CN107904156A - 一种一体全自动化数字pcr检测系统及实施方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种一体全自动化数字PCR检测系统及实施方法，该系统包括左腔室和右腔室，左腔室和右腔室通过自动隔离门装置隔开；左腔室内设置有液滴生成装置；右腔室内设置有PCR扩增装置、生物芯片阅读装置；还包括负压装置，左腔室和右腔室均与负压装置的入口相通，负压装置使左腔室和右腔室形成负压，并使空气通过负压装置排出。本发明采用负压屏蔽技术，通过负压和高效过滤器结合，有效防止整体实验操作过程中对人员及环境的污染。本发明采用自动隔离门，通过隔离门装置，有效将整体设备功能区分为两个独立操作区，在核酸提取与核酸扩增过程中防止交叉污染。

Description

一种一体全自动化数字PCR检测系统及实施方法

技术领域

本发明属于医疗器械领域，尤其涉及一种一体全自动化数字PCR检测系统及实施方法。

背景技术

聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)是现代生命科学研究中最常规的实验方法之一，其发展经历了3个主要阶段：

第一代PCR就是我们目前最常用的终点PCR技术，通过凝胶电泳获得定性的结果。

第二代实时定量PCR技术，它利用荧光试剂监控扩增，来实现相对定量。在开展基因表达分析时，需要标准曲线或参考基因来协助定量。

第三代数字PCR作为一种全新的核酸检测方法，通过反应体系均分到大量反应单元中独立地进行PCR，并依据泊松分布和阳性比例来计算核酸数量。目前数字PCR主要分为微滴式和芯片式两种，与传统PCR技术相比，微滴式数字PCR(简称ddPCR)具有高灵敏度、高精度、高耐受性和绝对定量的优点。

域值循环数(cycle threshold，Ct)是实时荧光定量PCR的重要概念，是指每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。对实时荧光定量PCR和dPCR的原理进行比较后可以发现，dPCR通过统计学原理直接给出靶序列的起始浓度，其结果不再依赖于Ct值，可以避免实时荧光定量PCR在低拷贝靶分子、细微模板浓度差异中灵敏度和精确度相对较差的缺陷它不再依赖Cq值或内参基因，即可确定低至单拷贝的待检靶分子的绝对数目。微滴技术让数字PCR更低成本，且更实用。

微滴式数字PCR，将含有核酸分子的反应体系处理为纳升级的微滴，使每个微滴含或不含待检靶分子，且每个微滴都作为一个独立的PCR反应器，经PCR扩增后采用微滴阅读仪逐个对微滴进行检测，并以终点信号的有或无作为判断标准(有荧光信号的微滴判读为“1”，无荧光信号的微滴判读为“0”)。最后，根据泊松分布原理及阳性微滴的比例，利用分析软件计算待检靶分子的浓度或拷贝数，从而获得最终结果。

现有市场上的相关产品在操作过程中存在如下的问题：

1、芯片分析过程中，从核酸提取到实验报告的输出，各流程环节涉及几十个操作步骤，十多种仪器设备。自动程度低，工作繁琐，对人员水平要求高。

2、整体试验过程中自适应性不强，人力干扰因素大，重复性较差。

3、试验过程分属使用不同的仪器设备，处于不同工作环境区域，物料转移过程中，对环境、样本、人员的污染风险较大。

4、整体实验过程周期较长，人员的工作效率低，准确度差。

发明内容

为克服现有技术上的不足，本发明提供一种一体全自动化数字PCR检测系统及实施方法，以解决现有技术中灵活性、自适应性不强、人为干扰因素，重复性差的技术问题。

为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案如下：一种一体全自动化数字PCR检测系统，所述系统包括左腔室和右腔室，左腔室和右腔室通过自动隔离门装置隔开；左腔室内设置有液滴生成装置；右腔室内设置有PCR扩增装置、生物芯片阅读装置；所述液滴生成装置用于将预混液进行提取，最后将预混液加到液态生物反应系统中，从而实现将核酸样本加载到生物芯片中；

所述PCR扩增装置用于将生物芯片进行核酸扩增；

所述生物芯片阅读装置用于自动识别扩增后的生物芯片核酸样本所承载的核酸信息；

还包括负压装置，左腔室和右腔室均与负压装置的入口相通，负压装置使左腔室和右腔室形成负压，并使空气通过负压装置排出。

作为优选，所述左腔室内设置有移液装置和抓板移动装置，移液装置和抓板移动装置用于核酸样本的提取，并将提取到的核酸样本通过移液装置与反应体系进行混合，得到预混液。

作为优选，所述移液装置包括X轴移液机构、Y轴移液机构、Z轴移液机构及吸液机构；所述X轴移液机构设置在左腔室上，沿左腔室横向移动，所述Y轴移液机构位于X轴移液机构上，沿左腔室前后移动，所述Z轴移液机构位于Y轴移液机构上，沿左腔室纵向移动；所述吸液机构安装在Z轴移液机构上。

作为优选，所述抓板移动装置包括X轴移动机构、Y轴移动机构、Z轴移动机构以及抓板机构；所述X轴移动机构设置在左腔室上，沿左腔室横向移动，所述Y轴移动机构位于X轴移动机构上，沿左腔室前后移动，所述Z轴移动机构位于Y轴移动机构上，沿左腔室纵向移动；所述抓板机构安装在Z轴移动机构上。

作为优选，所述液滴生成装置包括液滴生成装置支架、加样组件、托盘组件、XZ双轴移动机构、Y轴移动组件、液路驱动装置、储液装置、气泡传感器、第一控制器；所述XZ双轴移动机构安装在液滴生成装置支架上方，加样组件设置在XZ双轴移动机构上；所述Y轴移动组件设置在液滴生成装置支架上，所述托盘组件安装在Y轴移动组件上；所述液路驱动装置的入口通过管道与储液装置相连，气泡传感器安装在液路驱动装置的入口与储液装置相连的管道上，液路驱动装置的出口与加样组件的入口相连，所述XZ双轴移动机构、Y轴移动组件、液路驱动装置以及气泡传感器均与第一控制器相连。

作为优选，所述加样组件包括竖直的座板，所述座板上设有固定座和活动座，所述活动座位于固定座的下方，且之间设有缓冲机构，所述活动座背对固定座一侧设有至少一个用于安装移液管的固定嘴，所述固定嘴与液路驱动装置的出口相连通。

作为优选，所述液路驱动装置包括二位三通电磁阀、注射器和注射器驱动装置；所述二位三通电磁阀的P口通过管道与储液装置相连通，气泡传感器安装在该管道上；二位三通电磁阀的A口与注射器相连通，二位三通电磁阀的B口通过管道与固定嘴相连；注射器驱动装置包括丝杆、螺母和第四电机，所述螺母固定连接在注射器的活塞杆上，所述丝杆穿设在螺母中，与螺母啮合传动，所述步进电机的输出轴与丝杆相连，所述二位三通电磁阀和步进电机均与第一控制器相连。

作为优选，所述PCR扩增装置包括整机支架、热盖、热盖提升机构、罩子、加热模块、第二控制器；所述热盖通过热盖提升机构设置在整机支架上，热盖和整机支架之间构成加热区，加热模块给加热区加热，所述罩子罩在加热区的上方，所述热盖提升机构和加热模块均与第二控制器相连，罩子通过管道与负压装置相连通。

作为优选，所述热盖提升机构包括侧板、前支架、推动架、提升块、第一连杆、第二连杆、第一直线驱动机构；一对侧板对称安装在整机支架上、位于热盖的两侧，热盖的两侧均固定有提升块，所述前支架和推动架均滑动设置在一对侧板之间，第一连杆的一端与提升块铰接，第一连杆的另一端与第二连杆的一端铰接，第二连杆的另一端与推动架铰接，所述热盖上至少具有两根直线导轨，所述前支架上安装有与直线导轨相配合的直线轴承，所述推动架通过第一直线驱动机构驱动。

作为优选，所述加热模块包括加热膜、保温块、TE制冷片、导热块、密封硅胶条；所述加热膜贴合在保温块上，保温块固定连接在热盖内，所述导热块固定在整机支架上、位于保温块的下方，所述TE制冷片贴合在导热块的下表面；TE制冷片和加热膜均与第二控制器相连。

作为优选，所述生物芯片阅读装置包括生物芯片载物台、光路模组、连续变倍镜头、荧光滤光片、CCD相机、第三控制器；所述光路模组包括分光二色镜和激光光源；所述激发光源布置在分光二色镜入射光路上，生物芯片载物台布置在分光二色镜反射光路上，连续变倍镜头、荧光滤光片和CCD相机依次布置在分光二色镜透射光路上，光路模组和CCD相机均与第三控制器相连。

作为优选，至少有3个光路模组，光路模组并排设置在镜片安装盒内，镜片安装盒滑动设置在阅读仪支架上，阅读仪支架上还设置有第二直线驱动机构，第二直线驱动机构驱动镜片安装盒移动，第二直线驱动机构与第三控制器相连。

作为优选，所述负压装置包括第一风机、气流通道、第二风机、第三风机、静压室、高效过滤器；所述PCR扩增模块通过管道与第一风机的进气口相连通，第一风机的出气口通过管道与气流通道相连通，第二风机的进气口与右腔室相连通，第二风机的出气口与气流通道相连通，左腔室上开有出气口，左腔室的出气口与气流通道相连通，气流通道与第三风机的进气口相连通，第三风机的出气口与静压室相连通，静压室的出口处设置有高效过滤器，高效过滤器的出口与外面大气相通。

作为优选，还包括废料区，所述废料区包括废料站和废液槽，所述废液槽活动连接在左腔室上，所述废料站与废液槽相连，废料站设置在左腔室外。

本发明还提供一种一体全自动化数字PCR检测系统的实施方法，该方法包括以下步骤：

S1、启动电源开关，开启负压装置；

S2、在左腔室内对核酸样本进行提取；

S3、将提取到的核酸样本与反应体系进行混合，得到预混液；

S4、将预混液放置在液滴生成装置上；

S5、液滴生成装置对预混液进行提取，最后将预混液加到液态生物反应系统中，从而实现将核酸样本加载到生物芯片；

S6、生物芯片完成芯片加样后，将生物芯片放置到PCR扩增装置中进行核酸扩增；

S7、核酸扩增结束后，将生物芯片放置在生物芯片阅读装置上，按照设定的程序自动识别生物芯片核酸样本所承载的核酸信息；

S8、依次关闭负压装置电源，检测系统电源。

本发明的有益效果如下：

1.本发明采用高精度吸液装置，包括多通道独立装置，吸液机构可在横向移液机构和纵向移液机构的配合下单独运行1个通道或同时运行多个通道，可实现单个操作也可实现同时多个操作，极大地提高了加样精度和加样率。

2.本发明采用负压屏蔽技术，通过负压和高效过滤器结合，有效防止整体实验操作过程中对人员及环境的污染。

3.本发明整机电气控制系统采用国际标准的现场总线式控制模式，采用“多主”工作模式，各模块部件都并在接线系统中，网络上任一节点部件模块，任意时刻都可主动向网络发送信息，不分主从。整体实验流程自动化，实现从“样本进”到“数据出”，无需实验人员值守，而且有效避免人为干扰因素，减少误差，提高了实验的准确性及有效数量。

4.本发明采用自动隔离门，通过隔离门装置，有效将整体设备功能区分为两个独立操作区，在核酸提取与核酸扩增过程中防止交叉污染。

5.本发明采用国际标准的模组实现x,y水平面的精准定位，一次性可并行检测数十个生物样本，使用医用冷光源为整机拍摄提供稳定的激发光，将特定波长激发光投射在芯片上，通过自主开发的数据校正模型计算和校正微孔，最终生成以拷贝数为单位的浓度值。从而实现了高通量、高灵敏检测。

附图说明

图1是本发明的一体全自动化数字PCR检测系统带外罩的结构示意图；

图2‐4是本发明的一体全自动化数字PCR检测系统不带外罩的结构示意图；

图5是本发明的液滴生成装置的结构示意图；

图6是本发明的加样组件的结构示意图；

图7是本发明的液路驱动装置的结构示意图；

图8‐12是本发明的PCR扩增装置的结构示意图；

图13是本发明的PCR扩增装置中侧板的结构示意图；

图14是本发明的生物芯片阅读装置的结构示意图；

图15是本发明的实施例中负压装置的结构示意图；

图16‐19是本发明的负压装置的四种连接结构示意图；

图20是本发明测定的HPV-16病毒携带者的生物芯片特征峰分布情况图；

图中：左腔室1、右腔室2、隔离门3、移液装置4、抓板移动装置5、液滴生成装置6、PCR扩增装置7、生物芯片阅读装置8、负压装置9、工作台10、废液槽11、

X轴移液机构401、Y轴移液机构402、Z轴移液机构403、吸液机构404；

X轴移动机构501、Y轴移动机构502、Z轴移动机构503、抓板机构504；

液滴生成装置支架601、加样组件602、托盘组件603、XZ双轴移动机构604、Y轴移动机构605、液路驱动装置606、储液装置607、气泡传感器608、第一直线轴承609、支撑板610、后板611、第一底板612、座板613、固定座614、活动座615、缓冲机构616、移液管617、固定嘴618、导柱619、缓冲弹簧620、限位槽621、二位三通电磁阀622、注射器623、丝杆624、螺母625、步进电机626、枪头基座627、芯片基座628、预混板基座629；

扩增仪支架701、热盖702、热盖提升机构703、加热模块704、罩子705、散热装置706、加热区707、侧板708、前支架709、推动架710、提升块711、第一连杆712、第二连杆713、第一直线驱动机构714、第一滑轮715、水平滑槽716、垂直滑槽717、直线导轨718、第二直线轴承719、导槽720、第二滑轮721、第三滑轮722、散热片723、散热风扇724、排风风道725、加热膜726、保温块727、TE制冷片728、导热块729、密封硅胶条730、限位锁止部731、

阅读仪支架801、生物芯片载物台802、XY双轴移动机构803、光路模组804、连续变倍镜头805、CCD相机806、左侧支撑板架807、右侧支撑板808、中间支撑板809、立板810、第二底板811、第二直线驱动机构812、镜片安装盒813、分光二色镜814、激光光源815、荧光滤光片816；

第一风机901、第二风机902、第三风机903、高效过滤器904、气流通道905、静压室906。

具体实施方式

这里将详细地对示例性实施例进行说明，其示例表示在附图中。下面的描述及附图时，除非另有表示，不同附图中的相同数字表示相同或相似的要素。以下示例性实施例中所描述的实施方式并不代表与本发明相一致的所有的实施方式。相反，它们仅是与如所附中权利要求书中所详述的，本发明的一些方面相一致的装置的例子。本说明书的各个实施例均采用递进的方式描述。

需要说明，本发明实施例中所有方向性指示(诸如上、下、左、右、前、后……)仅用于解释在某一特定姿态(如附图所示)下各部件之间的相对位置关系、运动情况等，如果该特定姿态发生改变时，则该方向性指示也相应地随之改变。

另外，在本发明中涉及“第一”、“第二”等的描述仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示其相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。另外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。

如图1‐4所示，本发明提供一种一体全自动化数字PCR检测系统，包括左腔室1和右腔室2，左腔室1和右腔室2通过自动隔离门装置3隔开；左腔室1内设置有移液装置4、抓板移动装置5、液滴生成装置6；右腔室2内设置有PCR扩增装置7、生物芯片阅读装置8；左腔室1上端设置有负压装置9，左腔室1和右腔室2均与负压装置9的入口相通，负压装置9使左腔室1和右腔室2形成负压，有效预防对应过程对工作环境的污染及对人员的保护；左腔室1和右腔室2架设在工作台10上。

所述移液装置4和抓板移动装置5用于核酸样本的提取，并将提取到的核酸样本通过移液装置4与反应体系进行混合，得到预混液；

所述液滴生成装置6用于将抓板移动装置5输送来的预混液进行提取，最后将预混液加到液态生物反应系统中，从而实现将核酸样本加载到生物芯片；

所述PCR扩增装置7用于将抓板移动装置5输送来的生物芯片进行核酸扩增；

所述生物芯片阅读装置8用于自动识别抓板移动装置5输送来的扩增后的生物芯片核酸样本所承载的核酸信息；

该系统还包括废料区，所述废料区包括废液槽11和废料站，所述废液槽11活动连接在左腔室1上，所述废料站与废液槽11相连通，废料站设置在左腔室1外，从而保证整体功能区域的相对密闭。还包括灭菌装置，所述灭菌装置位于左腔室1上方，所述灭菌装置可以为紫外灯、臭氧发生器或过氧化氢发生器。

所述自动隔离门装置3、移液装置4、抓板移动装置5、液滴生成装置6、PCR扩增装置7以及生物芯片阅读装置8均与现场总线相连。采用国际标准的现场总线式控制模式，采用“多主”工作模式，所有各模块部件都并在接线系统中，网络上任一节点部件模块，任意时刻都可主动向网络发送信息，不分主从。

在左腔室1内完成生物芯片制作、实现核酸提取及生物芯片加样生成功能，核酸提取功能通过移液装置4和抓板移动装置5实现，按照程序参数的设置，利用移液装置4和抓板移动装置5，完成核酸提取过程中的样本采集、核酸释放、核酸结合、核酸洗涤、核酸洗脱的过程。在右腔室2内完成生物芯片的阅读，两个腔室进行物料传递时，自动隔离门装置3采用电机及丝杆的机械传动结构实现开闭，通过抓板移动装置5实现两个腔室物料的传递；自动隔离门装置3中还可以增加密封设计，在自动门关闭状态能有效对两个腔室的隔离防止污染。

如图4所示，所述移液装置4包括X轴移液机构401、Y轴移液机构402、Z轴移液机构403及吸液机构404；所述X轴移液机构401设置在左腔室1上，沿左腔室1横向移动，所述Y轴移液机构402位于X轴移液机构401上，沿左腔室1前后移动，所述Z轴移液机构403位于Y轴移液机构402上，沿左腔室1纵向移动；

所述X轴移液机构401、Y轴移液机构402和Z轴移液机构403均可以采用丝杆螺母的转动形式或者同步带轮的传动形式，这两种机构传动形式是比较常见的传动形式，都可以将电机的转动转化为直线运动，当然不限于这两种传动形式，这里不再赘述；本实施例中下面描述的移动机构、轴移动平台、直线移动机构、双轴移动机构等的设计也雷同，下面不再详细赘述这些机构的详细设计。

所述吸液机构404安装在Z轴移液机构403上；所述吸液机构404包括多通道独立装置，可以单独运行1个通道或同时运行多个通道，通过X轴移液机构401、Y轴移液机构402和Z轴移液机构403的相互配合，实现吸液机构404运动到左腔室1内的任意位置。

如图4所示，所述抓板移动装置5包括X轴移动机构501、Y轴移动机构502、Z轴移动机构503以及抓板机构504；所述X轴移动机构501设置在左腔室1上，沿左腔室1横向移动，所述Y轴移动机构502位于X轴移动机构501上，沿左腔室1前后移动，所述Z轴移动机构503位于Y轴移动机构502上，沿左腔室1纵向移动；

所述抓板机构504安装在Z轴移动机构503上；抓板机构504在X轴移动机构501、Y轴移动机构502和Z轴移动机构503的相互配合下，实现抓板机构504运动到左腔室1内的任意位置。

如图5所示，所述液滴生成装置6包括液滴生成装置支架601、加样组件602、托盘组件603、XZ双轴移动机构604、Y轴移动机构605、液路驱动装置606、储液装置607、气泡传感器608、第一控制器；托台采用XZ双轴移动机构604，XZ双轴移动机构604安装在液滴生成装置支架601上，所述加样组件602安装在XZ双轴移动机构604上，通过XZ双轴移动机构604实现移液管617的X轴方向和Z轴方向的运动；所述Y轴移动机构605设置在液滴生成装置支架601上，托盘组件609安装在Y轴移动机构605上；所述液路驱动装置606的入口通过管道与储液装置607相连，气泡传感器608安装在液路驱动装置606的入口与储液装置607相连的管道上，液路驱动装置606的出口与加样组件602的入口相连，所述XZ双轴移动机构604、Y轴移动机构605、液路驱动装置606以及气泡传感器608均与第一控制器相连。

所述液滴生成装置支架601包括支撑板610、后板611和第一底板612，所述一对支撑板610平行安装在第一底板612上，一对支撑板610之间通过后板611固定相连；

所述XZ双轴移动机构604实现加样组件602沿X轴和Z轴的移动；通过以上XZ双轴移动机构和Y轴移动平台，实现了自动加样组件相对于托盘组件609的X轴、Y轴、Z轴方向的移动，通过电机控制，实现了三个方向上方向上的精准定位，最终实现和生物反应系统的精确配合，对生物反应系统进行加样。

如图6所示，加样组件602是一种上下运动机构，对液态生物反应系统加样完成后，自动上升离开液态生物反应系统。此机构相对于三坐标来说为Z轴运动，从而实现对反应系统的加样；所述加样组件602包括竖直的座板613，所述座板613上设有固定座614和活动座615，所述活动座615位于固定座614的下方，且之间设有缓冲机构616，所述活动座615背对固定座614一侧设有至少一个用于安装移液管617的固定嘴618，所述固定嘴618连通于液路驱动装置606的出口。

用于制作可固态生物芯片的液滴生成装置6，加样组件602中的移液管617采用长条形开口的加样头，通过液路驱动装置606控制给加样头进样的量，再通过托台实现生物芯片转动，从而将加样头上的预混液刷入到生物芯片上。

缓冲机构616安装在固定座614和活动座615之间，实现有效的缓冲作用，在进行加样时，通过XZ双轴移动机构604使加样组件602沿Z轴移动到达液态生物反应系统表面时，加样组件2继续下行，此时缓冲机构616发挥作用，能够使得加样组件602与液态生物反应系统之间有效贴合。

如图6所示，所述缓冲机构616包括导柱619和穿套在导柱619上的缓冲弹簧620，所述导柱619一端与活动座615固定连接，另一端穿过固定座614与其滑动配合，所述缓冲弹簧620设于固定座614和活动座615之间；所述导柱619与固定座614之间设有第一直线轴承609；所述活动座615朝向固定座614的侧面设有与缓冲弹簧620配合的限位槽621；所述活动座615上设有与所述固定嘴618配合的螺纹孔，所述固定嘴618顶端旋入螺纹孔，固定嘴618连通于液路驱动装置606的出口。

如图7所示，所述液路驱动装置606包括二位三通电磁阀622、注射器623和注射器驱动装置；所述二位三通电磁阀622的P口通过管道与储液装置608相连通，气泡传感器608安装在该管道上，用于实现在提取液体的过程中的气泡的检测，实现对生物反应系统的较高精度的加样；二位三通电磁阀622的A口通过管道与注射器623相连通，二位三通电磁阀622的B口通过管道与固定嘴618相连通；注射器驱动装置包括丝杆624、螺母625和步进电机626，所述螺母625固定连接在注射器623的活塞杆上，所述丝杆624穿设在螺母625中，与螺母625啮合传动，所述步进电机626的输出轴与丝杆624相连，驱动丝杆624传动，从而实现注射器623上的活塞杆的抽排运动；所述储液装置608为一储液的容器，但不限于此。所述二位三通电磁阀622和步进电机626均与PLC9相连。当二位三通电磁阀622中的P口与A口相通、A口与B口不相通时，通过丝杆传动使注射器623上的活塞杆向下移动，从而将储液装置608中的矿物油进行提取，吸入到注射器623内，然后使二位三通电磁阀622换向，此时P口与A口不相通、A口与B口相通，通过丝杆传动使注射器623内的矿物油排到移液管617中，使得移液管617中充满矿物油。在此过程中注射器623的提取精度首先通过液路驱动装置自身的丝杆传动驱动注射器623，然后在提取过程中当气泡传感器608检测到有气泡通过液态管道时上述从储液装置608提取到移液管中充满矿物油整个过程会进行循环，直到气泡传感器608检测不到有气泡从储液装置608中被吸取时，此过程停止。

所述托盘组件603包括枪头基座627、芯片基座628以及预混板基座629，初始时，移液管617放置在枪头基座627上，通过XZ双轴移动机构604使固定嘴618沿Z轴向下移动，直至固定嘴618插入移液管617中，使得移液管617固定在固定嘴618上，完成移液管617的提取，然后用移液管617对预混板基座629里面的液态预混液进行提取，最后将液态预混液加到液态生物反应系统中，即芯片基座628中的芯片上。

本发明加样精度主要通过液路驱动装置606自身的丝杆传动控制精度和气泡传感器608得以实现。首先通过步进电机626控制丝杆进行旋转，然后带动注射器623的活塞对试剂进行提取和排出，其提取精度通过丝杆的传动精度进行控制，最终实现对生物反应系统的加样精度的控制；在从储液装置607进行矿物油提取的过程中有气泡传感器608对液路管道中的气泡进行检测，当管道中有气泡时，重复提取矿物油，直至管道中全部充满液体，在对生物反应系统加样时，液态在受压时的压缩量小于气态，从而更近一步的保证了对生物反应系统的加样。

如图8‐图13所示，PCR扩增装置7包括扩增仪支架701、热盖702、热盖提升机构703、加热模块704、罩子705、散热装置706、第二控制器；所述热盖702通过热盖提升机构703设置在扩增仪支架701上，通过热盖提升机构703实现热盖702的开合；热盖702和扩增仪支架701之间构成加热区707，将需要扩增的生物系统放置与加热区707，加热模块704给加热区707加热，所述罩子705罩在加热区707的上方，用于将扩增过程中和/或是扩增完成后提升热盖702时散发出来的生物系统所产生的微量样本泄露的气体引导向罩子705中，通过负压装置9使罩子705内的空气流向高效过滤器904，在高效过滤器904进行过滤和收集；所述热盖提升机构703和加热模块704均与第二控制器相连。

所述热盖提升机构703包括侧板708、前支架709、推动架710、提升块711、第一连杆712、第二连杆713、第一直线驱动机构714；一对侧板708对称安装在扩增仪支架701上、位于热盖702的两侧，热盖702的两侧均固定有提升块711，所述前支架709和推动架710均呈倒U形，所述前支架709和推动架710均滑动设置在一对侧板708之间，所述前支架709和推动架710的两端均安装有至少两个第一滑轮715，所述侧板708上开有相同的水平滑槽716和垂直滑槽717，如图13所示；所述第一滑轮715均滑动设置在水平滑槽716中，通过第一滑轮715的设计，减少了滑动摩擦；第一连杆712的一端与提升块711铰接，第一连杆712的另一端与第二连杆713的一端铰接，第二连杆713的另一端与推动架710铰接，所述热盖702上至少具有两根直线导轨718，所述前支架709上安装有与直线导轨718相配合的第二直线轴承719，热盖702、直线导轨718和第二直线轴承719构成滑块机构，所述推动架710通过第一直线驱动机构714驱动，第一直线驱动机构714受控于第二控制器。

第一直线驱动机构714输出的动力通过第一连杆712和第二连杆713带动提升块711沿第二直线轴承719上下移动，从而实现热盖702的上下移动；在此过程中，第一连杆712传递给提升块711一个水平的分力和竖直向上的分力，竖直向上的分力是热盖702上的直线导轨718相对于第二直线轴承719滑动的动力，而水平的分力则使直线导轨718相对于第二直线轴承719产生一个弯矩，若不消除弯矩，久而久之必然会磨损过度，部件变形，从而误差增大；为了消除弯矩，本发明在前支架709的两侧均开有导槽720，所述第一连杆712的一端与提升块711铰接的铰接处安装有第二滑轮721，所述第二滑轮721滑动设置在导槽720内，通过第二滑轮721抵住导槽720的避免，从而消去了水平的分力。

通过第一直线驱动机构714的驱动，前支架709和推动架710可以沿侧板708向前移动或向后移动，向后移动时，热盖702被提升，加热区707被打开；向前移动时，热盖702下降，加热区707闭合，进行扩增；本发明将加热区707设置在热盖702下降到最底端的位置；由于滑块机构通过丝杆3073驱动在两个位置热盖702处于最底端，虽然通过第一直线驱动机构714驱动中的丝杆传动能够实现位移量的准确控制，但是为了保险起见，本发明在提升块711上具有限位锁止部731，限位锁止部731的上安装有第三滑轮722，第三滑轮722设置在垂直滑槽717中，当热盖702被提升到顶端时，第三滑轮722处于垂直滑槽717的最上部(即垂直滑槽717和水平滑槽716的交汇处)，当热盖702被下放到最下端时，第三滑轮722处于垂直滑槽717的最下部，通过第三滑轮722设置在垂直滑槽717，限制了前支架709前移动的极限位置。

所述加热区707的下方设置有散热装置706；本实施例中所述散热装置706包括散热片723、散热风扇724、排风风道725，所述散热片723设置在加热区707的表面，所述散热风扇724布置在散热片723旁，所述散热风扇724的排风口处设置排风风道725，所述散热风扇724与第二控制器相连，通过第二控制器控制散热风扇724的风速以及通断。

如图12所示，所述加热模块704包括加热膜726、保温块727、TE制冷片728、导热块729、密封硅胶条730；所述加热膜726贴合在保温块727上，保温块727固定连接在热盖702内，所述导热块729固定在扩增仪支架701上、位于保温块727的下方，所述TE制冷片728贴合在导热块729的下表面；TE制冷片728和加热膜726均与第二控制器相连，控制TE制冷片728和加热膜726进行工作。为了使加热区707密闭性更好，在热盖702的边缘安装密封硅胶条730，使整个加热模块704形成一个密封腔体，从而对生物系统更好的加热。所述的TE制冷片728主要用于生物系统的加热的热源和制冷源，TE制冷片728产生的热量通过导热块729传递，最终用于给生物系统实现加热，加热完成后，TE制冷片728对导热块729进行制冷，从而对生物系统实现制冷；加热膜726的热量主要是为了平衡整个生物系统加热区707内部温度的均匀，当TE制冷片728对生物系统进行加热时，此时整个加热区707的温度下面的温度高于上面的温度，为了避免在生物系统的上表面发生冷凝，从而设计了加热膜726和保温块727。作为实施例，本发明中的第二控制器可以采用DELTA台达牌的DVP14SS211T产品，但不限于此。

PCR扩增装置7工作过程如下：第一直线驱动机构714将推动架710拉到最右端，推动架710带动第二连杆713和第一连杆712，第一连杆712将热盖702沿着第二直线轴承719向上拉，于此同时，前支架709也跟随推动架710向右滑动，加热区707打开，将需要加热的生物系统的放置于加热区707；第一直线驱动机构714反向驱动，前支架709和推动架710向左边移动，移动到最左端时，热盖702被下方，加热区707闭合，开启加热模块704进行扩增，同时负压装置9将扩增过程中生物系统所产生的微量样本泄露的气体抽向高效过滤器904，避免了生物系统形成的样本泄露气体对外界空气造成的污染。散热风扇724对散热片723进行散热，通过排风风道725将在加热过程中形成的热量全部排到整机外面，避免热量对整机的影响。完成扩增后，第一直线驱动机构714工作，将热盖702被提升，加热区707被打开，取出生物系统即可。

如图14所示，所述生物芯片阅读装置8包括阅读仪支架801、生物芯片载物台802、XY双轴移动机构803、光路模组804、连续变倍镜头805、荧光滤光片816、CCD相机806、第三控制器；

所述阅读仪支架801包括左侧支撑板架807、右侧支撑板808、中间支撑板809、立板810、第二底板811；所述第二底板811的左右两侧竖直安装左侧支撑板架807和右侧支撑板808，左侧支撑板架807和右侧支撑板808之间通过立板810固定连接，左侧支撑板架807和右侧支撑板808之间还横架有中间支撑板809；

所述XY双轴移动机构803设置在第二底板811上，位于中间支撑板809的下方，所述生物芯片载物台802设置在XY双轴移动机构803上；

所述中间支撑板809的上表面设置第二直线驱动机构812和镜片安装盒813，第二直线驱动机构812驱动镜片安装盒813直线运动，镜片安装盒813中布置至少3个光路模组804，本实施例中给出5个，所述光路模组804包括分光二色镜814和激光光源815；所述连续变倍镜头805安装在中间支撑板809，CCD相机806安装在连续变倍镜头805的顶端；

激发光源815布置在分光二色镜814入射光路上，生物芯片载物台802布置在分光二色镜814反射光路上，连续变倍镜头805、荧光滤光片816和CCD相机806依次布置在分光二色镜814透射光路上，分光二色镜814入射光水平布置，分光二色镜814透射光竖直布置。

所述XY双轴移动机构803、第二直线驱动机构812、CCD相机806、激发光源815均与第三控制器相连。所述第三控制器可以采用DELTA台达牌的PLC DVP‐14SS2或西门子PLCS7‐200，但不限于此。CCD相机806可以采用Lumenera的型号为LT965RM的产品，但不限于此。

如图15所示，所述负压装置9包括第二腔室排风装置和过滤排风装置；右腔室2的出气口与第二腔室排风装置的进气口相连通，所述左腔室1的出气口和第二腔室排风装置的出气口均与过滤排风装置的进气口相连通，过滤排风装置的出气口与大气相通。具体的连接方式，这里给出以下四种实施方式：

实施例1：

如图15和图16所示，所述第二腔室排风装置包括第一风机901和第二风机902；所述过滤排风装置包括第三风机903和高效过滤器904；所述左腔室1的出气口、第一风机901的出气口以及第二风机902的出气口均通过气流通道905与第三风机903的进气口相连通；所述第一风机901的进风口与PCR扩增模块7相连，所述第二风机902的进气口与右腔室2相连通，第三风机903的出气口与静压室906的进气口相连通，高效过滤器904设置在静压室906的出口处，高效过滤器904的进气口与静压室906相连通，高效过滤器904的出气口与大气相通。

实施例2：

如图17所示，所述第二腔室排风装置包括第一风机901和第二风机902；所述过滤排风装置包括第三风机903和高效过滤器904；所述第一风机901的出气口与第二风机902的进气口相连通，所述右腔室2与第二风机902的进气口相连通，所述第一风机901的进风口与PCR扩增模块7相连；所述左腔室1的出气口和第二风机902的出气口均通过气流通道905与第三风机903的进气口相连通，第三风机903的出气口与静压室906的进气口相连通，高效过滤器904设置在静压室906的出口处，高效过滤器904的进气口与静压室906相连通，高效过滤器904的出气口与大气相通。

实施例3：

如图18所示，所述第二腔室排风装置包括第一风机901和第二风机902；所述过滤排风装置包括第三风机903和高效过滤器904；所述第一风机901的进风口与PCR扩增模块7相连，所述第二风机902的进气口与右腔室2相连通，所述左腔室1的出气口、所述第一风机901的出气口以及第二风机902的出气口均通过气流通道905与静压室906的进气口相连通，高效过滤器904设置在静压室906的出口处，高效过滤器904的进气口与静压室906相连通，高效过滤器904的出气口与第三风机903的进气口相连通，第三风机903的出气口与大气相通。

实施例4：

如图19所示，所述第二腔室排风装置包括第一风机901和第二风机902；所述过滤排风装置包括第三风机903和高效过滤器904；所述第一风机901的进风口与PCR扩增模块7相连，所述第一风机901的出气口与第二风机902的进气口相连通，所述右腔室2与第二风机902的进气口相连通，左腔室1的出气口和第二风机902的出气口均通过气流通道905与静压室906的进气口相连通，高效过滤器904设置在静压室906的出口处，高效过滤器904的进气口与静压室906相连通，高效过滤器904的出气口与第三风机903的进气口相连通，第三风机903的出气口与大气相通。

高效过滤器12可以采用HEPA高效过滤器，其上设有报警器，等到使用性能不能满足要求后提醒用户进行更换。各风机的风量可以是可调节的，也可以是不可调，固定的风量。

负压装置9工作过程如下：

1、当升降隔离门8关闭时，开启控制右腔室2的第二风机902和控制左腔室1的第三风机903，此时移液装置4、抓板移动装置5、液滴生成装置6在工作；移液装置4、抓板移动装置5、液滴生成装置6工作结束，再开启第一风机901；第三风机903抽取气流通道905中的气体并使气体进入静压室906，静压室906中的气体通过高效过滤器904过滤后经排风口排向室外；在此过程中，调节第一风机901、第二风机902和第三风机903的转速，使得左腔室1内的压力大于气流通道905内的压力，右腔室2内的压力大于气流通道905内的压力。

2、当升降隔离门8打开时，将左腔室1的生物样本转移到PCR扩增装置7上，此时，调节第一风机901、第二风机902和第三风机903的转速，使得左腔室1内的压力大于右腔室2内的压力，右腔室2内的压力大于气流通道905内的压力，使得左腔室1和右腔室2结合面的的气体始终从左腔室1到右腔室2方向流动；

3、关闭左腔室1和右腔室2结合处的升降隔离门8，PCR扩增模块7开始工作，控制右腔室2的第二风机902的风量减少，仅满足外界空气流入右腔室2；

4、PCR扩增模块7工作结束时，再延时一段时间，关闭第一风机901；

5、将右腔室2的生物样本转移到生物芯片阅读装置4上，生物芯片阅读装置4开始工作；

6、生物芯片阅读装置4工作结束时，再延时一段时间，关闭第二风机902、关闭第三风机903。

实施例5：

实验原材料为HPV-16病毒携带者的1ML生理盐水(含宫颈拭子刮取的阴道分泌物)，所用DNA提取试剂盒为天根病毒提取试剂盒(货号：DP315)。

S01、启动电源开关，开启负压装置9；

S02、在左腔室1内利用移液装置4和抓板移动装置5，按照设定的程序，完成核酸提取过程中的样本采集、核酸释放、核酸结合、核酸洗涤、核酸洗脱的过程。核酸样本可为血样、体液、组织中的一种。

S03、将提取到的核酸物质通过移液装置4与反应体系进行混合，得到预混液，优选的，数字PCR反应体系是：

数字PCR反应液	7.5μl
		上游引物	1μl(10μM/μl)
下游引物	1μl(10μM/μl)
		探针	0.375μl(10μM/μl)
去离子水	0.625μl
		逆转录酶	0.5μl
模板	4μl
		总体积	15μl

HPV-16E7区上游引物：

5’-CCGGACAGAGCCCATTACAA-3’

HPV-16E7区下游引物：

5’-CGAATGTCTACGTGTGTGCTTTG-3’

HPV-16E7区探针：CGCACAACCGAAGCGTAGAGTCACACT

S04、预混液通过抓板移动装置5的X轴移动机构501、Y轴移动机构502、Z轴移动机构503以及抓板机构504将预混液放置在液滴生成装置6的预混板基座629上；

S05、初始时，移液管617放置在枪头基座627上，通过XZ双轴移动机构604使固定嘴618沿Z轴向下移动，直至固定嘴618插入移液管617中，使得移液管617固定在固定嘴618上，完成移液管617的提取，然后用移液管617对预混板基座629里面的液态预混液进行微量样本的提取，最后将微量样本和油相注入到液态生物反应系统中，从而实现将核酸样本加载到生物芯片上；优选的，油相为500μl导热油；

S06、生物芯片完成芯片加样后，抓板移动装置5通过X轴移动机构501、Y轴移动机构502、Z轴移动机构503以及抓板机构504将生物芯片放置到PCR扩增装置7的加热模块704上，按照设定的程序进行核酸扩增。优选的，扩增条件为：96℃变性10分钟，然后60℃1分钟、96℃变性30秒，共40个循环，之后55℃保温2分钟。

S07、核酸扩增结束后，抓板移动装置5通过X轴移动机构501、Y轴移动机构502、Z轴移动机构503以及抓板机构504将生物芯片放置在生物芯片阅读装置8的生物芯片载物台802上，按照设定的程序自动识别生物芯片核酸样本所承载的核酸信息。

S08、生物芯片阅读装置8识别反应容器核酸信息包含但不限于浓度、准确性、准确度范围、样本编号等，通过显示或数据传送通道报告。

S09、启动杀菌装置，对系统进行全面的消毒处理，防止仪器的污染。

S10、依次关闭防污装置电源，仪器电源。

结果说明：图20为HPV-16病毒携带者的芯片检测结果，图中A为ROX背景信号，图中B为VIC信号的特征峰分布情况，所得VIC拷贝数为491.8。该结果表明样本对应患者感染了HPV-16病毒并产生了基因表达。

Claims (15)

1.一种一体全自动化数字PCR检测系统，其特征在于，所述系统包括左腔室和右腔室等，左腔室和右腔室通过自动隔离门装置隔开；左腔室内设置有液滴生成装置；右腔室内设置有PCR扩增装置、生物芯片阅读装置；所述液滴生成装置用于将预混液进行提取，最后将预混液加到液态生物反应系统中，从而实现将核酸样本加载到生物芯片中；

所述PCR扩增装置用于将生物芯片进行核酸扩增；

所述生物芯片阅读装置用于自动识别扩增后的生物芯片核酸样本所承载的核酸信息；

还包括负压装置，左腔室和右腔室均与负压装置的入口相通，负压装置使左腔室和右腔室形成负压，并使空气通过负压装置排出。

2.根据权利要求1所述的一种一体全自动化数字PCR检测系统，其特征在于，所述左腔室内设置有移液装置和抓板移动装置，移液装置和抓板移动装置用于核酸样本的提取，并将提取到的核酸样本通过移液装置与反应体系进行混合，得到预混液。

3.根据权利要求2所述的一种一体全自动化数字PCR检测系统，其特征在于，所述移液装置包括X轴移液机构、Y轴移液机构、Z轴移液机构及吸液机构；所述X轴移液机构设置在左腔室上，所述Y轴移液机构位于X轴移液机构上，所述Z轴移液机构位于Y轴移液机构上；所述吸液机构安装在Z轴移液机构上。

4.根据权利要求2所述的一种一体全自动化数字PCR检测系统，其特征在于，所述抓板移动装置包括X轴移动机构、Y轴移动机构、Z轴移动机构以及抓板机构；所述X轴移动机构设置在左腔室上，所述Y轴移动机构位于X轴移动机构上，所述Z轴移动机构位于Y轴移动机构上；所述抓板机构安装在Z轴移动机构上。

5.根据权利要求1所述的一种一体全自动化数字PCR检测系统，其特征在于，所述液滴生成装置包括液滴生成装置支架、加样组件、托盘组件、XZ双轴移动机构、Y轴移动组件、液路驱动装置、储液装置、气泡传感器、第一控制器；所述XZ双轴移动机构安装在液滴生成装置支架上方，加样组件设置在XZ双轴移动机构上；所述Y轴移动组件设置在液滴生成装置支架上，所述托盘组件安装在Y轴移动组件上；所述液路驱动装置的入口通过管道与储液装置相连，气泡传感器安装在液路驱动装置的入口与储液装置相连的管道上，液路驱动装置的出口与加样组件的入口相连，所述XZ双轴移动机构、Y轴移动组件、液路驱动装置以及气泡传感器均与第一控制器相连。

6.根据权利要求5所述的一种一体全自动化数字PCR检测系统，其特征在于，所述加样组件包括竖直的座板，所述座板上设有固定座和活动座，所述活动座位于固定座的下方，且之间设有缓冲机构，所述活动座背对固定座一侧设有至少一个用于安装移液管的固定嘴，所述固定嘴与液路驱动装置的出口相连通。

7.根据权利要求5所述的一种一体全自动化数字PCR检测系统，其特征在于，所述液路驱动装置包括二位三通电磁阀、注射器和注射器驱动装置；所述二位三通电磁阀的P口通过管道与储液装置相连通，气泡传感器安装在该管道上；二位三通电磁阀的A口与注射器相连通，二位三通电磁阀的B口通过管道与固定嘴相连；注射器驱动装置包括丝杆、螺母和第四电机，所述螺母固定连接在注射器的活塞杆上，所述丝杆穿设在螺母中，与螺母啮合传动，所述步进电机的输出轴与丝杆相连，所述二位三通电磁阀和步进电机均与第一控制器相连。

8.根据权利要求1所述的一种一体全自动化数字PCR检测系统，其特征在于，所述PCR扩增装置包括整机支架、热盖、热盖提升机构、罩子、加热模块、第二控制器；所述热盖通过热盖提升机构设置在整机支架上，热盖和整机支架之间构成加热区，加热模块给加热区加热，所述罩子罩在加热区的上方，所述热盖提升机构和加热模块均与第二控制器相连，罩子通过管道与负压装置相连通。

9.根据权利要求8所述的一种一体全自动化数字PCR检测系统，其特征在于，所述热盖提升机构包括侧板、前支架、推动架、提升块、第一连杆、第二连杆、第一直线驱动机构；一对侧板对称安装在整机支架上、位于热盖的两侧，热盖的两侧均固定有提升块，所述前支架和推动架均滑动设置在一对侧板之间，第一连杆的一端与提升块铰接，第一连杆的另一端与第二连杆的一端铰接，第二连杆的另一端与推动架铰接，所述热盖上至少具有两根直线导轨，所述前支架上安装有与直线导轨相配合的直线轴承，所述推动架通过第一直线驱动机构驱动。

10.根据权利要求8所述的一种一体全自动化数字PCR检测系统，其特征在于，所述加热模块包括加热膜、保温块、TE制冷片、导热块、密封硅胶条；所述加热膜贴合在保温块上，保温块固定连接在热盖内，所述导热块固定在整机支架上、位于保温块的下方，所述TE制冷片贴合在导热块的下表面；TE制冷片和加热膜均与第二控制器相连。

11.根据权利要求1所述的一种一体全自动化数字PCR检测系统，其特征在于，所述生物芯片阅读装置包括生物芯片载物台、光路模组、连续变倍镜头、荧光滤光片、CCD相机、第三控制器；所述光路模组包括分光二色镜和激光光源；所述激发光源布置在分光二色镜入射光路上，生物芯片载物台布置在分光二色镜反射光路上，连续变倍镜头、荧光滤光片和CCD相机依次布置在分光二色镜透射光路上，光路模组和CCD相机均与第三控制器相连。

12.根据权利要求11所述的一种一体全自动化数字PCR检测系统，其特征在于，至少有3个光路模组，光路模组并排设置在镜片安装盒内，镜片安装盒滑动设置在阅读仪支架上，阅读仪支架上还设置有第二直线驱动机构，第二直线驱动机构驱动镜片安装盒移动，第二直线驱动机构与第三控制器相连。

13.根据权利要求1所述的一种一体全自动化数字PCR检测系统，其特征在于，所述负压装置包括第一风机、气流通道、第二风机、第三风机、静压室、高效过滤器；所述PCR扩增模块通过管道与第一风机的进气口相连通，第一风机的出气口通过管道与气流通道相连通，第二风机的进气口与右腔室相连通，第二风机的出气口与气流通道相连通，左腔室上开有出气口，左腔室的出气口与气流通道相连通，气流通道与第三风机的进气口相连通，第三风机的出气口与静压室相连通，静压室的出口处设置有高效过滤器，高效过滤器的出口与外面大气相通。

14.根据权利要求1所述的一种一体全自动化数字PCR检测系统，其特征在于，还包括废料区，所述废料区包括废料站和废液槽，所述废液槽活动连接在左腔室上，所述废料站与废液槽相连，废料站设置在左腔室外。

15.一种一体全自动化数字PCR检测系统的实施方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

S1、启动电源开关，开启负压装置；

S2、在左腔室内对核酸样本进行提取；

S3、将提取到的核酸样本与反应体系进行混合，得到预混液；

S4、将预混液放置在液滴生成装置上；

S5、液滴生成装置对预混液进行提取，最后将预混液加到液态生物反应系统中，从而实现将核酸样本加载到生物芯片；

S6、生物芯片完成芯片加样后，将生物芯片放置到PCR扩增装置中进行核酸扩增；

S7、核酸扩增结束后，将生物芯片放置在生物芯片阅读装置上，按照设定的程序自动识别生物芯片核酸样本所承载的核酸信息；

S8、依次关闭负压装置电源，检测系统电源。