CN107964065A - 一种基于量子点的温敏型蛋白质印迹传感微球及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种基于量子点的温敏型蛋白质印迹传感微球及其制备方法，属于材料科学与生物分离工程技术领域。本发明首先以功能蛋白分子为模板分子，利用功能蛋白分子中丰富的氨基和羧基可与谷胱甘肽‑巯基乙酸(GSH‑TGA)共修饰的CdTe量子点通过静电电荷作用结合；之后在无氧环境下，以温敏性的异丙基丙烯酰胺(NIPAM)为功能单体，N,N‑亚甲基双丙烯酰胺(MBA)为交联剂，以过硫酸钾(KPS)引发聚合，通过自由基聚合法，得到基于量子点的温敏型蛋白质印迹传感微球。通过功能蛋白与量子点间的电子转移机理，从而实现微球对模板蛋白的荧光传感，使得合成的印迹微球具有温敏响应、荧光检测等性能。

Description

一种基于量子点的温敏型蛋白质印迹传感微球及其制备方法
技术领域
本发明属于材料科学与生物分离工程技术领域，尤其涉及一种基于量子点的温敏型蛋白质印迹传感微球及其制备方法。
背景技术
分子印迹技术，是制备对特定目标分子(也称模板分子、印迹分子)具有特异预定选择性的高分子化合物—分子印迹聚合物(MIPs)的技术。在如今各个领域都向智能化靠拢的时代，分子印迹领域也出现了智能印迹材料，或者称刺激响应型分子印迹材料，即在某些信号刺激下，刺激响应聚合物通过自身物理或化学性质的改变对刺激做出敏锐的应答，将刺激响应聚合物制备技术与分子印迹技术相结合制备MIPs，不仅具有刺激响应聚合物响应外界刺激的能力，而且具有印迹分子的识别能力，可以实现对目标分子的特异性控释。
中国专利CN104844768A公布了一种核壳结构的温敏型磁性蛋白质印迹微球的制备方法，通过温敏单体的加入，制得的印迹分子可以通过控制外界温度控制聚合物的溶胀和收缩状态，从而控制吸附和解吸附过程，实现温敏响应。但是，对于同时具有荧光传感与温敏响应的蛋白质印迹微球未有记载。
发明内容
有鉴于此，本发明目的在于提供一种基于量子点的温敏型蛋白质印迹传感微球及其制备方法，合成的印迹微球同时具有温敏响应和荧光检测性能。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种基于量子点的温敏型蛋白质印迹传感微球的制备方法，包含以下步骤：
1)将巯基乙酸和谷胱甘肽共修饰的CdTe量子点、功能分子蛋白溶液混合后进行静电吸附得静电吸附溶液；
2)将所述步骤1)得到的静电吸附溶液、异丙基丙烯酰胺、N,N-亚甲基双丙烯酰胺、过硫酸钾和水混合后进行自由基聚合反应，得到基于量子点的温敏型印迹壳层；
3)将所述步骤2)得到的温敏型印迹壳层用无水乙醇-氢氧化钠混合溶液洗脱，得到基于量子点的温敏型蛋白印迹微球。
优选地，所述功能蛋白分子为藻蓝蛋白、藻红蛋白、牛血清蛋白、牛血红蛋白或人血清白蛋白。
优选地，所述功能蛋白分子溶液的浓度为1.5-3.5g/L。
优选地，所述巯基乙酸和谷胱甘肽共修饰的CdTe量子点与功能分子蛋白分子溶液中的功能蛋白分子的质量比为15-30：16-24。
优选地，所述静电吸附的时间为1-4h。
优选地，所述异丙基丙烯酰胺、N,N-亚甲基双丙烯酰胺、过硫酸钾与巯基乙酸和谷胱甘肽共修饰的CdTe量子点的质量比为80-120：60-100：3-50：15-30。
优选地，所述步骤2)中自由基聚合反应的温度为25-35℃，自由基聚合反应的时间为3-5h。
优选地，所述步骤2)中自由基聚合反应在无氧环境中进行。
优选地，所述无水乙醇-氢氧化钠混合溶液中无水乙醇与氢氧化钠的摩尔比为103-112：0.6-1.2。
本发明还提供了基于量子点的温敏型蛋白质印迹传感微球的制备方法制得的基于量子点的温敏型蛋白质印迹传感微球，所述基于量子点的温敏型蛋白质印迹传感微球的粒径为30-40nm，所述基于量子点的温敏型蛋白质印迹传感微球的壳层为洗脱功能蛋白分子后的印迹层，所述基于量子点的温敏型蛋白质印迹传感微球的核层为量子点，所述量子点的的粒径为3-5nm。
有益技术效果：
本发明将量子点的荧光性能与智能响应型印迹识别策略相结合，以温敏性的异丙基丙烯酰胺(NIPAM)为功能单体，N,N-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)为交联剂，以过硫酸钾(KPS)引发聚合，通过自由基聚合法将蛋白质印迹在量子点表面制备了基于量子点的温敏型蛋白质印迹传感微球，通过功能蛋白与量子点间的电子转移机理，实现微球对模板蛋白的荧光传感，基于温敏单体的温敏特性实现微球的温敏功能。本发明得到的基于量子点的温敏蛋白质印迹传感微球对外界温度反应灵敏，不同的溶液温度对其吸附能力影响较大，可以通过简单的温度调控实现对模板蛋白的吸附与释放，并通过表面吸附作用实现量子点的荧光减弱/猝灭，洗脱掉模板，荧光恢复/增强，据此可进行模板蛋白检测。可实现对模板蛋白的高灵敏、高选择识别和高容量吸附。
附图说明
图1为实施例1中基于量子点的温敏型蛋白质印迹传感微球合成路线图；
图2为实施例1中巯基乙酸和谷胱甘肽共修饰的CdTe量子点和基于量子点的温敏型藻蓝蛋白印迹传感微球的透射电镜图；
图3为实施例1中基于量子点的温敏型蛋白质印迹传感微球的温敏测试图；
图4为室温下相同浓度的量子点、NIPs和MIPs的荧光强度对比；
图5为25℃下实施例1中得到的MIPs与不同浓度藻蓝蛋白结合的荧光光谱；
图6为45℃下实施例1中得到的MIPs与不同浓度藻蓝蛋白结合的荧光光谱；
图7为25℃下对比例1中得到的NIPs与不同浓度藻蓝蛋白结合的荧光光谱；
图8为实施例1中得到的MIPs和对比例1中得到的NIPs对不同蛋白识别能力对比图。
具体实施方式
本发明提供了一种基于量子点的温敏型蛋白质印迹传感微球的制备方法，包含以下步骤：
1)将巯基乙酸和谷胱甘肽共修饰的CdTe量子点、功能分子蛋白溶液混合后进行静电吸附得静电吸附溶液；
2)将所述步骤1)得到的静电吸附溶液、异丙基丙烯酰胺、N,N-亚甲基双丙烯酰胺、过硫酸钾和水混合后进行自由基聚合反应，得到基于量子点的温敏型印迹壳层；
3)将所述步骤2)得到的温敏型印迹壳层用无水乙醇-氢氧化钠混合溶液洗脱，得到基于量子点的温敏型蛋白印迹微球。
本发明将巯基乙酸和谷胱甘肽共修饰的CdTe量子点、功能分子蛋白溶液混合后进行静电吸附得静电吸附溶液。
本发明对所述巯基乙酸和谷胱甘肽共修饰的CdTe量子点的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的制备方法制得即可。在本发明的实施例中，可具体采用包括以下步骤的方法制备得到：
将碲粉、硼氢化钠、无水乙醇和水混合后在无氧环境中进行氧化还原反应，得到碲粉产物溶液；
将硝酸镉、水、巯基乙酸和谷胱甘肽混合后进行置换反应，得修饰后的硝酸镉溶液；
将所述碲粉产物溶液与修饰后的硝酸隔溶液混合后在无氧环境中回流反应，得到巯基乙酸和谷胱甘肽共修饰的CdTe量子点。
本发明将碲粉、硼氢化钠、无水乙醇和水混合后在无氧环境中进行氧化还原反应得到碲粉产物溶液。
在本发明中，所述碲粉、硼氢化钠、无水乙醇和水的用量比优选为35-40mg：30-45mg：1-2mL：0.4-1mL，更优选为37-39mg：35-40mg：1.5-2mL：0.5-0.8mL。
在本发明中，所述氧化还原反应的温度35-50℃，更优选为38-45℃；所述氧化还原反应的时间优选为3-5h，更优选为3.5-4.5h。
在本发明中，所述氧化还原反应结束后得到的上层清液即为碲粉产物溶液。
在本发明中，所述无氧环境的提供方法为本领域技术人员所熟知的方法即可，在本发明优选的实施例中为液封隔氧。
本发明将硝酸镉、水、巯基乙酸和谷胱甘肽混合后进行置换反应得修饰后的硝酸镉溶液。
在本发明中所述硝酸镉、水、巯基乙酸和谷胱甘肽的用量比优选为90-100mg：70-90mL：0.06-0.07mL：80-140mg，更优选为91-96mg：75-85mL：0.06-0.07mL：100-120mg。
在本发明中所述置换反应的温度优选为90-110℃，更优选为95-105℃，所述置换反应的时间优选为1-3h，更优选为1.5-2.5h。
得到碲粉产物溶液和修饰后的硝酸镉溶液后，本发明将所述碲粉产物溶液和修饰后的硝酸镉溶液混合在无氧环境中回流得到巯基乙酸和谷胱甘肽共修饰的CdTe量子点。
在本发明中，所述回流温度优选为90-110℃，更优选为95-105℃，所述回流时间优选为1-3h，更优选为1.5-2.5h。
在本发明中，所述无氧环境的提供方法优选采用本领域技术人员熟知的方法即可，在本发明的优选实施例中为通入氮气为碲粉产物和修饰后的硝酸镉反应提供无氧环境。
回流反应后，冷却，所得产物即为巯基乙酸和谷胱甘肽共修饰的CdTe量子点溶液。
得到巯基乙酸和谷胱甘肽共修饰的CdTe量子点后，本发明将巯基乙酸和谷胱甘肽共修饰的CdTe量子点和功能蛋白分子溶液混合后进行静电吸附得静电吸附溶液。
在本发明中，所述功能蛋白分子溶液中功能蛋白分子优选为藻蓝蛋白、藻红蛋白、牛血清蛋白、牛血红蛋白或人血清白蛋白，更优选为藻蓝蛋白、藻红蛋白或牛血清蛋白。在本发明中，所述功能蛋白分子中丰富的氨基和羧基，可与巯基乙酸和谷胱甘肽共修饰的CdTe量子点通过静电作用结合。
在本发明中，所述功能蛋白分子溶液的浓度优选为1.5-3.5g/L，更优选为1.8-3g/L。本发明对所述功能蛋白分子溶液的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的市售商品即可。
在本发明中，所述巯基乙酸和谷胱甘肽共修饰的CdTe量子点和所述功能蛋白分子溶液中的功能蛋白分子的质量比为优选为15-30：16-24，更优选为20-25：18-22。
在本发明中，所述静电吸附的时间优选为1-4h，更优选为2-3h。
得到静电吸附溶液后，本发明将得到的静电吸附溶液与异丙基丙烯酰胺、N,N-亚甲基双丙烯酰胺、过硫酸钾和水混合后进行自由基聚合反应，得到基于量子点的温敏型印迹壳层。
在本发明中，所述异丙基丙烯酰胺、N,N-亚甲基双丙烯酰胺、过硫酸钾与巯基乙酸和谷胱甘肽共修饰的CdTe量子点的质量比优选为80-120：60-100：3-5：15-30，更优选为90-110：70-90：3.5-34.5：18-22。本发明在此处对水的用量没有特殊限定，能够溶解或分散反应物即可。
在本发明中，所述自由基聚合反应的温度优选为25-35℃，更优选为28-32℃；所述自由基聚合反应的时间优选为3-5h，更优选为3.5-4.5h；所述自由基聚合反应的pH值优选为9.0-9.5，更优选为9.1-9.3。本发明对pH值的调节方法没有特殊限制，选用本领域中常规的调节方法即可，在本发明优选的实施例中为通过加入氢氧化钠调节溶液的pH。
在本发明中，所述自由基聚合反应优选在无氧环境中进行。本发明对无氧环境的提供方法没有特殊限制，采用本领域技术人员熟知的方法即可，在本发明的优选实施例中为通入氮气为自由基聚合反应提供无氧环境。
本发明对自由基聚合反应的物料加入顺序没有特殊限定，选用本领域技术人员熟知的物料加入顺序即可，具体的，先将异丙基丙烯酰胺加入到静电吸附液中，然后再加入N,N-亚甲基双丙烯酰胺，最后再加入过硫酸钾，进行自由基聚合反应。
在本发明中，所述异丙基丙烯酰胺、N,N-亚甲基双丙烯酰胺和硫酸钾优选以水溶液的形式加入，本发明对所述水的用量没有特殊限定，选用本领域常规用量，能够溶解异丙基丙烯酰胺、N,N-亚甲基双丙烯酰胺和硫酸钾即可。
得到基于量子点的温敏型印迹壳层后，本发明将得到的温敏型印迹壳层用乙醇-氢氧化钠混合溶液洗脱，得到基于量子点的温敏型蛋白质印迹传感微球。
本发明优选将得到的温敏型印迹壳层用乙醇-氢氧化钠混合溶液洗脱后，依次进行离心水洗、干燥，得到量子点的温敏型蛋白印迹传感微球。
在本发明中，所述乙醇-氢氧化钠混合溶液中无水乙醇与氢氧化钠的摩尔比优选为103-112：0.6-1.2，更优选为106-110：0.9-1.1。
本发明对水洗的方法没有特殊限制，选用本领域中常规的水洗方法即可。
本发明对干燥方法没有特殊限制，选用本领域中常规的干燥方法即可。在本发明中所述干燥优选为真空干燥，所述干燥温度优选为40-50℃，所述干燥时间优选为6-10h。
图1为本发明基于量子点的温敏型蛋白质印迹传感微球合成路线图，利用巯基乙酸和谷胱甘肽各自具有的丰富氨基与羧基，制备了巯基乙酸和谷胱甘肽共修饰的CdTe量子点；然后以功能蛋白分子为模板分子，利用功能蛋白中丰富的氨基和羧基可与修饰的量子点通过静电电荷作用结合固定之后，在无氧环境下，以温敏性的异丙基丙烯酰胺为功能单体，N,N-亚甲基双丙烯酰胺为交联剂，以过硫酸钾为引发聚合，通过自由基聚合法，得到了基于量子点的温敏型印迹壳层，然后将模板分子洗脱得到基于量子点的温敏型蛋白质印迹微球。通过藻蓝蛋白与量子点间的电子转移机理，从而实现微球对模板蛋白的荧光传感，使得合成的印迹微球同时具有荧光检测和温敏响应等性能。
本发明还提供了基于量子点的温敏型蛋白质印迹传感微球的制备方法制得的基于量子点的温敏型蛋白质印迹传感微球，所述基于量子点的温敏型蛋白质印迹传感微球的粒径优选为30-40nm，更优选为33-38nm；所述基于量子点的温敏型蛋白质印迹传感微球的壳层为洗脱功能蛋白分子后的印迹层，所述基于量子点的温敏型蛋白质印迹传感微球的核层为量子点。
下面结合实施例对本发明提供的基于量子点的温敏型蛋白质印迹传感微球及其制备方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
巯基乙酸和谷胱甘肽共修饰的CdTe量子点的合成：称取38.3mg的碲粉和40mg的硼氢化钠加入到2mL的尖底黄盖瓶中，先加入1.5mL的无水乙醇，再加入0.5mL的去离子水，迅速盖上盖子，使体系密闭，在盖子上插一根针头，在针头上用去离子水进行液封隔氧，40℃恒温反应4h，至黑色的碲粉完全消失，上清液为淡紫色为止。同时把92.4mg的硝酸镉加入到75mL的去离子水中，然后加入63μL的巯基乙酸和谷胱甘肽，再用1mol/L的氢氧化钠溶液将pH调到9.2，用氮气吹20min除氧。将碲粉产物的上清液1mL加入到硝酸镉溶液中，氮气保护下回流2h，即可得到黄绿色的量子点。
基于量子点的温敏型印迹壳层的制备：取20mg上述修饰的量子点，加14mL去离子水，与10mL 2g/L藻蓝蛋白混合，室温搅拌反应2h。将100mg异丙基丙烯酰胺(NIPAM)溶于2mL水中加入，反应30min；80mg N,N-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)溶于4mL水加入，充分排空气反应1h，恒压漏斗滴加4mL硫酸钾)(KPS)水溶液(4mg)在30℃氮气保护下反应4h，离心得到基于量子点的温敏型印迹壳层。
模板分子的洗脱：将上述基于量子点的温敏型印迹壳层，先用无水乙醇(99.5％)-氢氧化钠(1mol/L)的混合溶液(体积比5:1,即摩尔比109:1)洗涤，将模板分子洗脱；然后将其用去离子水以大约7500转/分钟的速度在离心机中进行清洗，10分钟左右，然后把上清液倒掉，所得微球沉降在离心管底部，将该微球取出再放到真空干燥箱40-50℃干燥6-10h待用，得到的即为基于量子点的温敏型藻蓝蛋白印迹传感微球，简写为MIPs。
对比例1：
制备非印迹聚合物(NIPs)作为对比，除了不加模板藻蓝蛋白之外，其它步骤与实施例1相同。
图1为实施例1中基于量子点的温敏型蛋白质印迹传感微球合成路线图；
图2为实施例1中巯基乙酸和谷胱甘肽共修饰的CdTe量子点和基于量子点的温敏型藻蓝蛋白印迹传感微球的透射电镜图。
取10μL稀释的实施例1中的巯基乙酸和谷胱甘肽共修饰的CdTe量子点分散在经过无水乙醇清洗的铝片上，干燥之后，进行喷金处理，将载有样品的铝片用扫描电镜进行观察如图2A所示，可以看到实施例1中合成的巯基乙酸和谷胱甘肽共修饰的CdTe量子点粒径比较均匀，粒径约为3-5nm，且分散均匀。
取10μL稀释的实施例1中的基于量子点的温敏型藻蓝蛋白印迹传感微球溶液分散在经过乙醇清洗的铜网上，干燥之后，将载有样品的铜网用透射电镜进行观察如图2B、图2C所示，可以看出通过自由基聚合反应之后，表面形成了一层明显的印迹层，得到粒径为30-40nm，形貌规则的微球颗粒。由于纳米粒子具有高比表面积，因此纳米印迹聚合物中识别位点大都处于聚合物表面，即使少量印迹位点处于聚合物内部，但由于粒径较小，模板分子进出的阻力也比较小，同样可以解决模板分子洗脱不完全造成的MIPs结合容量低、质量传递慢等问题。因此,该纳米印迹聚合物微球能很好地发挥传感和识别作用。
图3为实施例1中基于量子点的温敏型蛋白质印迹传感微球的温敏测试图。
如图3A所示，选择20℃和45℃分别作为测试的低温和高温条件，在相同浓度下测定实施例1中得到的传感微球的基础荧光强度，高温时，功能单体收缩，堵塞了传感器中部分通道的荧光；低温时，功能单体舒张，打开通道，更容易检测到荧光，也相应的更容易与目标蛋白结合和检测。
如图3B所示，将实施例1中得到的传感微球的在高温与低温之间测定荧光强度，如图3B，呈现出有规律的变化。说明实施例1中得到的传感微球具有温敏性质；重复测定荧光强度，基本没有荧光损失，说明MIPs具有稳定的温敏荧光性。
图4为室温下相同浓度的量子点、NIPs和MIPs的荧光强度对比。
图4中按照荧光峰从上至下依次为室温下相同浓度的量子点(实施例1中得到的巯基乙酸和谷胱甘肽共修饰的CdTe量子点)、对比例1中得到的NIPs和实施例1中得到的MIPs的荧光强度对比。可以看出，NIPs比量子点荧光强度低，但没有明显的峰位移，说明不加入模板蛋白的NIPs粒径更小，只是在团聚的量子点表面包裹一层聚合物；MIPs荧光强度比NIPs低，发生红移，半峰宽变宽，说明粒径变大，发生了印迹过程。
图5为25℃下实施例1中得到的MIPs与不同浓度藻蓝蛋白结合的荧光光谱。
图6为45℃下实施例1中得到的MIPs与不同浓度藻蓝蛋白结合的荧光光谱。
图7为25℃下对比例1中得到的NIPs与不同浓度藻蓝蛋白结合的荧光光谱。
图5、图6和图7中按照荧光峰从上至下藻蓝蛋白的浓度依次为0μM、0.25μM、0.50μM、0.70μM、0.9μM、1.4μM、1.8μM。
图5和图6分别为25℃和45℃下MIPs与不同浓度藻蓝蛋白结合的荧光光谱，可以看出，二者有明显的区别，可通过温度的改变调节对模板分子的吸附量。
图6和图7分别为室温下MIPs和NIPs与不同浓度藻蓝蛋白结合的荧光光谱，可以看出，二者有着不同KSV猝灭系数，模板蛋白对MIPs有更大的影响，MIPs更容易吸附目标分子，这是因为MIPs上的印迹位点与目标分子互相匹配，发生特异性的相互作用，从而会引起荧光强度的显著降低。
图8为实施例1中得到的MIPs和对比例1中得到的NIPs对不同蛋白识别能力对比图。
从图8可以看出，实施例1中得到的MIPs对目标分子藻蓝蛋白(PC)具有很好的选择能力，MIPs材料的猝灭系数最大。另外，对藻红蛋白(PE)和螺旋藻(Spirulina)，也有一定的识别作用，因为这两种与藻蓝蛋白同属于藻类蛋白，结构类似，螺旋藻粉中含有一定量的藻蓝蛋白，会造成部分的荧光猝灭。藻蓝蛋白的印迹因子IF为4.59，对于结构相差较大的普通蛋白牛血清蛋白(BSA)而言，具有相当大的区别能力。同时，NIPs材料对这4类蛋白的猝灭量均较小，没有明显差别。
上述检测结果表明，本发明中实施例1得到的基于量子点的温敏型蛋白质印迹传感微球对藻蓝蛋白具有良好的识别选择性和优异的吸附性能。
本发明以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种基于量子点的温敏型蛋白质印迹传感微球的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：
1)将巯基乙酸和谷胱甘肽共修饰的CdTe量子点与功能蛋白分子溶液混合进行静电吸附，得静电吸附溶液；
2)将所述步骤1)得到的静电吸附溶液与异丙基丙烯酰胺、N,N-亚甲基双丙烯酰胺、过硫酸钾和水混合进行自由基聚合反应，得到基于量子点的温敏型印迹壳层；
3)将所述步骤2)得到的温敏型印迹壳层用无水乙醇-氢氧化钠混合溶液洗脱印迹分子，得到基于量子点的温敏型蛋白印迹微球。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述静电吸附的时间为1-4h。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述功能蛋白分子溶液中的功能蛋白分子为藻蓝蛋白、藻红蛋白、牛血清蛋白、牛血红蛋白或人血清白蛋白。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述功能蛋白分子溶液的浓度为1.5-3.5g/L。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述巯基乙酸和谷胱甘肽共修饰的CdTe量子点与功能蛋白分子溶液中的功能蛋白分子的质量比为15-30：16-24。
6.根据权利要求1-5任意一项权利要求所述的制备方法，其特征在于，所述异丙基丙烯酰胺、N,N-亚甲基双丙烯酰胺、过硫酸钾与巯基乙酸和谷胱甘肽共修饰的CdTe量子点的质量比为80-120：60-100：3-50：15-30。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中自由基聚合反应的温度为25-35℃，自由基聚合反应的时间为3-5h。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中自由基聚合反应在无氧环境中进行。
9.根据权利要求1-5和权利要求7-8任意一项所述的制备方法，其特征在于，所述无水乙醇-氢氧化钠混合溶液中无水乙醇与氢氧化钠的摩尔比为103-112：0.6-1.2。
10.权利要求1-9任意一项所述的制备方法制得的基于量子点的温敏型蛋白质印迹传感微球，所述基于量子点的温敏型蛋白质印迹传感微球的粒径为30-40nm，所述基于量子点的温敏型蛋白质印迹传感微球的壳层为洗脱功能蛋白分子后的印迹层，所述基于量子点的温敏型蛋白质印迹传感微球的核层为量子点，所述量子点的粒径为3-5nm。
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