CN107849608A - 一种筛选用于治疗阿尔茨海默病的药物和治疗靶点的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了利用遗传手段或相关抑制剂抑制下调PI4KIIIα蛋白、RBO/EFR3/EFR3A/EFR3B膜蛋白、TTC7蛋白、以及它们形成的膜蛋白复合体的数量或其相关的酶活性能够促进神经元细胞的Aβ(尤其是Aβ42)分泌并相应减少了神经元内的Aβ积累，从而可以减轻AD模型果蝇和小鼠的神经功能障碍。本发明因此揭示了神经元的Aβ42分泌在AD治疗中的重要作用，为治疗AD提供了全新的策略；同时，本发明也提供了治疗AD的新药物，并为进一步筛选治疗AD的药物和治疗靶点指明了新方向。
Description
关于资助研究的声明
本发明是在国家科技部973项目(2013CB530900)和国家自然基金委面上项目(81371400和81071026)资助下完成。
本发明属于医药领域，涉及利用相关抑制剂来下调PI4KIIIα激酶及其与RBO/EFR3/EFR3A/EFR3B蛋白和TTC7蛋白形成的膜蛋白复合体从而治疗阿尔茨海默病的方法；另一方面，本发明涉及根据是否促进细胞的Aβ分泌来筛选用于治疗阿尔茨海默病的药物及治疗靶点的方法。
阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是老年人中最常见的神经退行性疾病，以进行性学习记忆能力丧失为特征。突触功能异常和丢失在AD早期发生，被广泛认为是AD学习记忆障碍的一种主要细胞机制，Aβ(尤其是Aβ42)的积累在其中起着重要作用。然而，尽管对大量的旨在抑制Aβ产生和促进其清除的许多化合物或分子进行了临床试验，但还未发现一种化合物或分子可以改善学习记忆或阻止学习记忆障碍进一步恶化。一种可能的解释是这些药物或治疗方法没有改变导致AD学习记忆障碍的关键病理变化，对Aβ在AD中积累的各个方面的认识还待深入。
Aβ不仅在细胞外，也在神经元内积累。大量的证据提示Aβ在神经元的多种细胞内器官中积累，且参与了突触障碍、淀粉样斑块形成、神经元死亡等AD病理变化。另外，被认为对突触和认知功能最具破坏力的寡聚状Aβ在细胞内形成并在AD病人和APP转基因小鼠的大脑神经元内积累或细胞膜中积累。这些膜偶联的Aβ可能扎住在神经元的细胞膜或胞内的细胞器官膜上。导致积神经元Aβ积累的途径可能有多种，比如胞外Aβ内吞、胞内产生的Aβ分泌减少而滞留、自噬泡产生并积累Aβ、胞内Aβ清除下降。
尽管Aβ在细胞内外积累，但AD病人和处于AD早期的病人的脑脊液Aβ42浓度是减低的，约为对照人群的一半。在AD模型小鼠中，脑脊液和脑组织液的Aβ42浓度也呈月龄依赖性减低，脑组织液中也检测不到Aβ二聚体。人们推测脑脊液和脑组织液的Aβ42浓度减低可能是由于胞外淀粉样斑块摄取、Aβ42分泌减少、Aβ42在神经元或大脑细胞膜中积累所致。
已有研究结果揭示，磷脂通过与Aβ相互作用或通过多种细胞和分子过程参与AD病理变化，包括：1)Aβ42能插入脂质膜与酸性磷脂相结合，结合的酸性磷脂则促使Aβ42由无序向β折叠的构型转变，从而导致Aβ42在脂质膜上或膜内聚合；2)培养细胞的细胞膜上的4,5二磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol 4,5-phosphate，PIP2)水平与细胞分泌Aβ42的量呈负相关；3)Aβ42表达引起的果蝇神经元功能障碍和学习记忆障碍可通过抑制PI3K而被修复。
在果蝇中rolling blackout(rbo)基因编码一个与二酯酰甘油裂解酶具有一定同源性的膜蛋白RBO。RBO蛋白在果蝇的磷脂代谢、视觉细胞的光传导、突触传递和散装的内吞(bulk endocytosis)中起作用。RBO蛋白从酵母到人都保守。RBO在酵母中的同源蛋白(EFR3)和小鼠的两个同源蛋白(EFR3A和EFR3B)在细胞膜上与IIIα型磷脂酰肌醇4激酶(PI4KIIIα)和一个脚手架蛋白(在哺乳动物中称为
Tetratricopeptide repeat domain 7，TTC7，参见Baird D,Stefan C,et al.,2008,J Cell Biol；Nakatsu F,Baskin JF,et al.,2012,J Cell Biol)形成复合体，从而将PI4KIIIα锚泊在细胞膜上，并进一步调控细胞膜上4磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol 4-phosphate，PI4P)和PIP2的水平。
在果蝇中，泛神经元表达与分泌信号肽融合的Aβ42导致神经元内Aβ42积累和神经退行性改变。之前，发明人在成虫果蝇的一个简单神经通路，即巨纤维通路(giant fiber pathway，GF)中表达含有分泌信号肽的Aβ42，发现Aβ42在神经元内积累，并导致了日龄依赖(age-dependent)的突出传递失败和运动能力下降等障碍。这种表达Aβ42的果蝇为研究一些可能与AD相关的基因在神经元内Aβ42积累及其引起的突触障碍中的作用提供了很好的平台。有鉴于此，发明人利用该模型检测了基因rbo、PI4KIIIα及ttc7的突变或过量表达，以及常用的PI4KIIIα蛋白抑制剂对该模型中神经退行性病变的影响。发明人还在APP/PS1转基因小鼠中，研究了敲减rbo基因的一个小鼠同源基因Efr3a对海马神经元萎缩，以及利用常见的PI4KIIIα激酶的小分子抑制剂PAO灌胃对学习记忆、脑脊液中和大脑实质的细胞膜组分中Aβ42浓度的影响，以及下调PI4KA基因(编码PI4KIIIα蛋白)对学习记忆的影响，以及PI4KIIIα的产物PI4P对Aβ42在脂质体中形成聚合体的影响。
发明内容
本发明公开了利用遗传手段或相关抑制剂抑制下调PI4KIIIα蛋白、RBO/EFR3/EFR3A/EFR3B膜蛋白、TTC7蛋白、以及它们形成的膜蛋白复合体的数量或其相关的酶活性能够促进神经元细胞的Aβ(尤其是Aβ42)分泌并相应减少了神经元内的Aβ积累，从而可以减轻AD模型果蝇和小鼠的神经功能障碍。本发明因此揭示了神经元的Aβ42分泌在AD治疗中的重要作用，为治疗AD提供了全新的策略；同时，本发明也提供了治疗AD的新药物，并为进一步筛选治疗AD的药物和治疗靶
点指明了新方向。
一方面，本发明提供了一种筛选用于治疗阿尔茨海默病的药物以及治疗靶点的方法，所述方法包含筛选能提高细胞分泌Aβ水平的候选药物或治疗靶点。
根据本发明的一个具体实施例，所述筛选用于治疗阿尔茨海默病的药物以及治疗靶点的方法，包括以下步骤：1)将所述药物应用于过量表达APP或含分泌信号肽的Aβ的细胞系或果蝇组织或调节过量表达APP或含分泌信号肽的Aβ的细胞系或果蝇组织中的所述治疗靶点；以及2)利用免疫分析方法检测所述过量表达APP或含分泌信号肽的Aβ的细胞系或果蝇组织中细胞分泌Aβ的情况，其中，如果所述药物的应用或治疗靶点的调节能导致细胞分泌Aβ的量增加，则所述药物或治疗靶点可用于治疗阿尔茨海默病。优选地，所述的筛选用于治疗阿尔茨海默病的药物以及治疗靶点的方法中，所检测的Aβ为Aβ42；所述检测Aβ的分泌情况的免疫分析方法为酶联免疫吸附剂测定或电化学发光免疫分析方法；所述过量表达APP或含分泌信号肽的Aβ的细胞系为稳转人源APP或含分泌信号肽的Aβ的HEK293T、N2a或SH-SY5Y细胞系，或者所述过量表达APP或含分泌信号肽的Aβ的果蝇组织为果蝇三龄幼虫组织。
图1示出rbo基因突变缓解表达Aβarc的果蝇的神经功能损伤，减低PI4KIIIα蛋白的表达量或减弱了PI4KIIIα蛋白与RBO蛋白的相互作用。
图2示出下调PI4KIIIα蛋白表达量或药物抑制PI4KIIIα酶活性缓解表达Aβarc的果蝇的神经功能损伤。
图3示出下调RBO/PI4KIIIα蛋白表达量或功能降低神经元内Aβ的积累。
图4示出下调RBO/PI4KIIIα蛋白表达量或功能促进Aβ42的分泌。
图5示出在APP/PS1和对照小鼠中敲减Efr3a基因对海马CA3和DG区神经元的树突的直径和树突棘密度的影响。
图6示出PAO处理对APP/PS1小鼠和对照小鼠的学习和记忆能力以及脑脊液和大脑细胞膜偶联的Aβ42水平的影响。
图7示出rbo基因突变缓解表达Aβ42的果蝇的神经功能损伤。
图8示出rbo基因和shibire基因突变分别对过表达Aβarc或果蝇Tau蛋白的果蝇的运动能力和寿命的影响。
图9示出rboS358A基因和itprSV35基因突变对表达Aβarc果蝇的影响。
图10示出敲减Efr3a基因对N2a细胞内吞细胞外Aβ42的影响和rbo基因及PI4KA基因突变对Aβarc表达果蝇中Aβarc转录的影响。
图11示出在HEK293细胞或小鼠原代培养的海马神经元中敲减Efr3a基因或PI4KA基因的效率。
图12示在APP/PS1小鼠的一个拷贝PI4KA基因中插入转座子明显改善小鼠的学习和记忆能力。
图13示PI4P促进Aβ42在脂质体中形成寡聚体。
图14示PAO对APP表达量和α,β,γ分泌酶活性的影响。
图15示ttc7基因突变和过量表达对Aβarc果蝇的神经功能损伤的影响。
本发明中，包括说明书和权利要求书，除非特别说明，使用的下列术语具有如下的含义：
本发明所用的术语“rbo/Efr3/Efr3a/Efr3b基因”是指源自果蝇的rbo基因、源自酵母的Efr3、或源自哺乳动物Efr3a基因以及Efr3b基因；本发明所用术语“RBO/EFR3/EFR3A/EFR3B蛋白”是指源自果蝇的rbo基因、源自酵母的Efr3基因、或源自哺乳动物的Efr3a/Efr3b基因所编码的蛋白。
本发明所用的术语“PI4KIIIα/PI4KA基因”是指源自果蝇或哺乳动物的PI4KIIIα基因或PI4KA基因；本发明所用术语“PI4KIIIα蛋白”是指果蝇或哺乳动物中由PI4KIIIα/PI4KA基因所编码的蛋白。
本发明所用的术语“ttc7基因”是指源自哺乳动物的ttc7基因；本发明所用术语“TTC7蛋白”是指前述哺乳动物中由ttc7基因所编码的蛋白。
本发明所用的术语“抑制剂”是指能够起到降低、减少、或消除目标物的数量、特定功能、以及特定性质的物质。所述目标物可以为蛋白、多肽、核酸等，而所述抑制剂以所述目标物的数量、特定功能以及特定性质为直接或间接的作用对象，可以使得所述目标物的数量、特定功能以及特定性质产生相应的降低、减少或消除。所述抑制剂可以为蛋白、多肽、核酸、小分子化合物等。
例如，本发明所用的术语“PI4KIIIα抑制剂”是指能够降低、减少、消除PI4KIIIα/PI4KA基因的表达、转录、翻译，和/或其形成的PI4KIIIα蛋白的稳定性、与膜蛋白RBO\EFR3\EFR3A\EFR3B以及TTC7蛋白的结合能力、以及具有的磷酸激酶活性等各方面的各类物质，包括但不限于对PI4KIIIα/PI4KA基因特异的抑制性核苷酸、抗PI4KIIIα蛋白抗体、能够抑制PI4KIIIα激酶活性的小分子化合物，和/或能够抑制PI4KIIIα蛋白与其他膜蛋白相互作用的各种物质等。
类似地，本发明所用的术语“RBO/EFR3/EFR3A/EFR3B抑制剂”是指能够抑制、降低、消除rbo/Efr3/Efr3a/Efr3b基因的表达、转录、翻译、和/或其形成的RBO/EFR3/EFR3A/EFR3B蛋白的稳定性、其与PI4KIIIα蛋白的结合能力等各方面的各类物质，包括但不限于对rbo/Efr3/Efr3a/Efr3b基因特异的抑制性核苷酸、抗RBO/EFR3/EFR3A/EFR3B蛋白的抗体、以及能够抑制RBO/EFR3/EFR3A/EFR3B蛋白与PI4KIIIα蛋白形成复合体的各种物质。
本发明所用的术语“TTC7抑制剂”是指能够降低、减少、消除ttc7基因的表达、转录、翻译、和/或其形成的TTC7蛋白的稳定性、与膜蛋白RBO\EFR3\EFR3A\EFR3B的结合能力等各方面的各类物质，包括但不限于对ttc7基因特异的抑制性核苷酸、抗TTC7蛋白抗体、和/或能够抑制TTC7蛋白与膜蛋白RBO\EFR3\EFR3A\EFR3B相互作用的各种物质等。
同样，本发明所用术语“PI4P抑制剂”是指能够抑制、降低、消除细胞膜上PI4P数量水平的各类物质，包括但不限于抗PI4P抗体、以及能与PI4P特异结合的OSH2-PH2X融合蛋白或者OSH2-2x-PH融合蛋白等。
本发明所用的术语“抗体”，是指结合特定表位的任何免疫球蛋白或完整分子以及其片段。所述抗体包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体、以及完整抗体的片段和/或部分，只要这些片段或部分保留亲本抗体的抗原结合能力。例如，本发明中，“抗PI4KIIIα抗体”是指能特异性地结合PI4KIIIα蛋白，或其功能变体或功能片段的单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体和其具有免疫活性的片段或部分。本发明中，诸如“PI4KIIIα抗体”、“抗PI4KIIIα抗体”以及“针对PI4KIIIα的抗体”这样的术语均可以互换使用。
本发明中，“功能变体”是指本发明的蛋白或多肽，其氨基酸序列上一个或多个氨基酸发生了改变。所述改变可以是“保守性”改变(其中取代的氨基酸具有相似结构或化学特性)也可以是“非保守性”变化；类似的变化还可包括氨基酸缺失或插入或两者均有。但这些氨基酸残基的改变或氨基酸的缺失或插入，均不应实质性地改变或破坏原氨基酸序列的生物学或免疫学活性和功能。类似地，本发明中，“功能片段”是指本发明的蛋白或多肽的任何部分，所述部分保留其作为
一部分的蛋白或多肽(即“亲本”蛋白或多肽)的基本相似或相同的生物学或免疫学活性和功能。
本发明所用的术语“抑制性核苷酸”是指能够结合并抑制特定基因表达的核苷酸化合物。典型的抑制性核苷酸包括但不限于反义寡核苷酸(antisense oligonucleotides)、三链螺旋DNA(triple helix DNA)、RNA适配体(aptamers)、核酶(ribozymes)、短抑制核糖核苷酸(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)和microRNA。这些核苷酸化合物能以比对于其他核苷酸序列更大的亲和力与所述特定基因相结合，从而抑制特定基因的表达。
本发明所用术语“小分子化合物”是指一种分子量小于3千道尔顿的有机化合物，该有机化合物可以是天然的或者是化学合成的。本发明所用术语“衍生物”是指通过一种或多种化学反应对母体有机化合物进行修饰所产生的化合物，其与母体有机化合物具有相似的结构，在功能上具有相似的效果。本发明所用术语“类似物”则是指这样一类有机化合物，其并不一定是通过对母体有机化合物进行化学修饰而获得的，但其从结构上看与母体有机化合物相似，且在功能上也具有相似的效果。
本发明所用术语“阿尔茨海默病”(AD)是指一种以进行性学习记忆障碍为突出临床症状的老年性神经退行性疾病。大部分AD患者在中晚期有神经细胞外beta淀粉样斑块，细胞内有Tau蛋白组成的神经纤维缠结、或突触及神经细胞丢失。该疾病既可存在于人，也可存在于动物，比如狗。
本发明所用术语“Aβ”是指与由淀粉样前体蛋白(Amyloid Precursor Protein，APP)经分泌酶剪切而产生的一系列长度在38-48个氨基酸之间的多肽，主要是Aβ38、Aβ40、Aβ42、Aβ44和Aβ45等氨基酸序列相同的多肽。本发明中，利用特定的表达系统，Aβ也可以通过利用转基因
或病毒载体感染细胞等方法表达的Aβ融合蛋白经其它蛋白剪切酶剪切而来，比如Aβ的N端可以与来源于果蝇necrotic基因编码的蛋白的分泌信号肽(氨基酸序列：MASKVSILLLLTVHLLAAQTFAQDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA)(SEQ ID NO：1)或来源于大鼠Proenkephalin前体(pre-proenkephalin)的分泌信号肽(氨基酸序列：MAQFLRLCIWLLALGSCLLATVQA(SEQ ID NO：2))等组成的融合蛋白。
本发明所用术语“Aβ分泌”是指Aβ在细胞内或细胞膜产生后经由细胞膜排出到胞外的过程，该过程可导致细胞内的Aβ积累减少。其中，“Aβ42分泌”是专门指Aβ42在细胞内或细胞膜产生后经由细胞膜排出到胞外的过程，该过程可导致细胞内的Aβ42积累减少。
本发明所用术语“治疗靶点”是指可用于治疗某种疾病的各种物质及其在动物体或人体的作用目标。所述物质作用于所述作用目标可以起到治疗该种疾病的效果。所述物质可以为蛋白、多肽、核酸、小分子化合物等各类物质，所述作用目标可以是某个基因(包括基因的特定序列)、某个蛋白(包括蛋白的某个特定位点)、某种蛋白复合体(包括其特定的结合部位)等这样的物质实体，也可以是前述基因和/或蛋白的某种特性、某种功能、某种与周边物质、环境的相互关系等，只要所述物质能够影响该基因、蛋白、蛋白复合体，或其特定的特性、功能、相互关系等，从而能够起到治疗该疾病的作用。
本发明所用的术语“治疗”是指逆转、减轻或抑制该术语所应用的疾病的进展，或疾病的一种或多种症状。如本文所使用的，根据患者的状况，该术语也包括预防疾病，包括预防疾病或与其相关的任何症状的发作，以及减轻病症或其在发作前的任何病状的严重性。
本发明所用术语“抑制”、“削弱”、“下调”、“消除”等均是指数量或程度上的减少或减轻。这种减少或减轻并不限于任何幅度，
只要表现出这种趋势即可。例如，该种减少或减轻相对于原来的数量或程度可以是100％，也可以是50％，也可以是1％甚至更少。
本发明揭示了下调RBO/EFR3/EFR3A/EFR3B蛋白、TTC7蛋白或PI4KIIIα蛋白的表达、削弱RBO/EFR3/EFR3A/EFR3B蛋白、TTC7蛋白、与PI4KIIIα蛋白之间的相互作用、以及抑制PI4KIIIα的酶活性等一系列行为均可改善表达Aβ42的神经细胞随着年龄的增长而出现的突触功能减退和丢失等缺陷，并且公开了这些作用是通过促进神经细胞的Aβ(尤其是Aβ42)分泌，减少神经细胞膜或神经细胞内的Aβ(尤其是Aβ42)累积所致。
例如，本发明中，发明人发现敲减Efr3a基因可以减少APP/PS1双转基因小鼠的海马神经元树突和棘的萎缩，而用一种常用的PI4KIIIα蛋白抑制剂－氧化苯砷(Phenylarsine Oxide，PAO)进行灌胃则可以明显改善APP/PS1小鼠的学习和记忆能力，减少了脑组织细胞膜偶联的Aβ42尤其是聚合状Aβ42的含量，尽管该过程同时伴随有脑脊液中Aβ42含量增加。这些结果揭示，APP/PS 1小鼠的痴呆症状可以通过促进神经元的Aβ42分泌，减少神经元内或神经元细胞膜上Aβ42(特别是聚合状Aβ42)的累积而得到改善。
发明人发现，通过遗传方法适度下调细胞或神经元内RBO/EFR3/EFR3A/EFR3B蛋白、TTC7蛋白、以及PI4KIIIα蛋白的表达，或阻止它们形成蛋白复合物以减少PI4KIIIα蛋白的膜上分布，或抑制PI4KIIIα蛋白的磷酸激酶活性，均能起到促进细胞或神经元的Aβ42分泌，减少神经元内Aβ42积累，缓解AD相关的神经退行性改变以及功能障碍的作用，但同时，无论是Aβ42或APP的表达量，还是剪切APP的α、β和γ分泌酶的活性，均未受到明显影响。发明人另外还发现，PI4KIIIα蛋白的产物PI4P在脂质体中促进Aβ42单体聚合形成多聚体，且该促进作用比PI4P的前体(PI)和其衍生物PI4,5P的促进作用要强很多。
发明人认为，Aβ(包括Aβ42)产自于细胞质膜上或细胞内器官，而产生的Aβ可能通过被动释放、胞吐、溶酶体介导的释放、或其它还未被发现的途径被分泌出细胞。但是，不管Aβ产自于哪儿，如何被分泌，细胞质膜应是Aβ离开细胞必须经过的最后通路。由于Aβ的疏水性，在细胞质膜上，Aβ一方面插入疏水的脂肪酸链区，另一方面又与磷脂酰肌醇(尤其是磷酸化磷脂酰肌醇中的PI4P)和其他酸性磷脂相互作用，这种作用促使Aβ从无序构型向β折叠构型转变，进而聚集形成Aβ聚合体沉积于膜上或随后被内吞而在细胞内积累。此外，研究表明，可溶Aβ(包括Aβ42)聚合体与细胞膜或脂质体膜的亲和力要比Aβ单体强许多。因此，形成聚合体的Aβ将更容易累积在细胞膜上。
PI4P是细胞膜上磷酸化磷脂酰肌醇的主要组成成分之一，其对Aβ聚合体形成的促进作用比PI和PI4,5P的作用要强。本发明中，发明人发现，PI4P对处于脂质中的Aβ42形成聚合体的促进作用呈现明显的剂量依赖性。下调RBO/EFR3/EFR3A/EFR3B蛋白、TTC7蛋白或PI4KIIIα蛋白的表达，抑制它们之间形成复合物，或者抑制PI4KIIIα蛋白的激酶功能，均将减少细胞膜上PI4P的生成量。因此，下调RBO/EFR3/EFR3A/EFR3B蛋白、TTC7蛋白和/或PI4KIIIα蛋白的表达，或阻止RBO/EFR3/EFR3A/EFR3B蛋白、TTC7蛋白和PI4KIIIα蛋白形成附着在膜上的蛋白复合体，或抑制PI4KIIIα蛋白相应的磷酸激酶功能，均将实质性地降低细胞质膜上磷酸化磷脂酰肌醇(尤其是PI4P)的含量，从而削弱细胞质膜上Aβ(包括Aβ42)与磷酸化磷脂酰肌醇的相互作用，从而导致细胞质膜上的Aβ更多地以无序的Aβ单体形式存在。如前所述，这种无序形式的Aβ单体和膜的亲和力低，很容易被从膜上释放出来而分泌到细胞外。因此，上述调节行为能在APP表达量和α、β和γ分泌酶活性无明显变化的情况下，有效地减低胞内Aβ的积累，并导致胞外Aβ水平明显增多。
已有研究报导发现，果蝇细胞内Aβ42的累积可激活PI3K和与之相
关的PI3K/Akt信号通路，从而诱发AD相关的突触功能损害和长期记忆缺失；相应地，相关研究认为抑制PI3K的活性也可以作为治疗AD的手段。但本发明中，发明人认为细胞中Aβ42的累积并不是因磷脂酰肌醇激酶(包括PI3K)激活其所相关联的PI3K/Akt信号通路所造成的，而更直接地是因细胞质膜上磷脂酰肌醇激酶被激活后磷酸化膜上的磷脂酰肌醇所导致的结果；此外，本发明所涉及的磷脂酰肌醇激酶主要为PI4K，而并非涉及PI3K/Akt信号通路的PI3K。例如，发明人发现，采用针对PI4K具有较高特异性但对PI3K不敏感的磷脂酰肌醇激酶抑制剂，例如PAO，在较低浓度下即可以有效地促进细胞的Aβ42分泌。
因此，本发明揭示，为了实现治疗AD的目的，可以采用促进Aβ分泌，尤其是促进Aβ42分泌的方式，以减少Aβ(包括Aβ42)在神经细胞内或细胞膜上的累积。但是，增加的Aβ分泌，不能是可归因于上调了APP的表达量，或是改变了α、β和γ分泌酶的活性而导致的Aβ的产生量增多。
本领域普通技术人员了解，促进神经细胞的Aβ分泌可以采用很多种形式，包括削弱Aβ与细胞膜上糖、脂和蛋白的结合或相互作用等。本发明中，优选为如前所述通过减少Aβ(尤其是Aβ42)在细胞膜上形成聚合体的方法来促进细胞的Aβ分泌。
此外，本发明还揭示，由于调节RBO/EFR3/EFR3A/EFR3B蛋白、TTC7蛋白与PI4KIIIα蛋白的数量和它们形成复合物的能力，以及调节PI4KIIIα蛋白的磷酸激酶活性，均可减少Aβ在细胞膜上形成的聚合体，从而促进细胞的Aβ(尤其是Aβ42)分泌，因此这些蛋白以及这些蛋白的相互关系均能构成对AD治疗的潜在治疗靶点。
据此，本领域普通技术人员可以了解，能够抑制、降低、减弱、或者消除rbo/Efr3/Efr3a/Efr3b基因的表达、转录或翻译以及降低其编码的RBO/EFR3/EFR3A/EFR3B蛋白的稳定性的抑制剂和方法，以及能
够阻止它和磷酸肌醇激酶PI4KIIIα蛋白以及TTC7蛋白形成蛋白复合物的抑制剂和方法，均可用于治疗AD。所述RBO/EFR3/EFR3A/EFR3B抑制剂包括但不限于rbo/Efr3/Efr3a/Efr3b基因的抑制性核苷酸(包括反义RNA、siRNA或miRNA等)，以及抗RBO/EFR3/EFR3A/EFR3B蛋白的抗体等。
本领域技术人员了解，rbo/Efr3/Efr3a/Efr3b基因的抑制性核苷酸及其制备方法已经公开(例如，可参见www.genecards.org，以及已有的产品：ORIGENE，Cat.#SR308056和Cat.#TR303768)。类似地，抗RBO/EFR3/EFR3A/EFR3B抗体的制备方法也已经公开(例如，可参考www.genecards.org，以及已有的产品：Novus，Cat.#NBP1-81539；Thermo Fisher Scientific Cat.#PA5-24904)。
此外，如前所述，调节PI4KIIIα/PI4KA基因在细胞上的表达、转录、翻译，调节PI4KIIIα/PI4KA基因编码的PI4KIIIα蛋白的稳定性，调节该蛋白和膜蛋白RBO/EFR3/EFR3A/EFR3B以及TTC7蛋白形成蛋白复合体的能力，以及调节该磷酸激酶的酶活性，也均可作为AD治疗的手段。本领域普通技术人员因此应该知道，能够抑制、降低、减弱、消除PI4KIIIα/PI4KA基因的表达、转录、翻译，或其编码的PI4KIIIα蛋白的稳定性和其生物活性的抑制剂和方法，包括但不限于对PI4KIIIα/PI4KA基因特异的抑制性核苷酸，抗PI4KIIIα蛋白的抗体能够抑制PI4KIIIα蛋白与膜蛋白形成膜蛋白复合体，以及能够抑制激酶活性的小分子化合物抑制剂等，均可用于治疗AD。优选地，该抑制剂为小分子化合物，例如，PAO(氧化苯砷或Phenylarsine Oxide)，PAO的衍生物，A1，G1，或A1以及G1的类似物。更优选地，该抑制剂可以为PAO或其衍生物。
本领域技术人员了解，PAO是一种以氧化砷基与苯环为基本结构
的小分子化合物，其对PI4KIIIα蛋白的磷酸激酶活性具有很强的抑制作用。PAO的化学式结构为：
苯基氧化砷(氧化苯砷)(oxo(phenyl)arsane)
PAO的制备方法为本领域技术人员所熟知。根据本发明，可以用于治疗AD的还包括PAO的各种衍生物，只要这些衍生物具有抑制PI4KIIIα蛋白的磷酸激酶活性的作用。本领域技术人员了解，该类衍生物的制备方法均已公开。
同样，本领域技术人员了解，A1和G1均为PI4KIIIα蛋白的小分子化合物抑制剂，具有较类似的结构。其中，A1的化合结构式为：
5-(2-氨基-1-(4-(4-吗啉基)苯基)-1H-苯并咪唑-6-基)-N-(2-氟代苯基)-2-甲氧基-3-吡啶磺酰胺
G1的化学结构式为：
(aS)-5-(2-氨基-4-氧代-3-(2-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢喹唑啉-6-基)-N-(2,4-二氟代苯基)-2-甲氧基吡啶-3-磺酰胺
A1和G1的制备方法均已公开(例如，可参见Bojjireddy,N.,et al.(2014),JBC 289:6120-6132和Leivers,A.L.,et al.(2014),JMC 57:2091-2106)。根据本发明，A1和G1的结构类似物，只要它们具备抑制PI4KIIIα蛋白的磷酸激酶活性的功能，也同样可以用于治疗AD。本领域技术人员了解，该类结构类似物的制备方法也均已公开。
此外，PI4KIIIα蛋白与RBO/EFR3/EFR3A/EFR3B蛋白结合形成膜蛋白复合体需要相应的脚手架蛋白TTC7的协助。因此，根据本发明，本领域普通技术人员可以了解，能够抑制、降低、减弱、或者消除ttc7基因的表达、转录或翻译以及降低其编码的TTC7蛋白的稳定性的抑制剂和方法，以及能够阻止它和RBO/EFR3/EFR3A/EFR3B蛋白以及PI4KIIIα蛋白形成蛋白复合物的抑制剂和方法，均可用于治疗AD。所述TTC7抑制剂包括但不限于ttc7基因的抑制性核苷酸(包括反义RNA、siRNA或miRNA等)，以及抗TTC7蛋白的抗体等。
再者，根据本发明，下调RBO/EFR3/EFR3A/EFR3B蛋白和PI4KIIIα蛋白的表达，或阻止它们形成复合物以减少PI4KIIIα蛋白的膜上分布，或抑制PI4KIIIα蛋白的磷酸激酶活性，实质上均导致的是细胞膜上PI4P减少，进而促进细胞的Aβ分泌。因此，本领域普通技术人员了解，任何时候能减少细胞膜上PI4P数量水平的抑制剂或方法，进而可以减少Aβ在细胞膜上形成多聚体，也均能起到前述治疗AD的作用。
本领域技术人员了解，前述PI4P抑制剂可以是能与PI4P特异结合的抗体或其它分子。目前抗PI4P抗体的制备方法已经公开(参见Brown BK and Karasavass N,et al.,2007,J virol；Wassef NM and Roerdink F,et al.1984,Mol Immuol)。例如，可以是人源的广谱中和抗体4E10和其它抗PI4P抗体。目前与PI4P特异结合的分子的制备方法也已经公开(Balla A
and Kim YJ,et al.,2008,Mol Biol Cell；Zubenko GS and Stiffler et al.,1999,Biol Psychiary)。例如，可以是OSH2-PH2X融合蛋白或者OSH2-2x-PH融合蛋白。
本发明所提供的上述各种可以用于治疗AD或具有治疗AD的潜力物质(笼统称为“本发明物质”)，包括但不限于抗RBO/EFR3/EFR3A/EFR3B抗体、抗PI4KIIIα抗体、抗TTC7抗体，抗PI4P抗体、对rbo/Efr3/Efr3a/Efr3b基因特异的抑制性核苷酸、对PI4KIIIα/PI4KA基因特异的抑制性核苷酸、以及对PI4KIIIα蛋白的磷酸激酶作用有抑制作用的小分子化合物等，均可以是分离的、纯化的、合成的、和/或重组的。
此外，本发明物质还可以配制成组合物，诸如药物组合物。在这一点上，本发明提供包括前面所述任意抗体、抑制性核苷酸、或/和小分子化合物等抑制剂，以及相应的药用载体的药物组合物。
包含任意本发明物质的药物组合物可以包括多于一种本发明物质，例如：抗体和小分子化合物、抑制性核苷酸和抗体，或两种或更多不同的抗体或者小分子化合物等。备选地，所述药物组合物还可以包括与另一种或多种具有药物活性的试剂或药物的组合。例如，可以包括抗Aβ的抗体药物，如Bapineuzumab，或者是可以与大脑内神经细胞外的Aβ或β淀粉样斑块结合，阻滞Aβ聚合或促进聚合状的Aβ解聚的化合物，比如海洋硫酸寡糖类HSH971及其类似物、阿坎酸(tramiprosate)及其类似物、依达拉奉(Edaravone)及其类似物等。这样，该药物组合物一方面促进Aβ从神经元内分泌出来，一方面促进神经元外的Aβ清除，从而可达到更好的治疗AD的效果。
另一方面，本发明同时还揭示了一种新的用于筛选治疗AD的药物或治疗靶点的方法。该方法的设计基于前述本发明的新发现，也即采用促进Aβ42分泌的方式可以减少胞内的Aβ42的累积，从而可以减缓和
防止AD相关的神经退化和功能障碍。因此，筛选候选药物或治疗靶点的标准是应用该药物或调节该治疗靶点后能够达到促进细胞的Aβ分泌的效果，尤其是Aβ42的分泌，且增加的Aβ分泌不能归因于是因为上调了APP的表达量，或者改变了α、β或γ分泌酶的活性而导致的Aβ的产生增多。
根据本发明，所述治疗靶点的调节是指利用相关物质对该治疗靶点进行直接或间接的作用，从而导致该治疗靶点的功能、性质或与周围环境的相关关系发生改变，因而能够产生或引发产生相应的促进细胞的Aβ分泌的效果，尤其是Aβ42的分泌。
普通技术人员可以了解，为了选出有效的治疗阿尔茨海默病的药物，可以用于筛选试验的细胞系可为哺乳动物、昆虫等的真核细胞系，比如：HEK293、COS7、N2a、SH-SY5Y、S2和sf9等。所述方法包括检测候选药物是否能减少细胞膜或细胞内的Aβ积累，尤其是Aβ42的积累，从而选出有效的治疗阿尔兹海茨海默病的药物。优选地，所述Aβ42分泌是否增加的检测实验可利用过量表达APP的细胞系(如稳转人源APP的HEK293、COS7、N2a、SH-SY5Y细胞系)来进行，或者利用果蝇模型进行，优选是果蝇三龄幼虫组织。所述Aβ42分泌是否增加可以采用免疫分析方法来检测，包括酶联免疫吸附剂测定方法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)或电化学发光免疫分析(Electrochemiluminescence，ECLIA)方法。
优选地，所述用于筛选治疗AD的药物或调节靶点的方法可以包括首先观察候选药物或调节靶点的应用对PI4KIIIα酶活性的影响，若候选药物或调节靶点的应用能够使检测系统中PI4KIIIα激酶的作用效果发生负向改变，即表征PI4KIIIα酶活性减弱或细胞膜上PI4P水平下降，则表明该候选药物、试剂或靶点是治疗AD的潜在药物或调节靶点。通过这样的筛选，再检测其是否对细胞内Aβ(尤其是Aβ42)积累造成减少，是否促进Aβ向胞外的分泌。采用这样的方法，可以大大提高候
选对象的筛选效率。
根据本发明的一个具体实施例，所述筛选用于治疗AD的药物或治疗靶点的方法可以通过直接检测候选药物的应用或治疗靶点的调节是否能使原来定位在细胞膜的PI4KIIIα蛋白向胞浆分布，从而减少PI4KIIIα蛋白在细胞膜上的量，导致减少细胞膜上的Aβ单体向聚合体的转变并增加向胞外的分泌来判断。优选地，可以选择观察细胞膜上利用荧光标记的PI4KIIIα，比如荧光蛋白标记的PI4KIIIα(GFP-PI4KIIIα)，观察该荧光标记的PI4KIIIα是否从细胞膜上向胞浆转移。
根据本发明的一个具体实施例，所述筛选用于治疗AD的药物或治疗靶点的方法还可以利用包括免疫共沉淀等检测蛋白与蛋白相互作用的方法来进行。如候选药物的应用或者治疗靶点的调节能够使RBO/EFR3/EFR3A/EFR3B蛋白与TTC7蛋白以及PI4KIIIα蛋白相互作用减弱，即表征该药物或靶点能够削弱PI4KIIIα蛋白形成膜蛋复合体白的能力，从而减少细胞膜上的Aβ单体向聚合体转变，增加向胞外的分泌。
根据本发明的一个具体实施例，所述筛选用于治疗AD的药物或治疗靶点的方法还可以通过直接检测候选药物的应用或者治疗靶点的调节是否能够使细胞膜的PI4P水平下降来实现。优选地，可以利用荧光显微镜、共聚焦或双光子显微镜观察细胞膜上荧光标记的特异结合PI4P的分子，比如荧光蛋白标记的OSH2-PH2X或者OSH2-2x-PH融蛋白，在细胞膜上的量是否减少，或是否从细胞膜上向胞浆转移来判断。
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
以下数据主要是通过动物和细胞培养实验获得的，选择SPSS软件
分析。如其他地方未特别标明，数据采用mean±sem表示。P＜0.05为差异有统计学意义。这里和以下显示的所有数据均以mean±sem表示，“*”，“**”和“***”分别表示p<0.05，0.01和0.001。
实施例1：果蝇品系与遗传学方法
标准培养基，在12小时光照12小时黑暗交替循环，恒温25℃条件下培养。
本发明采用了下列转基因果蝇品系：rboS358A、[UAS]Aβarc、[UAS]Aβ42、[UAS]dtau、[UAS]mCD8-gfp(由Dr.Z.Wang提供)、[UAS]shibirets1(由Dr.A Guo提供)、[Gal4]A307(由Dr.O’Kane提供)。其中，rboS358A基因是用含有rbo基因的野生型基因组DNA经定点突变后构建的转基因，其表达由rbo基因本身的前驱动子驱动。[Gal4]A307表达转录因子Gal4，用于驱动[UAS]Aβarc、[UAS]Aβ42、[UAS]dtau、[UAS]mCD8-gfp、[UAS]shibirets1转基因在果蝇的巨纤维通路(Giant Fiber system)神经元和少量其它神经元表达Aβarc、Aβ42、dTau、mCD8-GFP或温度敏感型突变的Dynamin。采用的果蝇突变体有：rbots1(温度敏感的错义突变)、rbo2(敲除突变)、itprsv35(无义突变，Bloomington Stock # 30740)、PI4KIIIαdef(缺失了PI4KIIIα基因及其附近DNA的突变，Bloomington Stock # 9518)、PI4KIIIαGS27和PI4KIIIαGJ86(均为无义突变)。P{lacW}l(2)k14710k15603转座子插在(l(2)k14710基因的第一个外显子中，阻止(l(2)k14710基因的转录，Bloomington Stock # 11134)；P{EPgy2}bin3EY09582(Bloomington Stock # 20043)。为了纯化基因背景，所有的转基因和突变体果蝇在使用前均分别与一个野生的等基因品系(isogenic w1118，Bloomington stock #5 905)回交5代以上。
发明人之前的研究发现在GF通路中表达野生型或北极突变型(arctic mutant)Aβ42的果蝇(Aβ42或Aβarc果蝇)呈现神经元内Aβ42积累、日龄依赖性突触传递失败、寿命缩短。这些果蝇还表现出日龄
依赖的爬行能力下降。为了研究rbo基因在神经元内Aβ42积累引起的神经障碍中的作用，将rbo基因的两个突变―错义突变(rbots1)和敲除突变(rbo2)―分别引入了Aβarc果蝇中，并分别检测了它们对突触传递、爬行能力、寿命的影响。为了这些测试，共构建了4组果蝇，它们分别是对照果蝇(control)、rbots1/+或rbo2/+杂合体果蝇(rbo)、Aβarc果蝇和含有rbots1/+或rbo2/+杂合突变的Aβarc果蝇(Aβarc-rbo)。每组果蝇含有1-2个品系，其中，“ctrl”是指带有[Gal4]A307转基因的野生型对照组果蝇；“rbots1/+”and“rbo2/+”是指带有一个拷贝[Gal4]A307转基因的rbots1/+和rbo2/+杂合子果蝇；“Aβarc”是指带有([Gal4]A307/[UAS]Aβarc双转基因的果蝇；“Aβarc-rbots1/+”和“Aβarc-rbo2/+”是分别指[Gal4]A307-rbots1/[UAS]Aβarc和[Gal4]A307-rbo2/[UAS]Aβarc。前两组果蝇不表达Aβarc，被归类为“non-Aβ flies”，而后两组果蝇是表达Aβarc的，被归类为“Aβ flies”。
实施例2：通过突触传递检测rbo基因突变特异性地抑制Aβ42表达果蝇的神经障碍
突触传递的检测方法：
逃跑通路中记录细胞内的兴奋性突触后电位(excitatory junction potential,EJP)方法。利用低熔点蜡tackiwax(Boekel Scientific)将特定日龄的成年雌果蝇在解剖镜下固定在载玻片上，腹部向下。记录系统包括腹部一根参考电极，插入眼中的两根刺激电极和插入背部纵向肌肉细胞内的一根记录电极。双眼给予电刺激(100Hz,50pulses)。刺激强度5-20Volts，持续时间0.2ms，约为阈值刺激强度的150％。电信号通过Axonal clamp 900A(Molecular Devices)记录并放大，在频率10kHz下通过Digidata 1440A(Molecular Devices)数字化。数据经由pClamp软件(version 10.0；Molecular Devices)记录并分析。电极均为玻璃电极，其中灌注3.0摩尔浓度的氯化钾溶液。记录的环境温度为25℃。
在图1中，4组果蝇在不同日龄阶段的脑刺激诱发的EJP的代表性
记录(参见图1(a))，以及诱导EJPs的成功率的定量分析(参见图1(b))。特别值得注意的是，rbo突变明显抑制了由Aβarc引起的日龄依赖的神经突触传递失败。对于第3-7、15-17和25-27天的数据，n＝6～12，对于31-35天的数据，n＝10-23，统计学检验使用的是单因素方差(one-way ANOVA)分析。
根据上述突触传递的检测方法，在果蝇大脑给予高频电刺激(100Hz，50个脉冲)，在背部纵向肌纤维细胞内记录兴奋性神经肌肉接头的终板电位(EJP)。当果蝇处于羽化后3-7th、15-17th、25-27th和31-35th日龄时我们进行了EJP记录。于3-7th和15-17th日龄时，高频电刺激在Aβarc-rbo果蝇中的EJP诱发成功率与在其它三组果蝇中的无显著差异(图1a和b)。于25-27th和31-35th日龄时，Aβarc-rbo果蝇中的EJP诱发成功率比对照果蝇和rbo果蝇的要低，但比Aβarc果蝇中的显著增高(图1a和b)。
这些结果显示rbo基因突变缓解了神经元内Aβarc积累引起的日龄依赖性突触传递失败。这种缓解作用不可能是基因背景差异所致，因为通过与一个野生的等基因系(isogenic w1118)回交5代以上，用于建立上述4组果蝇的转基因果蝇和rbo突变体果蝇的基因背景早已基本被纯化。由于完全敲除rbo基因导致胚胎致死，所以无法研究完全敲除rbo基因对Aβarc引起突触传递障碍的影响。
实施例3：通过爬管试验检测rbo基因突变特异性地抑制Aβ42表达果蝇的神经障碍
爬管试验：
爬管能力的研究是通过测量10只果蝇从直立的透明塑料管底部向上爬行7秒后的高度的平均值。为此，开发了一套重复性高的果蝇爬管能力测试装置。该装置包括：1)一个长方形的金属框架(宽32cm，
高21cm)，框架中垂直固定10根透明塑料管(内径2.1cm，高19.0cm)；2)一台电动马达，用来驱动金属框架在垂直方向上移动；3)一台步进驱动器，用来把电动马达的工作节奏控制在每隔1分钟使金属框架连续快速上下移动各4次，每次上下移动预定的高度；4)一台录像机，用来记录爬管过程；5)一套分析软件，用来分析录像中特定时刻果蝇的爬管位置。实验时，每根透明塑料管中放置10只特定基因型的果蝇，塑料管均匀分布并固定于金属盒中。金属盒可以沿着垂直固定在基座上的两根金属杆上下滑动。在爬管实验中，步进驱动器控制电机运转，电机将金属盒提升5.8cm然后释放，金属盒依重力下落到原位置。当金属盒停止运动时，果蝇由于惯性掉落到管底部。在金属盒3秒内被抬升下落4次后，所有果蝇都位于管底部。随后，果蝇沿管壁向上爬行。整个过程被录像以进行后续分析。发明人编写了一个电脑程序，用于测量每只果蝇在开始爬管后任何时间点的所在高度。
在图1(c)中，rbo基因突变改善了日龄依赖的表达Aβarc的果蝇的爬管能力，n＝3(3组果蝇，每组10只)，单因素方差(one-way ANOVA)分析。
在果蝇羽化后第3天、第16天、第26天和第31天测试果蝇的爬管能力。在第3天和第16天，四组果蝇的爬管能力在都相似(图1c)。在第26天和31天，Aβarc-rbo果蝇比Aβarc果蝇明显爬得快，但是并不像对照组和rbo果蝇那么快(图1c)。
实施例4：通过寿命分析rbo基因突变特异性地抑制Aβ42表达果蝇的神经障碍
寿命分析：
每种基因型100或200只果蝇，平均分配到5或10个含标准果蝇食物和干酵母的管中，在25℃下培养。每3天将果蝇换到含新食物和干酵母的管中，并记录死亡果蝇数目。最终用SPSS 11 Kaplan-Meier
软件统计存活率。
在图1(d)中，rbo基因突变延长了表达Aβarc的果蝇的寿命。每组果蝇均是n＝200，P<0.001，采用Log Rank检验。
在图7中，3组果蝇在不同日龄阶段的脑刺激诱发的EJP的代表性记录(参见图7(a))，以及诱导EJP成功率的定量分析(参见图7(b))，“ctrl”是指带有[Gal4]A307转基因的野生型对照组果蝇；“Aβ42”是指带有([Gal4]A307和[UAS]Aβ42双转基因的果蝇；“Aβ42-rbots1/+”和“Aβ42-rbo2/+”是指[Gal4]A307-rbots1/[UAS]Aβ42和[Gal4]A307-rbo2/[UAS]Aβ42。值得注意的是，rbo突变明显抑制了由Aβ42引起的日龄依赖的神经突触传递失败。对于第3-5天的数据，n＝6～12，对于37-39天的数据，n＝10-12，单因素方差(one-way ANOVA)分析。
在图7(c)中，rbo基因突变改善了表达Aβ42的果蝇的日龄依赖的爬管能力，n＝3，单因素方差(one-way ANOVA)分析。
在图7(d)中，rbo基因突变延长了表达Aβ42的果蝇的寿命。每组果蝇均是n＝200，P<0.001，采用Log Rank检验。
寿命研究显示Aβarc-rbo果蝇的寿命也比Aβarc果蝇的长，虽然比对照组和rbo果蝇的短(图1d)；在比较四组果蝇的寿命平均值时也可以得出相同的结论(表1)。这些结果与上述研究突触传递时的发现一致。对rbo基因突变对表达野生型Aβ42的果蝇的突触传递、爬管能力和寿命长度的影响做出进一步的研究，发现了更好的改善(图7a－d)。
表1.果蝇寿命均值及其比较
在图8(a)中，rbo基因突变对在果蝇巨纤维通路过表达果蝇Tau蛋白引起的运动障碍(左侧)和过早死亡的影响。在图8(b)中，shibire基因突变对在果蝇巨纤维通路过表达Aβarc引起的运动障碍(左侧)和过早死亡的影响。寿命分析实验中，每组果蝇均是n＝100，采用Log Rank检验。
rbo基因突变对抗Aβ42的毒性作用不能归因于一种对神经元内毒性蛋白积累的普遍效应，因为rbo基因突变不能改善过表达Tau蛋白的果蝇的寿命缩短(图8a)。rbo基因突变对抗Aβ42的毒性作用也不能归因于一种可能基于突触功能或者细胞内吞功能下调的普遍效应，因为向Aβarc果蝇中导入shibire基因突变(shibirets1)不能缓解Aβarc果蝇过早死亡的现象(图8b)。与rbots1基因突变相同，shibirets1基因突变也引起温度依赖的突触传递、散装的胞吞作用以及运动功能改变。
通过实施例1-4，结果显示rbo基因突变或不足可以特异性地改善表达野生型和突变体Aβ42果蝇的神经退行性病变。
实施例5：通过免疫共沉淀检测缺乏或抑制与RBO蛋白相互作用的PI4KIIIα酶减轻Aβarc果蝇的神经损伤
免疫共沉淀和免疫印迹：
收集300个果蝇头，在预冷的500μl Tris缓冲液中碾磨均匀。Tris缓冲液配方如下：50mM Tris,50mM KCl,1mM EDTA,1％ cocktail protease inhibitor(Calbiochem)，调PH至7.4。将组织匀浆10000g离心10分钟，取上清，使用约1μg的小鼠源抗果蝇RBO单克隆抗体或者兔源抗果蝇PI4KIIIα的多克隆抗体进行免疫共沉淀和免疫印迹实验。上述两种抗体分别与上海Abmart和中国Abgent合作构建。构建RBO抗体采用的多肽是果蝇C亚型RBO蛋白的251th-500th氨基酸，构建抗果蝇PI4KIIIα的多肽是NH2-KRSNRSKRLQYQKDSYC-CONH2(SEQ ID NO：3)。免疫印迹实验时，抗果蝇RBO和PI4KIIIα抗体的稀释比例都是1:2000。利用野生型和相应的纯合突变体的头部组织匀浆分别验证了抗果蝇RBO和PI4KIIIα抗体。
在图9(a)中，rboS358A基因不改善表达Aβarc果蝇的寿命(P＝0.07)。
尽管RBO是一种推定(putative)的二酯酰甘油(diacylglycerol,DAG)裂解酶，并且有报道说DAG裂解酶活性在AD病人和动物模型中的海马区有上调。但是，RBO蛋白不太可能以DAG裂解酶的作用方式调节Aβarc的毒性，因为在Aβarc果蝇中导入rboS358A转基因不能缓解Aβarc果蝇过早死亡的现象(图9a)。在rboS358A基因编码的RBO蛋白中，一个推定的酶活性中心被突变了。
在图1(e)中，显示RBO蛋白与PI4KIIIα蛋白相互共免疫沉淀的代表性免疫印迹图，n>3。
在图1(f)中，代表性免疫印迹图(左侧)和半定量分析(右侧)显示RBO蛋白与PI4KIIIα蛋白在野生型对照果蝇和rbo基因突变的杂合子果蝇中的表达量，n＝7，单因素方差分析。
在图1(g)中，代表性免疫印迹图(左侧)和半定量分析(右侧)显示PI4KIIIα分别与野生型(wtRBO)和突变型(mRBO)RBO蛋白的
免疫共沉淀，n＝4，T检验。
在图1(h)中，RT-PCR定量分析PI4KIIIα信使RNA在Aβarc、Aβarc-rbots1/+、Aβarc-rbo2/+果蝇中的表达水平，n＝5-6，单因素方差分析。
RBO蛋白在酵母细胞和小鼠中的同源蛋白与PI4KIIIα蛋白结合，并且在细胞膜上形成一种复合体。与此一致的是，RBO蛋白会特异性地和果蝇PI4KIIIα蛋白发生免疫共沉淀(图1e)。此外，在Aβarc-rbo果蝇中除去一个拷贝的rbo基因(rbo2/+)，可以显著地降低RBO蛋白和PI4KIIIα蛋白的表达水平(图1f)，而rbots1/+基因突变并没有减少RBO蛋白和PI4KIIIα蛋白的表达量，但是显著地削弱了RBO蛋白与PI4KIIIα蛋白之间的相互作用(图1g)。值得注意的是，两种rbo基因突变并没有改变PI4KIIIα基因的转录(图1h)。
为了测试PI4KIIIα酶在Aβarc果蝇的神经损伤中是否起着与RBO蛋白相同的作用，向表达Aβarc的果蝇中分别引入一种染色体缺失(一条染色体上缺失了包含PI4KIIIα基因的DNA片段，pi4kdef/+)和一种PI4KIIIα的无意义突变(PI4KIIIαGS27/+)。
在图2中，表达Aβarc的果蝇的突触传递和运动障碍及过早死亡均被杂合的PI4KIIIα基因缺失(PI4KIIIαdef/+)(参见图2(a))和无义(PI4KIIIαGS27/+)(参见图2(b))突变缓解，也被PAO缓解(图2(c)-(e))。“ctrl”是指带有[Gal4]A307转基因的野生型对照组果蝇；“PI4KIIIαdef/+”和“PI4KIIIαGS27/+”是指带有一个拷贝[Gal4]A307转基因的PI4KIIIαdef/+和PI4KIIIαGS27/+杂合子果蝇；“Aβarc”是指带有([Gal4]A307/[UAS]Aβarc双转基因的果蝇；“Aβarc-PI4KIIIαdef/+”和“Aβarc-PI4KIIIαGS27/+”是指PI4KIIIαdef/+；[Gal4]A307/[UAS]Aβarc和PI4KIIIαGS27/+；[Gal4]A307-rbo2/[UAS]Aβarc。对于每组EJP记录数据，n＝6～10；每个爬管实验数据，n＝3～5；每个果蝇品系的寿命数据，n＝100～200，P值均小于0.001。统计数检验方法如上所述。
事实上，实验结果表明这些PI4KIIIα的基因突变均抑制了Aβarc在突触传递、运动功能以及寿命上的引起的改变(图2(a)-(b))。与此结果一致的是，喂给Aβarc果蝇一种PI4KIIIα的抑制剂PAO，同样显著地减轻了这些改变，并呈现一种与药剂量相关的效应(图2(c)-(e))。
在图9(b)中，itprSV35基因突变不改善表达Aβarc果蝇的突触传递和寿命(P＝0.13)。寿命分析实验中，每组果蝇均是n＝100，采用Log Rank检验；EJP诱发成功率实验中，n＝5。
然而，下调RBO/PI4KIIIα所带来的抑制Aβarc果蝇中的神经损伤不能够归结于减轻了磷脂酶C，PI4,5P和肌醇三磷酸受体(IP3R)所介导的钙释放所可能引起的毒性作用，因为向表达Aβarc的果蝇中引入编码肌醇三磷酸受体的基因的无意义突变即不能减轻突触障碍，也不能延长寿命(图9(b)-(c))。
实施例6：通过染色和成像检测下调RBO/PI4KIIIα减少了Aβ42的细胞内沉积
染色和成像：
果蝇中枢系统中的Aβ染色方法如下。在预冷的PBS中解剖出果蝇中枢神经系统(CNS)整体，包括脑和腹神经节，于PBS配置的4％ PFA中固定约45分钟。以PBS洗30分钟，随后以甲酸(70％的水溶液)处理45分钟，使抗原决定簇暴露，然后用PBS-0.25％Triton-5％BSA重复冲洗。一抗(6E10,1:100稀释)在4℃下孵育10-12小时。以PBS洗，其后在室温下，以cy3-偶联的二抗(Jackson ImmunoResearch,1:200稀释)孵育2小时。使用Nikon A1R-A1共聚焦显微镜采集图像，果蝇中枢神经系统的基因型对于采集图像的人员来说是未知的。
在图3(a)中，日龄为21-25天的表达mCD8-GFP的对照果蝇(上
排)和Aβarc表达果蝇(中排)的腹侧神经节的全标本包埋Aβ染色的共聚焦成像；mCD8-GFP和Aβarc的表达均为[Gal4]A307驱动。每组染色重复两次；下排是中排图中被正方形框定区域的放大。日龄为21-25天的Aβarc、Aβarc-rbots1/+、Aβarc-rbo2/+、Aβarc-PI4KIIIαdef/+和Aβarc-PI4KIIIαGS27/+果蝇的代表性腹侧神经节的全标本包埋Aβ染色的共聚焦成像，每组染色重复两次(参见3(b))，以及ELISA方法定量头部的Aβ水平(图3(c)，上图)。图3(c)的下图是ELISA方法定量不同浓度PAO处理后的Aβarc表达果蝇头部的Aβ水平。ELISA方法定量的每组数据，n＝3～5，单因素方差(one-way ANOVA)分析。在图3(a)和(b)中，比例尺是50微米。
先前，由于表达Aβarc在GF通路里所引发的神经损伤被归结于细胞内Aβ淀粉样蛋白的积累。这里，通过向Aβarc果蝇中导入uas-mCD8-gfp转基因，以便进一步证实Aβ淀粉样蛋白在神经元内积累。uas-mCD8-gfp转基因表达的是定位到细胞膜的mCD8-GFP萤光蛋白，它是由与Aβarc相同的驱动子驱动的，所以表达Aβarc的神经元会被GFP标记，共聚焦显微成像揭示绝大部分Aβ免疫染色信号与GFP信号共定位(图3(a))，从而确证了这一果蝇模型中神经元内Aβ积累的现象。
为了研究RBO/PI4KIIIα的不足是否会影响细胞内Aβ积累，在Aβarc，Aβarc-rbo,和Aβarc-PI4KIIIα果蝇中进行Aβ免疫染色。发现Aβarc-rbo和Aβarc-PI4KIIIα果蝇的Aβ免疫反应信号比Aβarc果蝇的明显减弱(图3(b))。
实施例7：通过ELISA定量测试检测下调RBO/PI4KIIIα减少了Aβ42的细胞内沉积
ELISA方法检测：
ELISA使用的是Aβ42Human ELISA Kit(invitrogen)，并按照使用说明进行实验。为分析中枢系统中Aβ42的水平，将每个品系中25个
果蝇的大脑在预冷过的PBS中解剖出来，并迅速置于冷的添加了蛋白酶抑制剂混合物(Calbiochem)的ELISA样品稀释液中，果蝇脑被充分的捣碎，室温摇动孵育4小时候，-20℃保存。
与实施例6相一致的是，ELISA定量测试显示在Aβarc-rbo,Aβarc-PI4KIIIα和用药物PAO治疗的Aβarc果蝇中，Aβ42的量显著地降低(图3(c&d))。
在图10(a)中，RT-PCR方法检测N2细胞中敲减EFR3a基因效率的代表图(左侧)和归一化法定量分析(中间)，右侧显示敲减EFR3a基因不影响N2a细胞内吞细胞外Aβ42。用于构建敲减Efra RNAi的序列是：5’-AGGTATCATTCAGGTTCTGTT-3’(SEQ ID NO:4)。图10(b)中，RT-PCR方法检测显示rbo基因及PI4KIIIa基因突变没有减低Aβarc表达果蝇中Aβarc转录水平。
通过实施例6和7，RBO/PI4KIIIα下调所导致的神经元内Aβ积累减少并不像是因为细胞外Aβ42的摄取的降低所导致，也不像是Aβarc转录的减少所造成，因为：1)敲减了rbo同源基因的N2a细胞摄取细胞外的Aβ42没有明显减少(图10(a))；2)在不同日龄的Aβarc-rbo以及Aβarc-PI4KIIIα果蝇中Aβarc的mRNA表达水平与实验组Aβarc果蝇比较并没有减少(图10(b))。
实施例8：PI4KIIIα抑制剂PAO、A1和G1溶液制备及其毒性测试
利用PAO或A1处理HEK293细胞、果蝇幼虫和成虫时，首先把PAO粉末(Sigma-Aldrich,CAS NO.637-03-6)和A1粉末(分别溶于DMSO，制成10和0.9mM的母液。然后用蒸馏水梯度稀释到所要的浓度，并调整DMSO的最终浓度以避免DMSO浓度差异影响实验结果。
测试PAO对活体果蝇的毒性时，我们用含有50、100、200、300、
400和600μM PAO的食物培养野生型果蝇，从胚胎期开始。发现200μM及以下PAO对羽化率和羽化后的爬行能无明显影响。从而选取25、50、100和150μM PAO浓度培养Aβarc果蝇及对照果蝇。
测试PAO对解剖的果蝇三龄幼虫的毒性时，我们用含有50、100、150、200、300、400和500nM PAO的施耐德培养基在25℃下过夜培养解剖的野生型果蝇三龄幼虫。发现300nM和以上浓度的PAO会使果蝇幼虫的唾液腺和中枢神经系统的颜色变为灰白，提示损伤。而150nM和以下浓度的PAO则不会。因此，选取50、100和150nM PAO浓度进行培养。
测试PAO和A1对HEK239细胞的毒性时，用含有50、100、150、200、250、300、400和600nM PAO或A1的DMEM培养基培养HEK239细胞12小时后，用MTT法分析发现250nM和以上浓度的PAO和A1均会杀死大部分细胞，150nM和以下浓度则不会。因此，选取25、50、100和150nM PAO和A1浓度进行培养。
测试PAO灌胃对小鼠的毒性时，把PAO粉末溶于DMSO，制成30mg/ml的母液。然后用蒸馏水梯度稀释到所要的浓度，并调整DMSO的最终浓度以避免DMSO浓度差异影响实验结果。首先按18、10和6mg/kg体重的剂量给3月龄的C57BL/6小鼠灌胃，每个剂量灌胃2只小鼠。第2天发现所有小鼠均死亡。然后按4.5和2.0mg/kg体重的剂量灌胃，每个剂量灌胃5只小鼠。对于4.5mg/kg体重剂量，每天灌胃1次，连续5天后，5只小鼠中有4只存活。对于2.0mg/kg体重剂量，按周1至周5每天灌胃1次，周末停药。连续2周后，发现5只小鼠均存活。因此，对于C57/B6小鼠，PAO灌胃的半数致死量在2-6mg/kg体重，约为4mg/kg体重。所以，我们选取0.1、0.3和1.0mg/kg体重剂量给APP/PS1和对照小鼠灌胃，按周1至周5每天灌胃1次，周末停药，连续6周。
实施例9：通过表达Aβ的幼虫组织培养检测下调RBO/PI4KIIIα促进Aβ42分泌
表达Aβ的幼虫组织培养：
将果蝇三龄幼虫用水清洗和70％酒精消毒2分钟，在施耐德(Schneider’s)(Sigma)培养基中沿着幼虫的背中线剪开，小心清除幼虫的气管，内脏和脂肪组织。在施耐德培养基中清洗解剖过的幼虫，并转入2ml的离心管中，该离心管中有150ul的施耐德培养基和庆大霉素(20毫克/毫升)。每管中有5个解剖后的幼虫，将离心管置于潮湿，黑暗，恒温25℃的环境中8小时。然后从每管中提取100ul用ELISA定量测试Aβ42。ELISA使用的是Aβ42Human ELISA Kit(invitrogen)。
在图4中，图4(a)-(c)显示归一化法定量分析不同PAO浓度处理、rbo基因和PI4KIIIα基因突变对培养解剖了的表达Aβarc果蝇三龄幼虫的培养基中Aβ42的水平的影响。
为了探究PAO药物治疗和RBO/PI4KIIIα不足减少神经元内Aβ积累的机理，检测了表达Aβarc的三龄幼虫解剖样本在Schneider培养基培养的过程中分泌Aβ42的情况。ELISA测试表明，PAO处理会促进Aβ42分泌，且呈现一种与药物剂量关联的趋势(图4(a))，表明抑制PI4KIIIα酶活性促进Aβ42分泌。与此一致的是，较之Aβarc幼虫的培养基，Aβarc-rbo品系和Aβarc-PI4KIIIα品系的幼虫培养基中有显著升高的Aβ42浓度(图4(b)-(c))。
实施例10：通过表达人源APP的HEK293T细胞培养检测下调RBO/PI4KIIIα促进Aβ42分泌
表达人源APP的HEK293T细胞培养：
稳转了人源APP的HEK293T细胞使用DMEM培养基(Hyclone)培养，加入10％FBS(Gibco)，青霉素和链霉素，和G418(100微克/毫升)。
表达目的基因shRNA的pSUPER.basic重组质粒通过LipofectamineTM 2000(invitrogen)瞬时转染到HEK293T细胞中。转染后培养细胞两天，再用于后续试验。用ELISA检测培养液中Aβ42浓度时，收集新换的且培养了细胞12小时的培养液。
APP的α,β,γ分泌酶的活性和稳转人源APP的HEK293T细胞中APP表达量检测：
利用12孔板培养稳转APP的HEK293T细胞，培养液中含有PAO的浓度为0、25、50、100或150nM，培养6-8小时后，分别收集等量的细胞。检测分泌酶活性时，用500微升TBS缓冲液分别裂解细胞，低温离心(13000g)15分钟，保留上清，沉淀则用500微升TBS缓冲液重悬浮。检测α和β分泌酶的活性时，取100微升的上清与含有10μM的α或β分泌酶特异性萤光底物(specific fluorogenic substrates Calbiochem,Cat.No.565767/565758)的2倍反应液(50mM Tris-HCl,pH 6.8,4mM EDTA,0.5％ CHAPSO(w/v))混合；检测γ分泌酶的活性时，取100微升的重悬浮液与含有10μM的γ分泌酶特异性萤光底物(specific fluorogenic substrates Calbiochem,Cat.No.565764)的2倍反应液(50mM Tris-HCl,pH 6.8,4mM EDTA,0.5％ CHAPSO(w/v))混合。在37℃反应30分钟后，用酶标仪(excitation/emission：365/490nm for α/β酶活性，365/440forγ酶活性)检测。
检测APP表达量时，将收集的细胞用含有蛋白酶抑制剂(1％ cocktail，invitrogen)TBS缓冲液裂解后进行后利用抗APP/Aβ抗体(6E10)进行免疫印迹。
图14(a)示归一化法定量分析PAO对HEK293T细胞的α,β,γ分泌酶活性的影响，每个数据点，n＝5，单因素方差检验；图14(b)示免疫印迹显示经不同PAO浓度处理后HEK293T细胞的APP表达量的代表图，该实验重复了3以上。
为了测试这种易化作用是否作用于从β淀粉样蛋白前体蛋白(APP)剪切而来的Aβ42的分泌，检测了一种稳定过量表达人源APP的
HEK293T细胞的Aβ42分泌情况。在图4(d)-(g)中，归一化法定量分析不同PAO和A1浓度处理、EFR3a和PI4KA基因敲减对培养稳转人源APP的HEK293细胞的培养基中Aβ42的水平的影响。事实上，PAO处理在培养基中产生类似的提高Aβ42浓度的效果(图4(d))，且PAO即使在γ-分泌酶抑制剂DAPT(1uM)存在的情况之下，依然提升了培养基中的Aβ42浓度(图4(e))。值得注意的是，PAO的浓度甚至在相当低(甚至可以低到1.0nM)的情况下，仍然存在稳定的效果(图4(i))。再者，在稳定过量表达人源APP的HEK293T细胞中敲减EFR3a或PI4KA基因或应用A1处理均可以显著的提升培养基内的Aβ42浓度(图4(f-g)。每组数据，n＝4～15，单因素方差检验。
根据检测在稳定过量表达人源APP的HEK293T细胞的Aβ42分泌情况，对以下化合物进行检测并获得如下结果：
此外，PAO促进稳转APP的HEK293细胞分泌Aβ42，但不改变剪切APP的α,β,γ分泌酶的活性图14(a)、也不引起APP水平升高图4(b)。
实施例11：病毒构建包装及其在小鼠中的显微注射
慢病毒由invitrogen公司(上海)使用BLOCK-iTTM HiPerformTM Lentiviral Pol II miR RNAi Expression System with EmGFP这一表达系统制造。四个针对EFR3a基因的miRNAs寡聚片段被合成并插入pcDNATM6.2-GW/EmGFPmi载体。用RT-PCR或Western Blot的方法检测敲除效率。检测结果显示，其中一个载体在过表达EFR3a基因的HEK293T细胞中，对沉默EFR3a基因表达最有效。敲除效率最高的载体目的序列为AGGTATCATTCAGGTTCTGTT。这一最有效的miRNA载体与pDONRTM221及pLenti6/V5 DEST重组，通过重组反应得到pLENT6/V5-GW/±EmGFP-miRNA载体。慢病毒通过共转染pLENT6/V5-GW/±EmGFP-miRNA vector和Packaging Mix得到。病毒浓度经由在HEK293T细胞中连续稀释得到。随后每三天统计一次EGFP阳性的细胞。沉默效率进一步通过慢病毒转染原代培养的海马神经元得到。
APP/PS1转基因雄鼠(B6.Cg-Tg(APPswe,PSEN1dE9)85Dbo/Mmjax(MMRRC ID 034832-JAX)通过与(C57BL/6和C3H交配的F1带)小鼠杂交保种。在6月龄时，使用100mg/kg Ketamine加20mg/kg Xylazine麻醉小鼠，固定于立体定位仪，腹部向下置于电热毯上。清除头部毛发，切开皮肤，穿透颅骨打一小洞。使用注射泵(Harvard Apparatus)通过套管系统(external diameter,0.29mm,internal diameter,0.1mm,RWD Life Science Co.,Ltd)，在20分钟内注射2μl慢病毒溶液(病毒浓度：6x10-7)至2.1mm posterior to bregma,2.3mm lateral and 1.9mm ventral。注射后5分钟，移除针头，缝合皮肤，小鼠移至25℃含充足食物和水的环境中培养。至12月龄时，再次麻醉小鼠，使用PBS配制的4％多聚甲醛(para-formaldehyde,简称PFA)灌流。实验遵照美国神经科学协会对动物使用的政策在小鼠上进行实验。
实施例12：通过小鼠脑片GFP染色检测敲减EFR3a基因可修复APP/PS1鼠神经元树突的萎缩
小鼠脑片GFP染色：
脑片(厚60μm)使用PBS-0.3％triton-5％BSA封闭1小时，使用兔源anti-GFP抗体(A11122,invitrogen,1:100稀释)于4℃孵育过夜。随后以PBS洗，并用生物素化羊源抗兔IgG抗体(H+L)(AbboMax,Inc,1:100稀释)于4℃孵育过夜。再次以PBS洗，使用Cy3-Streptavidin(Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc,1:1000稀释)于室温下孵育2小时。使用Zeiss LSM 511共聚焦显微镜采集图像，通过AutoQuant X2反卷积，再用NeuronStudio软件进行数据分析。脑片与采集到的树突图像所属基因型对于采集图像的人员和进行数据分析的人来说都分别是未知的。
在图11中，RT-PCR方法检测在HEK293细胞中敲减内在EFR3a基因(a)和PI4KA基因(b)，在HEK293细胞中敲减过表达的小鼠
EFR3a-gfp重组基因(c)，以及在小鼠原代培养的海马神经元中敲减小鼠内在EFR3a基因(d)的效率。代表图在上，归一化法定量分析在下。用于构建敲减人源Efr3a和PI4KA基因的RNAi的序列分别是：5’-GGTTATTGAAATTCGAACT-3’(SEQ ID NO:5)和5’-TGCTCATTAGCAGTAAAGA-3’(SEQ ID NO:6)。对于每个数据，n＝3-5，T检验获得P值。
在图5(a)中，共聚焦成像显示抗GFP免疫染色的海马切片全图(上部)与慢病毒转染的CA3区锥体细胞(下部)。选取长度约30μm的树突片段(两箭头之间)片段量化树突的直径和树突棘的密度。比例尺是500微米(上部)和50微米(下部)。在APP/PS1和同窝对照小鼠的CA3区锥体神经元(参见图5(b))和DG区颗粒神经元(参见图5(c))中敲减EFR3a基因对树突直径和树突棘密度的影响。CA3和DG区树突的代表图位于顶部，树突直径和树突棘密度的定量分析位于底部。每个数据点取自3～4只动物的n≥25张切片，P值通过单因素方差分析得到。比例尺在图5(b)和(c)中是1.0微米。
小鼠和人类有EFR3a基因和EFR3b基因两个rbo的同源基因，这两个基因在海马等AD易感区富集(Allen brain atlas)。通过在APP/PS1小鼠中运用EGFP标记的RNAi技术，研究下调EFR3a基因后能否保护海马神经细胞。RNAi的敲减效率(见图11(a)&(b))。激光共聚焦成像显示海马CA3和DG区的小部分神经细胞被表达EGFP的慢病毒感染(图5(a)上)。我们通过随机选取细胞近端部分(约30μm长)的次级顶树突，测量其树突直径及树突棘密度。在野生型对照组小鼠与APP/PS1小鼠之间比较，以上两个参数的值在受对照慢病毒感染的APP/PS1小鼠的CA3和DG区神经细胞中显著降低(图5(b)&(c))，表明APP/PS1小鼠的海马神经元树突及树突棘有萎缩。在APP/PS1小鼠之间比较，以上两个参数的值在受RNAi慢病毒感染的神经细胞中显著增高，几乎与这两个参数在野生型小鼠中的值无差异(图5(b)&(c))。
因此，下调APP/PS1小鼠海马的神经元的rbo同源基因EFR3a也可保护神经细胞。
实施例13：通过对脑脊液和分离小鼠大脑细胞膜组分的分析检测PAO改善APP/PS1小鼠的记忆和学习能力，增加脑脊液内Aβ42，但减少大脑细胞膜中的Aβ42
脑脊液的采集：
用氯胺酮和甲苯噻嗪将小鼠麻醉，注意用适配器保护小鼠的头部。将小鼠颈部的毛剃掉并切开皮肤，用钳子把下面的皮下组织和肌肉向两侧分开，以暴露覆盖在小脑延髓池的那部分硬脑膜。准备一只一端很锐利但另一端较钝的玻璃毛细管，钝的一端连接显微注射器，然后用锐利的一端刺入硬脑膜。当感觉到明显的突破感时，说明毛细管成功进入小脑延髓池，脑脊液就会被吸入毛细管，大约收集10－20微升。将收集的脑脊液转移到微量离心管，-80℃保存备用。
分离小鼠大脑细胞膜组分：
通过一系列的抽提得到可溶于去垢剂的Aβ42，加入相当于小鼠大脑半球的5倍体积的用缓血酸胺缓冲液(TBS)进行研磨，研磨成匀浆后放入离心机，在4℃以100,000g离心60min，则上层清液是TBS提取物。收集下面的沉淀，加入5倍体积的含有1％聚乙二醇辛基苯基醚的TBS缓冲液，再次研磨并离心，则上层为TBS-Triton提取物。再收集下层沉淀，加入5倍体积的包含1％ SDS的TBS缓冲液，进行第三次研磨并离心，则上层清液为TBS-SDS提取物。分别收集这三次的上次清液，分装好后，放入-80℃冰箱保存，为做ELISA检测备用。
以上在培养细胞和果蝇中的实验结果显示PAO可以促进Aβ42分泌，减少神经元内Aβ42积累并改善突触等功能，说明通过促进Aβ42分泌，PAO可作为治疗AD的一个潜在药物。为此，对灌胃服用了不同PAO剂量的APP/PS1小鼠进行了行为和生化实验。
在图6(a)中，不同浓度PAO处理的APP/PS1小鼠(左侧图)和同窝出生的野生型小鼠(右侧图)的水迷宫实验训练曲线。为了方便对比，PAO灌胃浓度为0的APP/PS1小鼠的学习曲线在左右两图中均有显示。在图6(b)中，训练后对照和APP/PS1小鼠在目标象限中的搜寻时间占总的搜寻时间的百分比。ELISA方法定量分析不同浓度处理的APP/PS1小鼠脑脊液中(参见图(c))，和1％ Triton及1％SDS的TBS缓冲液提取的大脑细胞膜组分中(参见图6(d))的Aβ42水平。在图6(e)中，100℃处理不同时间对ELISA方法定量分析APP/PS1小鼠脑脊液中(左图)和1％SDS的TBS缓冲液提取的大脑细胞膜组分中的Aβ42测定值的影响。在图6(f)中，ELISA方法定量分析100℃处理60分钟后1％ Triton及1％SDS的TBS缓冲液提取的大脑细胞膜组分中的Aβ42水平。在图6(f)中，100℃处理60分钟后从1％ Triton及1％SDS的TBS缓冲液提取的各大脑细胞膜组分中所释放出的Aβ42量占各自总量的百分比。在图6(a)和(b)中，各野生型对照组n＝6～8，各APP/PS1组n＝7～8；在图6(e)，左侧，n＝3，图e，右侧，n＝23；在图6(c,d和f)中，n＝5～6。P值均通过单因素方差(one-way ANOVA)分析得到。
通过在实施例8中描述的对野生型小鼠灌胃测试PAO的毒性后，以0、0.1、0.3和1.0mg/kg为浓度梯度进行以下实验。对4月龄大的APP/PS1小鼠和野生型小鼠进行PAO灌胃，周一至周五每天一次，连续6周。之后停药一周，通过按照Vorhees and Williams描述的方法进行的水迷宫实验测试小鼠的学习和记忆能力。与野生型对照组相比，没有进行PAO灌胃的APP/PS1小鼠的空间记忆和学习能力明显受损(图6(a)&(b))。这种损害在有PAO灌胃的APP/PS1小鼠中显著降低，尤其当剂量为0.3mg/kg时最明显(图6(a)&(b))。这一结果表明PAO能治疗APP/PS1小鼠的学习记忆障碍。行为测试后，对每只APP/PS1小鼠进行收集脑脊液和提取脑组织的细胞膜组分。利用含有1％Triton X-100和1％ SDS的两种TBS缓冲液对脑组织进行分级分馏操作，提取细胞膜偶联的Aβ42，然后采用ELISA定量法检测。发现PAO增加了
脑脊液中Aβ42的含量(图6(c))，并出乎意料地增加了大脑细胞膜中Aβ42的水平，尤其当剂量在0.3mg/kg时(图6(d))。但是，图6(f)显示PAO处理显著减少了大脑细胞膜中聚合状Aβ42的水平，尤其当剂量在0.3mg/kg时。
实施例14：通过水迷宫实验检测突变小鼠PI4KIIIα改善APP/PS1小鼠的学习记忆能力
在Aβ42表达果蝇中遗传方法下调PI4KIIIα的表达量或PAO抑制其酶活性都减轻了神经功能异常，在APP/PS1小鼠中PAO抑制PI4KIIIα的酶活性也改善了学习记忆功能。为了进一步明确PI4KIIIa在APP/PS1小鼠神经退行性改变中的功能，我们检测了PI4KIIIα杂合突变(Pi4kaGt(RRO073)Byg/+:转座子pGT2Lxf插入在一个拷贝的PI4KA基因中会导致该拷贝基因在转录时出现障碍，产生的mRNA仅能翻译PI4KIIIα氨基端的前～265个氨基酸与报告基因编码的蛋白所组成的融合蛋白)对APP/PS1小鼠在水迷宫实验中影响。把Pi4kaGt(RRO073)Byg/+突变杂合子(MMRRC，Cat.#016351-UCD)与APP/PS1小鼠交配，获得四组基因型小鼠：野生型(WT)、PI4KIIIa突变杂合子(PI4K*/+)、APP/PS1(TG)和含有PI4KIIIa杂合突变的APP/PS1(TG；PI4K*/+)。当这四组小鼠达到5月龄时按照Vorhees and Williams描述的方法进行水迷宫实验。如图12所示，结果显示PI4KIIIa杂合突变能显著改善5月龄APP/PS1小鼠的空间学习和记忆能力。图12左侧显示的是四组基因型小鼠在训练日的上台时间，右侧显示的是在训练结束日后第1天的测试中四组基因型小鼠在目标象限中游动时间所占的百分比。
实施例15：通过脂质体实验检测PI、PI4P、PI4,5P在脂质体中对Aβ42聚合的影响
脂质体实验：
1)用六氟异(2)丙醇(hexafluoro-2-propranol，HFIP)溶解合成
的Aβ42，溶解比率是1:1(mg:ml)，然后是在室温下用50Hz的超声波混匀15分钟。超声波产生器是KUDOS ultrasonic instrument(Model SK250HP)。
2)用氯仿(chloroform)分别溶解用于制备脂质体的各种脂类(见表1)溶解比率也是是1:1(mg:ml)，在室温下用50Hz的超声波混匀15分钟。
3)按表1的比率把Aβ42和各种脂类混合在一起，随后用冷冻干燥器抽干混合液中的有机溶剂。
4)用1.0ml的Tris缓冲液(50mMTris,120mM NaCl,pH7.0)重悬浮冷冻干燥处理后所得的沉淀，在冰水中超声波混匀30分钟。然后在4℃下静置48小时后进行免疫印迹检测(一抗是抗人源Aβ的单可容抗体6E10，1:1000)。免疫印迹检测前需在冰水中超声波混匀15分钟。
表1.制备脂质体的各种脂类配比
对PI、PI4P、PI4,5P在脂质体中对Aβ42寡聚体形成的影响和比较进行分析，图13的左列显示的是PI4P对脂质体中Aβ42寡聚体形成的促进作用呈浓度依赖性，上下部是同一免疫印记膜的相对短和长时间的曝光后显影的结果；请注意PI4P浓度为80μM时，对Aβ42寡聚体形成
的促进作用反而比40μM时有所减弱。图13的右列显示的是PI、PI4P和PI4,5P对脂质体中Aβ42聚合的促进作用，上下部是同一免疫印记膜的相对短和长时间的曝光后显影的结果；请注意PI4P的作用明显比PI和PI4,5P，且PI和PI4P对Aβ42三聚体和以上的寡聚体形成的促进作用又比PI4,5P强。
实施例16：RBO/EFR3/EFR3A/EFR3B、PI4KIIIa和TTC7在细胞膜上形成复合体
报道显示，酵母的EFR3蛋白与PI4KIIIa和一个脚手架蛋白YPP1(在哺乳动物中叫TTC7，包括TTC7A和TTC7B两个同源蛋白)在细胞膜上形成复合体，且以斑片状聚集(PIK patchs)，一起控制膜的PI4P水平、甚至PI4,5P水平。YPP1与酵母PI4KIIIa蛋白的N端和中间区域均有直接相互作用，对PIK patchs的组建和稳定起着关键作用(Baird D,Stefan C,et al.,2008,J Cell Biol)。PIK patchs的构成和功能在哺乳动物细胞中也保守(Nakatsu F,Baskin JF,et al.,2012,J Cell Biol)。果蝇中的TTC7的果蝇同源蛋白是由lethal(2)k14710[(l(2)k14710)基因编码。
为了检测TTC7蛋白在神经元内Aβ积累引起的神经退行性改变中的作用，在Aβarc果蝇中分别引入两个转座子(transpon)介导的转基因，一个是P{lacW}l(2)k14710k15603,(Bloomington Cat.#11134)该转座子插在(l(2)k14710基因的第一个外显子中，阻止(l(2)k14710基因的转录；另一个是P{EPgy2}bin3EY09582,(Bloomington Cat.#20043)。该实验共构建了4组果蝇：对照果蝇(ctrl)、Aβarc果蝇、含有一个拷贝的P{lacW}l(2)k14710k15603的Aβarc果蝇(Aβarc-dttc7+/-，TTC7下调)和含有一个拷贝P{EPgy2}bin3EY09582的Aβarc果蝇(Aβarc-dttc7-OE，TTC7过表达)。当4组果蝇的成虫达到5-10、30-35天两个日龄段后，进行100赫兹脑刺激诱发的逃跑通路的兴奋性突触后电位记录。
图15示定量分析分别下调和过量表达TTC7对Aβarc果蝇中神经传递的影响。在日龄为5-10天时，4组果蝇的100赫兹脑刺激诱发的神经传递成功率无明显差异，但在日龄为30-35天时，Aβarc果蝇的神经传递的成功率明显比对照果蝇(ctrl)要低，过量表达TTC7(Aβarc-dttc7-OE)使成功率进一步降低，但下调TTC7表达(Aβarc-dttc7+/-)则提高神经传递的成功率。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
- 一种筛选用于治疗阿尔茨海默病的药物以及治疗靶点的方法，所述方法包含筛选能提高细胞分泌Aβ水平的候选药物或治疗靶点。
- 如权利要求1所述的筛选用于治疗阿尔茨海默病的药物以及治疗靶点的方法，所述方法包括以下步骤：(1)将所述药物应用于过量表达APP或含分泌信号肽的Aβ的细胞系或果蝇组织或调节过量表达APP或含分泌信号肽的Aβ的细胞系或果蝇组织中的所述治疗靶点；以及(2)利用免疫分析方法检测所述过量表达APP或含分泌信号肽的Aβ的细胞系或果蝇组织中细胞分泌Aβ的情况，其中，如果所述药物的应用或治疗靶点的调节能导致细胞分泌Aβ的量增加，则所述药物或治疗靶点可用于治疗阿尔茨海默病。
- 如权利要求1或2中任一所述的筛选用于治疗阿尔茨海默病的药物以及治疗靶点的方法，所述Aβ为Aβ42。
- 如权利要求2中所述的筛选用于治疗阿尔茨海默病的药物以及治疗靶点的方法，所述检测Aβ的分泌情况的免疫分析方法为酶联免疫吸附剂测定或电化学发光免疫分析方法。
- 如权利要求2中所述的筛选用于治疗阿尔茨海默病的药物以及治疗靶点的方法，所述过量表达APP或含分泌信号肽的Aβ的细胞系为稳转人源APP或含分泌信号肽的Aβ的HEK293T、N2a或SH-SY5Y细胞系。
- 如权利要求2中所述的筛选用于治疗阿尔茨海默病的药物以及治疗靶点的方法，所述过量表达APP或含分泌信号肽的Aβ的果蝇组 织为果蝇三龄幼虫组织。
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