CN107922982B - 用于检测高致病性的病毒性出血性败血症病毒的生物标志物及诊断方法 - Google Patents
用于检测高致病性的病毒性出血性败血症病毒的生物标志物及诊断方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明为涉及用于检测病毒性出血性败血症病毒(VHSV)的生物标志物组合物的技术，所述生物标志物组合物包含具有5‑120个连续氨基酸的多肽作为活性成分，所述多肽含有至少一种氨基酸置换，所述至少一种氨基酸置换选自于由以下所组成的组：在由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的VHSV的氨基酸序列中，第56位的丝氨酸(S)置换为亮氨酸(L)，第8位的丝氨酸(S)置换为天冬酰胺(N)，第81位的苏氨酸(T)置换为丙氨酸(A)，第88位的缬氨酸(V)置换为异亮氨酸(I)，第117位的甘氨酸(G)置换为天冬氨酸(D)，以及第119位的谷氨酸(E)置换为赖氨酸(K)。在本发明中，可将这六个氨基酸突变可用于生物标志物以检测新的VHSV，以及可将其用于能够在鱼类中早期确定VHSV感染的生物标志物，以用于诊断病毒性出血性败血症。
Description
技术领域
本发明涉及用于检测高致病性的病毒性出血性败血症病毒(viral hemorrhagicsepticemia virus，VHSV)的生物标志物组合物以及诊断VHSV感染的方法。
背景技术
病毒性出血性败血症病毒(VHSV)是病毒性病原体，导致许多养殖鱼类(包括比目鱼)的严重损失，并且被认为是病毒性出血性败血症(viral hemorrhagic septicemia，VHS)的病因。
VHS首次是作为虹鳟鱼(rainbow trout)的危重病毒性疾病而被报道。然而，最近有报道称VHS在各种鱼类中发生，不仅包括鲑科鱼类(例如鳟鱼(trout)、虹鳟鱼、银鲑鱼(coho salmon)、溪红点鲑(brook trout)、褐鳟鱼(brown trout)或硬头鳟(steelheadtrout))，还包括天然水系统中的鱼类(例如鳕鱼或鲱鱼)和养殖的海洋鱼类(如比目鱼)；以及，VHS主要在欧洲、北美洲和亚洲发生。
自从2001年首次在比目鱼中被报道以来，在韩国，VHS持续在庆尚北道(Gyeongbuk)地区和济州地区被报道。特别是，VHS不仅引起小型鱼类的死亡，从深秋到春季当水的温度低于14℃时，还引起大型鱼类的死亡。当用肉眼检查感染的比目鱼时，观察到体色变暗、系统性出血、由腹部潴留(abdominal reservoir)引起的腹胀和疝(hernia)、鳃褪色、盲侧上红斑样出血等。
VHSV是负义单链RNA病毒，在1963年由世界动物卫生组织举办的鱼类病理学研讨会(the Symposium on Fish Pathology)上首次被报道。VHSV为子弹形，长度约为180nm，直径约为60nm，大小为11kb。VHSV属于弹状病毒(Rhabdovirus)家族，含有6个基因、核衣壳蛋白(N)、聚合酶相关的磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、表面糖蛋白(G)、独特的非毒粒蛋白(NV)以及病毒聚合酶(L)；以及，在产生VHSV的六种蛋白中，已经报道了NV蛋白与VHSV的致病性有关联。
VHSV以非常高的速率遗传突变，因此新的变体VHS病毒不断增加。
然而，对在韩国获得的低致病性VHSV和高致病性VHSV的总基因序列信息进行分析的结果是，在所报道的与VHSV的致病性有关的NV基因序列方面没有差异。就此来说，研究具有高致病性的新VHSV的早期检测方法对保护国内外的比目鱼和各种鱼类而言是至关重要的。
发明内容
技术问题
本发明提供了用于检测高致病性的病毒性出血性败血症病毒(VHSV)的生物标志物组合物，并因此提供了诊断VHSV感染的方法，所述生物标志物组合物用于具有高致病性的新VHSV的早期检测。
技术方案
本发明提供了用于检测病毒性出血性败血症病毒(VHSV)的生物标志物组合物，所述生物标志物组合物包含具有5-120个连续氨基酸的多肽作为活性成分，其中，所述多肽包含选自于由如下所组成的组中的至少一种氨基酸：在VHSV的NV蛋白的氨基酸序列(由SEQID NO：1表示)中，其中第56位的丝氨酸(S)被置换为亮氨酸(L)的氨基酸，其中第8位的丝氨酸(S)被置换为天冬酰胺(N)的氨基酸，其中第81位的苏氨酸(T)被置换为丙氨酸(A)的氨基酸，其中第88位的缬氨酸(V)被置换为异亮氨酸(I)的氨基酸，其中第117位的甘氨酸(G)被置换为天冬氨酸(D)的氨基酸，以及其中第119位的谷氨酸(E)被置换为赖氨酸(K)的氨基酸。
本发明提供用于检测病毒性出血性败血症病毒(VHSV)的生物标志物组合物，所述生物标志物组合物包含具有5-360个连续核苷酸的一种或至少两种多核苷酸作为活性成分，其中，所述一种或至少两种多核苷酸选自于由以下所组成的组：在由通过SEQ ID NO：2表示的核苷酸序列构成的VHSV的NV基因中，其中第23位的碱基被置换为腺嘌呤(A)的基因，其中第167位的碱基被置换为胸腺嘧啶(T)的基因，其中第241位的碱基被置换为鸟嘌呤(G)的基因，其中第262位的碱基被置换为腺嘌呤(A)的基因，其中第350位的碱基被置换为腺嘌呤(A)的基因，以及其中第355位的碱基被置换为腺嘌呤(A)的基因。
本发明提供了提供用于诊断病毒性出血性败血症病毒(VHSV)的信息的方法，所述方法包括：对来自VHSV感染的受试者的VHSV的NV基因的DNA序列进行测序，以获得DNA序列信息；将由测序获得的DNA序列信息转换成氨基酸信息；以及，对选自于由以下氨基酸所组成的组中的一种或至少两种氨基酸进行检测：其中第56位的丝氨酸(S)被置换为亮氨酸(L)的氨基酸，其中第8位的丝氨酸(S)被置换为天冬酰胺(N)的氨基酸，其中第81位的苏氨酸(T)被置换为丙氨酸(A)的氨基酸，其中第88位的缬氨酸(V)被置换为异亮氨酸(I)的氨基酸，其中第117位的甘氨酸(G)被置换为天冬氨酸(D)的氨基酸，以及其中第119位的谷氨酸(E)被置换为赖氨酸(K)的氨基酸。
本发明提供了用于检测病毒性出血性败血症病毒(VHSV)的试剂盒，所述试剂盒包括检测选自于由以下氨基酸所组成的组中的一种或至少两种氨基酸的药剂：在VHSV的NV蛋白的氨基酸序列(由SEQ ID NO：1表示)中，其中第56位的丝氨酸(S)被置换为亮氨酸(L)的氨基酸，其中第8位的丝氨酸(S)被置换为天冬酰胺(N)的氨基酸，其中第81位的苏氨酸(T)被置换为丙氨酸(A)的氨基酸，其中第88位的缬氨酸(V)被置换为异亮氨酸(I)的氨基酸，其中第117位的甘氨酸(G)被置换为天冬氨酸(D)的氨基酸，以及其中第119位的谷氨酸(E)被置换为赖氨酸(K)的氨基酸。
此外，本发明提供了用于检测病毒性出血性败血症病毒(VHSV)的试剂盒，所述试剂盒包括检测选自于由以下所组成的组中的一种或至少两种多核苷酸的药剂：在由通过SEQ ID NO：2表示的核苷酸序列构成的VHSV基因的NV基因中，其中第23位的碱基被置换为腺嘌呤(A)的基因，其中第167位的碱基被置换为胸腺嘧啶(T)的基因，其中第241位的碱基被置换为鸟嘌呤(G)的基因，其中第262位的碱基被置换为腺嘌呤(A)的基因，其中第350位的碱基被置换为腺嘌呤(A)的基因，以及其中第355位的碱基被置换为腺嘌呤(A)的基因。
有益效果
根据本发明，确认了与病毒性出血性败血症病毒(VHSV)的高致病性有关联的独特的非毒粒(NV)蛋白中的6个氨基酸的突变。特别是，在这6种氨基酸突变体中，当第56位的氨基酸(具体是丝氨酸)被置换为亮氨酸时，诱导了高致病性。因此，该6种氨基酸突变体可作为生物标志物来检测新的VHSV，并且可用作VHS的诊断生物标志物以对鱼类VHSV感染进行早期诊断。
附图说明
图1示出了在实施用于完全解码病毒性出血性败血症病毒(VHSV)的PCR之后，对获得的扩增的DNA片段进行确认的结果。
图2为用于克隆以使VHSV的NV突变基因在细胞中有效地表达成蛋白的pcDNA3载体的示意图。
图3示出了在将VHSV的NV蛋白区域的扩增DNA序列转换成氨基酸序列后，对独特的非毒粒(NV)蛋白的氨基酸序列的突变部分进行确认的结果。
图4示出了根据在比目鱼细胞上用含有克隆的野生型VHSV的NV基因的载体进行转导后的细胞中的野生型VHSV的NV蛋白的表达，对ATP水平进行确认的结果。
图5示出了对在比目鱼细胞上用载体实施转导并诱导比目鱼表达后获得的ATP水平进行确认的结果，从而确定VHSV的6种NV氨基酸突变体的致病性，所述载体被制备为表达6种氨基酸突变体的每一个。
图6示出了对VHSV的NV突变体蛋白的亲水指数(hydropathy index)进行确认的结果；更具体而言，图6A示出了对其中第8位的丝氨酸被置换为天冬酰胺的突变体中的ATP水平变化进行确认的结果；图6B示出了对其中第56位的丝氨酸被置换为亮氨酸的突变体中的ATP水平变化进行确认的结果；图6C示出了对其中第81位的苏氨酸被置换为丙氨酸的突变体中的ATP水平变化进行确认的结果；图6D示出了对其中第88位的缬氨酸(V)被置换为异亮氨酸(I)的突变体中ATP水平变化进行确认的结果。
具体实施方式
本发明提供了用于检测病毒性出血性败血症病毒(VHSV)的生物标志物组合物，所述生物标志物组合物包含具有5-120个连续氨基酸的多肽作为活性成分，其中，所述多肽含有选自于由以下氨基酸所组成的组中的至少一种氨基酸：在SEQ ID NO：1表示的VHSV的NV蛋白的氨基酸序列中，其中第56位的丝氨酸(S)被置换为亮氨酸(L)的氨基酸，其中第8位的丝氨酸(S)被置换为天冬酰胺(N)的氨基酸，其中第81位的苏氨酸(T)被置换为丙氨酸(A)的氨基酸，其中第88位的缬氨酸(V)被置换为异亮氨酸(I)的氨基酸，其中第117位的甘氨酸(G)被置换为天冬氨酸(D)的氨基酸，以及其中第119位的谷氨酸(E)被置换为赖氨酸(K)的氨基酸。
由SEQ ID NO：1表示的VHSV的氨基酸序列可包括VHSV的非结构蛋白(称为独特的非毒粒(NV)蛋白)。
在本发明的实施方式中，如图3所示，在与VHSV的高致病性有关的NV蛋白中确认了6个氨基酸的突变。特别是，还确认了在6种氨基酸突变体中，当第56位的氨基酸(具体是丝氨酸)被置换为亮氨酸时诱导高致病性。因此，所述6种氨基酸突变体可用作生物标志物来检测新的VHSV，并且可进一步用作VHS的诊断生物标志物，用于对鱼类VHSV感染进行早期诊断。
本发明提供了用于检测VHSV的生物标志物组合物，所述生物标志物组合物包含具有5-360个连续核苷酸的一种或至少两种多核苷酸作为活性成分，其中，所述一种或至少两种多核苷酸选自于由以下所组成的组：在由通过SEQ ID NO：2表示的核苷酸序列构成的VHSV基因中，其中第23位的碱基被置换为腺嘌呤(A)的基因，其中第167位的碱基被置换为胸腺嘧啶(T)的基因，其中第241位的碱基被置换为鸟嘌呤(G)的基因，其中第262位的碱基被置换为腺嘌呤(A)的基因，其中第350位的碱基被置换为腺嘌呤(A)的基因，以及其中第355位的碱基被置换为腺嘌呤(A)的基因。
本发明提供了提供用于诊断VHSV的信息的方法，所述方法包括：对来自VHSV感染的受试者的VHSV的NV基因的DNA序列进行测序，以获得DNA序列信息；将由测序获得的DNA序列信息转换成氨基酸信息；以及，对选自于由以下氨基酸所组成的组中的一种或至少两种氨基酸进行检测：其中第56位的丝氨酸(S)被置换为亮氨酸(L)的氨基酸，其中第8位的丝氨酸(S)被置换为天冬酰胺(N)的氨基酸，其中第81位的苏氨酸(T)被置换为丙氨酸(A)的氨基酸，其中第88位的缬氨酸(V)被置换为异亮氨酸(I)的氨基酸，其中第117位的甘氨酸(G)被置换为天冬氨酸(D)的氨基酸，以及其中第119位的谷氨酸(E)被置换为赖氨酸(K)的氨基酸。
受试者可选自于由以下所组成的组：岩鱼、比目鱼、鲷鱼、七带石斑鱼(convictgrouper)、鲻鱼(gray mullet)、海鲈(sea bass)、鰶(gizzard shad)、大菱鲆、河豚、鲭鱼(mackerel)、斑头六线鱼(spotty belly greenling)、金枪鱼、石首鱼(croaker)、黄尾鱼(yellow tail)、竹荚鱼、鲤鱼(carp)、无鳞鲤(leather carp)、日本鳗鲡(Japanese eel)、鲶鱼、鳅(loach)和鲫鱼，并且优选可为比目鱼，但不限于此。
测序步骤中的序列分析可通过使用本领域已知的所有方法来进行。具体而言，尽管不限于此，可使用自动测序仪，或者选自于以下已知方法中的至少一种方法：例如焦磷酸测序、PCR-限制性片段长度多态性(RELP)、PCR-单链构象多态性(SSCP)、PCR-序列特异性寡核苷酸(specific sequence oligonucleotide，SSO)、结合PCR-SSO和斑点杂交的等位基因特异性寡核苷酸(ASO)杂交、TaqMan-PCR、MALDI-TOF/MS、滚环扩增(RCA)、高分辨率熔解(HRM)、引物延伸、Southern印迹杂交和斑点杂交。
从测序步骤获得的DNA序列信息可包括VHSV的非结构蛋白(称为NV蛋白区域)。
本发明提供了用于检测VHSV的试剂盒，所述试剂盒包含检测一种或至少两种氨基酸的药剂，所述一种或至少两种氨基酸选自于由以下所组成的组：在由SEQ ID NO：1表示的VHSV的NV蛋白的氨基酸序列中，其中第56位的丝氨酸(S)被置换为亮氨酸(L)的氨基酸，其中第8位的丝氨酸(S)被置换为天冬酰胺(N)的氨基酸，其中第81位的苏氨酸(T)被置换为丙氨酸(A)的氨基酸，其中第88位的缬氨酸(V)被置换为异亮氨酸(I)的氨基酸、其中第117位的甘氨酸(G)被置换为天冬氨酸(D)的氨基酸，以及其中第119位的谷氨酸(E)被置换为赖氨酸(K)的氨基酸。
此外，本发明提供了用于VHSV的试剂盒，所述试剂盒包含检测一种或至少两种多核苷酸的药剂，所述一种或至少两种多核苷酸选自于由以下所组成的组：在由通过SEQ IDNO：2表示的核苷酸序列构成VHSV的NV基因中，其中第23位的碱基被置换为腺嘌呤(A)的基因，其中第167位的碱基被置换为胸腺嘧啶(T)的基因，其中第241位的碱基被置换为鸟嘌呤(G)的基因，其中第262位的碱基被置换为腺嘌呤(A)的基因，其中第350位的碱基被置换为腺嘌呤(A)的基因，以及其中第355位的碱基被置换为腺嘌呤(A)的基因。
根据本发明的用于检测VHSV的试剂盒不仅可包含能够选择性地识别具有碱基置换的基因或该基因的蛋白的引物或抗体，还可包含本领域中通常用于免疫学分析的工具和试剂。
此类工具或试剂的实例包括合适的运载体、能够产生可检测信号的标记材料、增溶剂、缓冲剂和稳定剂，但不限于此。当标记材料为酶时，该标记材料可包括能够测量酶活性的底物和反应终止剂。尽管不限于此，合适的运载体可为：可溶性运载体，例如本领域已知的生理学上可接受的缓冲剂(包括PBS)；或不溶性运载体，例如聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚酯、聚丙烯腈、含氟树脂(fluoride resin)、交联葡聚糖、多糖、聚合物(如胶乳上涂覆有金属的磁性微粒)、其它纸、玻璃、金属、琼脂糖、以及它们的组合。
根据本发明的用于检测VHSV的试剂盒可优选为RT-PCR试剂盒、DNA试剂盒或蛋白芯片试剂盒。
RT-PCR试剂盒可包含特异性于标志物基因的一对引物，另外还可包含试管或其它合适的容器、反应缓冲溶液(具有各种pH和镁浓度)、脱氧核苷酸(dNTP)、Taq聚合酶、酶(如逆转录酶)、DNAse、RNAse抑制剂DEPC-水、灭菌水等。
DNA芯片试剂盒可包含其上附着cDNA或寡核苷酸(所述cDNA或寡核苷酸对应于基因或其片段)的基底，以及用于产生荧光标记探针的试剂、药剂、酶等，其中，所述基底可包含cDNA或寡核苷酸(所述cDNA或寡核苷酸对应于对照基因或其片段)。
蛋白芯片试剂盒可为包含在其上针对标志物的至少一种抗体被排列在预定位置并以高密度固定的基底的试剂盒。关于蛋白芯片的使用方法，从样品中分离蛋白，将分离的蛋白与蛋白芯片杂交以形成抗原-抗体复合物，然后对蛋白芯片进行解码以确定蛋白的存在或表达水平。
实施例
在下文中，参照实施例对本公开进行详细描述。然而，本文示出和描述的实施例是本发明的说明性实施例，而并不旨在以任何方式限制本发明概念的范围；更确切地说，提供这些实施例以使得本公开全面和完整，并且将使本发明概念充分传达给本领域的技术人员。
<实施例1>病毒性出血性败血症病毒(VHSV)全基因中的突变的确认
为了早期诊断导致各种养殖鱼类(包括比目鱼)的严重死亡的高致病性VHSV，在韩国沿海地区获得了诱导鱼类死亡的13种类型的VHSV的全基因突变序列，然后从2012年-2014年这3年对其进行测序。
1.分离VHSV
为了从表现出VHS症状的比目鱼的肠中获得VHSV，将从13个比目鱼中获得的肠组织粉碎在含有抗生素和胎牛血清的MEM培养基中，然后在4℃下以13,000rpm的速度将粉碎产物离心10分钟，随后用0.45μm膜进行过滤。
以1:100-1:1000的稀释比将过滤后得到的粉碎产物与EPC比目鱼细胞接种，并将细胞在16℃下培养。然后，通过显微检查，确认了细胞的异常。
当细胞的病理现象被明确鉴定时，收集细胞培养物，保存在-80℃的温度下，然后通过标准的空斑分析进行量化(Dulbecco,R.,&Vogt,M.(1953).Some problems of animalvirology as studied by the plaque technique.Cold Spring HarborSymp.Quant.Biol.,18,273-279；Leland D,Ginocchio C.Role of cell culture forvirus detection in the age of technology.Clin Microbiol Rev.2007；20:49-78)。
表1
| 命名 | 地区 | 年 |
| VHSV-KR-JJ-2 | 济州 | 2012 |
| VHSV-KR-JJ-3 | 济州 | 2012 |
| VHSV-KR-JJ-4 | 济州 | 2012 |
| VHSV-KR-JJ-5 | 济州 | 2012 |
| VHSV-KR-JJ-6 | 济州 | 2012 |
| VHSV-KR-JJ-7 | 济州 | 2013 |
| VHSV-KR-JJ-8 | 济州 | 2013 |
| VHSV-KR-JJ-9 | 济州 | 2013 |
| VHSV-KR-JJ-10 | 济州 | 2013 |
| VHSV-KR-JJ-12 | 济州 | 2014 |
| VHSV-KR-JJ-13 | 济州 | 2014 |
| VHSV-KR-JJ-14 | 济州 | 2014 |
| VHSV-KR-PH | 浦项市 | 2013 |
2.VHSV基因组的分离和基因测序
基于VHSV NV蛋白的基因序列(SEQ ID NO：2)，制备了全病毒基因测序所需的DNA聚合酶链式反应(PCR)的引物(如表2所示)。
表2
将1μM各引物、2mM各dNTP、10×Buffer和5U nTaq DNA聚合酶(Enzynomics，韩国)添加至100ng模板pcDNA3-NV DNA中，并向其中加入蒸馏水，以使PCR混合物的终体积为20μL。PCR条件为：95℃的温度下预变性5分钟，95℃的温度下变性30秒、58℃的温度下退火30秒、72℃的温度下延伸30秒，25个循环。
之后，将PCR产物在72℃的温度下再延伸5分钟。使用1×buffer作为电泳所需的缓冲液，对扩增的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，其中，本文使用的琼脂糖凝胶为含有溴化乙锭的1％琼脂糖凝胶。使用UV检测器观察DNA带。
通过使用凝胶纯化试剂盒(QIAGEN，德国)对扩增的PCR产物进行回收，然后以1:1的比例与每个样品进行混合以用作模板。然后，在与上述相同的条件下，通过使用NV ORF引物在其上再次进行PCR。PCR之后，将得到的PCR产物进行电泳，然后使用UV检测器观察DNA条带。通过使用凝胶纯化试剂盒(QIAGEN，德国)对扩增的PCR产物进行回收，并通过使用TOPclonerTM TAcoreKit(Enzynomics，韩国)进行克隆，以实施其序列分析。
通过使用琼脂糖凝胶对由PCR获得的DNA产物进行鉴定，获得了DNA片段(如图1所示)。
对DNA片段进行其序列分析，从而鉴定VHSV NV DNA的突变。
获得DNA序列信息后，对VHSV NV基因的ORF序列进行翻译，并从中获得氨基酸序列。对氨基酸序列进行比对以鉴定由突变修饰的序列。以上所有过程均通过使用Bioedit程序来进行。
结果，从13条比目鱼中分离的13个VHSV序列中，突变通常发生在4个位点(39C/T、253C/T、291G/A和336G/A)，其中，这样的4种DNA突变被证实为没有改变氨基酸的突变。
除了这四个常见的突变位点之外，还鉴定了六个非重叠(non-overlapping)的DNA突变位点(如表3所示)。已经证实了，如表3所示，在DNA突变位点上诱导了NV蛋白的氨基酸的突变(No.8、No.56、No.81、No.88、No.117和No.119)。
表3
<实施例2>VHSV氨基酸突变体的致病性的确认
1.确认在比目鱼细胞中野生型VHSV NV蛋白突变体的影响
首先，在比目鱼细胞中，对ATP(其被认为是细胞能量)的生产程度进行分析以确认VHSV的高致病性。
为了在细胞中有效地表达野生型VHSV NV蛋白，将野生型VHSV NV基因克隆到pcDNA3载体中以制备重组载体。
将制备的重组载体用于转导HINAE细胞(比目鱼的胚胎细胞)(国立水产科学研究所，National Institute of Fisheries Science)，从而表达VHSVNV蛋白。转导24小时后，根据制造商的说明书，通过使用ATP生物发光分析试剂盒(Roch Company，瑞士)测量ATP(其被认为是细胞能量)的生产。结果，确认了在VHSV NV蛋白表达时细胞能量生产的变化。
结果，如图4所示，确认了在比目鱼细胞中VHSV NV蛋白的表达导致ATP细胞能量的生产降低了约20％。
2.确认VHSV NV蛋白的氨基酸突变体的致病性
为了确认VHSV NV蛋白的6个氨基酸突变体的致病性，将表3所示的6个氨基酸突变位点的序列克隆到pcDNA3载体中，以制备重组载体。
以与实施例2-1相同的方式，将制备的载体用于转导比目鱼细胞，然后诱导6种氨基酸突变体(No.8，S→N；No.56，S→L；No.81，T→A；No.88，V→I；No.117，G→D；No.119，E→K)各自的表达，从而对ATP的产量进行分析。
结果，如图5所示，确认了与野生型VHSV NV蛋白相比，ATP的生产减少了多至45％，并且在6种氨基酸突变体中，No.56的氨基酸突变体(丝氨酸→亮氨酸)表现出最多的降低。
此外，由于蛋白的功能与蛋白的结构密切相关，根据关于各突变的氨基酸的置换，对亲水指数进行确认，所述亲水指数是蛋白结构测定中最重要的因素之一，并说明蛋白的亲水性/疏水性(参见Kyte J，Doolittle RF(1983年5月).“A simple method fordisplaying the hydropathic character of a protein”.J.Mol.Biol.157(1):105-32)。
结果，如图6所示，确认了所有突变体的亲水指数的变化。特别是，如图6B所示，No.56的突变体(丝氨酸→亮氨酸)在其亲水指数方面显示出最大的变化，从-0.8(丝氨酸)到+3.8(亮氨酸)。这样的结果与之前的ATP产量分析结果一致。因此，确认了由于No.56氨基酸上的突变，诱导了NV蛋白三维结构的急剧变化。
基于上述结果，确认了如下内容：考虑到蛋白功能与蛋白结构之间的密切关系，No.56氨基酸突变后NV蛋白的结构变化可影响VHSV的高致病性，关于这点，可将No.56氨基酸的突变(丝氨酸→亮氨酸)用作有效的病原性标志物，以在比目鱼中早期诊断VHSV相关的高致病性/死亡的诱导。
上述描述的本发明的实施方式并不旨在限制本发明的精神。本发明的范围应当根据下面的权利要求来解释，并且在权利要求的范围内的精神应当被解释为包括在本发明的范围内。
<110> Republic of Korea(National Fisheries Research and DevelopmentInstitute
<120> 用于检测高致病性的病毒性出血性败血症病毒的生物标志物及诊断方法
<130> ADP-2016-0074
<160> 8
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 122
<212> PRT
<213> VHSV NV
<400> 1
Met Thr Thr Gln Ser Ala His Ser Thr Thr Ser Phe Ser Pro Leu Val
1 5 10 15
Leu Arg Glu Met Ile Glu Tyr Arg Leu Thr Phe Asp Pro Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Ser Asp Leu Asp Arg Ser Glu Ile Ser Ala Thr Asp Phe Phe
35 40 45
Glu Thr Thr Leu Ser Arg Val Ser Glu Asp Leu Arg Thr Cys Thr Arg
50 55 60
Leu Pro Tyr Leu His Val Leu Asp Met Arg Ile Ser Leu Leu Glu Gly
65 70 75 80
Thr His Tyr Ile Leu Arg Asn Val Pro Ser Ser Pro Ala Thr Thr Gly
85 90 95
Arg Pro Ser Asp Pro Gly Leu Phe Ile Ile Ser Leu Glu Gly Met Lys
100 105 110
Thr Leu Thr Asn Gly Ser Glu Ser Pro Pro
115 120
<210> 2
<211> 369
<212> DNA
<213> VHSV NV
<400> 2
atgacgaccc agtcggcaca cagcacaacc agcttctctc cacttgtcct tcgcgagatg 60
atcgagtaca gactaacatt tgacccaagc aactacctca acagtgacct cgatcggtca 120
gaaatctccg ctacagactt cttcgagaca actctttcta gagtctcaga ggatctaagg 180
acctgcacac gacttcccta cctccatgtg cttgacatga ggataagtct cctagaggga 240
actcattaca tactaaggaa tgtcccctcc agtcctgcta caactggtag accatctgat 300
cctggactct tcatcatttc acttgaggga atgaagacct tgacgaatgg ctccgaatct 360
cccccatga 369
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> VHSV NV
<400> 3
cggcacacaa cacaaccagc 20
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> VHSV NV
<400> 4
ctagagtctt agaggatcta aggac 25
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> VHSV NV
<400> 5
gtctcctaga gggagctcat tac 23
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> VHSV NV
<400> 6
ctaaggaata tcccctccag tcc 23
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> VHSV NV
<400> 7
gacgaatgac tccgaatctc cc 22
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> VHSV NV
<400> 8
gacgaatggc tccaaatctc cc 22
Claims (7)
1.用于检测病毒性出血性败血症病毒（VHSV）的生物标志物组合物，所述生物标志物组合物包含至少一种多肽作为活性成分，
其中，所述至少一种多肽选自于由以下所组成的组：1）在由SEQ ID NO：1表示的VHSV的NV蛋白的氨基酸序列中，其中第56位的丝氨酸（S）被置换为亮氨酸（L）的多肽；2）在由SEQID NO：1表示的VHSV的NV蛋白的氨基酸序列中，其中第8位的丝氨酸（S）被置换为天冬酰胺（N）的多肽；3）在由SEQ ID NO：1表示的VHSV的NV蛋白的氨基酸序列中，其中第81位的苏氨酸（T）被置换为丙氨酸（A）的多肽；4）在由SEQ ID NO：1表示的VHSV的NV蛋白的氨基酸序列中，其中第88位的缬氨酸（V）被置换为异亮氨酸（I）的多肽；5）在由SEQ ID NO：1表示的VHSV的NV蛋白的氨基酸序列中，其中第117位的甘氨酸（G）被置换为天冬氨酸（D）的多肽；或6）在由SEQ ID NO：1表示的VHSV的NV蛋白的氨基酸序列中，其中第119位的谷氨酸（E）被置换为赖氨酸（K）的多肽。
2.用于检测病毒性出血性败血症病毒（VHSV）的生物标志物组合物，所述生物标志物组合物包含一种或至少两种多核苷酸作为活性成分，其中，所述一种或至少两种多核苷酸选自于由以下所组成的组：1）在由通过SEQ ID NO：2表示的核苷酸序列组成的VHSV的NV基因中，其中第23位的碱基被置换为腺嘌呤（A）的基因；2）在由通过SEQ ID NO：2表示的核苷酸序列组成的VHSV的NV基因中，其中第167位的碱基被置换为胸腺嘧啶（T）的基因；3）在由通过SEQ ID NO：2表示的核苷酸序列组成的VHSV的NV基因中，其中第241位的碱基被置换为鸟嘌呤（G）的基因；4）在由通过SEQ ID NO：2表示的核苷酸序列组成的VHSV的NV基因中，其中第262位的碱基被置换为腺嘌呤（A）的基因；5）在由通过SEQ ID NO：2表示的核苷酸序列组成的VHSV的NV基因中，其中第350位的碱基被置换为腺嘌呤（A）的基因；或6）在由通过SEQID NO：2表示的核苷酸序列组成的VHSV的NV基因中，其中第355位的碱基被置换为腺嘌呤（A）的基因。
3.检测一种或至少两种氨基酸的试剂在制备用于诊断和/或检测病毒性出血性败血症病毒（VHSV）感染的受试者的VHSV的试剂盒中的用途，其中，
所述一种或至少两种氨基酸选自于由以下所组成的组：1）在由SEQ ID NO：1表示的VHSV的NV蛋白的氨基酸序列中，其中第56位的丝氨酸（S）被置换为亮氨酸（L）的氨基酸；2）在由SEQ ID NO：1表示的VHSV的NV蛋白的氨基酸序列中，其中第8位的丝氨酸（S）被置换为天冬酰胺（N）的氨基酸；3）在由SEQ ID NO：1表示的VHSV的NV蛋白的氨基酸序列中，其中第81位的苏氨酸（T）被置换为丙氨酸（A）的氨基酸；4）在由SEQ ID NO：1表示的VHSV的NV蛋白的氨基酸序列中，其中第88位的缬氨酸（V）被置换为异亮氨酸（I）的氨基酸；5）在由SEQ IDNO：1表示的VHSV的NV蛋白的氨基酸序列中，其中第117位的甘氨酸（G）被置换为天冬氨酸（D）的氨基酸；或6）在由SEQ ID NO：1表示的VHSV的NV蛋白的氨基酸序列中，其中第119位的谷氨酸（E）被置换为赖氨酸（K）的氨基酸。
4.如权利要求3所述的用途，其中，所述受试者选自于由以下所组成的组：岩鱼、比目鱼、鲷鱼、七带石斑鱼、鲻鱼、海鲈、鰶、大菱鲆、河豚、鲭鱼、斑头六线鱼、金枪鱼、石首鱼、黄尾鱼、竹荚鱼、鲤鱼、无鳞鲤、日本鳗鲡、鲶鱼、鳅、和鲫鱼。
5.用于检测病毒性出血性败血症病毒（VHSV）的试剂盒，所述试剂盒包含检测一种或至少两种氨基酸的药剂，所述一种或至少两种氨基酸选自于由以下所组成的组：1）在由SEQID NO：1表示的VHSV的NV蛋白的氨基酸序列中，其中第56位的丝氨酸（S）被置换为亮氨酸（L）的氨基酸；2）在由SEQ ID NO：1表示的VHSV的NV蛋白的氨基酸序列中，其中第8位的丝氨酸（S）被置换为天冬酰胺（N）的氨基酸；3）在由SEQ ID NO：1表示的VHSV的NV蛋白的氨基酸序列中，其中第81位的苏氨酸（T）被置换为丙氨酸（A）的氨基酸；4）在由SEQ ID NO：1表示的VHSV的NV蛋白的氨基酸序列中，其中第88位的缬氨酸（V）被置换为异亮氨酸（I）的氨基酸；5）在由SEQ ID NO：1表示的VHSV的NV蛋白的氨基酸序列中，其中第117位的甘氨酸（G）被置换为天冬氨酸（D）的氨基酸；或6）在由SEQ ID NO：1表示的VHSV的NV蛋白的氨基酸序列中，其中第119位的谷氨酸（E）被置换为赖氨酸（K）的氨基酸。
6.用于检测病毒性出血性败血症病毒（VHSV）的试剂盒，所述试剂盒包含检测一种或至少两种多核苷酸的药剂，所述一种或至少两种多核苷酸选自于由以下所组成的组：1）在由通过SEQ ID NO：2表示的核苷酸序列组成的VHSV的NV基因中，其中第23位的碱基被置换为腺嘌呤（A）的基因；2）在由通过SEQ ID NO：2表示的核苷酸序列组成的VHSV的NV基因中，其中第167位的碱基被置换为胸腺嘧啶（T）的基因；3）在由通过SEQ ID NO：2表示的核苷酸序列组成的VHSV的NV基因中，其中第241位的碱基被置换为鸟嘌呤（G）的基因；4）在由通过SEQID NO：2表示的核苷酸序列组成的VHSV的NV基因中，其中第262位的碱基被置换为腺嘌呤（A）的基因；5）在由通过SEQ ID NO：2表示的核苷酸序列组成的VHSV的NV基因中，其中第350位的碱基被置换为腺嘌呤（A）的基因；或6）在由通过SEQ ID NO：2表示的核苷酸序列组成的VHSV的NV基因中，其中第355位的碱基被置换为腺嘌呤（A）的基因。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其中，所述药剂选自于由特异性结合至基因的引物和探针所组成的组。
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