CN107904169B - 一种适用于多种细胞类型培养的模块化生物反应器 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种适用于多种细胞类型培养的模块化生物反应器，包括培养罐体、搅拌装置、通气装置、排气装置、补料装置、拦截装置、收获装置、控温装置和自动化控制器，所述搅拌装置安装在所述培养罐体底部，通气装置分为表层通气管道和深层通气管道，排气装置包括回流冷凝器、尾气加热器、无菌过滤器芯及不锈钢滤壳，补料装置和收获装置均包括四阀组管道、补料制药用硅胶管和高精度蠕动泵，拦截装置包括管路和筛网，控温装置采用双板换方式进行升温和降温。本发明用于生物制药行业中大规模高密度细胞培养及目标产物表达，根据培养细胞类型的不同，更换生物反应器内相关模块组件，满足不同细胞类型的培养需求。

Description

一种适用于多种细胞类型培养的模块化生物反应器

技术领域

本发明涉及细胞培养领域，具体是一种适用于多种细胞类型培养的模块化生物反应器。

背景技术

近数十年来，由于人类对生长激素、干扰素、单克隆抗体、疫苗及白细胞介素等生物制品的需求猛增，通过大规模体外培养技术进行细胞培养是生产生物制品的有效方法。所谓细胞大规模培养技术是指在人工条件下（设定PH、温度、溶氧等），在生物反应器中高密度大量培养动物细胞用于生产生物制品的技术。目前，可大规模培养的动物细胞有鸡胚、猪肾、猴肾、地鼠肾等多种原代细胞及人二倍体细胞、CHO细胞、BHK-21、Vero细胞等，已成功生产了包括狂犬病疫苗、口蹄疫疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、红细胞生成素、单克隆抗体等产品。

生物反应器指以活细胞或酶为生物催化剂进行细胞增殖或生化反应提供适宜环境的设备，它是大规模动物细胞培养过程中的关键设备。动物细胞培养生物反应器，由于为细胞生长提供了一个适宜、可控的生长环境，并能够扩大生产规模，符合生物制品生产要求，使动物细胞工业化大规模培养成为可能。生物反应器的应用，在生物制品生产上具有较大优越性，能够持续提高生产力，进而降低成本，增强竞争力。生物反应器是动物细胞体外大规模培养时，整个培养过程的关键设备，动物细胞培养技术能否大规模工业化、商业化，关键在于能否设计出合适的动物细胞培养生物反应器。

细胞培养指模拟体内生存环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使其生长繁殖并维持结构和功能的培养技术。根据细胞特性分为三种方式：全悬浮、微载体贴壁、固定床。全悬浮培养，适用于细胞为非贴壁信赖性细胞，无需支撑面，细胞或细胞聚集体悬浮于液体培养基中增殖，全悬浮培养是大规模细胞培养的理想方式；微载体贴壁培养，适用于细胞为贴壁信赖性细胞，需贴附于不发生化学作用的物质（玻璃或塑料等无活性物质）表面上生长、生存和维持，并最终在附着面生长至单层，支撑物表面演常带有适量电荷；固定床培养，动物细胞因无细胞膜，易受剪切力影响，固定床技术可较好保护细胞免受机械力及环境变化的影响，提高细胞耐受力，促使细胞高密度培养，提高目的产物的产率。常用固定方式有吸附、包埋、中空纤维或胶囊化等，具有剪切力低，传递效果好和抗污染能力强、细胞生长密度高、产物易收集和分离纯化的特点；但培养规模会受到限制。

根据细胞培养方式，需提供特定的生物反应器进行细胞培养。当改变培养细胞类型时（即培养的细胞发生变化），可能需要更换全新设计的生物反应器，来适应细胞的培养需求，通用性不足，局限性较大。

发明内容

本发明的目的在于提供一种适用于多种细胞类型培养的模块化生物反应器，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种适用于多种细胞类型培养的模块化生物反应器，包括培养罐体、搅拌装置、通气装置、排气装置、补料装置、拦截装置、收获装置、控温装置和自动化控制器，所述搅拌装置安装在所述培养罐体底部，为底部搅拌方式，搅拌驱动方式为机械搅拌或磁力搅拌，所述通气装置分为表层通气管道和深层通气管道，所述排气装置包括回流冷凝器、尾气加热器、无菌过滤器芯及不锈钢滤壳，所述补料装置和收获装置均包括四阀组管道、补料制药用硅胶管和高精度蠕动泵，所述拦截装置包括管路和筛网，所述控温装置采用双板换方式进行升温和降温。

作为本发明进一步的方案：所述培养罐体为316L不锈钢材质，培养罐体为圆柱状设计，培养罐体底部为碟形浅底设计，培养罐体顶部为平口设计，罐顶盖可拆卸和升降，培养罐体高度与培养罐体直径的比例为1.2～2，培养罐体还设有水套夹层和隔热保温层。

作为本发明进一步的方案：所述搅拌装置的搅拌轴密封部件为双端面机械密封或磁吸式密封件，搅拌轴可伸缩调节，搅拌轴上安装搅拌桨叶，搅拌桨叶为3D打印一次铸造成型，无焊接缝，搅拌桨叶直径最大为所述培养罐体直径的1/2。

作为本发明进一步的方案：所述通气装置的管道中包括流量计和阀门、0.2μm无菌过滤器蕊和不锈钢滤壳，通入气体类型包括空气、氧气、二氧化碳和氮气，气体流量采用质量流量计精准控制，深层通气管道的喷气装置，可分为点状微泡、柱状微泡和环形大泡，喷气装置采用不锈钢丝网和不锈钢烧结陶瓷设计，筛网孔径为10～2000μm。

作为本发明进一步的方案：所述拦截装置采用圆柱状设计，管路采用不锈钢材质，制药用无死角接口，筛网采用不锈钢丝网和不锈钢烧结陶瓷材质，筛网孔径为0.1～200μm。

作为本发明进一步的方案：该模块化生物反应器进行固定床培养时，固定床载体拦截装置为圆柱形设计，为不锈钢材质，拦截装置采用多层设计，拦截装置的顶部和底部焊接在外框架上，分别留有孔径为1～10mm的孔洞。

作为本发明进一步的方案：该模块化生物反应器的自动化控制器包括控制柜、触摸屏、PLC、紧急按钮、电路板及电气元件。

作为本发明进一步的方案：所述培养罐体、通气装置、排气装置、补料装置、拦截装置和收获装置均可独立在位清洗和独立在位灭菌，且带有冷凝管线温度检测。

作为本发明进一步的方案：该模块化生物反应器适用于动物细胞全悬浮培养，微载体贴壁培养和固定床培养。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：该适用于多种细胞类型培养的模块化生物反应器，用于生物制药行业中大规模高密度细胞培养及目标产物表达，根据培养细胞类型的不同，更换生物反应器内相关模块组件，满足不同细胞类型的培养需求。

附图说明

图1为本发明的一种模块化生物反应器用于全悬浮培养时的结构示意图。

图2为本发明的一种模块化生物反应器用于微载体贴壁培养时的结构示意图。

图3为本发明的一种模块化生物反应器用于固定床培养时的结构示意图。

图4为本发明的一种模块化生物反应器的外观整体结构示意图。

图中：1-培养罐体，2-搅拌装置，3-马达，4-通气装置，5-补料装置，6-拦截装置，7-收获装置，8-控温装置。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图1-4，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

请参阅图1～4，本发明实施例中，一种适用于多种细胞类型培养的模块化生物反应器，包括培养罐体1、搅拌装置2、通气装置4、排气装置、补料装置5、拦截装置6、收获装置7、控温装置8、自动化控制器以及相关管道。

所述培养罐体1为316L不锈钢材质，整体设计符合ASME-BPE要求，易清洗无死角设计，所述培养罐体1为圆柱状设计，最大化体积利用率，培养罐体1底部为碟形浅底设计，利于细胞、微载体和培养液的混匀，所述培养罐体1顶部为平口设计，罐顶盖可拆卸和升降，方便更换和维护培养罐体1内模块组件，培养罐体1高度与培养罐体1直径的比例为1.2～2，更适合细胞培养需求，培养罐体1套有水套夹层，进行培养罐体1升温和降温，培养罐体1带有隔热保温层，保护操作人员受到伤害。

进一步的，所述培养罐体1可独立在位清洗（CIP）和独立在位灭菌（SIP），并带有冷凝管线温度检测，确保灭菌过程完全可监测。

所述搅拌装置2安装在所述培养罐体1底部，为底部搅拌方式，搅拌驱动方式为机械搅拌或磁力搅拌，搅拌轴密封部件为双端面机械密封或磁吸式密封件。

进一步的，搅拌轴带有一定的高度，且高度是可调整的，搅拌轴上可以安装搅拌桨叶。搅拌桨叶的数量及高度是可调节。

更进一步的，搅拌桨叶为3D打印一次铸造成型，无焊接缝，桨叶直径最大可达到所述培养罐体1直径的1/2。

所述通气装置4分为表层通气管道和深层通气管道，管道中包括流量计和阀门、0.2μm无菌过滤器蕊和不锈钢滤壳等，通入气体类型包括空气、氧气、二氧化碳和氮气等，气体流量采用质量流量计精准控制，通气装置4可独立在位清洗（CIP）和独立在位灭菌（SIP），带有冷凝管线温度检测。

进一步的，所述深层通气管道的喷气装置，可分为点状微泡、柱状微泡和环形大泡等。喷气装置可采用不锈钢丝网和不锈钢烧结陶瓷设计，筛网孔径为10～2000μm，根据培养细胞类型，选择合适的喷气装置，满足相应气体传递效率。

所述排气装置包括回流冷凝器、尾气加热器、0.2μm无菌过滤器芯及不锈钢滤壳。可根据排气量的需求，增加排气管道数量，排气装置可独立在位清洗（CIP）和独立在位灭菌（SIP），带有冷凝管线温度检测。

所述补料装置5包括四阀组管道、补料制药用硅胶管和高精度蠕动泵等，补料装置5可独立在位清洗（CIP）和独立在位灭菌（SIP），带有冷凝管线温度检测。可根据细胞培养工艺需求，随时无菌操作下，更换补料物质，满足工艺需求。

所述拦截装置6包括管路和筛网，拦截装置6采用圆柱状设计，管路采用不锈钢材质，制药用无死角接口，筛网采用不锈钢丝网和不锈钢烧结陶瓷材质，筛网孔径为0.1～200μm。拦截装置6可独立在位清洗（CIP）和独立在位灭菌（SIP），带有冷凝管线温度检测。

进一步的，该模块化生物反应器进行固定床培养时，固定床载体拦截装置6为圆柱形设计，为不锈钢材质，外框为不锈钢，起支撑作用。拦截装置6的顶部和底部焊接在外框架上，分别留有孔洞，孔径为1～10mm，培养液等液体可自由流过。拦截装置6采用多层设计，可避免载体堆集，并留有孔洞，孔径为1～10mm，培养液等液体可自由流过。

所述收获装置7包括四阀组管道、补料制药用硅胶管和高精度蠕动泵等。补料装置7可独立在位清洗（CIP）和独立在位灭菌（SIP），带有冷凝管线温度检测。在进行灌流培养时，可将培养罐体1内的液体吸出，将细胞代谢的物质排出。

所述控温装置8采用双板换方式来进行升温和降温，所述培养罐体1的水套夹层在运行充满水，并通过内置泵保持水流循环。升温时，加热板换中通入工业蒸汽，热量交换至夹套中水内，通过循环，夹套内的水将热量传递至培养罐体1内的液体，来完成升温；降温时，加热板换中通入冷却水，冷量交换至夹套中水内，通过循环，夹套内的水将冷量传递至培养罐体1内的液体，来完成降温。

该模块化生物反应器的控制器包括控制柜、触摸屏、PLC、紧急按钮、电路板及电气元件，通过自控软件来完成所有操作的自动化。

【实施例1】

结合图1所示，本发明提供了一种适用于多种细胞类型培养的模块化生物反应器，当用于动物细胞全悬浮培养时，培养模式为批次培养，采用逐次补加营养物方式。

所述培养罐体1内可安装适合全悬浮细胞培养的通气装置4和搅拌装置2，另无需安装所述拦截装置6，模块化生物反应器各组件安装完成，生物反应器进行在位灭菌（设备自身可导入纯蒸汽来完成灭菌），包括所述喷气装置、排气装置、补料装置5等组件，也可同时完成在位灭菌，生物反应器培养罐体1可空罐灭菌或者实罐灭菌（即罐体内装有一定体积的水或其它液体），如实罐灭菌，灭菌结束后，应排空罐内液体。

培养过程中所需用的各种营养物质和补料液体，应提前进行无菌处理（高温高压灭菌或无菌过滤处理等），并装入合适的无菌容器中（带有合适的无菌管道及接头）。装有补料液体的容器，与完成灭菌后所述生物反应器，通过四阀组接头连接，并再次通入纯蒸汽，进行无菌处理。灭菌结束后，关闭蒸汽及疏水阀门，打开补料阀门，将补料管道中的硅胶管放入蠕动泵内，固定住即可。

在所述控制柜的触摸屏内，运行自控软件，操作指定蠕动泵运行补料，可手动操作或自动操作，当补充到指定体积液体后，操作停止；需要补充的液体有细胞培养液、碱液等。

将足够数量的所述全悬浮细胞导入到培养罐体1内，在所述自控软件中，设定温度、搅拌转速、PH、DO等参数，并自动控制运行，另PH模块与碱液补料管路关联，DO模块与深层通气管道关联。

所述全悬浮细胞在培养罐体1内，混合均匀，培养参数稳定，细胞总数逐渐扩增，当细胞进入平衡期，细胞密度达到较高水平。此过程，可补加一定量营养物质，满足细胞培养代谢所需，此操作可手动操作或自动运行。其中PH调整可通过PH传感器在线监测，自动控制碱液补料蠕动泵来进行。DO调整可通过DO传感器在线监测，自动控制气体流量计及阀门来补料气体。

所述全悬浮细胞密度达到较高水平，可接种毒种或自行分泌目标产物。可在自控软件中设定补料速度，补加适当营养物质，促使细胞分泌相应的目标产物。可每日从培养罐体1内取样，检测样品中目标产物浓度，记录数据，绘制目标产物浓度曲线。当所述全悬浮细胞数量及活力均降低，且目标产物浓度降低时，结束培养。将培养罐体1内液体采用无菌方式收获，将收获液体进行下游纯化处理，即可获得相应制品。

【实施例2】

结合图2所示，本发明提供了一种适用于多种细胞类型培养的模块化生物反应器，当用于动物细胞微载体贴壁细胞培养时，培养模式为灌流培养，采用连续补加、连续收获的补料策略。

所述培养罐体1内可安装适合微载体贴壁细胞培养的通气装置4和搅拌装置2，需安装所述拦截装置6。所述模块化生物反应器各组件安装完成，生物反应器进行在位灭菌（设备自身可导入纯蒸汽来完成灭菌），包括所述喷气装置、排气装置、补料装置5等组件，也可同时完成在位灭菌，生物反应器罐体应实罐灭菌（即罐体内装有一定体积的缓冲液和处理过的微载体），灭菌结束后，通过拦截装置6，排空罐内缓冲液。

培养过程中所需用的各种营养物质和补料液体，应提前进行无菌处理（高温高压灭菌或无菌过滤处理等），并装入合适的无菌容器中（带有合适的无菌管道及接头）。装有补料液体的容器，与完成灭菌后所述生物反应器，通过四阀组接头连接，并再次通入纯蒸汽，进行无菌处理。灭菌结束后，关闭蒸汽及疏水阀门，打开补料阀门，将补料管道中的硅胶管放入蠕动泵内，固定住即可。

在所述控制柜的触摸屏内，运行自控软件，操作指定蠕动泵运行补料。可手动操作或自动操作，当补充到指定体积液体后，操作停止。需要补充的液体有细胞培养液、碱液等。

将足够数量的所述贴壁细胞导入到培养罐体1内，在所述自控软件中，设定温度、搅拌转速、PH、DO等参数，并自动控制运行。另PH模块与碱液补料管路关联，DO模块与深层通气管道关联。PH调整可通过PH传感器在线监测，自动控制碱液补料蠕动泵来进行。DO调整可通过DO传感器在线监测，自动控制气体流量计及阀门来补料气体。

所述贴壁细胞和微载体在培养罐体1内，混合均匀，培养参数稳定。贴壁细胞会在短时间内，吸附到微载体上并逐渐扩增。当贴壁细胞大部分贴附到微载体上后，应设置补料泵速，连续往罐体内补加营养物质；并通过拦截装置6，设置收获泵速（应与补料泵速保持一致）；保证罐体内不断有新的营养物质进入，不断有代谢产物被排出，且罐体内液体体积保持不变。

当细胞进入平衡期，细胞密度达到较高水平。可接种毒种，感染细胞。补料策略保持不变。可每日从罐体内取样，检测样品中目标产物浓度，记录数据，绘制目标产物浓度曲线。当所述贴壁细胞数量及活力均降低，且目标产物浓度降低时，结束培养。将罐体内液体或细胞，采用无菌方式收获，将收获液体进行下游纯化处理，即可获得相应制品。

【实施例3】

结合图3所示，本发明提供了一种适用于多种细胞类型培养的模块化生物反应器，当用于动物细胞固定床培养时，培养模式为灌流培养，采用连续补加连续收获的补料策略。

所述培养罐体1内安装固定床装置，安装适合贴壁细胞培养的通气装置4和搅拌装置2，另无需安装所述拦截装置6，模块化生物反应器各组件安装完成，生物反应器进行在位灭菌（设备自身可导入纯蒸汽来完成灭菌），包括所述喷气装置、排气装置、补料装置5等组件，也可同时完成在位灭菌。生物反应器罐体采用实罐灭菌（即罐体内装有一定体积的缓冲液和处理过的载体），灭菌结束后，应排空罐内缓冲液。

培养过程中所需用的各种营养物质和补料液体，应提前进行无菌处理（高温高压灭菌或无菌过滤处理等），并装入合适的无菌容器中（带有合适的无菌管道及接头）。装有补料液体的容器，与完成灭菌后所述生物反应器，通过四阀组接头连接，并再次通入纯蒸汽，进行无菌处理。灭菌结束后，关闭蒸汽及疏水阀门，打开补料阀门。将补料管道中的硅胶管放入蠕动泵内，固定住即可。

在所述控制柜的触摸屏内，运行自控软件，操作指定蠕动泵运行补料。可手动操作或自动操作，当补充到指定体积液体后，操作停止。需要补充的液体有细胞培养液、碱液等。

将足够数量的所述贴壁细胞导入到培养罐体1内。在所述自控软件中，设定温度、搅拌转速、PH、DO等参数，并自动控制运行。另PH模块与碱液补料管路关联，DO模块与深层通气管道关联。PH调整可通过PH传感器在线监测，自动控制碱液补料蠕动泵来进行。DO调整可通过DO传感器在线监测，自动控制气体流量计及阀门来补料气体。

所述载体固定在固定床内，贴壁细胞经流体循环，逐渐贴附在固定床内的载体上，培养参数稳定。贴壁细胞会在短时间内，吸附到微载体上并逐渐扩增。当贴壁细胞大部分贴附到微载体上后，应设置补料泵速，连续往罐体内补加营养物质；并通过拦截装置6，设置收获泵速（应与补料泵速保持一致）；保证罐体内不断有新的营养物质进入，不断有代谢产物被排出，且罐体内液体体积保持不变。

当细胞进入平衡期，细胞密度达到较高水平。可接种毒种，感染细胞。补料策略保持不变。可每日从罐体内取样，检测样品中目标产物浓度，记录数据，绘制目标产物浓度曲线。当所述全悬浮细胞数量及活力均降低，且目标产物浓度降低时，结束培养。将罐体内液体，采用无菌方式收获。将收获液体进行下游纯化处理，即可获得相应制品。

以上的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。

Claims (7)

1.一种适用于多种细胞类型培养的模块化生物反应器，包括培养罐体、搅拌装置、通气装置、排气装置、补料装置、拦截装置、收获装置、控温装置和自动化控制器，其特征在于，所述搅拌装置安装在所述培养罐体底部，为底部搅拌方式，搅拌驱动方式为机械搅拌或磁力搅拌，所述通气装置分为表层通气管道和深层通气管道，所述排气装置包括回流冷凝器、尾气加热器、无菌过滤器芯及不锈钢滤壳，所述补料装置和收获装置均包括四阀组管道、补料制药用硅胶管和高精度蠕动泵，所述拦截装置包括管路和筛网，所述控温装置采用双板换方式进行升温和降温；

所述培养罐体为316L不锈钢材质，培养罐体为圆柱状设计，培养罐体底部为碟形浅底设计，培养罐体顶部为平口设计，罐顶盖可拆卸和升降，培养罐体高度与培养罐体直径的比例为1.2～2，培养罐体还设有水套夹层和隔热保温层；

所述搅拌装置的搅拌轴密封部件为双端面机械密封或磁吸式密封件，搅拌轴可伸缩调节，搅拌轴上安装搅拌桨叶，搅拌桨叶为3D打印一次铸造成型，无焊接缝，搅拌桨叶直径最大为所述培养罐体直径的1/2。

2.根据权利要求1所述的适用于多种细胞类型培养的模块化生物反应器，其特征在于，所述通气装置的管道中包括流量计和阀门、0.2μm无菌过滤器蕊和不锈钢滤壳，通入气体类型包括空气、氧气、二氧化碳和氮气，气体流量采用质量流量计精准控制，深层通气管道的喷气装置，可分为点状微泡、柱状微泡和环形大泡，喷气装置采用不锈钢丝网和不锈钢烧结陶瓷设计，筛网孔径为10～2000μm。

3.根据权利要求1所述的适用于多种细胞类型培养的模块化生物反应器，其特征在于，所述拦截装置采用圆柱状设计，管路采用不锈钢材质，制药用无死角接口，筛网采用不锈钢丝网和不锈钢烧结陶瓷材质，筛网孔径为0.1～200μm。

4.根据权利要求1或3所述的适用于多种细胞类型培养的模块化生物反应器，其特征在于，该模块化生物反应器进行固定床培养时，固定床载体拦截装置为圆柱形设计，为不锈钢材质，拦截装置采用多层设计，拦截装置的顶部和底部焊接在外框架上，分别留有孔径为1～10mm的孔洞。

5.根据权利要求1所述的适用于多种细胞类型培养的模块化生物反应器，其特征在于，该模块化生物反应器的自动化控制器包括控制柜、触摸屏、PLC、紧急按钮、电路板及电气元件。

6.根据权利要求1或2或3所述的适用于多种细胞类型培养的模块化生物反应器，其特征在于，所述培养罐体、通气装置、排气装置、补料装置、拦截装置和收获装置均可独立在位清洗和独立在位灭菌，且带有冷凝管线温度检测。

7.根据权利要求6所述的适用于多种细胞类型培养的模块化生物反应器，其特征在于，该模块化生物反应器适用于动物细胞全悬浮培养，微载体贴壁培养和固定床培养。

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