CN107850589B - 13+/17+ bin1表达作为心脏病症的标记 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了确定受试者是否具有心脏病症或处于患心脏病症的风险的方法。

Description

13+/17+ BIN1表达作为心脏病症的标记
本申请要求于2015年3月2日提交的美国临时申请No.62/126,867的权益，其在此通过引用全部并入本文。
背景技术
在美国心脏病症是死亡的主要原因。因此，需要用于诊断心脏病症的方法，用于评价心脏病症进展的方法和用于评估心脏病症治疗功效的方法。
发明内容
提供的是确定受试者是否具有心脏病症或处于患心脏病症的风险的方法。所述方法包括使来自受试者的生物样本与(i)特异性结合由BIN1的外显子13编码的多肽(13+BIN1多肽)的抗体和(ii)特异性结合由BIN1的外显子17编码的多肽(17+ BIN1多肽)的抗体接触，以及确定13+/17+ BIN1多肽的总水平。在这些方法中，与对照水平相比，总13+/17+BIN1多肽水平的降低表示受试者具有心脏病症或处于患心脏病症的风险。
还提供的是治疗心脏病症的受试者的方法。所述方法包括通过检测13+/17+ BIN1多肽水平与来自受试者的样本中的对照水平相比降低来确定受试者是否具有心脏病症或处于心脏病症的风险。
还提供的是基于受试者的13+/17+ BIN1多肽水平的变化确定受试者的心脏病症治疗功效的方法。所述方法可包括使来自受试者的第一生物样本与(i)特异性结合13+BIN1多肽的抗体和(ii)特异性结合17+ BIN1多肽的抗体接触以确定第一13+/17+ BIN1水平，在使用心脏病症的第一疗法的至少一次治疗后获得来自受试者的第二生物样本，使第二生物样本与(i)特异性结合13+ BIN1多肽的抗体和(ii)特异性结合17+ BIN1多肽的抗体接触以确定第二13+/17+ BIN1水平，以及比较第一BIN1多肽水平与第二BIN1多肽水平。在这些方法中，与第一生物样本相比，如果BIN1多肽水平在第二生物样本中降低或没有增加，则可以为受试者选择心脏病症的第二疗法。与第一生物样本相比，如果13+/17+ BIN1水平在第二生物样本中增加，则可以继续受试者使用心脏病症的第一疗法的治疗。
进一步提供的是用于确定受试者的心脏病症进展或患心脏病症的风险增加的方法。所述方法可包括从受试者获得第一生物样本，确定第一生物样本的第一13+17+ BIN1多肽水平，从受试者获得第二生物样本，确定第二生物样本的第二13+17+ BIN1多肽水平，以及比较第一13+17+ BIN1多肽水平和第二13+17+ BIN1多肽水平。在这些方法中，与第二生物样本相比，如果13+17+ BIN1多肽水平在第二生物样本中降低，则受试者的心脏病症已经进展或在受试者中患心脏病症的风险已经增加。
附图说明
图1是显示当使用捕获抗体(capture antibody)(抗BIN1外显子17抗体)和检测抗体(detection antibody)(抗BIN1外显子13抗体)的组合时，在13+/17+ BIN1多肽水平和光密度(OD)信号之间存在线性相关(R2＝0.99)的图。
图2显示正常狗样本中13+/17+BIN1心脏同种型(cardiac isoform)的心脏血浆水平为1.67±0.57ng/ml(平均±SEM)，中值为0.86。然而，在心肌病狗中，血浆13+/17+ BIN1多肽水平显著降低至0.30±0.11ng/ml(平均±SEM,中值处于0.22,p＝0.02)。
图3是显示通过在13+/17+ BIN1多肽的血浆水平的各种阈值设置下绘制真阳性率(敏感性％，Y轴)与假阳性率(100％-特异性％，X轴)而生成的受试者工作特征(ROC)曲线的图。ROC曲线下的面积是0.85(p＝0.01)，这表示血浆13+/17+ BIN1多肽用于检测心肌病。
具体实施方式
本文所述的方法基于可以通过在来自受试者的生物样本中检测降低的13+/17+BIN1多肽水平而诊断受试者具有心脏病症或处于患心脏病症的风险的发现。因此，本文提供的是用于确定受试者是否具有心脏病症或处于患心脏病症的风险的方法。所述方法包括，在允许鉴定13+/17+ BIN1多肽的条件下，使来自受试者的生物样本与(i)特异性结合由BIN1的外显子13编码的多肽(13+ BIN1多肽)的抗体和(ii)特异性结合由BIN1的外显子17编码的多肽(17+ BIN1多肽)的抗体接触，其中，13+/17+ BIN1多肽包含由外显子13变啊的多肽和由外显子17编码的多肽；以及确定13+/17+ BIN1多肽的总水平，其中，与对照水平相比，13+/17+ BIN1多肽总水平的降低表示受试者具有心脏病症或处于患心脏病症的风险。
桥接整合因子1(Bridging integrator 1)(BIN1)基因通过任选的剪接编码核质蛋白的几种同种型。迄今为止，已经鉴定了十种BIN1同种型，两种同种型被普遍表达，而其他仅存在于特定组织中。BIN1位于127,805,599～127,864,903bps的染色体2(2q14)上(来源:NCBI)，并且包含20个可以被任选地剪接形成至少10种不同同种型的外显子。BIN1蛋白含有不同的结构域，如BAR结构域(BIN1-两性蛋白-Rvs167)、磷酸肌醇结合结构域、网格蛋白相关蛋白结合结构域(CLAP)、Myc结合结构域(MBD)和Src同源3结构域(SH3)(Prendergast GC,et al.,Biochim Biophys Acta.2009 1795(1):25-36)。外显子13编码一部分CLAP结构域。
如本文所述使用的，13+/17+ BIN1多肽是BIN1同种型，其包含由BIN1的外显子13编码的多肽(13+ BIN1多肽)和由BIN1的外显子17编码的多肽(17+ BIN1多肽)。一些包括心脏同种型的BIN1同种型，包含13+ BIN1多肽和17+ BIN1多肽。这些包括BIN1同种型1(GenBank登录号NP_647593)、BIN1同种型4(GenBank登录号NP_647596)、BIN1同种型5(GenBank登录号NP_647597)和BIN1同种型6(GenBank登录号NP_647598)。BIN1的外显子13和外显子17，也被分别称为外显子12a和外显子13。因此，所理解的是，当指BIN1的外显子13时，术语“外显子12a”和“外显子13”可以交替使用。相似地，当指13+ BIN1多肽时，术语“12a+ BIN1多肽”和“13+ BIN1多肽”可以交替使用。还理解的是，当指BIN1的外显子17时，术语“外显子13”和“外显子17”可以交替使用。相似地，当指17+ BIN1多肽时，术语“13+ BIN1多肽”和“17+ BIN1多肽”可以交替使用。
编码13+/17+ BIN1多肽的13+ BIN1多肽的外显子13可具有以下核苷酸序列：
Figure BDA0001454075420000031
Figure BDA0001454075420000032
Figure BDA0001454075420000033
或者，核苷酸序列与SEQ ID NO:1具有至少百分之85、90或95的同一性，并且这样的变化可能导致或可能不导致表达蛋白中的氨基酸变化。可选地，外显子13可编码包含序列LRKGPPVPPP PKHTPSKEVK QEQILSLFED TFVPEISVTT PSQ(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列。或者，氨基酸序列可以与SEQ ID NO:2至少百分之85、90或95相同。序列的变化可包括氨基酸插入、删除或置换(其包括，例如，1-5个保守氨基酸置换)。
编码13+/17+ BIN1多肽的17+ BIN1多肽的外显子17可具有以下核苷酸序列：
CCAGCAGAGGCCTCGGAGGTGGCGGGTGGGACCCAACCTGCGGCTGGAGC
CCAGGAGCCAGGGGAGACGGCGGCAAGTGAAGCAGCCTCC(SEQ ID NO:3)。或者，核苷酸序列与SEQ ID NO:3具有至少百分之85、90或95的同一性，并且这样的变化可能导致或可能不导致表达蛋白中的氨基酸变化。可选地，外显子17可编码包含序列PAEASEVAGGTQPAAGAQEPGETAASEAAS(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列。或者，氨基酸序列可以与SEQ ID NO:4至少百分之85、90或95相同。序列的变化可包括氨基酸插入、删除或置换(其包括，例如，1-5个保守氨基酸置换)。
在本文提供的方法中，受试者可以是脊椎动物，并且更具体地是哺乳动物(例如，人、马、猪、兔、狗、绵羊、山羊、非人灵长目动物、奶牛、猫、豚鼠或啮齿动物)、鱼、鸟，或者爬行动物或两栖动物。术语不代表特定的年龄或性别。因此，成年和新生受试者，无论雄性或雌性，都意欲被覆盖。如本文所使用的，患者或受试者可以交替使用，并且可指具有心脏疾病或病症，或者处于患心脏疾病或病症的风险的受试者。术语患者或受试者包括人或兽医受试者。
受试者可任选地具有一种或多种与心脏病症相关的风险因素。这些包括，但不限于，高血压、肥胖、抑郁、压力、糖尿病、饮食饱和脂肪高、家族史、心脏病症的遗传倾向、吸烟以及异常血脂水平(例如，高胆固醇、三酸甘油、高的低密度脂蛋白和/或低水平的高密度脂蛋白)。
如本文所使用的，对照水平指来自相同受试者或不同受试者或者受试者的13+/17+ BIN1表达水平。来自相同受试者的13+/17+ BIN1表达水平可以在最近时间点前的各个时间点获得以比较13+/17+ BIN1的表达水平。来自不同受试者的13+/17+ BIN1表达水平可在与现有受试者相同的时间点获得(例如，对照受试者和现有受试者年龄相同)。通常，对照受试者和现有受试者共有许多相同或相似特征(例如，年龄、体重、身高、种族特点和养育)。
生物样本可以是从有机体获得的任何样本。生物样本的实例包括体液和组织样本。样本的来源可以是生理介质，如血液、血清、血浆、脑脊髓液、母乳、脓、组织刮擦、洗涤液、尿液、粪便、组织，如淋巴结、脾等。术语组织指身体的任何组织，其包括血液、结缔组织、上皮、收缩组织、神经组织等。
对照水平可从对照样本获得，其可包含从对照受试者(例如，从与生物样本不同时间的相同受试者)或从第二受试者获得的样本，或者可包含已知的标准。
可选地，对照水平可以是正常的，即，指示没有心脏病症的受试者或与一般群体相比处于较大患心脏病症风险的受试者的水平。在这种情况下，13+/17+ BIN1多肽的检测水平小于对照水平表示受试者具有心脏病症或处于患心脏病症的风险，而与对照水平大致相同或高于对照水平的13+/17+ BIN1多肽的检测水平表示受试者没有心脏病症或未处于患心脏病症的风险。可选地，对照水平是低于正常的，并且相当于或小于对照水平的13+/17+BIN1多肽的检测水平表示受试者具有心脏病症或处于患心脏病症的风险。可选地，对照水平是高于正常的，并且相当于的或低于对照水平的13+/17+ BIN1多肽的检测水平表示受试者没有心脏病症并且未处于患心脏病症的风险。
对照水平可以用来建立阈值，例如，使得小于阈值的13+/17+ BIN1多肽水平表示受试者具有心脏病症或处于患心脏病症的风险。该阈值可以通过比较阳性对照(来自具有心脏病症或处于患心脏病症风险的受试者的样本)和阴性对照(来自没有心脏病症的受试者、成功治疗心脏病症的受试者或与一般人群相比未处于更大心脏病症风险的受试者的样本)凭经验确定。这样的对照可选地是年龄匹配的或根据心脏病症类型匹配的。为了区分降低的13+/17+ BIN1多肽水平，阈值可以被设置为低于平均阴性对照值的至少1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或5个标准偏差。其他统计方法可以用来设置测定所需的希望预测能力内的阈值。
如本文所使用的，阴性对照水平可以从没有心脏病症的不同受试者或心脏病症诊断前的相同受试者确定。同样地，阳性对照值可以从一个或多个具有心脏病症或处于患心脏病症风险的受试者确定。或者，如在标准对照中，阴性或阳性对照可以基于一种或多种含有已知浓度的13+/17+ BIN1多肽，如重组13+/17+ BIN1多肽的样本。
可选地，与事先从相同受试者获得的样本的13+/17+ BIN1多肽水平相比，20％的13+/17+ BIN1多肽水平降低表示受试者具有心脏病症或处于患心脏病症的风险。
可选地，13+/17+ BIN1多肽水平低于截断值(cutoff value)表示受试者具有心脏病症或处于患心脏病症的风险。例如，从0至截断值的13+/17+ BIN1多肽水平，例如截断值为约0.25ng/ml～约1.0ng/ml±20％，表示受试者具有心脏病症或处于患心脏病症的风险。可选地，截断值可以是约0.25ng/ml～约1.0ng/ml±10％。所理解的是，截断值可以是包括并且是约0.25ng/ml～约1.0ng/ml±20％的任何值。例如，如果截断值是0.25ng/ml，则小于或等于0.25ng/ml的13+/17+ BIN1多肽水平表示受试者具有心脏病症或处于患心脏病症的风险，并且任何大于0.25ng/ml的值表示受试者没有心脏病症或未处于患心脏病症的风险。在另一个实例中，如果截断值是0.50ng/ml，则小于或等于0.50ng/ml的13+/17+ BIN1多肽水平表示受试者具有心脏病症或处于患心脏病症的风险，并且任何大于0.50ng/ml的值表示受试者没有心脏病症或未处于患心脏病症的风险。在另一个实例中，如果截断值是0.75ng/ml，则小于或等于0.75ng/ml的13+/17+ BIN1多肽水平表示受试者具有心脏病症或处于患心脏病症的风险，并且任何大于0.75ng/ml的值表示受试者没有心脏病症或未处于患心脏病症的风险。在另一个实例中，如果截断值是1.0ng/ml，则小于或等于1.0ng/ml的13+/17+ BIN1多肽水平表示受试者具有心脏病症或处于患心脏病症的风险，并且任何大于1.0ng/ml的值表示受试者没有心脏病症或未处于患心脏病症的风险。
可选地，约为13+/17+ BIN1多肽正常对照水平的50％以下的13+/17+ BIN1多肽水平表示受试者具有心脏病症或处于患心脏病症的风险。因此，约50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、1％的正常对照水平表示受试者具有心脏病症或处于患心脏病症的风险。正常对照值可以从开始风险或疾病状态前的相同受试者确定，或可以从任意匹配年龄、性别和其他条件或因素(例如，术后状态、地理位置等)的一群人确定。
在整个过程中，心脏病症可以是，但不限于，心律不齐(例如，室性心律不齐)、充血性心力衰竭或心肌病。
当受试者被鉴定为具有心脏病症或处于患心脏病症的风险时，可以进行受试者的进一步评估。进一步评估可包括超声心动图、胸部X线，心电图(EKG)、运动或灌注压力测试、心导管插入术、心脏磁共振成像(MRI)、心脏计算机断层扫描(CT)扫描和/或Holter监测(连续EKG)。还可以进行其他基于血液的心脏生物标记增加的测量。这些生物标记包括，但不限于，肌钙蛋白、B型利钠多肽(BNP)、C-反应蛋白(CRP)和肌酸磷酸激酶(CK)。
在本文所提供的方法中，生物样本中的13+/17+ BIN1多肽水平可以通过检测13+/17+ BIN1多肽来确定，其中多肽包含由BIN1的外显子13编码的多肽和由BIN1的外显子17编码的多肽。为了检测生物样本中的13+/17+ BIN1多肽，在允许鉴别13+/17+ BIN1多肽的条件下，使生物样本与(i)特异性结合由BIN1的外显子13编码的多肽(13+ BIN1多肽)的抗体和(ii)特异性结合由BIN1的外显子17编码的多肽(17+ BIN1多肽)的抗体。所理解的是，本文所提供的方法涉及鉴定包含13+ BIN1多肽和17+ BIN1多肽两者的BIN1多肽，而不涉及鉴定包含13+ BIN1多肽而不包含17+ BIN1多肽的BIN1多肽，或不涉及鉴定包含17+ BIN1多肽而不包含13+ BIN1多肽的BIN1多肽。
如本文所使用的，术语抗体包括，但不限于，任何种类的整个免疫球蛋白(即，完整抗体)。具有双或多抗原或者表位特异性的嵌合抗体和杂交抗体以及片段，如包括杂交片段的F(ab’)2、Fab’、Fab等，在本文中是有用的。因此，提供保持结合其特定抗原能力的抗体片段并用于这里教导的方法。例如，保持13+ BIN1多肽或17+ BIN1多肽的结合活性的抗体片段包括在术语抗体或其片段的含义中。这样的抗体和片段可以通过本领域中已知的技术来制备，并且可以根据用于制备抗体和筛选抗体的特异性和活性的一般方法筛选这样的抗体和片段的特异性和活性(见Harlow and Lane.Antibodies,A Laboratory Manual.ColdSpring Harbor Publications,New York(1988))。在本文的方法中也有用的是如例如内容在此通过引用全部并入的美国专利No.4,704,692所述的抗体片段和抗原结合蛋白的缀合物(conjugate)。
可选地，抗体是单克隆抗体，如本文所使用的术语单克隆抗体指来自基本同源的抗体群体的抗体，即除了可以少量存在的可能天然发生的突变之外包含群体的单个抗体是相同的。单克隆抗体可以使用杂交瘤法，如由Kohler and Milstein,Nature,256:495(1975)或Harlow and Lane,Antibodies,A Laboratory Manual.Cold Spring HarborPublications,New York(1988)所述的那些来制备。在杂交瘤法中，小鼠或其他适合的宿主动物通常使用免疫剂免疫以诱导产生或能够产生将特异性结合免疫剂的抗体的淋巴细胞。
单克隆抗体还可以通过重组DNA法，如美国专利No.4,816,567中所述的那些方法来制备。编码单克隆抗体的DNA可以使用常规程序(即，通过使用能够特异性结合编码鼠抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)轻而易举地分离并测序。杂交瘤细胞可用作这样的DNA的优选来源。当分离时，可以将DNA置于表达载体中，然后将其转染至不另外产生免疫球蛋白的宿主细胞，如类人猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、浆细胞瘤细胞或骨髓瘤细胞，以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。还可以，例如通过用编码序列置换人重链和轻链恒定结构域代替同源鼠序列(美国专利No.4,816,567)，或通过共价结合免疫球蛋白编码序列和全部或部分的非免疫球蛋白多肽的编码序列来修饰DNA。
体外方法也适合于制备单价抗体。消化抗体以产生其片段，尤其是Fab片段，可以使用本领域中已知的常规技术完成。例如，可以使用木瓜蛋白酶进行消化。木瓜蛋白酶消化的实例在WO 94/29348、美国专利No.4,342,566和Harlow and Lane,Antibodies,ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Publications,New York,(1988)中描述。抗体的木瓜蛋白酶消化通常产生两个相同的被称为Fab片段、各自具有单个抗原结合位点的抗原结合片段，和残留的Fc片段。木瓜蛋白酶处理产生了被称为F(ab’)2片段的片段，其具有两个抗原结合位点并且仍然能够交联抗原。
在抗体消化中产生的Fab片段也可含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域。Fab’由于在重链结构域的羧基端加入几个残基而不同于Fab片段，其包含来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。F(ab’)2片段是包含两个通过铰链区的二硫桥连接的Fab’片段的二价片段。Fab'-SH是Fab'在本文中的名称，其中恒定结构域的半胱氨酸残基具有游离巯基。
本文进一步提供的是人源化抗体或人版本的抗体。人源化抗体和人抗体可以使用本领域技术人员已知的方法来制备；例如，人抗体可以使用种系突变或通过噬菌体呈现文库(phage display library)而产生。
本文提供了特异性结合BIN13+多肽的抗体。例如，特异性结合SEQ ID NO:2，即由BIN1的外显子13编码的多肽的抗体可以用于本文所提供的方法。抗体可以是单克隆抗体或重组抗体。可以使用特异性结合外显子13的单克隆抗体(9D7 1C1)。9D7 1C1在通过引用全部并入本文的国际申请公开No.WO/2013/049666中描述。9D7 1C1抗体的重链的互补决定区(CDR)包含氨基酸序列GFNIKDYY(SEQ ID NO:5)、IDPENGNT(SEQ ID NO:6)和VRGEDYGGYAMDY(SEQ ID NO:7)。9D7 1C1抗体的轻链的CDR包含氨基酸序列KSLLHSNGNTY(SEQ ID NO:8)、MQHLEFPFT(SEQ ID NO:9)和QDVSTA(SEQ ID NO:10)。因此，所公开的选择性结合13+ BIN1多肽的单克隆抗体和重组抗体包含至少这些CDR，或与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10具有至少95％至99％同一性的CDR。
特异性结合SEQ ID NO:4的抗体，即由BIN1的外显子17编码的多肽，可以用于本文所提供的方法。抗体可以是单克隆抗体或重组抗体。例如，抗体可以是单克隆抗体，如在来自Sigma(St.Louis,MO)的目录No.#9428中阐述的克隆99D。
如本文所使用的，短语“特异性结合”或“选择性结合”指决定在蛋白质、细胞、蛋白多糖和其他生物制剂的异质群体中的多肽，例如13+ BIN1多肽或17+ BIN1多肽存在的结合反应。因此，在指定条件下，本发明的抗体或其片段结合13+ BIN1多肽、17+ BIN1多肽，或其表位、片段或变体，并且不结合大量其他蛋白或如本文所述的生物样本中的蛋白多糖。
在这样的条件下选择性结合抗体可能需要选择其特异性针对13+ BIN1多肽、17+BIN1多肽或它们的片段的抗体。各种免疫测定形式可以用来选择与13+ BIN1多肽、17+BIN1多肽或其片段选择性结合的抗体。例如，固相ELISA免疫测定通常用来选择与蛋白、蛋白多糖或其变体、片段、表位或蛋白核选择性免疫反应的抗体。对于可以用来确定选择结合的免疫测定形式和条件的描述，见Harlow and Lane.Antibodies,A LaboratoryManual.Cold Spring Harbor Publications,New York,(1988)。单克隆抗体的结合亲和力可以例如通过Munson et al.,Anal.Biochem.,107:220(1980)的斯卡查德分析(Scatchardanalysis)来确定。
优选地，在ELISA中，本发明的抗体或其片段与13+ BIN1多肽或17+ BIN1多肽的结合是至少1.5倍的本底水平(background level)(即，相当于非特异性结合或略高于非特异性结合)。更优选地，本发明的抗体或其片段与13+ BIN1多肽或17+ BIN1多肽的结合是至少2.5倍的本底水平。
用于确定多肽表达的分析技术的实例包括免疫组织化学、蛋白质印迹、酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶免疫测定(EIA)、放射免疫测定(RIA)、蛋白质阵列或荧光激活细胞分选(FACS)。这些技术是本领域的技术人员已知的。见，例如Sambrook et al.,MolecularCloning:A Laboratory Manual,3rd Ed.,Cold Spring Harbor Press,Cold SpringHarbor,NY(2001)。
可选地，本文所述的抗体可以使用可检测的部分标记。例如，可检测的部分可以选自下组：荧光部分、酶连接的部分(例如，辣根过氧化物酶缀合的抗体)、生物素部分和放射性标记的部分。
如在实例中所述，生物样本中的13+/17+ BIN1多肽水平可以使用捕获ELISA测定检测。例如，使来自受试者的生物样本与特异性结合13+BIN1多肽的抗体接触，以便捕获含有13+BIN1多肽的生物样本中的所有BIN1同种型，即13+ BIN1同种型。然后，使捕获的13+BIN1同种型与特异性结合17+ BIN1多肽的检测抗体接触，以便鉴定还包含17+ BIN1多肽的13+ BIN1同种型，即13+/17+ BIN1同种型或多肽。本领域技术人员之一会理解的是捕获测定还可以通过使生物样本与特异性结合17+BIN1多肽的抗体来进行以便捕获含有17+ BIN1多肽的生物样本中的所有BIN1同种型，即17+ BIN1同种型。然后，使捕获的17+ BIN1同种型与特异性结合13+ BIN1多肽的抗体接触，以便鉴定还包含13+ BIN1多肽的17+ BIN1同种型，即13+/17+ BIN1同种型或多肽。
进一步提供的是治疗具有心脏病症或处于心脏病症风险的受试者的方法。这些方法包括根据本文所述的方法确定受试者是否具有心脏病症或处于患心脏病症的风险，以及治疗心脏病症的受试者。
如本文所使用的术语疗法(treatment)、医治(treat)或治疗(treating)指减少疾病或病症的影响或者疾病或病症的症状的方法。因此在本公开的方法中，治疗可指既定疾病或病症的严重程度或者疾病或病症的症状减少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。心脏病症的症状包括，但不限于，胸痛、眩晕、呼吸急促和心率异常。例如，与对照相比，用于治疗疾病的方法被认为是受试者疾病的一种或多种症状是否减少10％的治疗。因此，与天然或对照水平相比，减少可以是10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％，或10％～100％的任何百分比减少。所理解的是治疗并不一定指疾病、病症或者疾病或病症的症状的治愈或完全消除。
治疗将根据几个因素变化，其包括但不限于，受试者的心脏病症的类型、年龄、体重、总体健康、性别和饮食。治疗的方式和时间也将根据病症的严重程度变化，并且可以由本领域技术人员之一来决定。
例如，充血性心力衰竭可以通过施用利尿剂(例如，呋塞米(furosemide)、布美他尼(bumetanide)或氢氯噻嗪(hydrocholorothiazide))、血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂、血管紧张素受体阻滞剂(ARB)、β阻滞剂或可增加心输出量的试剂，如地高辛(digoxin)来治疗。治疗可以适当与减肥计划、运动计划和/或停止吸烟结合。还可以使用用于控制高血压、高胆固醇和糖尿病的治疗。根据心力衰竭的严重程度，可以进行手术程序，例如冠状动脉旁路搭桥(CABG)手术、瓣膜手术(例如，主动脉瓣置换术或二尖瓣置换术)、动脉瘤修补术、左心室辅助装置(LVAD)手术、子宫肌瘤切除术、冠状动脉再灌注或心脏移植。
也可以治疗心肌病，一种心脏的腔室扩大且心脏变弱的病症。当伴随其他心脏病症时，治疗取决于心肌病的类型、症状的严重程度、年龄和整体健康、特有的其他因素。例如，心肌病可以通过施用，例如降低血压的药剂、减缓心率的药剂(例如，β阻滞剂或钙通道阻滞剂)、抗心律不齐药剂、抗凝血剂或抗炎剂来治疗。可以进行非手术程序，如酒精消融术。还可以进行手术程序，如心内直视手术、心脏起搏器植入术或心脏移植来治疗心肌病。
在另一个实例中，心律不齐可以通过施用控制受试者心率的药剂，例如β阻滞剂来治疗。还可以施用抗凝血剂，例如华法林(warfarin)、达比加群(dabigatran)或阿司匹林(aspirin)。如果药物不能控制持续不规则的心率，可以进行电击复律。还可以在受试者中植入起搏器或心脏复律除颤器(ICD)。在一些情况下，可能需要心脏手术以改正由心律不齐导致的心脏疾病。本文所提供的方法可以用来确定已经患有或正患有室性心律不齐的受试者是否处于未来室性心律不齐的风险。例如，与事先从相同受试者获得的样本中的13+/17+BIN1多肽水平相比，如果观察到20％的13+/17+ BIN1多肽水平减少，这表示受试者处于未来室性心律不齐的风险，并且受试者应该据此治疗。未来室性心律不齐的早期检测可促进受试者的早期治疗，并预防严重后果，如心力衰竭或死亡。
进一步提供的是确定受试者心脏病症治疗功效的方法。这些包括在允许鉴定13+17+ BIN1多肽的情况下，使来自受试者的第一生物样本与(i)特异性结合由BIN1的外显子13编码的多肽的抗体和(ii)特异性结合由BIN1的外显子17编码的多肽的抗体接触，确定第一13+17+ BIN1水平；在使用心脏病症的第一疗法的至少一次治疗后，从受试者获得第二生物样本；在允许鉴定13+/17+ BIN1多肽的条件下，使第二生物样本与(i)特异性结合由BIN1的外显子13编码的多肽的抗体和(ii)特异性结合由BIN1的外显子17编码的多肽的抗体接触，确定第二13+/17+ BIN1水平；比较第一13+/17+ BIN1多肽水平与第二13+/17+ BIN1多肽水平；以及与第一生物样本相比，如果13+/17+ BIN1多肽水平在第二生物样本中降低或没有增加，则选择心脏病症的第二疗法，或与第一生物样本相比，如果13+/17+ BIN1多肽水平在所述第二生物样本中增加，则继续使用所述心脏病症的第一疗法治疗受试者。本领域技术人员之一可决定适当剂量或改变治疗方案。
还提供的是确定受试者的心脏病症进展或患心脏病症的风险增加的方法。这些方法包括，从受试者获得第一生物样本；通过使样本与(i)特异性结合13+ BIN1多肽的抗体和(ii)特异性结合17+ BIN1多肽的抗体接触来确定第一生物样本中的第一13+17+ BIN1多肽水平；从受试者获得第二生物样本；通过使样本与(i)特异性结合13+ BIN1多肽的抗体和(ii)特异性结合17+ BIN1多肽的抗体接触来检测第二生物样本中的第二13+17+ BIN1多肽水平；比较第一13+17+ BIN1多肽水平与第二13+17+ BIN1多肽水平，其中，与第一生物样本相比，如果13+17+ BIN1多肽水平在第二生物样本中降低，则受试者的心脏病症已经进展或患心脏病症的风险在受试者中已经增加。
心脏病症的进展或患心脏病症风险的增加通常表示需要附加测定、改变治疗和/或改变治疗频率。本领域技术人员之一可决定治疗的哪些变化是必要的以治疗具有心脏病症已经进展的受试者或患心脏病症的风险已经增加的受试者。与先前的生物样本相比，13+/17+ BIN1表达的相似水平表示心脏病症尚未进展，而与先前的生物样本相比，13+/17+BIN1表达的更高水平表示改善。通常，这样的改善表示治疗的成功。在这种情况下，如果13+/17+ BIN1多肽的水平足够高，则可以继续治疗或者甚至中止。
所公开的是可以使用的、可以与其一起使用的、可以用于制备的物质、组合物和组分，或者是所公开的方法和组合物的产物。这些物质和其他物质在本文中公开，并且所理解的是，当这些物质的组合、子集、相互作用、组等被公开时，虽然可以不明确地公开这些化合物的各种个体和集体的组合和排列的具体参考，但是每个都在本文中具体考虑和描述。例如，如果公开并讨论了一种方法，并且讨论了对包括在方法中的一些分子可以做出的一些修改，除非具体指出相反，否则每个方法和方法的每个组合和排列，以及可能的修改是具体考虑的。同样地，还具体考虑并公开了这些的任何子集或组合。该概念适用于本公开的所有方面，其包括但不限于，使用所公开的组合物的方法中的步骤。因此，如果有多种另外可以进行的步骤，所理解的是，每个这些另外的步骤可以与任何特定的方法步骤一起，或与所公开方法的方法步骤组合来进行，并且每个这样的组合或组合的子集是具体考虑的并且应该考虑公开的。
本文引用的公开和它们引用的物质在此通过引用特别全部并入。
实施例
抗体
为了测量血液样本中的BIN1心脏同种型13+/17+ BIN1(也称为12a+/13+ BIN1)的水平，两种BIN1抗体用于酶联免疫吸附测定(ELISA)。13+/ 17+ BIN1心脏同种型的检测使用小鼠单克隆抗BIN1外显子17抗体(克隆99D,Sigma,Catalog.No.#9428,St.Louis,MO)作为捕获抗体进行。含有由外显子17编码的多肽的BIN1 13+/17+同种型子集的检测使用辣根过氧化物酶(HRP)缀合小鼠单克隆抗BIN1外显子13(重组抗体克隆#9D71C1)进行。
通过捕获夹心ELISA检测血浆BIN1蛋白
以上描述了用于ELISA测定的抗体组合。圆底96孔板在4℃使用在pH 9.0的0.1M碳酸钠缓冲液中稀释的捕获抗体(5μg/ml)涂布过夜。使用Tris缓冲盐水TWEEN-20(TBST)洗涤平板3次以除去未结合的抗体，并且在室温使用TBST(封闭缓冲液)中的1％牛血清白蛋白(BSA)封闭在定轨摇床上1小时。加入50μl标准品(纯化重组BIN1蛋白)和各血浆样本，一式两份，并且在4℃使用轨道旋转培养平板过夜。然后抽吸样品并且快速洗涤平板2次并使用TBST洗涤5分钟3次。然后加入初级检测抗体(50μl HRP缀合小鼠抗BIN1外显子13，5μg/ml的封闭缓冲液)并且在室温使用轨道旋转培养平板1小时。然后抽吸检测抗体并快速洗涤平板两次，然后使用TBST洗涤5分钟3次。加入四甲基联苯胺(TMB)底物，并且在使用1N盐酸终止反应前，在暗室中培养平板30分钟。然后终止反应，使用ELx800微孔板分光光度计(BIOTEK,Winooski,VT)读取平板，并且确定405nm的光密度(OD)值。标准曲线从已知蛋白浓度的蛋白标准品的OD值产生。然后，各样本的BIN1浓度来源于标准曲线。
狗样本
为此研究收集八个来自看似健康的狗(称为正常的)的血液样本和10个来自具有心肌病的狗(称为CM)的血液样本。10ml的全血在EDTA抗凝集管中获得。将样本在4℃以4,000rpm离心20分钟以将血浆从血细胞中分离。然后收集血浆，并且等分为200至500μl等分试样并在液氮中快速冷冻，然后储存在-80℃冰箱中用于以后分析。在ELISA实验当天，在冰上融化样本并在4℃以4,000rpm再次离心以除去任何沉淀。
结果
标准曲线
在此研究中，纯化重组BIN1蛋白同种型13+/17+ BIN1和17+ BIN1分别用作阳性对照和阴性对照。GST标记的BIN1重组蛋白(13+/17+ BIN1和17+ BIN1)在人HEK-293细胞中过表达。从这些细胞中收集总细胞蛋白裂解物，然后使用谷胱甘肽珠纯化BIN1蛋白。然后在咪唑缓冲液中洗脱附着于谷胱甘肽珠的BIN1蛋白。如图1所示，使用特定的心脏BIN1试验，使用捕获与抗BIN1外显子抗体的组合和检测与抗BIN1外显子13抗体的组合，仅13+/17+BIN1，而不是17+ BIN1，出现剂量依赖性增加的OD信号。在0-50ng纯化13+/17+ BIN1的范围内，13+/17+ BIN1蛋白水平和OD信号之间存在线性相关(R2＝0.99)。
狗样本
BIN1心脏测试用于分析18个狗样本(8个正常的和10个具有心肌病的)以检测正常的与心肌病(CM)狗中的心脏BIN1同种型水平。如图2所示，正常狗样本中的心脏13+/17+BIN1同种型血浆水平是1.67±0.57ng/ml(平均±SEM)，中值是0.86。在心肌病狗中，血浆13+/17+ BIN1显著降低至0.30±0.11ng/ml(平均±SEM,中值处于0.22,p＝0.02)。然后，受试者工作特征(ROC)曲线通过在13+/17+ BIN1的血浆水平的各种阈值设置下绘制真阳性率(敏感性％，Y轴)与假阳性率(100％-特异性％，X轴)而产生。如图3所示，ROC曲线下的面积是0.85(p＝0.01)表示血浆13+/17+ BIN1多肽用于检测心肌病。例如，在血浆13+/17+ BIN1多肽水平<0.39ng/ml(图3中的星状标记点)，可以检测到70％(真阳性率)的心肌病患者和仅12％假阳性率。
诊断心力衰竭
为了诊断受试者的心力衰竭，在呈现有一种或多种心力衰竭症状的患者上进行BIN1心脏测试。症状包括但不限于，疲劳、呼吸急促、运动不耐受、由于液体滞留引起的体重增加、四肢肿胀、由于呼吸困难引起的难以平躺、非特异性疼痛、食欲不振或便秘。从受试者获得样本，例如血浆，并且确定心脏13+/17+ BIN1同种型水平。如果心脏13+/17+ BIN1同种型水平低，例如低于约0.25ng/ml～约1.0ng/ml±20％的截断值，或水平是正常对照的约50％以下，预定超声心动图以评估心脏功能。如果超声心动图显示出患者患有由于射血分数(ejection fraction)降低(HFrEF)引起的心力衰竭，则开始受试者的治疗。治疗可包括，例如，施用一种或多种β阻滞剂、一种或多种ACE抑制剂、一种或多种血管紧张素受体阻滞剂和/或一种或多种利尿剂。如果超声心动图显示出患者患有由于射血分数保持(HFpEF)，即正常射血分数，甚至限制性充盈(restricted filling)和容量负荷过重(volumeoverload)引起的心力衰竭，则开始受试者的治疗。治疗可包括，例如，施用一种或多种β阻滞剂、一种或多种ACE抑制剂、一种或多种血管紧张素受体阻滞剂和/或一种或多种利尿剂。被诊断患有由HFpEF引起的心力衰竭的受试者还应该被测试缺血性心脏病。如果超声心动图显示出患者患有由瓣膜性心脏病引起的心力衰竭，则开始受试者的治疗。治疗可包括，例如施用一种或多种β阻滞剂、一种或多种ACE抑制剂、一种或多种血管紧张素受体阻滞剂和/或一种或多种利尿剂。也可以评估患者的手术修复或更换有缺陷的心脏瓣膜。
对于已知心力衰竭的患者，心脏13+/17+ BIN1同种型水平可以每3-6个月确定，并且与事先在受试者中检测的心脏13+/17+ BIN1同种型水平相比，当水平降低或低于截断值，例如低于约0.25ng/ml±20％～约1.0ng/ml±20％的截断值时，或当水平是13+/17+BIN1同种型正常水平的约50％以下时，预定心脏超声心动图。
追踪疾病进展
患有慢性高血压但具有正常运转的高血压心脏的患者，如果患者无临床症状或每次患者具有一种或多种与心力衰竭相关的症状，则可具有每年确定的心脏13+/17+ BIN1同种型水平。当心脏13+/17+ BIN1同种型水平降低低于截断水平，例如低于约0.25ng/ml～约1.0ng/ml±20％的截断值或心脏13+/17+ BIN1同种型水平是正常的约50％以下时，应该例如通过超声心动图来评估患者的HFpEF。当检测到降低的心脏13+/17+ BIN1同种型水平时，患者可以通过施用一种或多种β阻滞剂、一种或多种ACE抑制剂、一种或多种血管紧张素受体阻滞剂和/或一种或多种利尿剂来治疗。
患有糖尿病但具有正常运转的心脏的患者，如果患者无临床症状或每次患者具有一种或多种与心力衰竭相关的症状，则可具有每年确定的心脏13+/17+ BIN1同种型水平。当心脏13+/17+ BIN1同种型水平降低低于截断水平，例如低于约0.25ng/ml～约1.0ng/ml±20％的截断值或心脏13+/17+ BIN1同种型水平是正常对照的约50％以下时，应该例如通过超声心动图来评估患者的HFpEF。当检测到降低的心脏13+/17+ BIN1同种型水平时，可以通过施用一种或多种β阻滞剂、一种或多种ACE抑制剂、一种或多种血管紧张素受体阻滞剂和/或一种或多种利尿剂来治疗患者。
如果患者无临床症状或每次患者具有一种或多种与心力衰竭相关的症状，则具有正常运转的缺血性心脏病的患者可以具有每年确定的心脏13+/17+ BIN1同种型水平。当心脏13+/17+ BIN1同种型水平降低低于截断水平，例如低于约0.25ng/ml～约1.0ng/ml±20％的截断值或水平在或低于正常对照的约50％以下时，应该例如通过提交给心脏病专家和/或进行超声心动图来评估患者的HFpEF。当检测到降低的心脏13+/17+ BIN1同种型水平时，可以通过施用一种或多种β阻滞剂、一种或多种ACE抑制剂、一种或多种血管紧张素受体阻滞剂和/或一种或多种利尿剂来治疗患者。还应该通过压力测试或心导管插入术来评价该患者的缺血性心脏病。
如果患者无临床症状或每次患者具有一种或多种与心力衰竭相关的症状，则具有已知瓣膜性心脏病的患者可以具有每6-12个月确定的心脏13+/17+ BIN1同种型水平。当心脏13+/17+ BIN1同种型水平降低低于截断水平，例如低于约0.25ng/ml～约1.0ng/ml±20％的截断值或水平是正常对照的约50％以下时，这表示与瓣膜性心脏病，如主动脉狭窄或二尖瓣回流有关的心脏功能恶化。应该评价患者的外科手术。
心脏功能的术后恢复
心脏手术后，例如主动脉瓣置换术、二尖瓣置换术、子宫肌瘤切除术或冠状动脉再灌注、心脏移植后，可以通过确定患者的心脏13+/17+ BIN1同种型水平监控患者的心脏功能恢复。与手术前的心脏13+/17+ BIN1同种型水平相比，如果心脏13+/17+ BIN1同种型水平没有改善，或者改善然后下降，应该重新评估患者原始手术的附加程序或修正。
序列表
<110> 萨克特恩诊断有限责任公司
D·S·肖
N·G·肖
<120> 13+/17+ BIN1表达作为心脏病症的标记
<130> 095223-1003693 (004WO1)
<150> US 62/126867
<151> 2015-03-02
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 129
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 1
ctccggaaag gcccaccagt ccctccgcct cccaaacaca ccccgtccaa ggaagtcaag 60
caggagcaga tcctcagcct gtttgaggac acgtttgtcc ctgagatcag cgtgaccacc 120
ccctcccag 129
<210> 2
<211> 43
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 2
Leu Arg Lys Gly Pro Pro Val Pro Pro Pro Pro Lys His Thr Pro Ser
1 5 10 15
Lys Glu Val Lys Gln Glu Gln Ile Leu Ser Leu Phe Glu Asp Thr Phe
20 25 30
Val Pro Glu Ile Ser Val Thr Thr Pro Ser Gln
35 40
<210> 3
<211> 90
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 3
ccagcagagg cctcggaggt ggcgggtggg acccaacctg cggctggagc ccaggagcca 60
ggggagacgg cggcaagtga agcagcctcc 90
<210> 4
<211> 30
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 4
Pro Ala Glu Ala Ser Glu Val Ala Gly Gly Thr Gln Pro Ala Ala Gly
1 5 10 15
Ala Gln Glu Pro Gly Glu Thr Ala Ala Ser Glu Ala Ala Ser
20 25 30
<210> 5
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成构建体（Synthetic construct）
<400> 5
Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr Tyr
1 5
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成构建（Synthetic construct）
<400> 6
Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asn Thr
1 5
<210> 7
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成构建体（Synthetic construct）
<400> 7
Val Arg Gly Glu Asp Tyr Gly Gly Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 8
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成构建体（Synthetic construct）
<400> 8
Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
1 5 10
<210> 9
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成构建体（Synthetic construct）
<400> 9
Met Gln His Leu Glu Phe Pro Phe Thr
1 5
<210> 10
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成构建体（Synthetic construct）
<400> 10
Gln Asp Val Ser Thr Ala
1 5

Claims (7)

1.特异性结合由BIN1的外显子13编码的多肽(13+BIN1多肽)的抗体和特异性结合由BIN1的外显子17编码的多肽(17+BIN1多肽)的抗体用于制备用于确定受试者是否具有心脏病症或处于患心脏病症的风险的方法的试剂的用途，所述方法包括：
(a)在允许鉴定13+/17+BIN1多肽的条件下，使来自所述受试者的血浆样本与(i)特异性结合13+BIN1多肽的抗体和(ii)特异性结合17+BIN1多肽的抗体接触，其中，所述13+/17+BIN1多肽包含由外显子13编码的多肽和由外显子17编码的多肽；以及
(b)确定13+/17+BIN1多肽的总水平，其中，与对照水平相比，13+/17+BIN1多肽的总水平的降低表明所述受试者具有心脏病症或处于患心脏病症的风险。
2.特异性结合由BIN1的外显子13编码的多肽(13+BIN1多肽)的抗体和特异性结合由BIN1的外显子17编码的多肽(17+BIN1多肽)的抗体用于制备用于确定受试者心脏病症治疗功效的方法的试剂的用途，所述方法包括：
(a)在允许鉴定13+/17+BIN1多肽的条件下，使来自所述受试者的第一血浆样本与(i)特异性结合由BIN1的外显子13编码的多肽的抗体和(ii)特异性结合由BIN1的外显子17编码的多肽的抗体接触，确定第一13+/17+BIN1水平；
(b)在允许鉴定13+/17+BIN1多肽的条件下，使使用心脏病症的第一疗法的至少一次治疗后从所述受试者获得的第二血浆样本与(i)所述特异性结合由BIN1的外显子13编码的多肽的抗体和(ii)特异性结合由BIN1的外显子17编码的多肽的抗体接触，确定第二13+/17+BIN1水平；
(c)比较所述第一13+/17+BIN1多肽水平与所述第二13+/17+BIN1多肽水平；以及
其中，与所述第一血浆样本相比，所述13+/17+BIN1多肽水平在所述第二血浆样本中降低或没有增加表示可以选择心脏病症的第二疗法，或其中，与所述第一血浆样本相比，所述13+/17+BIN1多肽水平在所述第二血浆样本中增加表示所述受试者可以继续使用所述心脏病症的第一疗法。
3.特异性结合由BIN1的外显子13编码的多肽(13+BIN1多肽)的抗体和特异性结合由BIN1的外显子17编码的多肽(17+BIN1多肽)的抗体用于制备用于确定受试者的心脏病症进展或患心脏病症风险增加的方法的试剂的用途，所述方法包括：
(a)通过使第一血浆样本与(i)特异性结合13+BIN1多肽的抗体和(ii)特异性结合17+BIN1多肽的抗体接触来确定获取自所述受试者的第一血浆样本的第一13+17+BIN1多肽水平；
(b)通过使第二血浆样本与(i)特异性结合13+BIN1多肽的抗体和(ii)特异性结合17+BIN1多肽的抗体接触来确定来自所述受试者的第二血浆样本的第二13+17+BIN1多肽水平；
(c)比较所述第一13+17+BIN1多肽水平与所述第二13+17+BIN1多肽水平，其中，与所述第一血浆样本相比，如果所述13+17+BIN1多肽水平在所述第二血浆样本中降低，表示所述受试者的心脏病症已经进展，或在所述受试者中患心脏病症的风险已经增加。
4.权利要求1-3中任一项的用途，其中，所述心脏病症是心律不齐、心肌病或充血性心力衰竭。
5.权利要求1-3中任一项的用途，其中，所述受试者是具有一种或多种与心脏病症相关的风险因素的个体。
6.权利要求1-3中任一项的用途，其中，所述特异性结合13+BIN1多肽的抗体特异性结合SEQ ID NO:2。
7.权利要求6的用途，其中：
(a)所述抗体是单克隆抗体或重组抗体；
(b)抗体重链的互补决定区(CDR)包含氨基酸序列SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ IDNO:7；和/或
(c)抗体轻链的互补决定区(CDR)包含氨基酸序列SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ IDNO:10。
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