CN104075925A - 一种基于量子点的蛋白质核壳印迹微球的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于材料科学与工程和生物分离工程领域,具体来说是一种基于量子点的蛋白质核壳印迹微球的制备方法。用改进的
Description
技术领域
本发明属于材料科学与工程和生物分离工程领域,具体来说是一种基于量子点的蛋白质核壳印迹微球的制备方法。
背景技术
蛋白质的种类众多,性质和功能也各不相同。其中,藻蓝蛋白是仅存在于蓝藻中的一种少见的天然营养素,具有重要的生物/医药价值;同时,它经常用作蓝藻细菌的指标,在研究蓝藻污染方面是有效的指示物,具有重要的环境意义。藻蓝蛋白因而受到广泛关注,对藻蓝蛋白的识别和测定的技术要求也越来越迫切。利用新型的荧光传感技术结合分子印迹技术用于藻蓝蛋白的识别,对于材料科学和生命科学的发展具有重要的学术和应用价值。
量子点就是由少量的原子所构成的准零维的纳米材料。由于量子点在三维上尺寸都很微小,因而内部电子在各方向上的运动都受到局限,所以量子局限效应非常显著。作为新型的纳米材料,量子点因具有荧光特性和量子效应激起了广大研究人员的兴趣。近十几年来,人们对其水溶性改性、体内成像、毒性研究以及在生物材料的选择性识别上展开了广泛的研究。目前,将量子点用于高选择性、高度特异性标记细胞和生物分子的技术上,对非特异性背景进行弱化等,取得了巨大的进步。将其作为具有良好荧光效果的信号材料,与分子印迹作为识别材料相结合形成复合材料,用于高效识别和测定蛋白质有着广泛的前景。
核壳印迹是为解决模板分子洗脱不彻底的问题而提出的策略,结合各种聚合物制备技术,得到了快速的发展。核壳结构不仅能够提供更高的印迹容量和更快的传质速率,而且容易复合各种基团和性能。通过在形貌规则的粒子表面形成分子印迹薄层,可制备出高产率、窄分布的复合粒子。同时核材料作为基质,可以控制粒径大小和分布。制备之后无需磨碎和筛分,因此避免了材料的浪费。二氧化硅因粒径可控,表面易进行各种改性,同时具有良好的生物兼容性,在核壳结构中作为一种良好的核材料得到了广泛的应用。某些活性物质通过共振能量转移、表面吸附、电荷转移等方式可以实现对量子点荧光进行猝灭,同时通过分子印迹对其进行选择性识别,因此可以通过荧光的变化,选择性对活性物质进行识别和测定,从而实现核壳印迹微球的智能化。对其进行智能化的修饰和操作,可以使其具有快速、高选择、高灵敏等优点。因此,具有良好荧光效果的量子点和具有优异选择性的核壳印迹材料相结合,在纳米技术、生物医疗技术和环境监测等领域都有着强大的生命力和广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于量子点的蛋白质核壳印迹微球的制备方法。
为实现上述目的,本发明采用的技术方案为:
一种基于量子点的蛋白质核壳印迹微球的制备方法,用改进的法合成表面带有氨基的二氧化硅纳米粒子,同时合成表面带有羧基的CdTe量子点,将量子点接枝到二氧化硅表面,采用溶胶凝胶法与表面印迹技术在二氧化硅的表面形成蛋白质印迹层,洗脱掉模板得到基于量子点的蛋白质核壳印迹微球。
进一步的说,以溶胶凝胶法在经过量子点改性的二氧化硅表面进行核壳印迹,以藻蓝蛋白为模板分子,将分子印迹作为选择识别单元与量子点作为信号单元相结合,通过表面吸附作用实现量子点的荧光减弱/猝灭,洗脱掉模板分子,即得蛋白质核壳印迹微球。
所述的蛋白质核壳印迹微球的具体制备:
a.纳米级二氧化硅的合成:将乙醇和去离子水混合,再加入氨水作为催化剂,而后缓慢滴加乙醇和四乙氧基硅烷溶液的混合溶液,室温搅拌反应,反应后加入3-氨丙基三乙氧基硅烷,即可得到纳米级的二氧化硅粒子;
b.CdTe量子点的合成:将碲粉和硼氢化钠混合,混合后加入乙醇,再加入去离子水,密闭加热恒温反应,待用;同时把硝酸镉溶解在去离子水中,并加入巯基乙酸进行改性,而后用氢氧化钠溶液调节pH 9-10,用氮气除氧;将上述所得碲粉产物的上清液加入到上述改性后硝酸镉溶液中,氮气保护下回流,即得到黄绿色的CdTe量子点;
c.二氧化硅表面接枝:上述合成的二氧化硅溶液,加入到2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲溶液中,超声振荡使二氧化硅粒子完全分散开,然后缓慢依次滴加活化的量子点溶液,室温避光搅拌反应,使得量子点接枝到二氧化硅的表面;活化的量子点溶液为盐酸1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺活化;
d.印迹壳层的制备:将上述接枝量子点的二氧化硅加入到磷酸盐缓冲溶液中,超声分散,加入模板分子藻蓝蛋白和功能单体3-氨丙基三乙氧基硅烷,避光搅拌,使其充分结合,之后加入催化剂氨水和交联剂四乙氧基硅烷,室温反应、洗涤,即形成印迹壳层。
e.模板分子的洗脱:将上述所得印迹壳层用曲拉通X-100溶液振荡洗脱,去除模板分子藻蓝蛋白,用去离子水离心清洗、干燥,即得到藻蓝蛋白核壳印迹微球。
所述步骤a.纳米级二氧化硅的合成:将20-40mL的乙醇和40-60mL的去离子水混合,混合后加入8-12mL的氨水,而后滴加入20-30mL的乙醇和四乙氧基硅烷的混合溶液,室温搅拌反应4-8h,之后再加入3-6mL的3-氨丙基三乙氧基硅烷,搅拌反应10-14h,用乙醇离心清洗3-6遍,最后将二氧化硅分散在40-60ml的乙醇中,即可得到纳米级的二氧化硅粒子溶液;其中乙醇和四乙氧基硅烷按体积比为4:1混合。
所述步骤b.CdTe量子点的合成:称取35-40mg的碲粉和30-45mg的硼氢化钠混合,混合后加入1-2mL的乙醇,再加入0.4-1.0mL的去离子水,密闭条件下在30-50℃恒温反应,反应3-5h,至黑色的碲粉完全消失,上清液为淡紫色为止;同时把90-100mg的硝酸镉加入到70-90mL的去离子水中,然后加入60-70μL的巯基乙酸,再用1mol/L的氢氧化钠溶液将pH调到9-9.2,用氮气吹10-30min除氧,将碲粉产物的上清液1mL加入到硝酸镉溶液中,氮气保护下回流1-3h,即可得到黄绿色的量子点。
所述步骤c.二氧化硅表面接枝:取3-6mL纳米级的二氧化硅溶液,加入40-50mL的pH为5-6的2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲溶液,超声8-12min使二氧化硅粒子完全分散开,然后恒压滴加8-12mL量子点、4-8mL的20mg/mL的盐酸1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、4-8mL的10mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺溶液,室温避光搅拌反应4-8h,使得量子点接枝到二氧化硅的表面,将反应产物分别用去离子水、pH=7.5的0.01mol/L磷酸盐缓冲溶液清洗3-5遍,将其分散在40-60mL的pH=7.5磷酸盐缓冲溶液中。
所述步骤d.印迹壳层的制备:取上述分散有量子点接枝的二氧化硅溶液10mL,然后加入20-40mL的pH=7.5的磷酸盐缓冲溶液,超声分散8-12min,然后加入15-25mg的藻蓝蛋白和140-180μL的3-氨丙基三乙氧基硅烷,避光搅拌25-35min,使其充分结合之后,加入180-220μL的氨水和180-220μL的四乙氧基硅烷,反应10-14h,用去离子水清洗3-5遍,即形成印迹壳层。
所述步骤e.模板分子的洗脱:将上述所得用20-40mL的1%的曲拉通X-100溶液振荡清洗,将模板分子洗脱,然后用去离子水离心清洗、分离,再放到真空干燥箱40-50℃干燥6-10h,即得到藻蓝蛋白核壳印迹微球。
本发明所具有的优点:
本发明结合溶胶凝胶法和量子点,制备了基于量子点的蛋白质核壳印迹微球,用于藻蓝蛋白的高效识别与高灵敏荧光检测。形成蛋白质印迹层后,通过表面吸附作用实现量子点的荧光减弱/猝灭;洗脱掉模板,荧光恢复/增强,据此可进行模板蛋白检测。系统考察了该微球对藻蓝蛋白的分析性能,相比其它蛋白对藻蓝蛋白显示出很高的选择性吸附能力;相对于非印迹聚合物,对藻蓝蛋白有着更高的识别选择性、结合容量和吸附稳定性。该发明兼具快速、高选择、高灵敏等优势,不仅提供了对藻蓝蛋白检测的新策略,而且丰富了分子印迹/蛋白质相关研究。
附图说明
图1为本发明实施例提供的蛋白质核壳印迹微球制备过程示意图。
图2为本发明实施例提供的扫描电镜图(A、C)和透射电镜图(B、D):A、B:接枝有量子点的二氧化硅;C、D蛋白质核壳印迹微球。D中插图为蛋白质核壳印迹微球的普通照片(左)和在紫外灯下的荧光照片(右)。
图3为本发明实施例提供的蛋白质核壳印迹微球在不同pH下荧光强度变化,以及吸附藻蓝蛋白后随着pH变化的荧光强度变化比值。
图4为本发明实施例提供的量子点随着加入藻蓝蛋白的量增加其荧光最大发射波长的变化。插图为加入不同藻蓝蛋白的量子点的普通照片(上排)和对应的在紫外灯下的荧光照片(下排)。
图5为本发明实施例提供的蛋白质核壳印迹微球(MIP)和非印迹聚合物(NIP)在0.2mg/mL的藻蓝蛋白溶液中的吸附容量比较。
具体实施方式
实施例1
a.纳米级二氧化硅的合成:将30mL乙醇和50mL的去离子水加入到250mL的三口烧瓶中,加入10mL的氨水,用恒压滴液漏斗加入25mL的乙醇和四乙氧基硅烷的混合溶液(4:1,v/v),室温搅拌反应6h,之后再加入5mL的3-氨丙基三乙氧基硅烷,搅拌反应12h,用乙醇离心清洗3遍,最后将二氧化硅分散在50mL的乙醇中。即可得到纳米级的二氧化硅粒子溶液。
b.CdTe量子点的合成:称取38.3mg的碲粉和40mg的硼氢化钠加入到2mL的尖底黄盖瓶中,先加入1.5mL的乙醇,再加入0.5mL的去离子水,迅速盖上盖子,使体系密闭,在盖子上插一根针头,在针头上用去离子水进行液封隔氧。40℃恒温反应4h,至黑色的碲粉完全消失,上清液为淡紫色为止。同时把92.4mg的硝酸镉加入到75mL的去离子水中,然后加入63μL的巯基乙酸,再用1mol/L的氢氧化钠溶液将pH调到9.2,用氮气吹20min除氧。将碲粉产物的上清液1mL加入到硝酸镉溶液中,氮气保护下回流2h,即可得到黄绿色的量子点。
c.二氧化硅表面接枝:取5mL上述所得纳米级的二氧化硅溶液,加入45mL的pH为5.2的2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲溶液,超声10min使二氧化硅粒子完全分散开,然后恒压滴加10mL上述所得量子点,6mL的20mg/ml的盐酸1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺,6mL的10mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺溶液溶液,室温避光搅拌反应6h,使得量子点接枝到二氧化硅的表面。将反应产物分别用去离子水、pH=7.5的0.01mol/L磷酸盐缓冲溶液清洗,然后将其分散在50mL的pH=7.5磷酸盐缓冲溶液中;
d.印迹壳层的制备:取上述分散有量子点接枝的二氧化硅溶液10mL,然后加入30mL的pH=7.5磷酸盐缓冲溶液,超声分散10min,然后加入20mg的藻蓝蛋白,160μL的3-氨丙基三乙氧基硅烷,将其充分结合,避光搅拌30min,之后加入200μL的氨水和200μL的四乙氧基硅烷,反应12h,然后用去离子水清洗3遍,即形成印迹壳层。
e.模板分子的洗脱:将上述所得用30mL的1%的曲拉通X-100溶液振荡清洗,将模板分子洗脱,然后用去离子水离心清洗、分离,再放到真空干燥箱40℃干燥8h,即得到藻蓝蛋白核壳印迹微球,为简便起见,记为MIP。制备过程和印迹原理参见图1。
非印迹聚合物制备:按照上述操作规程,除了不加模板分子藻蓝蛋白之外,其他步骤同上,记为NIP。
实施例2
分别取10μL稀释的表面接枝量子点的二氧化硅颗粒和蛋白质核壳印迹微球溶液分散在经过乙醇清洗的铝片上,干燥之后,进行喷金处理,将载有样品的铝片用扫描电镜进行观察(图2A、C);分别取10μL稀释的表面接枝量子点的二氧化硅颗粒和蛋白质核壳印迹微球溶液分散在经过乙醇清洗的铜网上,干燥之后,将载有样品的铜网用透射电镜进行观察(图2B、D)。如图2A、B所示,可以看到二氧化硅颗粒比较均匀,CdTe量子点已经接枝在二氧化硅粒子上,并且每个二氧化硅球上都接枝多个CdTe量子点,而且CdTe量子点在二氧化硅载体上分布比较均匀;二氧化硅粒径为70-90nm,CdTe量子点的粒径远远小于二氧化硅的粒径。如图2C、D所示,通过溶胶凝胶法修饰之后,表面形成了一层明显的印迹层;得到粒径为80-100 nm,形貌规则的微球颗粒。并且,经过修饰之后,该印迹微球仍具有良好的荧光性能,如图2D插图所示。
实施例3
称取100mg的核壳印迹微球分散到2mL的磷酸缓冲溶液中,得到50mg/mL的原始溶液。配制pH值为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5和9.0等一系列缓冲溶液。第一组每个样品取0.2mL的核壳印迹微球的溶液,再分别加入一系列不同pH缓冲溶液0.8mL,混合振荡,然后用荧光仪测定每个样品的荧光强度。第二组每个样品取0.1mL的核壳印迹微球的溶液和0.1mL的1mg/L的藻蓝蛋白溶液,分别加入一系列不同pH缓冲溶液0.8mL,混合振荡一段时间,然后用荧光仪测定每个样品的荧光强度。如图3所示,在pH=7.5之前,随着pH的增大,核壳印迹微球的荧光强度逐渐增大,说明量子点在中性偏碱性的条件下具有较高的荧光产率,但随着pH的进一步加大,荧光产率反而降低,可以看出核壳印迹微球对藻蓝蛋白的吸附能力也随pH变化而变化,从pH=6.0开始吸附能力逐渐增大,直到pH=7.5达到最大值,然后随着pH值继续增大,印迹微球的吸附能力逐渐降低。因此,选用pH=7.5进行相关实验,同时也表明该印迹微球适于进行通常的生理条件下的研究。
实施例4
称取38.3mg的碲粉和40mg的硼氢化钠加入到2mL的尖底黄盖瓶中,先加入1.5mL的乙醇,再加入0.5mL的去离子水,迅速盖上盖子,使体系密闭,在盖子上插一根针头,在针头上用去离子水进行液封隔氧。在40℃恒温反应4h,至黑色的碲粉完全消失,上清液为淡紫色为止。同时把92.4mg的硝酸镉加入到75mL的去离子水中,然后加入63μL的巯基乙酸,再分别加入0、60、120、180、240和300μL的10mg/L的氯化汞溶液。再用1mol/L的氢氧化钠溶液将pH调到9.2,用氮气吹20min除氧。将碲粉产物的上清液1mL加入到硝酸镉溶液中,氮气保护下回流2h。即可得到一系列不同颜色的的量子点,如图4所示,不加氯化汞合成的量子点,其荧光量子产率高,并且半峰宽窄。所以,所以最终选择不加氯化汞合成所需的量子点。
实施例5
称取100mg的核壳印迹微球(MIP)和非印迹微球(NIP)分别分散到2mL的磷酸缓冲溶液中,得到50mg/mL的核壳印迹微球原始溶液。配制0.2mg/mL的藻蓝蛋白溶液,每个样品取MIP原始溶液0.2mL,加入2.0mL的0.2mg/mL的藻蓝蛋白溶液,振荡过夜,然后用高速离心机以7000r/min对其进行离心10min。取上清液用荧光仪测定藻蓝蛋白荧光强度。如图5所示,在相同的浓度时,MIP对藻蓝蛋白的吸附容量大大超过NIP的吸附容量,表明MIP对藻蓝蛋白具有良好的识别选择性和优异的吸附性能。
Claims (8)
1.一种基于量子点的蛋白质核壳印迹微球的制备方法,其特征在于:用改进的法合成表面带有氨基的二氧化硅纳米粒子,同时合成表面带有羧基的CdTe量子点,将量子点接枝到二氧化硅表面,采用溶胶凝胶法与表面印迹技术在二氧化硅的表面形成蛋白质印迹层,洗脱掉模板得到基于量子点的蛋白质核壳印迹微球。
2.按权利要求1所述的基于量子点的蛋白质核壳印迹微球的制备方法,其特征在于:
以溶胶凝胶法在经过量子点改性的二氧化硅表面进行核壳印迹,以藻蓝蛋白为模板分子,将分子印迹作为选择识别单元与量子点作为信号单元相结合,通过表面吸附作用实现量子点的荧光减弱/猝灭,洗脱掉模板分子,即得蛋白质核壳印迹微球。
3.按权利要求1所述的基于量子点的蛋白质核壳印迹微球的制备方法,其特征在于:
所述的蛋白质核壳印迹微球的制备:
a.纳米级二氧化硅的合成:将乙醇和去离子水混合,再加入氨水作为催化剂,而后缓慢滴加乙醇和四乙氧基硅烷溶液的混合溶液,室温搅拌反应,反应后加入3-氨丙基三乙氧基硅烷,即可得到纳米级的二氧化硅粒子;
b.CdTe量子点的合成:将碲粉和硼氢化钠混合,混合后加入乙醇,再加入去离子水,密闭加热恒温反应,待用;同时把硝酸镉溶解在去离子水中,并加入巯基乙酸进行改性,而后用氢氧化钠溶液调节pH 9-10,用氮气除氧;将上述所得碲粉产物的上清液加入到上述改性后硝酸镉溶液中,氮气保护下回流,即得到黄绿色的CdTe量子点;
c.二氧化硅表面接枝:上述合成的二氧化硅溶液,加入到2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲溶液中,超声振荡使二氧化硅粒子完全分散开,然后缓慢依次滴加活化的量子点溶液,室温避光搅拌反应,使得量子点接枝到二氧化硅的表面;活化的量子点溶液为盐酸1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺活化;
d.印迹壳层的制备:将上述接枝量子点的二氧化硅加入到磷酸盐缓冲溶液中,超声分散,加入模板分子藻蓝蛋白和功能单体3-氨丙基三乙氧基硅烷,避光搅拌,使其充分结合,之后加入催化剂氨水和交联剂四乙氧基硅烷,室温反应、洗涤,即形成印迹壳层;
e.模板分子的洗脱:将上述所得印迹壳层用曲拉通X-100溶液振荡洗脱,去除模板分子藻蓝蛋白,用去离子水离心清洗、干燥,即得到藻蓝蛋白核壳印迹微球。
4.按权利要求3所述的基于量子点的蛋白质核壳印迹微球的制备方法,其特征在于:所述步骤a.纳米级二氧化硅的合成:将20-40mL的乙醇和40-60mL的去离子水混合,混合后加入8-12mL的氨水,而后滴加入20-30mL的乙醇和四乙氧基硅烷的混合溶液,室温搅拌反应4-8h,之后再加入3-6mL的3-氨丙基三乙氧基硅烷,搅拌反应10-14h,用乙醇离心清洗3-6遍,最后将二氧化硅分散在40-60ml的乙醇中,即可得到纳米级的二氧化硅粒子溶液;其中乙醇和四乙氧基硅烷按体积比为4:1混合。
5.按权利要求3所述的基于量子点的蛋白质核壳印迹微球的制备方法,其特征在于:所述步骤b.CdTe量子点的合成:称取35-40mg的碲粉和30-45mg的硼氢化钠混合,混合后加入1-2mL的乙醇,再加入0.4-1.0mL的去离子水,密闭条件下在30-50℃恒温反应,反应3-5h,至黑色的碲粉完全消失,上清液为淡紫色为止;同时把90-100mg的硝酸镉加入到70-90mL的去离子水中,然后加入60-70μL的巯基乙酸,再用1mol/L的氢氧化钠溶液将pH调到9-9.2,用氮气吹10-30min除氧,将碲粉产物的上清液1mL加入到硝酸镉溶液中,氮气保护下回流1-3h,即可得到黄绿色的量子点。
6.按权利要求3所述的基于量子点的蛋白质核壳印迹微球的制备方法,其特征在于:所述步骤c.二氧化硅表面接枝:取3-6mL纳米级的二氧化硅溶液,加入40-50mL的pH为5-6的2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲溶液,超声8-12min使二氧化硅粒子完全分散开,然后恒压滴加8-12mL量子点、4-8mL的20mg/mL的盐酸1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、4-8mL的10mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺溶液,室温避光搅拌反应4-8h,使得量子点接枝到二氧化硅的表面,将反应产物分别用去离子水、pH=7.5的0.01mol/L磷酸盐缓冲溶液清洗3-5遍,将其分散在40-60mL的pH=7.5磷酸盐缓冲溶液中。
7.按权利要求3所述的基于量子点的蛋白质核壳印迹微球的制备方法,其特征在于:所述步骤d.印迹壳层的制备:取上述分散有量子点接枝的二氧化硅溶液10mL,然后加入20-40mL的pH=7.5的磷酸盐缓冲溶液,超声分散8-12min,然后加入15-25mg的藻蓝蛋白和140-180μL的3-氨丙基三乙氧基硅烷,避光搅拌25-35min,使其充分结合之后,加入180-220μL的氨水和180-220μL的四乙氧基硅烷,反应10-14h,用去离子水清洗3-5遍,即形成印迹壳层。
8.按权利要求3所述的基于量子点的蛋白质核壳印迹微球的制备方法,其特征在于:所述步骤e.模板分子的洗脱:将上述所得用20-40mL的1%的曲拉通X-100溶液振荡清洗,将模板分子洗脱,然后用去离子水离心清洗、分离,再放到真空干燥箱40-50℃干燥6-10h,即得到藻蓝蛋白核壳印迹微球。
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