mL、1x1010细胞/mL至1x1011细胞/mL或1x1011细胞/mL至1x1012细胞/mL。在某些方面中，在电穿孔期间的细胞密度可为(y)x106，其中y可以为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100中的任一者(或者其中可推导出的任何范围)。在某些方面中，在电穿孔期间的细胞密度可为(y)x1010，其中y可以为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000中的任一者(或者其中可推导出的任何范围)。
在某些方面中，在电穿孔后的细胞密度可为1x104细胞/mL至(y)x104，其中y可以为2、3、4、5、6、7、8、9或10(或者其中可推导出的任何范围)。在另一些方面中，在电穿孔后的细胞密度可为1x105细胞/mL至(y)x105，其中y为2、3、4、5、6、7、8、9或10(或者其中可推导出的任何范围)。在又一些方面中，在电穿孔后的细胞密度可为1x106细胞/mL至(y)x106，其中y可以为2、3、4、5、6、7、8、9或10(或者其中可推导出的任何范围)。在某些方面中，在电穿孔后的细胞密度可为1x107细胞/mL至(y)x107，其中y可以为2、3、4、5、6、7、8、9或10(或者其中可推导出的任何范围)。在又一些方面中，在电穿孔后的细胞密度可为1x107细胞/mL至1x108细胞/mL、1x108细胞/mL至1x109细胞/mL、1x109细胞/mL至1x1010细胞/mL、1x1010细胞/mL至1x1011细胞/mL或1x1011细胞/mL至1x1012细胞/mL(或者其中可推导出的任何范围)。在某些方面中，在电穿孔后的细胞密度可为(y)x10e6，其中y可以为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100中的任一者(或者其中可推导出的任何范围)。在某些方面中，在电穿孔后的细胞密度可为(y)x1010，其中y可以为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000中的任一者(或者其中可推导出的任何范围)。
在某些实施方案中，电穿孔可以在任何原核或真核细胞上进行。在一些方面中，电穿孔涉及对人细胞进行电穿孔。在另一些方面中，电穿孔涉及对动物细胞进行电穿孔。在某些方面中，电穿孔涉及将细胞系或杂交细胞类型电穿孔。在一些方面中，要电穿孔的细胞为癌细胞、肿瘤细胞或永生化细胞。在一些情况下，肿瘤、癌、永生化的细胞或细胞系被诱导，在另一些情况下，肿瘤、癌、永生化的细胞或细胞系进入其各自的天然状态或条件下。在某些方面中，电穿孔的细胞或细胞系可以为A549、B细胞、B16、BHK-21、C2C12、C6、CaCo-2、CAP/、CAP-T、CHO、CHO2、CHO-DG44、CHO-K1、CHO-DUXB11 COS-1、Cos-7、CV-1、树突细胞、DLD-1、胚胎干(ES)细胞或衍生物、H1299、HEK，293、293T、293FT、Hep G2、造血干细胞、HOS、Huh-7、诱导性多能干细胞(iPS)或衍生物、Jurkat、K562、L5278Y、LNCaP、MCF7、MDA-MB-231、MDCK、间充质细胞、Min-6、单核细胞、Neuro2a、NIH 3T3、NIH3T3L1、NK细胞、NS0、Panc-1、PC12、PC-3、外周血细胞、浆细胞、原代成纤维细胞、RBL、Renca、RLE、SF21、SF9、SH-SY5Y、SK-MES-1、SK-N-SH、SL3、SW403、刺激性触发多能性获得(STAP)细胞或衍生物SW403、T-细胞、THP-1、肿瘤细胞、U2OS、U937或Vero细胞。
在某些实施方案中，细胞是本领域已知的难以转染的细胞。这样的细胞是本领域已知的，包括例如原代细胞、昆虫细胞、SF9细胞、Jurkat细胞、CHO细胞、干细胞、缓慢分裂细胞和非分裂细胞。
在一些实施方案中，细胞是造血干细胞或祖细胞。由于造血干细胞和祖细胞的巨大医学潜力，已经做了大量工作来尝试改进用于从胚胎干细胞分化造血祖细胞的方法。在成年人中，主要存在于骨髓中的造血干细胞产生活跃地分裂的分化成血液系统中的所有细胞的造血(CD34+)祖细胞的异源群。在成年人中，造血祖细胞增殖并分化，导致每天产生数以亿计的成熟血细胞。造血祖细胞还存在于脐带血中。在体外，人胚胎干细胞可分化成造血祖细胞。造血祖细胞还可以是从外周血样品中扩增或富集的。造血细胞可以是人源、鼠源或任何其他哺乳动物物种的。
在一些情况下，可以在一定量的时间内对一定量的细胞进行电穿孔。鉴于所述的平台的灵活性、一致性和可再现性，可以在小于0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100秒(或者其中可推导出的任何范围)内对多至或大于约(y)x104、(y)x105、(y)x106、(y)x107、(y)x108、(y)x109、(y)x1010、(y)x1011、(y)x1012、(y)x1013、(y)x1014或(y)x1015(或者其中可推导出的任何范围)个细胞进行电穿孔，其中y可以为1、2、3、4、5、6、7、8或9中任一者(或者其中可推导出的任何范围)。在另一些情况下，可以在小于0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110或120分钟(或者其中可推导出的任何范围)内对多至或大于约(y)x104、(y)x105、(y)x106、(y)x107、(y)x108、(y)x109、(y)x1010、(y)x1011、(y)x1012、(y)x1013、(y)x1014或(y)x1015(或者其中可推导出的任何范围)个细胞进行电穿孔，其中y可以为1、2、3、4、5、6、7、8或9中任一者(或者其中可推导出的任何范围)。在又一些方面中，可以在小于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时(或者其中可推导出的任何范围)内对多至或大于约(y)x104、(y)x105、(y)x106、(y)x107、(y)x108、(y)x109、(y)x1010、(y)x1011、(y)x1012、(y)x1013、(y)x1014或(y)x1015(或者其中可推导出的任何范围)的细胞进行电穿孔，其中y可以为1、2、3、4、5、6、7、8或9中任一者(或者其中可推导出的任何范围)。
表达式“(y)x10e”被理解为意指可以取任意数值的变量“y”乘以升高到指数值e的10。例如，(y)x104，其中y为2，被理解为意指2x104，相当于2x10,000，等于20,000。(y)x10e4还可以写为(y)＊10e4或(y)x104或(y)＊104。
细胞或培养基的体积可根据待电穿孔的细胞量、待筛选的细胞量、待筛选的细胞类型、待产生的蛋白质类型、期望的蛋白质的量、细胞生存力和与期望的细胞浓度相关的某些细胞特征而改变。可以用于所述方法和所述组合物的体积的实例包括但不限于0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、441、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000ml或L(或者其中可推导出的任何范围)以及其中可推导出的任何范围。可保持这样的体积的容器被考虑用于本文中所述的实施方案中。这样的容器包括但不限于细胞培养皿、培养皿(petri dish)、烧瓶、生物袋、生物容器、生物反应器或大桶。特别考虑了用于大规模体积的容器，例如能够容纳10L或更大体积的那些容器。在某些实施方案中，使用100L或更大的体积。
特别考虑到通过本文中所述的方法对细胞进行电穿孔提供了提高的效率和/或降低的毒性的益处。这样的测量可通过测量并入基因组DNA序列修饰的细胞的量，测量表达标志物的细胞的量和/或测量在电穿孔后细胞的生存力来进行。
在一些实施方案中，序列修饰的效率大于约2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％。序列修饰的效率可以通过确定具有序列修饰的细胞的数量并除以细胞的总数量来测量。基因组DNA序列修饰的掺入可以通过本领域已知的方法来确定，例如直接基因组DNA测序、差别限制性消化(如果序列修饰是添加、移除或改变限制酶位点)、凝胶电泳、阵列毛细管电泳、MALDI-TOF MS、动态等位基因特异性杂交、分子信标、限制性片段长度多态性、引物延伸、温度梯度凝胶电泳等。
在另一些实施方案中，电穿孔后的细胞生存力为至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或85％。细胞生存力可以通过本领域已知的方法来测量。例如，可以通过细胞计数器装置在电穿孔之前和之后计数细胞。在另一些实施方案中，测量凋亡。大量核酸的引入被认为可诱导凋亡。考虑到本文中所述的方法导致比本领域其他方法更少的细胞凋亡。在某些实施方案中，在电穿孔后表现出凋亡的细胞的量小于50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％。凋亡是指程序性细胞死亡的具体过程，并且可以通过本领域已知的方法来测量。例如，凋亡可通过膜联蛋白V测定、经活化的胱天蛋白酶3/7检测测定和凋亡测定(Life Technologies)来测量。
在一些另外的实施方案中，表达编码标志物的核酸的细胞的百分比大于约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％。
当本公开内容的一个具体实施方案包括范围或具体值时，如本文中所述，特别考虑到在本发明的一些实施方案中可排除范围和特定值(即，浓度、核酸的长度和百分比)。还考虑到当本公开内容包括要素列表(例如细胞类型)时，本发明的一些实施方案可特别地排除列表中的一个或更多个要素。
3.其他非化学方法
细胞挤压是通过轻轻挤压细胞膜使分子递送到细胞中的转染方法。细胞挤压是用于细胞内递送的高生产量无载体微流体平台。细胞挤压不依赖于外源材料或电场。
超声穿孔使用高强度超声来在细胞膜中诱导孔形成。该孔形成主要归因于气泡空穴与附近细胞膜相互作用，通过添加超声造影剂(空穴核的来源)来增强。
光学转染是使用高度聚焦的激光在细胞的质膜中瞬时产生微小(约1μm直径)的孔的方法。在该技术中，一次处理一个细胞，使其特别适用于单个细胞分析。
流体力学递送在小鼠和大鼠中进行，但在较大的动物中的程度较小，使用流体力学注射可以将通常在质粒中的DNA(包括转座子)递送到肝，其涉及在小于10秒内在血液中输注相对大的体积；通过该过程几乎所有的DNA都在肝中表达。
B.基于化学的转染方法
基于化学的转染可以分为多个种类：环糊精、聚合物、脂质体或纳米颗粒(有或没有化学或病毒起作用的过程)。
最便宜的方法之一使用磷酸钙。将包含磷酸盐离子的HEPES缓冲盐水溶液(HEPES-buffered saline solution，HeBS)与包含待转染的DNA的氯化钙溶液组合。当两者组合时，带正电荷的钙和带负电荷的磷酸盐的精细沉淀物形成，在其表面上结合待转染的DNA。然后将沉淀物的混悬液添加到待转染的细胞中(通常单层培养的细胞培养物)。通过不完全了解的过程，细胞摄取一些沉淀物，和与其一起的DNA。
其他一些方法使用高度支化的有机化合物(所谓的树枝状聚合物)来结合DNA并使其进入细胞。
一种非常有效的方法是将待转染的DNA包在脂质体中，脂质体即小的膜包覆体，其在一些方式上类似于细胞的结构并且实际上可以与细胞膜融合，将DNA释放到细胞中。对于真核细胞，使用阳离子脂质体(或混合物)更好地实现转染，因为细胞更敏感。
另一种方法是使用阳离子聚合物，例如DEAE-右旋糖或聚乙烯亚胺。带负电荷的DNA与聚阳离子结合，并且复合物通过胞吞作用被细胞接受。
C.基于颗粒的方法
直接的转染方法是基因枪，其中DNA与惰性固体(通常是金)的纳米颗粒偶联，然后将其直接“射”入靶细胞的核中。
磁转染或磁辅助转染是使用磁力将DNA递送到靶细胞中的转染方法。首先将核酸与磁性纳米颗粒缔合。然后，施加磁力将核酸颗粒复合物递送向靶细胞并到靶细胞中，在那里释放货物。
刺穿转染通过用长形的纳米结构和这样的纳米结构阵列刺穿细胞来进行，这样的纳米结构例如已经用质粒DNA功能化的碳纳米纤维或硅纳米线。
另一种基于粒子的转染方法被称为粒子轰击。以高速通过膜透过递送通常与微发射体连接的核酸。
V.实施例
包括以下实施例以证明本发明的一些优选实施方案。本领域技术人员应理解，以下实施例中公开的技术代表本发明人发现的在本发明的实践中作用得很好的技术，因此可以被认为是构成用于其实践的优选模式。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应理解在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对所公开的具体实施方案进行许多改变，并且仍然获得相同或相似的结果。
实施例1：在特异性核酸酶和质粒供体DNA的帮助下在基因组DNA中的靶向整合转基因
由于治疗潜力，对转基因在细胞基因组DNA中的有效靶向整合的需求很高。除了治疗潜力之外，转基因的高效的靶向整合可适用于蛋白质生产(例如，抗体生产)。对于转基因的靶向整合，通常将转基因在大段DNA或质粒上递送，其在某些细胞(例如原代细胞、干细胞、造血细胞或免疫细胞)中可具有毒性。因此，对于治疗相关的转基因的靶向整合，该方法必须提供在治疗相关细胞的靶基因组DNA中的高的整合效率和特异性。
假设在活化过程期间细胞(例如造血细胞或免疫细胞)可对用质粒DNA的转染具有不同的敏感性。考虑到可能存在这样的时间窗口，在其中扩增的造血细胞可表现出对质粒DNA转染具有提高的耐受性和降低的毒性。
为了测试该假设，在K562细胞和人T细胞中进行靶向整合。使用引导RNA(gRNA)Cas9。gRNA模板是用与T7启动子缀合的引物通过PCR扩增制备的。所使用的引物是：SM285.AAVS1.g2.F：ttaatacgactcactataGGGGCCACTAGGGACAGGAT(SEQ ID NO：19)和SM212.sgRNA.R：aaaagcaccgactcggtgcc(SEQ ID NO：20)。Cas9模板是通过Cas9质粒的内切核酸酶-线性化(Xhol 1)获得的。然后通过mMESSAGE mMACHINE T7ULTRA试剂盒(可商购自Ambion)制备mRNA。所使用的供体DNA是包含GFP的质粒DNA。
A.GFP转基因向K562中的靶向整合
图1示出了在通过电穿孔转染后1、5和12天GFP在27％、32％和37％的细胞中表达。如所预期的，在没有经历电穿孔(-EP)的细胞中没有看到显著的GFP表达，但是在不包含引导RNA和Cas9(其赋予靶向整合)的转染中35％的细胞表达GFP。然而，该表达是短暂的，并且在随后的5天和12天的测试时间点看到如此大量的GFP表达。只有用CRISPR系统转染的细胞在超过1天时间点后维持了显著水平的GFP表达(图1)。这在另外的实验中进一步被证实，其中使用CRISPR系统使PGK-eGFP-PolyA质粒靶向K562细胞的AAVS1位点中。如图14所示，靶向整合(+CRISPR)允许GFP在转染后至少29天的时间点(图14，第二行和第四行)的稳定表达。
测试了经转染的K562细胞的生存力、表达和平均荧光强度(图13)。转染到K562细胞中的质粒没有显示出细胞生存力的任何降低(图13A)。如图13B至13C所示，只有用CRISP系统转染的K562细胞在转染后超过5天维持大量的GFP表达。这是所预期的，因为转基因与CRISPR系统的共转染允许转基因的稳定的位点特异性整合。转基因的表达在没有选择压力的情况下保留在这些细胞中。
总而言之，质粒DNA不诱导K562细胞的显著的细胞毒性，并且在没有选择细胞的情况下看到有效的靶向整合(30％至40％)。
B.GFP转基因向成纤维细胞中的靶向整合
为了测试GFP转基因(PGK-eGFP-PolyA)的靶向整合是否可以整合到成纤维细胞中，用(+Cas0/gRNA)或不用(-Cas9/gRNA)CRISPR系统并用GFP质粒DNA(PGK-eGFP-PolyA)对人成纤维细胞进行电穿孔。直到转染后15天，在两个实验中看到相当的GFP表达水平，但是只有用CRISPR系统转染的细胞在转染后23天和26天维持显著的GFP表达(图12)。
C.GFP转基因到人T细胞中的靶向整合
如图2所示，在用质粒DNA转染后，人T细胞表现出降低的生存力(图2A)、降低的增殖(图2B)和降低的GFP表达(图2C)。然而，在用mRNA-GFP转染的细胞中克服了这些负效应，表明质粒DNA是毒性的来源。
然后测试了在细胞活化后不同时间点用质粒DNA转染的细胞是否影响细胞的生存力。与对照相比，在通过人T-活化剂CD3/CD28(可商购自LifeTechnologies)活化后1天电穿孔的T细胞没有表现出显著的生存力降低(图3A)。与活化后1天相比，在活化后2天转染导致细胞生存力的降低(图3B)，但是在每个测试样品中细胞生存力仍然超过40％。在三天时，细胞生存力进一步降低(图3C)。这些数据表明细胞的活化降低了与质粒DNA转染相关的毒性。当测试同一细胞的GFP表达(图4A至4C)和平均荧光强度(MFI，图5A至5C)时，当在活化后两天转染细胞时，看到最高水平的GFP表达(图4B和图5B)。
进一步研究扩增的T细胞的转染窗口。如先前所述的，活化T细胞，并在活化后一天、两天或三天进行电穿孔。图6示出了在不同时间点电穿孔的细胞的增殖。在活化后一天电穿孔的细胞表现出最多的细胞增殖(图6A)，并且在活化后三天电穿孔的细胞表现出最少量的细胞增殖。这些数据证明了在转染前细胞的活化允许对质粒DNA的更好的耐受性。
接下来测试转基因的靶向整合是否可以通过对活化后的T细胞进行电穿孔进行。如先前所述的，活化扩增的T细胞，然后在活化后两天，用100μg/ml的GFP质粒DNA进行电穿孔。如图7所示，没有电穿孔对照(-EP)表现出低水平的背景荧光。3％的用GFP质粒DNA而没有用CRISPR系统(gRNA/Cas9)(其允许在AAVS1位点进行位点特异性整合)转染的细胞在转染后一天表现出GFP荧光。然而，在这些细胞中GFP的表达是短暂的，并且在转染后四天降低到2％，转染后十一天降低到0.3％。相比之下，用CRISPR系统的细胞在转染后十一天维持GFP表达。4％、5％和4％的这些细胞中分别在转染后一、四和十一天表现出GFP表达。重复该实验，并且结果证实了用GFP质粒DNA和CRISPR复合物转染的细胞在转染后6天维持GFP表达(2.3％的细胞)，而只用GFP质粒DNA转染的细胞在转染后6天不表达GFP(图8)。
图9示出了在细胞活化后一、二、三或四天转染的细胞的结果。图9A示出了用50、100或200μg/ml质粒DNA而没有用CRISPR系统转染的细胞的增殖或者用50、100或200μg/ml质粒DNA且用CRISPR系统转染的细胞的增殖。如图9A所示，当在转染后3天或更多天转染细胞时，细胞增殖下降。此外，增殖似乎不依赖于DNA浓度。图9D示出了细胞的生存力。如图9D所示，当在转染后3天或更多天转染细胞时，细胞生存力也下降，并且生存力似乎不依赖于DNA浓度。图9B示出了当在活化后两天转染细胞时获得了最高百分比的表达GFP的细胞。图9C示出了当在活化后两天转染细胞时，整合事件的相对数量(计算为GFP阳性细胞的细胞数量x百分比)最高。
这些实验通过扩增的T细胞的FACS分析进一步被证实，如先前所述的，活化扩增的T细胞并用100μg/mL质粒DNA和-CRISPR(图15，第一行和第三行)或+CRISPR(图15，第二行和第四行)在活化后两天进行电穿孔。如图15所示，只有用CRISPR转染的细胞在超过4或6天的时间点后表现出稳定的转基因表达。
总而言之，在用质粒DNA转染前活化T细胞克服了在这些细胞中与质粒DNA相关的毒性和效率损失。
根据本公开内容，本文中所公开和要求保护的所有方法可以在不进行过度实验的情况下进行和执行。虽然已经就一些优选实施方案描述了本发明的组合物和方法，但是对本领域技术人员明显的是，在不脱离本发明的概念、精神和范围的情况下可以对本文中所述的方法的步骤或步骤顺序进行变化。更具体地，明显的是，在化学和生理上相关的某些试剂可替代本文中所述的试剂，同时获得相同或相似的结果。对于本领域技术人员明显的所有这样的类似替代和修改被认为是在由所附权利要求书限定的本发明的精神、范围和概念内。

Claims (77)

1.对细胞中的靶基因组DNA区域进行位点特异性序列修饰的方法，其包括：
使所述细胞与活化组合物接触；
用包含(a)供体DNA和(b)DNA消化剂的非病毒转染组合物转染所述细胞；
其中所述供体DNA包含：
(i)包含与所述靶基因组DNA区域同源之核酸序列的同源区域；以及
(ii)序列修饰区域；并且
其中基因组DNA序列在所述靶基因组DNA区域处被特异性修饰。
2.权利要求1所述的方法，其中所述细胞是免疫细胞。
3.权利要求2所述的方法，其中所述免疫细胞是T细胞。
4.权利要求3所述的方法，其中所述T细胞是原代T细胞。
5.权利要求4所述的方法，其中所述活化组合物包含抗CD3和抗CD28抗体。
6.权利要求5所述的方法，其中所述转染细胞包括对所述细胞进行流式电穿孔。
7.对细胞中的靶基因组DNA区域进行位点特异性序列修饰的方法，其包括：
使所述细胞与活化组合物接触；
用包含(a)供体DNA和(b)DNA消化剂的转染组合物转染所述细胞；
其中所述供体DNA包含：
(i)包含与所述靶基因组DNA区域同源之核酸序列的同源区域；以及
(ii)序列修饰区域；并且
其中基因组DNA序列在所述靶基因组DNA区域处被特异性修饰。
8.权利要求7所述的方法，其中所述转染细胞包括对所述细胞进行电穿孔。
9.权利要求8所述的方法，其中所述电穿孔是使用流式电穿孔仪器的流式电穿孔。
10.权利要求7至9中任一项所述的方法，其中在使所述细胞与活化组合物接触后少于7天的时间段时转染所述细胞。
11.权利要求10所述的方法，其中在使所述细胞与活化组合物接触后少于3天的时间段时转染所述细胞。
12.权利要求11所述的方法，其中在使所述细胞与活化组合物接触后2天或更短的时间段时转染所述细胞。
13.权利要求12所述的方法，其中在使所述细胞与活化组合物接触后两天转染所述细胞。
14.权利要求7至13中任一项所述的方法，其中所述DNA消化剂选自TALEN、转座酶、整合酶和核酸酶。
15.权利要求7至14中任一项所述的方法，其中所述DNA消化剂被编码于一个或更多个RNA上。
16.权利要求7至15中任一项所述的方法，其中所述DNA消化剂是核酸酶。
17.权利要求16所述的方法，其中所述DNA消化剂是Cas9。
18.权利要求7至17中任一项所述的方法，其中所述转染组合物还包含引导RNA。
19.权利要求16所述的方法，其中所述核酸酶是位点特异性核酸酶。
20.权利要求7至19中任一项所述的方法，其中所述供体DNA是质粒。
21.权利要求7至19中任一项所述的方法，其中所述供体DNA包含转基因。
22.权利要求7至19中任一项所述的方法，其中所述供体DNA是寡核苷酸。
23.权利要求7至19中任一项所述的方法，其中所述供体DNA是单链寡核苷酸。
24.权利要求7至23中任一项所述的方法，其中所述转染组合物中供体DNA的浓度为约10至约500μg/mL。
25.权利要求7至24中任一项所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
26.权利要求25所述的方法，其中所述细胞是人细胞。
27.权利要求25所述的方法，其中所述细胞是成纤维细胞。
28.权利要求25所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是外周血淋巴细胞。
29.权利要求25所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是原代T细胞。
30.权利要求25所述的方法，其中所述细胞是自然杀伤(NK)细胞。
31.权利要求29或30所述的方法，其中所述活化组合物包含抗CD3和抗CD28抗体。
32.权利要求25所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是干细胞。
33.权利要求32所述的方法，其中所述干细胞是造血干细胞。
34.权利要求32所述的方法，其中所述细胞是间充质干细胞。
35.权利要求25所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是原代细胞。
36.权利要求7至35中任一项所述的方法，其中所述靶基因组DNA序列包含疾病相关基因。
37.权利要求7至36中任一项所述的方法，其中所述供体DNA包含疾病相关基因。
38.权利要求7至37中任一项所述的方法，其中所述供体DNA包含嵌合抗原受体(CAR)。
39.权利要求38所述的方法，其中所述供体DNA的序列修饰区域包含CAR。
40.权利要求7至36中任一项所述的方法，其中所述供体DNA包含具有至少10个核酸的同源序列的同源区域。
41.权利要求40所述的方法，其中所述供体DNA包含具有至少20个核酸的同源序列的同源区域。
42.权利要求41所述的方法，其中所述供体DNA包含具有至少30个核酸的同源序列的同源区域。
43.权利要求7至42中任一项所述的方法，其中所述序列修饰的效率大于0.2％。
44.权利要求43所述的方法，其中所述序列修饰的效率大于1％。
45.权利要求44所述的方法，其中所述序列修饰的效率大于5％。
46.权利要求7至45中任一项所述的方法，其中转染后的细胞生存力为至少30％。
47.权利要求46所述的方法，其中转染后的所述细胞生存力为至少40％。
48.权利要求47所述的方法，其中转染后的所述细胞生存力为至少50％。
49.权利要求7至48中任一项所述的方法，其中所述DNA序列修饰是一个或更多个终止密码子。
50.权利要求7至48中任一项所述的方法，其中所述序列修饰改变所述基因组序列的一个或更多个碱基对。
51.权利要求7至48中任一项所述的方法，其中所述序列修饰向所述基因组序列添加一个或更多个碱基对。
52.权利要求7至48中任一项所述的方法，其中所述序列修饰缺失所述基因组序列的一个或更多个碱基对。
53.权利要求7至48中任一项所述的方法，其中所述DNA序列修饰是转基因的位点特异性靶向整合。
54.权利要求7至53中任一项所述的方法，其中所述转染组合物包含两种或更多种具有不同互补序列的供体DNA。
55.权利要求54所述的方法，其中所述转染组合物包含两种或更多种DNA消化剂。
56.权利要求55所述的方法，其中所述转染组合物包含两种或更多种位点特异性DNA消化剂；其中所述DNA消化剂靶向不同的基因组位点。
57.权利要求7至56中任一项所述的方法，其还包括扩增经分离和选择的克隆细胞以产生具有所述DNA序列修饰的克隆细胞。
58.权利要求57所述的方法，其中扩增的细胞用于大规模制造。
59.权利要求57或58中任一项所述的方法，其中以大于1L的体积扩增细胞。
60.权利要求59所述的方法，其中以3L或更大的体积扩增细胞。
61.权利要求7至60中任一项所述的方法，其中在无血清培养基中培养所述细胞。
62.权利要求7至61中任一项所述的方法，其还包括针对所述序列修饰对细胞进行筛选。
63.权利要求7至62中任一项所述的方法，其还包括冷冻经转染的细胞。
64.权利要求7至63中任一项所述的方法，其还包括扩增先前冷冻的经转染细胞。
65.产生包含靶基因组DNA序列之基因组DNA序列修饰的稳定细胞系的方法，所述方法包括：
使所述细胞与活化组合物接触；
用包含(a)供体DNA和(b)DNA消化剂的转染组合物转染所述细胞；
其中所述供体DNA包含：
(i)包含与靶基因组DNA区域同源的核酸序列的同源区域；以及
(ii)序列修饰区域；以及
针对在所述靶基因组DNA区域的基因组DNA序列修饰对经转染细胞进行筛选；
通过限制性稀释分离所筛选的经转染细胞以获得克隆细胞；
扩增所分离的经转染细胞以产生包含所述基因组DNA序列修饰的稳定细胞系。
66.细胞系，其通过权利要求65所述的方法产生。
67.经转染细胞，其使用权利要求7至65中任一项所述的方法产生。
68.治疗患有或怀疑患有疾病或病症的对象的方法，其通过施用有效量的权利要求67所述的经转染细胞或权利要求66所述的细胞系进行。
69.临床研究方法，其包括施用有效量的权利要求67所述的经转染细胞或权利要求66所述的细胞系。
70.在有此需要的对象中治疗癌症的方法，其包括：
使细胞与活化组合物接触；
用包含(a)供体DNA和(b)DNA消化剂的转染组合物转染所述细胞；
其中所述供体DNA包含：
(i)包含与靶基因组DNA区域同源的核酸序列的同源区域；以及
(ii)嵌合抗原受体(CAR)；并且
其中在所述靶基因组DNA区域特异性修饰基因组DNA序列以整合所述CAR；以及
向患者施用所述细胞。
71.权利要求70所述的方法，其中所述转染组合物是非病毒的。
72.权利要求70或71所述的方法，其中所述细胞是自体的。
73.权利要求70或72所述的方法，其中所述细胞是T细胞或NK细胞。
74.权利要求70至73中任一项所述的方法，其中所述癌症为白血病、B细胞恶性肿瘤或急性成淋巴细胞白血病。
75.权利要求70至74中任一项所述的方法，其中所述细胞分离自所述患者的血液。
76.权利要求75所述的方法，其中所述细胞通过采集术分离。
77.权利要求70至76中任一项所述的方法，其还包括从所述患者分离细胞。
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