CN107929712A - 一种治疗肝癌的联合药物 - Google Patents

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王辉云
李晓星
江超
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Abstract

本发明公开了一种治疗肝癌的联合药物，即索拉菲尼和卡非佐米联合用药在肝癌治疗方面的应用。本发明首次明确了卡非佐米可以显著提高索拉菲尼对肝癌细胞的抑制作用，达到协同增效的作用，显著提高索拉菲尼对肝癌的治疗效果。根据本发明的方案，将卡非佐米与索拉菲尼联用，能显著提高索拉菲尼对肝癌的疗效，为肝癌的临床治疗提供了新的治疗思路和方案策略；且两种药物都是FDA已经批准的药物，无需新药研发所需的研发、试验、注册到上市的整个过程，可以更快的进入临床试验，具有重大的现实意义和开发应用前景。

Description

一种治疗肝癌的联合药物
技术领域
本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及一种治疗肝癌的联合药物。
背景技术
肝癌是严重威胁人类生命和健康的重要疾病，是世界第五大常见肿瘤，第三大肿瘤相关死亡原因。根据美国癌症协会发布的2012年全球癌症统计数据，2012年，全球新发肝癌病例大约为782,500 ，死亡病例大约为745,500，而其中50%的病例来自中国。
虽然肝癌的传统治疗方法较多，如手术、介入、化疗、放疗、肝移植等，但是只有不到30%的病人能够接受手术或者肝移植等治愈性疗法，且术后复发和转移率很高。而剩余的大部分病人则多为晚期患者，失去了手术或者肝移植的机会。对此，系统性化疗药物治疗，可能是唯一有效的治疗方法。
目前，索拉菲尼 (Nexavar®)是被美国FDA批准用于晚期肝癌患者的标准治疗药物。索拉菲尼是一种口服的多靶点激酶抑制剂，其作用靶点包括Raf-1 and B-Raf,vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR), platelet-derived growthfactor receptor beta (PDGFR β), c-KIT 以及 FLT3(5)。两个大规模三期临床试验的结果表明，与安慰剂相比，索拉菲尼能够明显提高肝癌病人的临床获益和生存时间，延缓病人的疾病进展。
但是，研究结果同时显示，索拉菲尼使病人获益十分有限，生存期延长大概只有2～3个月。因此，亟需发现新的肝癌治疗策略，有效提高病人生存期和生活质量。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有肝癌治疗药物和技术的缺陷与不足，提供一种肝癌治疗的联合用药新方案，即将卡非佐米与索拉菲尼联用，能显著提高索拉菲尼对肝癌的疗效，为肝癌的临床治疗提供了新的治疗思路和方案策略，具有很好的应用前景。
本发明的目的是提供索拉菲尼和卡非佐米在制备肝癌治疗药物方面的应用。
本发明另一目的是提供一种治疗肝癌的联合药物。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明通过大量研究发现，卡非佐米与索拉菲尼联用能显著提高索拉菲尼对肝癌的疗效。
因此，索拉菲尼和卡非佐米在制备肝癌治疗药物方面的应用，以及含有索拉菲尼和卡非佐米的肝癌治疗药物，都应在本发明的保护范围之内。
具体优选地，所述肝癌为肝癌细胞系Hep3B或BEL-7402。
优选地，索拉菲尼和卡非佐米的质量比为1～100 : 1～5。
更优选地，索拉菲尼和卡非佐米的质量比为15：1。
优选地，所述药物由索拉菲尼和卡非佐米组成。
本发明具有以下有益效果：
本发明公开了一种肝癌治疗的联合用药新方案，即将卡非佐米与索拉菲尼联用，显示出较好的肝癌抑制效果，具有推向肝癌临床治疗的潜力，索拉菲尼单药治疗疗效有限的患者，可以考虑进行索拉菲尼和卡非佐米联合用药治疗方案，以提高索拉菲尼的疗效，提高患者的生存时间。
两种药物都是FDA已经批准的药物，无需新药研发所需的研发、试验、注册到上市的整个过程；首先，该药物已经进行了严格的药理学研究，药物的活性、配方、剂型和有效剂量等已有明确的结论；其次，该药物进行了严格的药代动力学和药效学研究，药物的安全性和毒性有严格的测评和参考指导；第三，药物的原材料容易获得，制作工艺成熟，并且已经获得药物监督管理机构的上市批准，这些优势可以使其可以更快的进入临床试验，具有重大的现实意义和开发优势。
附图说明
图1中A图为肝癌细胞Hep3B和BEL-7402对索拉菲尼和卡非佐米单药的药物敏感性；B图为肝癌细胞Hep3B和BEL-7402对索拉菲尼和卡非佐米联合用药的药物敏感性；C图为肝癌细胞Hep3B和BEL-7402中药物联合作用CI值。
图2为肝癌细胞Hep3B和BEL-7402中索拉菲尼或卡非佐米单药，以及联合用药的细胞生长增殖分析。
图3为肝癌细胞Hep3B和BEL-7402中索拉菲尼或卡非佐米单药，以及联合用药的细胞凋亡分析。
图4为肝癌细胞Hep3B和BEL-7402中索拉菲尼或卡非佐米单药，以及联合用药的细胞运动能力分析。
图5为索拉菲尼和卡非佐米联合用药方案对肝癌细胞在小鼠体内生长的作用。
图6为联合用药方案协同抗癌作用机制研究结果。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
以下实施例中均设置对照组，单独用药组，以及联合用药组，联合用药组中索拉菲尼和卡非佐米的质量比为1～100 : 1～5（最佳为15：1）。
实施例1肝癌治疗新的联合用药方案的确定
1、药物敏感性
Hep3B、BEL-7402肝癌细胞分别铺96孔板，贴壁过夜之后，配制一系列从高到低浓度的药物，并设置对照组，加入孔中，每个浓度设置3个复孔。在细胞培养箱中孵育48小时之后，加入MTS，2小时之后利用多功能酶标仪检测490nm波长的细胞OD值，计算药物作用于不同细胞的IC50值，如图1所示。
图1中，A图为肝癌细胞Hep3B和BEL-7402对索拉菲尼和卡非佐米单药的药物敏感性；B图为肝癌细胞Hep3B和BEL-7402对索拉菲尼和卡非佐米联合用药的药物敏感性；C图为肝癌细胞Hep3B和BEL-7402中药物联合作用CI值。
结果表明，将卡非佐米与索拉菲尼联合应用于肝癌细胞Hep3B、BEL-7402，通过MTS的方法检测细胞增殖，通过计算联合用药指数CI（药物联合用药方案分为协同作用（CI＜1）、相加作用（CI=1）、拮抗作用（CI＞1）三类）。结果显示，索拉菲尼和卡非佐米联合用药为协同作用（CI＜1）。
2、细胞生长曲线
Hep3B、BEL-7402肝癌细胞铺96孔板，贴壁过夜之后，将细胞分为对照组、索拉菲尼单药组、卡非佐米单药组、及索拉菲尼和卡非佐米药物联合用药组，每组三个复孔，分别加入对应的培养基或者药物溶液，孵育5天，每24小时MTS法检测细胞增殖情况，并根据细胞OD值绘制细胞生长曲线。
结果如图2，结果显示，与对照组以及单药组相比，联合用药对细胞增殖具有明显的协同抑制作用，联合用药组细胞生长速率最慢。
3、细胞克隆形成实验
Hep3B、BEL-7402肝癌细胞铺6孔板，贴壁过夜之后，将细胞分为对照组、索拉菲尼单药组、卡非佐米单药组、及索拉菲尼和卡非佐米药物联合用药组，每组三个复孔，分别加入对应的培养基或者药物溶液，孵育14天，检测细胞平板克隆形成情况。
结果如图2，结果显示，与对照组以及单药组相比，联合用药对细胞克隆形成具有明显的协同抑制作用，联合用药组细胞克隆数量最少，体积最小。
4、细胞凋亡分析
（1）细胞凋亡情况
Hep3B、BEL-7402肝癌细胞铺6孔板，贴壁过夜之后，将细胞分为对照组、索拉菲尼单药组、卡非佐米单药组、及索拉菲尼和卡非佐米药物联合用药组，每组三个复孔，分别加入对应的培养基或者药物溶液，孵育24小时，然后收集各组细胞，流式细胞术检测各组细胞凋亡情况。
结果显示（如图3），与对照组以及单药组相比，联合用药对细胞凋亡具有明显的协同促进作用，联合用药组细胞凋亡比例最多。
（2）细胞凋亡标志性分子剪切情况
Hep3B、BEL-7402肝癌细胞铺6孔板，贴壁过夜之后，将细胞分为对照组、索拉菲尼单药组、卡非佐米单药组、及索拉菲尼和卡非佐米药物联合用药组，每组三个复孔，分别加入对应的培养基或者药物溶液，孵育24小时，然后收集各组细胞，提取细胞蛋白，western方法检测细胞凋亡标志性分子caspase3/7/9和PARP的剪切情况。
结果显示（如图3），与对照组以及单药组相比，联合用药明显促进了细胞凋亡，剪切形式的caspase和PARP明显增多。
5、细胞运动能力分析
（1）细胞运动情况
Hep3B、BEL-7402肝癌细胞铺Transwell小室，分为对照组、索拉菲尼单药组、卡非佐米单药组、及索拉菲尼和卡非佐米药物联合用药组，每组三个复孔，分别加入对应的培养基或者药物溶液，孵育24小时，观察细胞运动情况。
结果显示（如图4），与对照组以及单药组相比，联合用药对细胞运动能力具有明显的协同抑制作用，联合用药组细胞迁移和侵袭的数量最少。
（2）western检测EMT过程的标志性分子表达情况
Hep3B、BEL-7402肝癌细胞铺6孔板，贴壁过夜之后，将细胞分为对照组、索拉菲尼单药组、卡非佐米单药组、及索拉菲尼和卡非佐米药物联合用药组，每组三个复孔，分别加入对应的培养基或者药物溶液，孵育24小时，然后收集各组细胞，提取细胞蛋白，western方法检测EMT过程的标志性分子E-cadherin、N-cadherin、β-catenin的表达情况。
结果显示（如图4），与对照组以及单药组相比，联合用药明显抑制了细胞的EMT过程，E-cadherin表达增多，N-cadherin、β-catenin表达减少。
6、联合用药方案对肝癌细胞在小鼠体内生长的作用
用Hep3B细胞通过皮下接种构建裸鼠肝癌皮下成瘤模型，模型构建成功之后，将小鼠分为四组，对照组、索拉菲尼单药组、卡非佐米单药组、及索拉菲尼和卡非佐米药物联合用药组，并进行给药处理，索拉菲尼口服灌胃给药，一天1次，15mg/kg/day；卡非佐米腹腔注射给药，一周两次，4mg/kg；共给药21天。观察小鼠体内肿瘤的生长情况。
肝癌皮下成瘤结果显示（如图5），与对照组以及单药组相比，联合用药对肿瘤生长具有明显的抑制作用，联合用药组肿瘤生长速度最慢，最终剥取的肿瘤体积最小和重量最轻。Ki-67染色结果显示，联合用药明显抑制了肿瘤增殖，联合用药组Ki-67染色阳性细胞比例最少和强度最低。
实施例2 联合用药方案协同抗癌作用机制研究
为了探讨联合用药具有协同作用的分子机制，将Hep3B、BEL-7402肝癌细胞铺6孔板，贴壁过夜之后，将细胞分为对照组、索拉菲尼单药组、卡非佐米单药组、及索拉菲尼和卡非佐米药物联合用药组，每组三个复孔，分别加入对应的培养基或者药物溶液，孵育24小时，然后收集各组细胞，提取细胞蛋白，检测内质网应激信号通路相关分子的表达情况。
结果如附图6所示。图6中，A图为Hep3B肝癌细胞分别接受对照及不同浓度的索拉菲尼处理之后，western blot实验检测内质网应激信号通路相关分子ATF4/CHOP的表达变化情况；B图为Hep3B、BEL-7402肝癌细胞分别接受对照溶液、索拉菲尼单药溶液、卡非佐米单药溶液、及索拉菲尼和卡非佐米联合用药溶液处理之后，western blot实验检测内质网应激信号通路相关分子PERK/eIF2α/ATF4/CHOP的表达变化情况；C图为用siRNA瞬时敲降Hep3B、BEL-7402肝癌细胞中的CHOP表达，western blot实验检测敲降效率；D图为Hep3B、BEL-7402肝癌细胞先用siRNA敲降CHOP表达，再接受索拉菲尼和卡非佐米联合用药处理之后，caspase3/7的活性变化结果；E图为Hep3B、BEL-7402肝癌细胞接受索拉菲尼和卡非佐米联合用药处理，同时加入内质网应激信号通路的抑制剂Salubrinal之后，caspase3/7的活性变化结果。
结果显示，索拉菲尼和卡非佐米联合用药能够激活内质网应激相关的细胞凋亡信号通路PERK/eIF2α/ATF4/CHOP，从而产生协同抗肿瘤作用。

Claims (7)

1.索拉菲尼和卡非佐米联用在制备肝癌治疗药物方面的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肝癌为肝癌细胞系Hep3B或BEL-7402。
3.一种治疗肝癌的联合药物，其特征在于，含有索拉菲尼和卡非佐米。
4. 根据权利要求3所述的联合药物，其特征在于，索拉菲尼和卡非佐米的质量比为1～100 : 1～5。
5. 根据权利要求4所述的联合药物，其特征在于，索拉菲尼和卡非佐米的质量比为15: 1。
6.根据权利要求3所述的联合药物，其特征在于，由索拉菲尼和卡非佐米组成。
7.根据权利要求3所述的联合药物，其特征在于，所述肝癌为肝癌细胞系Hep3B或BEL-7402。
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