CN107973843B - 一种提高大豆蛋白质品质的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高大豆蛋白质品质的方法及其应用。本发明的方法是将序列1所示的DNA分子导入受体大豆中，得到转基因大豆，转基因大豆的蛋氨酸含量和蛋白含量高于受体大豆，脂肪含量低于受体大豆。利用本发明的方法可对大豆涉及生育期和品质等复杂性状进行有效的遗传改良，可进一步拓宽大豆生物技术育种的应用范围，更好的服务大豆育种工作。

Description

一种提高大豆蛋白质品质的方法及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种提高大豆蛋白质品质的方法及其应用。
背景技术
大豆(Glycine max(L.)Merr.)是一种重要的粮油兼用型经济作物，其蛋白含量可达35％-50％，油分含量在20％左右。随着社会经济的发展，人们对于油脂和蛋白的需求量日益增加，进一步加大了对大豆的需求；另一方面，人们对于依靠豆粕和大豆青饲为重要饲料原料的肉蛋奶的需求的加大同样增加了对大豆作物本身的需求。根据ISAAA机构2015年全球转基因作物的种植比例来看，在大豆种植业中以转基因品种为种植总量最大。日益扩大的种植面积充分说明了转基因品种在作物生产上的重要意义。全球应用最为广泛的为转基因抗除草剂和抗虫性状，其中大豆的抗除草剂性状是实现大豆规模化生产的重要性状。
1994年以前我国大豆总产可满足国内的大豆净需求，并有少量出口，其中1994年大豆总供给为1615万吨，净出口78万吨。然而，从1995年起我国大豆进口直线上涨，2015年我国年大豆进口量达到8169万吨，国内大豆产量约为1100万吨，进口依存度达到88％以上。存在于大豆生产和加工中的问题已成为业内及国际上的重要关注点。规模化生产、优良品种的应用、政府的政策导向和经济补贴是影响大豆生产效率和成本的决定性因素。这其中，通过实施分子育种策略对大豆品种进行改良是提升我国大豆品种竞争潜力，实现大豆生产良性发展的重要保证。
我国大豆转基因育种除了需要实现抗除草剂这一特殊性状的要求外，仍需要探索和应用针对大豆自身特性的其他性状的创制或改良。而转基因育种途径具有一些显著的优势，可结合传统育种更好地服务于农业生产，这其中包括：1)可扩大性状来源，跨物种获得可用于品种性状改良的有利基因；2)有目的性地对单一性状改良，最小限度地影响基因背景；3)可对外源导入基因进行表达调控，在表达特异性和表达量上实现控制。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种提高大豆品质的方法。
本发明提供的提高大豆品质的方法包括在受体大豆中表达蛋白质，得到转基因大豆的步骤；所述转基因大豆的品质高于所述受体大豆；
所述蛋白质是如下a)或b)或c)的蛋白质：
a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；
b)在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；
c)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。
上述方法中，
所述转基因大豆的品质高于所述受体大豆体现在如下(1)-(4)中任一种：
(1)所述转基因大豆的蛋氨酸含量高于所述受体大豆；
(2)所述转基因大豆中与蛋氨酸代谢途径相关的氨基酸含量高于所述受体大豆；
(3)所述转基因大豆的蛋白含量高于所述受体大豆；
(4)所述转基因大豆的脂肪含量低于所述受体大豆。
上述方法中，所述蛋氨酸含量为水解蛋氨酸含量和/或游离蛋氨酸含量。
上述方法中，
所述表达的方法为将权利要求1中所述的蛋白质的编码基因导入受体大豆；
所述蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列1。
上述方法中，
所述与蛋氨酸代谢途径相关的氨基酸至少为如下一种：天冬氨酸、高丝氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、苏氨酸和异亮氨酸。
上述方法中，
所述受体大豆为自贡冬豆或吉林小粒1号。
本发明提供了一种提高大豆品质的方法，本发明通过大豆转基因育种的方法，将序列1所示的DNA分子导入受体大豆中，得到转基因大豆。通过实验证明：转基因大豆的蛋氨酸含量和蛋白含量高于受体大豆，脂肪含量低于受体大豆。利用本发明的方法可对大豆涉及生育期和品质等复杂性状进行有效的遗传改良，可进一步拓宽大豆生物技术育种的应用范围，更好的服务大豆育种工作。
附图说明
图1为转基因大豆的PCR鉴定结果。
图2为转基因大豆及野生型大豆叶片中游离蛋氨酸含量的测定。其中，ZD-36和ZD-42-1均为转基因自贡冬豆；JX-51为转基因吉林小粒1号；ZD-WT为野生型自贡冬豆；JX-WT为野生型吉林小粒1号。显著性分析(P＜0.05)结果以星号进行标注。
图3为转基因大豆及野生型大豆籽粒中游离蛋氨酸及水解总蛋氨酸含量测定。图3a为转基因大豆及野生型大豆籽粒中游离蛋氨酸含量测定；图3b为转基因大豆及野生型大豆籽粒中水解总蛋氨酸含量测定；图3c为转基因大豆及野生型大豆籽粒中游离蛋氨酸含量测定；图3d为转基因大豆及野生型大豆籽粒中水解总蛋氨酸含量测定。其中，ZD-36a、ZD-36b、ZD-41-1a和ZD-41-1b均为转基因自贡冬豆；JX-102、JX-107、JX-112、JX-113和JX-117均为转基因吉林小粒1号；WT，野生型。显著性分析(P ＜0.05)结果以星号进行标注。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的pTF-101.1载体由Iowa state university，Iowa state，USA提供。载体的信息见如下网址：http://agron-www.agron.iastate.edu/ptf/procedures/sequences-1.pdf。
实施例1、转基因大豆的获得及其品质检测
一、转基因大豆的获得
1、重组表达载体的构建
将序列1所示的DNA分子替换pTF-101.1载体的HindIII和XbaI酶切位点间的片段，且保持pTF-101.1载体的其他序列不变，得到重组表达载体。重组表达载体表达序列2所示的蛋白质。
2、重组农杆菌的获得
取1μg上述步骤1制备的重组表达载体转化根癌农杆菌EHA101，得到重组菌EHA101/pTF-MPE。
取1μg的pTF-101.1载体转化根癌农杆菌EHA101，得到重组菌EHA101/pTF-101。
3、转基因大豆的获得和鉴定
(1)转基因大豆的获得
分别将上述步骤2获得的重组菌EHA101/pTF-MPE和EHA101/pTF-101转化大豆品种自贡冬豆和吉林小粒1号，大豆遗传转化流程主要参考文献“Zhang Z,Xing A,Staswick P,et al.The use of glufosinate as a selective agent in Agrobacterium-mediatedtransformation of soybean[J].Plant Cell,Tissue and Organ Culture,1999,56(1):37-46.”，分别得到T0代转基因大豆(自贡冬豆)、T0代转基因大豆(吉林小粒1号)、转空载体大豆植株(自贡冬豆)和转空载体大豆植株(吉林小粒1号)。
(2)转基因大豆的筛选及PCR鉴定
将T0代转基因大豆(自贡冬豆)、T0代转基因大豆(吉林小粒1号)、转空载体大豆植株(自贡冬豆)和转空载体大豆植株(吉林小粒1号)种植于中国农业科学院作物科学研究所温室中(25℃，湿度60％-80％)，在大豆材料生长至V2期时对大豆叶片进行160mg/L草丁膦涂抹筛选处理，5-7天后观察并统计筛选表型，对草丁膦抗性植株进行叶片取样，进行PCR鉴定，直至得到阳性的T3代转基因大豆(自贡冬豆)株系ZD-36，ZD-42。阳性T3代转基因大豆(吉林小粒1号)株系JX-51。PCR鉴定的引物和目的片段大小如下：Forward Primer 5'AGCAATGGTGGAAGAGTAAA 3'；Reversed Primer 5'AGCAATGGTGGAAGAGTAAA 3'；目的片段大小416bp。转基因大豆的PCR鉴定结果图1所示。
检测结果表明：引物在阳性的T3代转基因大豆(自贡冬豆)株系、阳性T3代转基因大豆(吉林小粒1号)株系中均扩增得到大小为416bp的条带，而转空载体大豆植株(自贡冬豆)、转空载体大豆植株(吉林小粒1号)中均未扩增得到大小为416bp的条带。说明成功将序列1所示的DNA分子整合到受体大豆中。选取部分阳性转基因大豆株系进行如下品质检测实验。
二、转基因大豆的品质检测
(一)转基因大豆中氨基酸含量的测定
对步骤一获得的阳性的T3代转基因大豆(自贡冬豆)株系、阳性T3代转基因大豆(吉林小粒1号)株系、自贡冬豆和吉林小粒1号的蛋氨酸含量进行测定，测定包含针对大豆叶片与籽粒的游离氨基酸含量及水解氨基酸含量的检测。每一株系选取3个植株。其中，水解氨基酸的检测需提前对样品进行水解处理，再参考常规游离氨基酸的提取及上样检测流程。
大豆叶片和籽粒中结合态氨基酸的水解的具体步骤如下：
(1)取干燥的大豆叶片及籽粒样品(50-100mg鲜基样品)，置于液氮中进行快速冷冻处理；
(2)取干净无污染的研钵，加入足量液氮和组织进行研磨，研磨后的植物样品粉末应足够精细；
(3)小心加入10ml提取缓冲液(正亮氨酸(Norleucine)60μg/ml溶于HPLC级别DDW)，继续研磨，充分接触均匀；
(4)将提取物转移至新的15ml离心管中，置于冰上待全部样品准备完备后一同处理；
(5)涡旋振荡1min，并迅速将提取混合物取100ml转入水解管中；
(6)将样品置于旋转真空干燥机，过夜干燥至样品完全干燥；
(7)将水解管放入一个40ml容积的干燥瓶中(每个干燥瓶中可放入1-8只水解瓶)；
(8)向干燥瓶内加入2-3苯酚颗粒，并向底部加入300μl HCl(6N)；
(9)向干燥瓶上加盖三通阀门封口盖，插入注射用针头接通纯N2，抽真空后对干燥瓶内重新注满N2；
(10)抽30s真空后，重注5s N2；重复该步循化三次后，60s抽真空处理；
(11)摘掉气针关闭阀门，确保没有气体交换；
(12)将干燥瓶至于110℃进行20-24h的水解反应；
(13)水解完成后对样品进行抽真空干燥15min处理，取出水解管，缓慢干燥降温至室温。
水解产物中的氨基酸提取的方法具体步骤如下：
(1)向干燥管中加入460μl色谱纯级别的超纯水，涡旋振荡充分重悬水解样品；
(2)加入140μl氯仿，关闭水解管(或转入新的离心管中)，进行涡旋振荡30s；
(3)样品5000g离心30min；
(4)取上清400μl的液相层置于新的离心管中(并测量样品管中剩余液相容积)；
(5)样品管上表明样品和总量比值，至于-20℃避光保存待测。
大豆叶片和籽粒游离氨基酸的提取的具体步骤如下：
(1)取大豆叶片100mg或籽粒20-50mg材料置于液氮中进行研磨；
(2)精细研磨过程中加入350μl甲醇(100％)，继续研磨过程中继续添加350甲醇溶液；
(3)加入4.6μl 2mg/L的正亮氨酸内标溶液研磨混匀后，吸取样品致离心管中进行涡旋混匀；
(4)将离心管至于金属浴模块上70℃加热15min(上压重物，防止液体喷出)；
(5)样品取下后16℃，1,4000rpm离心10min；
(6)将上清小心转移至玻璃质15ml离心管中；
(7)加入370μl氯仿，涡旋振荡15s；
(8)加入750μl DDW，涡旋振荡15s；
(9)16℃，4000rpm离心30min；
(10)取上清液300-400μl转移至新的离心管中，量取剩余液体量总量；
(11)样品管上表明样品和总量比值，至于-20℃避光保存待测。
氨基酸的检测方法：气相色谱-质谱法(CG-MS)，采用中国农业科学院作物科学研究所公共实验平台岛津气质联用预设参数及氨基酸标准曲线进行上机定量分析；其中，以正亮氨酸作为叶片蛋氨酸含量的测定内标，样量为5μl；部分参数如下：(1)样品设置：进样口235℃；柱流量2；分流比20；(2)气相设置：色谱柱：HP-1MS(膜厚0.25um，内径0.32mm，长度30m)；升温程序：60℃2min，速率15℃/min，升至220℃保持1min；(3)质谱设置：离子源：220℃；离子源接口：230℃；检测电压1.8KV；(4)全谱及SIM扫描方式：列出内标正亮氨酸及蛋氨酸质谱峰参数；Nor 7.39-8.71min，T：158m/z，R：73/147m/z；Remain Time：7.892；Met 8.7-9.71min，T：76m/z，R：128/73m/z；Remain Time：9.525。
1、叶片中游离蛋氨酸含量检测
对步骤一获得的阳性的T3代转基因大豆(自贡冬豆)株系ZD-36和ZD-42-1、阳性T3代转基因大豆(吉林小粒1号)株系JX-51、自贡冬豆和吉林小粒1号的游离蛋氨酸和总蛋氨酸含量进行测定。
转基因大豆叶片中的游离蛋氨酸含量的检测结果如图2所示。从图中可以看出，在自贡冬豆转基因后代株系中，T3代转基因大豆(自贡冬豆)株系ZD-36和ZD-42-1叶片中的游离蛋氨酸含量分别为47.90±21.21nmol/g和52.95±8.41nmol/g，野生型材料(自贡冬豆，ZD-WT)叶片中的游离蛋氨酸含量为7.23±1.27nmol/g，T3代转基因大豆(自贡冬豆)株系ZD-36和ZD-42-1叶片中的游离蛋氨酸含量显著高于野生型材料(自贡冬豆，ZD-WT)。在吉林小粒1号转基因后代株系中，T3代转基因大豆(吉林小粒1号)株系JX-51叶片中游离蛋氨酸含量为48.66±8.48nmol/g，野生型材料(吉林小粒1号，JX-WT)叶片中的游离蛋氨酸含量为13.10±1.20nmol/g，T3代转基因大豆(吉林小粒1号)株系JX-51叶片中游离蛋氨酸含量显著高于野生型材料(吉林小粒1号，JX-WT)。
2、籽粒中游离态氨基酸含量和水解氨基酸含量检测
对阳性T3代转基因大豆(自贡冬豆)株系ZD-36a、ZD-36b、ZD-42-1a、ZD-42-1b和阳性T3代转基因大豆(吉林小粒1号)株系JX-102、JX107、JX112、JX113、JX119籽粒中游离态氨基酸含量和水解氨基酸含量进行检测。
转基因大豆籽粒中游离态氨基酸含量和水解氨基酸含量的检测结果如表1-表4和图3所示。在自贡冬豆转基因后代株系中，T3代转基因大豆株系后代籽粒的游离蛋氨酸含量与野生型自贡冬豆相比，没有获得显著的提高。但天冬氨酸却获得了显著的提高，天冬氨酸是合成蛋氨酸、赖氨酸、苏氨酸、异亮氨酸的重要前体化合物；T3代转基因大豆株系籽粒中的水解蛋氨酸含量与野生型自贡冬豆相比显著的提高，其中，T3代转基因大豆(自贡冬豆)株系ZD-36和ZD-42-1籽粒中蛋氨酸含量相比野生型材料分别提高了1.5-2.9倍和2.0-4.8倍。在吉林小粒1号转基因后代株系中，T3代转基因大豆株系后代籽粒的游离态蛋氨酸含量和水解蛋氨酸含量与野生型吉林小粒1号相比均显著的提高，游离蛋氨酸含量是野生型吉林小粒1号的2.7-4.4倍，T3代转基因大豆(吉林小粒1号)株系JX-51后代籽粒中的总蛋氨酸含量比野生型材料提高了1.3-2.3倍，除了蛋氨酸含量比野生型有所提高，与蛋氨酸代谢相关的一些氨基酸含量也获得了显著的提高，其中包括高丝氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、苏氨酸以及异亮氨酸。
综上所述，阳性T3代转基因大豆(自贡冬豆)株系、阳性T3代转基因大豆(吉林小粒1号)株系中的水解蛋氨酸含量在两个基因型的转基因后代籽粒中，均获得了显著的提高。在游离态的蛋氨酸含量上，两个基因型转基因后代存在了差异。与此同时，游离蛋氨酸代谢过程中，影响了相关代谢途径上的其他氨基酸的代谢水平，使得大部分相关代谢氨基酸获得了显著提高。
表1转基因自贡冬豆籽粒中游离态氨基酸含量
Figure BDA0001133985450000071
表2转基因自贡冬豆籽粒中水解氨基酸含量
Figure BDA0001133985450000072
表3转基因吉林小粒1号籽粒中游离态氨基酸含量
Figure BDA0001133985450000073
Figure BDA0001133985450000081
表4转基因吉林小粒1号籽粒中水解氨基酸含量
Figure BDA0001133985450000082
(二)籽粒中蛋白含量的测定
采用凯氏定氮测定法对步骤一获得的阳性的T3代转基因大豆(自贡冬豆)株系ZD-36和ZD-42-1、阳性T3代转基因大豆(吉林小粒1号)株系JX-51、自贡冬豆和吉林小粒1号的的蛋白含量进行测定。具体步骤如下：
1)称取0.2g大豆粉末，置于凯氏定氮专用消化管中，加入催化剂3g(硫酸铜和硫酸钾混合物)。然后加10ml浓硫酸，混匀后。将消化管放入已预热消化炉进行加热消化。
2)使用BUCHI-438尾气过滤泵进行尾气抽滤；
3)消化反应进行2h，取出冷却至室温，待测；
4)处理好的样品上机检测，输入样品量设置，进行机器预热和PRIMING程序后，进行自动检测，并完成含量的换算和输出。
结果如表5和表6所示。阳性T3代转基因大豆(自贡冬豆)株系ZD-36、阳性T3代转基因大豆(吉林小粒1号)株系JX-51中除蛋氨酸含量提高外，其蛋白质含量同样获得显著的提高；而ZD-42-1株系后代未见显著差异。
(三)籽粒中脂肪含量的测定
采用索氏抽提对步骤一获得的阳性的T3代转基因大豆(自贡冬豆)株系ZD-36和ZD-42-1、阳性T3代转基因大豆(吉林小粒1号)株系JX-51、自贡冬豆和吉林小粒1号的脂肪含量进行测定。具体步骤如下：
(1)称取2.000g破碎研磨的大豆粉末，置于样品包中，置于105℃烘箱中干燥处理3h；
(2)将样包置于脂肪提瓶中，小心加入无水乙醚(分析纯)并没过样品高度。进行预处理浸泡8-10h；
(3)预处理液体倒入抽提瓶后，重新向抽提瓶中加入无水乙醚，并没过样品顶端；上机检测链接冷凝循环，加热对样品进行抽提，温度70-80℃，抽提6-8h。样品抽提
(4)结束后，取出样品在通风橱中使得剩余乙醚完全挥发排出；
(5)抽提后的样品材料经过上述干燥过程之后，称量剩余重量，差值计算样品中所含有的总脂肪含量。
结果如表5和表6所示。大豆蛋白和脂肪含量具有普遍的负相关性。大豆蛋白获得显著提高的阳性T3代转基因大豆(自贡冬豆)株系ZD-36和ZD-42-1、T3代转基因大豆(吉林小粒1号)株系JX-51中，同样出现了大豆籽粒脂肪含量的显著下降，与前人研究结果一致。
表5转基因自贡冬豆后代株系籽粒中蛋白质和脂肪含量的测定
Figure BDA0001133985450000091
注：*差异显著
表6转基因吉林小粒1号后代株系籽粒中蛋白质和脂肪含量的测定
Figure BDA0001133985450000092
注：*差异显著，**差异极显著。
Figure IDA0001133985510000011
Figure IDA0001133985510000021
Figure IDA0001133985510000031
Figure IDA0001133985510000041
Figure IDA0001133985510000051

Claims (4)

1.一种提高大豆品质的方法，包括在受体大豆中表达蛋白质，得到转基因大豆的步骤；所述转基因大豆的品质高于所述受体大豆；
所述蛋白质是氨基酸序列如序列2所示的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述转基因大豆的品质高于所述受体大豆体现在如下（1）-（4）中任一种：
（1）所述转基因大豆的蛋氨酸含量高于所述受体大豆；
（2）所述转基因大豆中与蛋氨酸代谢途径相关的氨基酸含量高于所述受体大豆；
所述与蛋氨酸代谢途径相关的氨基酸至少为如下一种：天冬氨酸、高丝氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、苏氨酸和异亮氨酸；
（3）所述转基因大豆的蛋白含量高于所述受体大豆；
（4）所述转基因大豆的脂肪含量低于所述受体大豆。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述表达的方法为将权利要求1中所述的蛋白质的编码基因导入受体大豆；
所述蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列1。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述受体大豆为自贡冬豆或吉林小粒1号。
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