CN107884528A - 基于发酵液对纯生啤酒货架期内泡持性进行预测的模型建立方法及其预测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于发酵液对纯生啤酒货架期内泡持性进行预测的模型建立方法及其预测方法。通过分析发酵液中蛋白酶A活性与纯生啤酒货架期泡持性之间的关联性，以及分析发酵液中泡沫蛋白含量与纯生啤酒货架期泡持性之间的关联性，然后将测得发酵液样品的泡沫蛋白含量、蛋白酶A活性及纯生啤酒货架期泡持值输入Mintab软件，通过所述Mintab软件拟合出发酵液中的所述泡沫蛋白含量和所述蛋白酶A活性与最后的纯生啤酒泡持性之间的线性方程。通过基于发酵液对纯生啤酒货架期内泡持性这一预测模型，可以提前获知该批次纯生啤酒的货架期泡持值，经过验证可知通过测定泡沫蛋白含量和蛋白酶A活性双因子进行预测，预测的精度更高，结果更准确可靠。

Description

基于发酵液对纯生啤酒货架期内泡持性进行预测的模型建立 方法及其预测方法

技术领域

本发明涉及纯生啤酒泡持性评价体系，具体地涉及一种基于发酵液对纯生啤酒货架期内泡持性进行预测的模型建立方法以及其预测方法。

背景技术

纯生啤酒是指利用低温膜过滤技术，在无菌条件下把发酵液中的酵母菌及其它可能的微生物全部过滤，然后在无菌操作环境中把啤酒灌装到经严格灭菌的啤酒瓶中而生产的不经任何热杀菌的无菌啤酒。因其未受到加热导致的啤酒加速氧化，它保持了新鲜啤酒的营养成分和风味物质，口味更纯正、营养更丰富、更加受到消费者青睐。

由于纯生啤酒的酿造是不经过任何热杀菌，使之残留有微量由酵母产生的、能在一定时间内保持活性的酶，蛋白酶A是其中之一。蛋白酶A能作用于啤酒泡沫蛋白，使其发生分解而破坏泡沫稳定性，因此相对于巴氏杀菌的熟啤酒，生啤酒更难得到较好的泡沫稳定性。而泡沫敏感蛋白是啤酒泡持稳定的主要因素，泡沫蛋白含量增加能显著提高啤酒的泡持性。纯生啤酒的泡沫稳定性问题已经成为制约其质量和消费者认可度的瓶颈问题之一。

近年来，对纯生啤酒泡沫的研究取得了很多进展。但到目前为止，关于纯生啤酒在货架期内泡持性的评估方法的研究却没有得到相应的提高和发展。目前国际上除了对蛋白酶A的研究比较多之外，缺乏公认客观有效的纯生啤酒泡持性评价和预测方法。这使得研究人员在纯生啤酒货架期内泡持性的相关研究中只能把啤酒放置到相应的货架期从而得到实际的泡持性。纯生啤酒生产企业也只能被动接受货架期内纯生啤酒泡持性的结果，而不能有效的积极应对和预防不良结果的发生。

中国发明专利申请CN105092800A公开了一种啤酒产品保质期内泡持衰减预评估方法。该方法包括以下步骤：1)选取同类别同批次产品分别存储于不同温度下，设定取样周期，每个周期对样品进行泡持性检测跟踪，选取泡持衰减最快的温度作为强化温度；2)对同类别同批次产品在销售区域自然气温条件下存放时的泡持衰减跟踪；3)对比自然气温存放及强化温度存放产品的泡持跟踪数据，以自然气温存放的所有周期中泡持数据的最小值作为目标值，当强化温度存放的所有周期中连续出现2～3个周期的泡持数据低于上述目标值时，选取该2～3个周期中的后一周期作为产品的强化标准时间；4)建立产品保质期内泡持衰减预评估标准。虽然CN105092800A公开对了啤酒产品保质期内泡持衰减预评估方法，但是并非从对于泡持性起主要作用的蛋白酶A和和泡沫蛋白出发。

影响纯生啤酒货架期内泡持性的因素主要有蛋白酶A和泡沫蛋白。泡沫蛋白是泡持性的物质基础，蛋白酶A则是破坏因素，如果使用其中的一种指标去评价纯生啤酒的泡持性并作出相对准确的评价，无疑比较困难。以往不少针对纯生啤酒泡持性评价的研究是一种因素出发来评价纯生啤酒泡持性，具有很强的局限性。导致纯生啤酒生产企业在纯生啤酒货架期泡持性预测和控制方面无能为力，因此急需研发出一种从蛋白酶A和泡沫蛋白这两种因素出发来预测纯生啤酒货架期内泡持性的模型建立方法。

发明内容

针对现有技术的以上缺陷，本发明提供一种基于发酵液对纯生啤酒货架期内泡持性进行预测的方法，该模型建立方法通过多批次的样品验证，该模型能较好预测不同批次纯生啤酒货架期的泡持性，帮助企业建立内控标，为提高纯生啤酒的货架期泡持性提供了辅助参考。

本发明的技术目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明所述基于发酵液对纯生啤酒货架期内泡持性进行预测的模型建立方法，通过测定发酵液样品中蛋白酶A活性和泡沫蛋白含量来预测纯生啤酒货架期内的泡持性，包括以下步骤：

1)、分析发酵液中蛋白酶A活性与纯生啤酒货架期泡持性之间的关联性：取多批次的发酵液样品，分别测定其蛋白酶A的活性，然后跟踪检测所述批次发酵液生产的纯生啤酒在货架期内的泡持性，并进行相关性分析；

2)、分析发酵液中泡沫蛋白含量与纯生啤酒货架期泡持性之间的关联性：取多批次的发酵液样品，分别测定其泡沫蛋白的含量，然后跟踪检测所述批次发酵液生产的纯生啤酒在货架期内的泡持性，并进行相关性分析；

3)、将测得发酵液样品的泡沫蛋白含量、蛋白酶A活性及纯生啤酒货架期泡持值输入Mintab软件，通过所述Mintab软件拟合出发酵液中的所述蛋白酶A活性、所述泡沫蛋白含量与最终生产的纯生啤酒泡持性之间的线性方程：

A＝35+0.523×b-1.94×c(p<0.05)，其中：

A:成品纯生啤酒货架期4～6个月泡持值(s)；

b:最终发酵液中泡沫蛋白含量(mg/L)；

c：最终发酵液中蛋白酶A活性(10^-5U/mL)。

本发明优选地，所述步骤1)和步骤2)的发酵液样品批次分别不少于10个。

本发明具体地，所述发酵液中蛋白酶A活性的测定步骤为：

S1：蛋白酶A活性标准曲线的建立：分别取不同活性梯度的蛋白酶A标准品、缓冲液、双蒸水、荧光底物混合均匀后，然后在避光、密封、水浴条件下避光反应，水浴中灭活，冷却后进行离心，用荧光分光光度计测定荧光强度，建立蛋白酶A的标准曲线；

S2：蛋白酶A活性测试样品的前处理：将缓冲液、双蒸水、经离心除气的发酵液上清液样品、荧光底物置于反应容器中混匀，然后在避光、密封、水浴条件下中反应，水浴中灭活，得蛋白酶A活性测试样品；

S3：计算待测样品蛋白酶A的活性：调节荧光分光光度计激发波长λex为328nm，发射波长λem为393nm，将所述蛋白酶A活性测试样品冷却后离心，测定其荧光强度值，将所得的荧光强度值代入到建立好的标准曲线中，得到待测样品蛋白酶A的活性。

本发明优选地，所述步骤S1中对发酵液进行离心除气的转速为4500～5000r/min,离心时间为5～6min。

本发明优选地，所述步骤S1灭活完成后还需进行离心，离心的转速为9,000～10,000r/min，离心的时间为3～5min。灭活后还需进行离心是为了除高温使啤酒出现的蛋白质沉淀，否则也会给检测结果带来严重误差。

本发明具体地,所述发酵液中泡沫蛋白含量的测定步骤：

S1.牛血清白蛋白标准曲线的绘制：取不同浓度梯度的牛血清蛋白与考马斯亮蓝G-250染液在室温下反应，测其吸光值，然后绘制出标准曲线；

S2.计算所得泡沫蛋白的含量：取发酵液样品与考马斯亮蓝溶液在室温下反应，测定吸光值，然后根据标准曲线得到所述泡沫蛋白的含量。

本发明更进一步地，所述发酵液样品是未过滤的发酵液样品。

本发明更进一步地，所述纯生啤酒的货架期为1～6个月。

本发明的另一技术目的是提供一种基于发酵液对纯生啤酒货架期泡持性进行预测的方法，所述方法包括以下步骤：

1)、取多批次的发酵液样品分别测定其蛋白酶A的活性，然后跟踪检测所述批次发酵液生产的纯生啤酒在货架期内的泡持性；

2)、取多批次的发酵液样品分别测定其泡沫蛋白的含量，然后跟踪检测所述批次发酵液生产的纯生啤酒在货架期内的泡持性；

3)、将测得发酵液样品的泡沫蛋白含量、蛋白酶A活性及纯生啤酒货架期泡持值输入Mintab软件，通过所述Mintab软件拟合出发酵液中的所述蛋白酶A活性、所述泡沫蛋白含量与最后的纯生啤酒泡持性之间的线性方程：

A＝35+0.523×b-1.94×c(p<0.05)

A:成品纯生啤酒货架期4～6个月泡持值(s)；

b:最终发酵液中泡沫蛋白含量(mg/L)；

c：最终发酵液中蛋白酶A活性(mg/L)。

本发明进一步地，所述步骤1)和步骤2)的发酵液样品批次分别不少于10个。

本发明的有益效果：

与现有的泡持性预测技术相比较，本发明具有以下显著优点：

1、通过不同发酵批次的样品进行验证，发现本发明所述的预测模型的重现性良好，实际泡持值与模型预测的泡持值偏差率较小(都在5％以内)，说明该模型可以准确的预测纯生啤酒在货架期内的泡持性。从而该模型具有较好的预测准度，可适用于大工业生产。

2、通过建立的预测模型，可提前获知该批次纯生啤酒的货架期泡持值。并且是通过泡沫蛋白和蛋白酶A双因子进行预测，预测的精度更高，结果更准确可靠。

附图说明

图1是本发明所述的蛋白酶A的标准曲线。

图2是本发明所述的发酵液中蛋白酶A与成品纯生啤酒泡持性的相互关系。

图3是本发明所述的牛血清蛋白的标准曲线。

图4是本发明所述的发酵液中泡沫蛋白含量与成品纯生啤酒泡持性的相互关系。

图5是本发明所述的预测模型的预测结果。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加明确，下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。

本发明的原理：影响纯生啤酒泡持性的最主要的因素就是泡沫蛋白的含量和蛋白酶A的活性，因此，通过测出这两个因素与货架期泡持性之间的关系，通过建立拟合模型，通过提前测定发酵液中的泡沫蛋白的含量和蛋白酶A活性就可以准确预测纯生啤酒货架期的泡持性。

一、发酵液样品中蛋白酶A活性的测定及其与与纯生啤酒货架期泡持性的关系分析1、蛋白酶A活性标准曲线的建立

分别取活性为0、2、4、6、8、10×10^-5U/ml单位的蛋白酶A标准品(用高压蒸汽灭活的啤酒配制)40μL，加入到500μL MCI缓冲液(pH5.5磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲体系)，440μL双蒸水，20μL浓度为0.2mmol荧光底物混合均匀后，将离心管避光盖紧转入30℃水浴中避光反应30min。反应结束后将离心管转入80℃水浴中灭活5min。灭活后的样品迅速冷却至0℃随后进行离心处理。用荧光分光光度计测定荧光强度，建立蛋白酶A的标准曲线。所述蛋白酶A的标准曲线如图1所示。

2、待测发酵液样品的前处理

在离心管中加入500μL MCI缓冲液(pH5.5磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲体系)，440μL双蒸水，40μL经过离心除气(5000r/min,5min)的发酵液上清液样品，20μL浓度为0.2mmol荧光底物(1.1mg荧光底物溶于3850μL DMSO中，于-20℃避光保存)混合均匀后，将离心管避光盖紧转入30℃水浴中避光反应30min。反应结束后将离心管转入80℃水浴中灭活5min。灭活后的样品迅速冷却至0℃随后进行离心处理。

3、待测发酵液样品的蛋白酶A活性的测定

调节荧光分光光度计激发波长λex＝328nm，发射波长λem＝393nm，然后吸取750μL待测样品测定其荧光强度，(空白试样需先进行80℃10min灭活)。另外，在80℃灭活样品后还需要对样品进行离心，以去除高温使啤酒出现的蛋白质沉淀，否则也会给检测结果带来严重误差。

4、跟踪检测用所述发酵液生产的纯生啤酒在货架期内的泡持值，然后得到发酵液的蛋白酶A活性水平与纯生啤酒货架期泡持性之间的关联性，结果如图2所示，可知，蛋白酶A破坏纯生啤酒货架期内泡持值的因素。

二、发酵液中泡沫蛋白的含量测定及与纯生啤酒货架期泡持性的线性关系分析

1、牛血清蛋白标准曲线的绘制

分别取200mg/L牛血清蛋白1、2、3、4、5、6mL于试管中加蒸馏水补足10mL混匀，用移液管分别取上述1mL牛血清蛋白与5mL考马斯亮蓝G-250染液在恒定室温下反应10min，测其在595nm波长下的吸光值，做三个平行，以牛血清白蛋白含量为横坐标，以吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，如图3所示。

2、测定发酵液待测样品的泡沫蛋白的含量

称取100mg考马斯亮蓝G-250溶于50mL 95％乙醇中，然后加入85％(w/v)磷酸100mL定容至1000mL，过滤至棕色试剂瓶中备用。取发酵液待测样品用蒸馏水稀释4倍后取1mL与5mL上述配制好的考马斯亮蓝溶液在恒定室温下反应10min，测定吸光值，重复三次。通过测定发酵液待测样品的吸光值，然后根据标准曲线计算所得泡沫蛋白的含量。

3、发酵液待测样品中泡沫蛋白含量和纯生啤酒货架期泡持性的关系

检测了35个发酵液待测样品中泡沫蛋白含量和纯生啤酒货架期泡持性的关系，结果如图4所示。从图4可知发酵液待测样品中泡沫蛋白含量与纯生啤酒货架期内泡持值的变化趋势一致，可以认为泡沫蛋白含量是纯生啤酒货架期内泡持性的物质基础。

三、建立纯生啤酒货架期泡沫稳定性

用最终(过滤前)发酵液的泡沫蛋白和蛋白酶A(见表1)建立方程来预测成品纯生啤酒4个月后的泡持值。将事先测得发酵液样品的泡沫蛋白含量、蛋白酶A活性值及纯生啤酒货架期泡持值输入Mintab软件，选择文件——打开——数据，进行数据的输入，然后选择分析——回归——线性，进行多元线性回归分析，用Mintab软件拟合，建立以下二元线性方程：

A＝35+0.523×b-1.94×c(p<0.05)

A:成品纯生啤酒4个月泡持性(s)

b:最终发酵液泡沫蛋白含量(mg/L)

c：最终发酵液蛋白酶活性(10^-5U/mL)

表1用于预测成品纯生啤酒4个月泡持性的数据

用该方程预测其它7组没有用于拟合的数据，结果基本吻合，如图5表示。泡持性真实值和预测值的相关性非常强，说明该方程的预测能力比较强。

四、纯生啤酒泡持性预测模型的验证

选择不同生产批次的10个纯生啤酒样品，根据检测所得到的发酵液的蛋白酶活性和泡沫蛋白含量，来进行模型的验证。

表2模型预测结果的准确性验证

通过表2中10组不同发酵批次的样品进行验证，发现模型的重现性良好，实际泡持性与模型预测的泡持性偏差率较小(都在5％以内)，说明该模型可以准确的预测纯生啤酒在货架期内的泡持性。该模型具有较好的预测准度，可以用于大工业生产。

通过以上分析可知，通过我们建立的这一预测模型，可以提前获知该批次纯生啤酒的货架期泡持性。并且是通过泡沫蛋白和蛋白酶A双因子进行预测，预测的精度更高，结果更准确可靠。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (10)

1.一种基于发酵液对纯生啤酒货架期内泡持性进行预测的模型建立方法，其特征在于：通过测定发酵液样品中蛋白酶A活性和泡沫蛋白含量来预测纯生啤酒货架期内的泡持性，包括以下步骤：

1)、分析发酵液中蛋白酶A活性与纯生啤酒货架期泡持性之间的关联性：取多批次的发酵液样品，分别测定其蛋白酶A的活性，然后跟踪检测所述批次发酵液生产的纯生啤酒在货架期内的泡持性，并进行相关性分析；

2)、分析发酵液中泡沫蛋白含量与纯生啤酒货架期泡持性之间的关联性：取多批次的发酵液样品，分别测定其泡沫蛋白的含量，然后跟踪检测所述批次发酵液生产的纯生啤酒在货架期内的泡持性，并进行相关性分析；

3)、将测得发酵液样品的泡沫蛋白含量、蛋白酶A活性及纯生啤酒货架期泡持值输入Mintab软件，通过所述Mintab软件拟合出发酵液中的所述蛋白酶A活性、所述泡沫蛋白含量与最终生产的纯生啤酒泡持性之间的线性方程：

A＝35+0.523×b-1.94×c(p<0.05),其中

A:成品纯生啤酒货架期4～6个月泡持值(s)；

b:最终发酵液中泡沫蛋白含量(mg/L)；

c：最终发酵液中蛋白酶A活性(10^-5U/mL)。

2.如权利要求1所述的基于发酵液对纯生啤酒货架期泡持性进行预测的模型建立方法，其特征在于，所述步骤1)和步骤2)的发酵液样品批次分别不少于10个。

3.如权利要求2所述的基于发酵液对纯生啤酒货架期泡持性进行预测的模型建立方法，其特征在于，所述发酵液中蛋白酶A活性的测定步骤为：

S1：蛋白酶A活性标准曲线的建立：分别取不同活性梯度的蛋白酶A标准品、缓冲液、双蒸水、荧光底物混合均匀后，然后在避光、密封、水浴条件下避光反应，水浴中灭活，冷却后进行离心，用荧光分光光度计测定荧光强度，建立蛋白酶A的标准曲线；

S2：蛋白酶A活性测试样品的前处理：将缓冲液、双蒸水、经离心除气的发酵液上清液样品、荧光底物置于反应容器中混匀，然后在避光、密封、水浴条件下反应，水浴中灭活，得蛋白酶A活性测试样品；

S3：计算待测样品蛋白酶A的活性：调节荧光分光光度计激发波长λex为328nm，发射波长λem为393nm，将所述蛋白酶A活性测试样品冷却后离心，测定其荧光强度值，，将所得的荧光强度值代入到建立好的标准曲线中，得到待测样品蛋白酶A的活性。

4.根据权利要求3所述的基于发酵液对纯生啤酒货架期泡持性进行预测的模型建立方法，其特征在于，所述步骤S1中对发酵液进行离心除气的转速为4500～5000r/min,离心时间为5～6min。

5.根据权利要求3所述的基于发酵液对纯生啤酒货架期泡持性进行预测的模型建立方法，其特征在于，所述步骤S1灭活完成后还需进行离心，离心的转速为9,000～10,000r/min，离心的时间为3～5min。

6.根据权利要求2所述的基于发酵液对纯生啤酒货架期泡持性进行预测的模型建立方法，其特征在于,所述发酵液中泡沫蛋白含量的测定步骤：

S1：牛血清白蛋白标准曲线的绘制：取不同浓度梯度的牛血清蛋白与考马斯亮蓝G-250染液在室温下反应，测其吸光值，然后绘制出标准曲线；

S2：计算所得泡沫蛋白的含量：取发酵液待测样品与考马斯亮蓝溶液在室温下反应，测定吸光值，然后根据标准曲线得到所述泡沫蛋白的含量。

7.如权利要求1～6中任意一项所述的基于发酵液对纯生啤酒货架期泡持性进行预测的模型建立方法，其特征在于，所述发酵液样品是未过滤的发酵液样品。

8.如权利要求1～6中所述的基于发酵液对纯生啤酒货架期泡持性进行预测的模型建立方法，其特征在于，所述纯生啤酒的货架期为1～6个月。

9.一种基于发酵液对纯生啤酒货架期泡持性进行预测的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1)、取多批次的发酵液样品分别测定其蛋白酶A的活性，然后跟踪检测所述批次发酵液生产的纯生啤酒在货架期内的泡持性；

2)、取多批次的发酵液样品分别测定其泡沫蛋白的含量，然后跟踪检测所述批次发酵液生产的纯生啤酒在货架期内的泡持性；

3)、将测得发酵液样品的泡沫蛋白含量、蛋白酶A活性及纯生啤酒货架期泡持值输入Mintab软件，通过所述Mintab软件拟合出发酵液中的所述泡沫蛋白含量和所述蛋白酶A活性与最终生产的纯生啤酒泡持性之间的线性方程：

A＝35+0.523×b-1.94×c(p<0.05)

A:成品纯生啤酒货架期4～6个月泡持值(s)；

b:最终发酵液中泡沫蛋白含量(mg/L)；

c：最终发酵液中蛋白酶A活性(10^-5U/mL)。

10.如权利要求9所述的基于发酵液对纯生啤酒货架期泡持性进行预测的方法，其特征在于，所述步骤1)和步骤2)的发酵液样品批次分别不少于10个。