CN104046676B - 清除淀粉样多肽的细胞及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及清除淀粉样多肽的细胞及其应用，首次揭示了NG2细胞可以被Aβ激活并吞噬Aβ。NG2细胞可作为一个药学靶点来研究和筛选激活或促进NG2吞噬Aβ的药物，本发明为脑中Aβ过量导致的神经退行性疾病的治疗提供了有效途径。
Description
技术领域
本发明属于细胞生物学和药学领域；更具体地，本发明涉及清除淀粉样多肽的细胞及其应用。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimerdisease，AD)是老年痴呆症的最常见的形式。在神经病理学上有三大特征：沉积在细胞外的淀粉样蛋白斑；细胞内的神经纤维缠结和特定脑区的神经元死亡。β淀粉样多肽(Aβ)是淀粉样蛋白斑的主要成分，其是由淀粉样前体蛋白(APP)经由不同的内切蛋白酶催化剪切而形成的自然代谢产物。有三种蛋白酶参与了APP的剪切过程，按其剪切位点的发现顺序，分别称为α-分泌酶，β-分泌酶和γ-分泌酶。APP的剪切过程可分为淀粉样途径和非淀粉样途径。淀粉样途径主要是β-分泌酶先把APP剪切成两个片段：游离形式的N-端蛋白片段(sAPPβ)和留在膜上的含β淀粉样多肽的C-端(C99)。γ-分泌酶复合体进一步剪切C-端，产生Aβ和APP胞内结构域片段(APPintracellulardomain，AICD)。大部分的全长Aβ由40个氨基酸组成(Aβ40)，仅有约10%由42个氨基酸组成(Aβ42)。Aβ42由于多了两个疏水的氨基酸残基而更易于聚集，同时也是淀粉样蛋白斑的主要成分。Aβ自身可自发地聚集从而形成多种共存形式。可由2-6个多肽形成寡聚体，并进一步融合形成中间聚集体；也可以形成纤维，并排列为β-折叠片，进一步形成不可溶纤维，最终导致淀粉样蛋白斑的形成。可溶性寡聚体和淀粉样中间聚集体是Aβ毒性最高的两种形式。
随着对AD研究的深入，越来越多的研究者认为，很多AD患者可能由于大脑清除Aβ的功能出现障碍，致使生命过程中正常生成的Aβ无法被及时清除，从而导致了AD。遗传有载脂蛋白E4(apolipoproteinE4，ApoE4)一个或两个等位基因的个体更容易患上AD，通过对其病因的研究，发现携带ApoE4等位基因的个体Aβ的生成量并没有增加，在细胞水平共表达APP和ApoE也没有改变细胞Aβ的生成量。人的神经病理性损伤分析和动物模型研究表明，ApoE使大脑中的Aβ总体水平稳定升高，可能增加了Aβ的纤维形成能力和/或是降低了Aβ的清除。尽管其具体机制还尚未研究清楚，ApoE介导的大脑中Aβ水平的增高至少提示了细胞在Aβ的清除方面存在功能障碍。
真核细胞中有两条主要的胞内蛋白降解途径：泛素-蛋白酶体途径(ubiquitin/proteasomepathway，UPP)和自噬-溶酶体途径(autophagy/lysosomepathway，ALP)。据报道，很多神经退行性疾病的病理都与泛素-蛋白酶体途径和自噬-溶酶体途径的功能障碍有关。有研究表明，Aβ既能被蛋白酶体降解，又能抑制其活性。如果蛋白酶体活性受到抑制，将被降解的已泛素化蛋白就会积累起来，这将引起神经元退行和死亡。而AD最主要的特征就是沉积在细胞外的淀粉样蛋白斑和细胞内的神经纤维缠结，这有可能是由于泛素蛋白酶体的功能异常，导致Aβ不能被及时清除，从而形成淀粉样蛋白斑，并对周围神经细胞产生毒性作用，引起一系列的病理损伤。当泛素蛋白酶体介导的蛋白质降解过程受到损伤或呈减弱趋势，这将促使自噬-溶酶体降解途径担负起更多的蛋白降解功能。
综上，本领域有必要研究有效清除细胞内Aβ的有效产品和途径，以期应用于AD疾病的治疗。
发明内容
本发明的目的在于提供清除淀粉样多肽的细胞及其应用。
在本发明的第一方面，提供一种筛选潜在的防治神经退行性疾病的药物的方法，所述方法包括：
(1)用β淀粉样多肽(Aβ)处理NG2细胞(包括NG2细胞系)，并确定细胞吞噬β淀粉样多肽的程度(包括吞噬效率)；
(2)在候选物质存在下，如(1)所述处理NG2细胞，再次确定细胞吞噬β淀粉样多肽的程度；和
(3)比较(1)和(2)中细胞吞噬β淀粉样多肽的差异；
其中，如果(2)中细胞吞噬β淀粉样多肽的程度在统计学上高于(优选显著高于，如高20%，较佳地高40%；更佳地高60%或更高)(1)中细胞吞噬β淀粉样多肽的程度，则所述候选物质是潜在的防治神经退行性疾病的药物。
在一个优选例中，所述的方法的(1)和(2)中，还包括：确定NG2细胞中β淀粉样多肽被转运到溶酶体中的量；并且，(3)中，还包括：比较(1)和(2)中β淀粉样多肽被转运到溶酶体中的量；其中，如果(2)中β淀粉样多肽被转运到溶酶体中的量在统计学上高于(优选显著高于，如高20%，较佳地高40%；更佳地高60%或更高)(1)中β淀粉样多肽被转运到溶酶体中的量，则所述候选物质是潜在的防治神经退行性疾病的药物。
在另一优选例中，所述方法的(1)和(2)中，还包括：确定细胞中β淀粉样多肽被降解的效率；并且，(3)中，还包括：比较(1)和(2)中β淀粉样多肽被降解(或被清除)的效率；其中，如果(2)中β淀粉样多肽被降解的效率在统计学上高于(优选显著高于，如高20%，较佳地高40%；更佳地高60%或更高)(1)中β淀粉样多肽被降解的效率，则所述候选物质是潜在的防治神经退行性疾病的药物。
在另一优选例中，所述方法的(1)和(2)中，还包括：确定细胞中自噬体数量；并且，(3)中，还包括：比较(1)和(2)中的自噬体数量；其中，如果(2)中自噬体数量在统计学上高于(优选显著高于，如高20%，较佳地高40%；更佳地高60%或更高)(1)中自噬体数量，则所述候选物质是潜在的防治神经退行性疾病的药物。
在另一优选例中，所述方法的(1)和(2)中，还包括：确定细胞中lamp1、lamp2、LC3-II、P62或beclin1基因或它们编码的蛋白的表达情况；并且，(3)中，还包括：比较(1)和(2)中的lamp1、lamp2、LC3-II、P62或beclin1基因或它们编码的蛋白的表达情况；其中，如果(2)中lamp1、lamp2、LC3-II、P62或beclin1基因或它们编码的蛋白的表达在统计学上高于(优选显著高于，如高20%，较佳地高40%；更佳地高60%或更高)(1)中相应基因或蛋白的表达，则所述候选物质是潜在的防治神经退行性疾病的药物。
在另一优选例中，所述的β淀粉样多肽、溶酶体或自噬体标记有可检测信号，如荧光信号。
在另一优选例中，通过鉴定β淀粉样多肽上可检测信号的定位来确定β淀粉样多肽的定位，进而确定β淀粉样多肽的吞噬程度或降解情况。
在另一优选例中，所述方法的(1)或(2)中，所述的NG2细胞以50nM～50μM(较佳地为100nM～20μM；更佳地为200nM～10μM)β淀粉样多肽处理。
在另一优选例中，所述的方法还包括：对获得的潜在药物进行进一步的细胞实验和/或动物试验，选择和确定对于防治神经退行性疾病有用的药物。
在另一优选例中，所述的神经退行性疾病是脑中β淀粉样多肽过量导致的神经退行性疾病，包括阿尔兹海默症。
在本发明的另一方面，提供一种NG2细胞的用途，用于筛选潜在的防治神经退行性疾病的药物；或用于制备防治神经退行性疾病的药物。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、NG2细胞聚集在淀粉样蛋白斑周围。A：14月龄APPswe/PS1转基因鼠(上)和对照组(下)大脑皮质的NG2免疫组织化学染色和斑块硫黄素-S染色。NG2阳性细胞在对照组的大脑皮质中呈均匀分布，在APPswe/PS1转基因鼠中则聚集在淀粉样蛋白斑周围。标尺=50μm。B：A图方框区域的局部放大。标尺=20μm。
图2、APPswe/PS1转基因鼠大脑皮质免疫组织化学染色。硫黄素-S染色显示淀粉样蛋白斑，Iba1显示小胶质细胞，GFAP显示星形胶质细胞，NeuN显示神经元。标尺=20μm。
图3、NG2细胞是一种新的聚集在淀粉样蛋白斑周围的细胞类型。APPswe/PS1转基因鼠大脑皮质免疫组织化学双标。将大脑皮质进行NG2和GFAP，NeuN，Iba1双标。DAPI用于细胞核定位染色。标尺=20μm。
图4、原代NG2细胞和oli-neu细胞能吞噬Aβ。原代NG2细胞(A)和Oli-neu细胞(B)接种于24孔板的玻片上，培养18小时后用2μM的荧光标记的Aβ孵育24小时。细胞固定后进行NG2抗体的细胞免疫荧光染色。DAPI染色用于细胞核定位。标尺=5μm。
图5、透射免疫电镜显示NG2细胞中的Aβ。Oli-neu细胞用Aβ处理6小时后用于免疫电镜实验。超薄切片用抗Aβ的一抗和结合18nm胶体金颗粒二抗标记。图中所嵌高倍图像为方框区域所示。标尺=0.2μm。
图6、Aβ吞噬过程具有时间依赖性。A：细胞免疫荧光检测Aβ吞噬过程。Oli-neu细胞用400nM荧光标记的Aβ处理不同时间点，固定后用NG2抗体进行细胞免疫荧光染色。标尺=5μm。B-C：流式细胞术检测NG2阳性细胞吞噬Aβ的过程。Oli-neu细胞(B)和原代NG2细胞(C)用400nM荧光标记的Aβ处理不同时间点。细胞所吞噬的Aβ含量通过流式细胞仪检测胞内荧光强度来定量。
图7、肌动蛋白参与oli-neu细胞对Aβ的吞噬过程。Oli-neu细胞用细胞松弛素D(A，cytochalasinD，肌动蛋白聚集形式抑制剂)和噻氨酯哒唑(B，nocodazole，破坏微管蛋白动态变化)预处理30分钟，然后再用400nM荧光标记Aβ处理不同时间点。细胞所吞噬的Aβ含量通过流式细胞仪检测胞内荧光强度来定量。
图8、吞噬到NG2细胞中的Aβ被迅速降解。免疫印迹实验检测NG2细胞胞内和细胞培养基中的Aβ含量。所有数据用平均值±标准偏差显示；与Aβ处理0小时相比较P＜0.01，为**。实验为三次重复。
图9、吞噬到NG2细胞中的Aβ被转运到溶酶体。NG2细胞用400nM荧光标记Aβ处理24小时，然后在细胞培养基中直接加入40nM溶酶体示踪剂，再孵育30分钟。DAPI染色用于细胞核定位。标尺=10μm。
图10、Aβ吞噬引起NG2细胞中LAMP1和LAMP2基因表达的改变。NG2细胞用Aβ处理不同时间点后收集RNA，用于实时定量PCR检测。所有数据用平均值±标准偏差显示；与Aβ处理0小时相比较P＜0.01，为**。实验为三次重复。
图11、溶酶体抑制剂可以抑制NG2细胞中Aβ的降解。NG2细胞用Aβ孵育6小时后，加亮肽素(Leupeptin，20μM)和胃酶抑素A(PepstatinA，20μM)处理18小时。所有数据用平均值±标准偏差显示；与只用Aβ处理组相比较P＜0.05，为*，P＜0.01，为**。实验为三次重复。
图12、Aβ吞噬增加NG2细胞中自噬相关蛋白的表达。所有数据用平均值±标准偏差显示；与Aβ处理0小时相比较P＜0.05，为*，P＜0.01，为**。实验为三次重复。
图13、Aβ与LC3-II阳性的自噬体共定位。NG2细胞与400nM荧光标记的Aβ孵育24小时，再用LC3-II抗体进行细胞免疫荧光标记。DAPI染色用于细胞核定位。标尺=5μm。
图14、Aβ孵育增加NG2细胞中自噬体形成。NG2细胞瞬时转染mCherry–LC3质粒后再与Aβ孵育，通过计量mCherry-LC3荧光斑点阳性细胞数量来定量自噬体形成水平。所有数据用平均值±标准偏差显示；与不用Aβ处理组相比较P＜0.01，为**。实验为三次重复。
图15、自噬抑制剂能抑制NG2细胞中Aβ降解。NG2细胞与Aβ孵育6小时后，加浓度梯度的渥曼青霉素(wortmannin，左)和巴佛洛霉素A1(bafilomycinA1，0.2nM，右)再孵育18小时。免疫印迹实验检测Aβ，LC3，P62和beclin1蛋白水平。所有数据用平均值±标准偏差显示；与只用Aβ处理组相比较P＜0.05，为*，P＜0.01，为**。实验为三次重复。
图16、蛋白酶体活性抑制剂能抑制NG2细胞中Aβ降解。NG2细胞与Aβ孵育6小时后，加MG132(1nM)再孵育18小时。免疫印迹实验检测Aβ，LC3，P62和beclin1蛋白水平。所有数据用平均值±标准偏差显示；与只用Aβ处理组相比较P＜0.05，为*，P＜0.01，为**。实验为三次重复。
具体实施方式
本发明人在研究中发现，阿尔兹海默症发病过程中，淀粉样蛋白斑周围的NG2细胞被激活，激活后的NG2细胞吞噬并降解淀粉样多肽(又称为淀粉样蛋白，Aβ)，其降解过程涉及到自噬溶酶体途径和蛋白酶体途径。因此，NG2细胞可作为一个药学靶点，用于研究和筛选可以激活或促进NG2吞噬Aβ的药物；且NG2细胞本身可作为一种治疗药物。本发明为脑中Aβ过量导致的神经退行性疾病的治疗提供了有效途径。
NG2细胞
NG2细胞也称为少突胶质细胞前体细胞，其区别于中枢神经系统里的星形胶质细胞、小胶质细胞、成熟的少突胶质细胞和神经元。在中枢神经系统的发育过程中，NG2前体细胞的分布区域与全能干细胞所在的以及具持续性神经发生的区域相重叠。与神经干细胞类似，NG2细胞在成熟的大脑中持续存在并缓慢增殖，是出生后仍具增殖分裂能力的最大一群前体细胞，分布于大脑的神经发生和非神经发生区域。在体外和体内实验中，NG2细胞具有分化成多种细胞的潜能，可分化产生少突胶质细胞和星形胶质细胞，以及神经元。
迄今的研究表明，NG2细胞在一系列的中枢神经系统损伤中会很快被激活，并伴随着细胞形态的改变。这些损伤包括物理创伤，兴奋性病变，病毒感染，暴露于化学试剂，X线照射和免疫引发的脱髓鞘等。但是，目前还没有研究来探讨NG2细胞在AD中的活性变化。
本发明中，通过多种实验手段研究在阿尔兹海默症的致病过程中NG2细胞的状态及其功能，以及其中的作用机制。结果表明，阿尔兹海默症转基因动物大脑皮层中，在淀粉样蛋白斑周围的NG2细胞被激活，并且被激活的NG2细胞是不同于神经元、小胶质细胞和星形胶质细胞的一类新的细胞类型。在体外实验中，利用原代NG2细胞和NG2细胞系(Oli-neu)，发现这两种细胞都能将外源的Aβ吞噬进入胞内，并且该吞噬过程具有时间依赖性。与小胶质细胞吞噬外源Aβ的机制不同，NG2细胞的吞噬是依赖于肌动蛋白的动态变化，当肌动蛋白聚合被抑制，外源Aβ则不能被吞噬进入胞内。当外源Aβ被吞噬进入胞内，通过免疫荧光实验，发现Aβ能与溶酶体示踪剂共定位，说明Aβ被转运到溶酶体中。溶酶体主要负责细胞内蛋白的降解，本发明人利用蛋白免疫印迹实验，检测到被转运到溶酶体中的Aβ被逐渐的降解。进一步的研究还提示，自噬体也参与了Aβ的降解。当外源Aβ被吞噬进入胞内，Aβ可以与自噬体共定位，与自噬相关的蛋白表达上调，自噬体数量增加，自噬过程被激活。当用自噬过程的抑制剂处理细胞，胞内的Aβ降解被抑制。通过RNA干扰，降低自噬过程中关键蛋白beclin1的表达，细胞内Aβ的降解也被抑制。说明自噬过程在Aβ的降解中发挥着重要作用。通过以上的研究，揭示了在阿尔兹海默症的发病过程中，淀粉样蛋白斑周围的NG2细胞被激活，激活后的NG2细胞吞噬并降解Aβ，其降解过程涉及到自噬溶酶体途径和蛋白酶体途径，这为进一步深入理解NG2细胞在大脑中的存在意义及其对疾病的治疗提供了广阔的思路。
本发明还提供了NG2细胞的用途，包括(但不限于)用于：研究Aβ的产生及降解机制；研究神经退行性疾病(特别是阿尔茨海默病)的机制；筛选潜在的防治神经退行性疾病(特别是阿尔茨海默病)的药物等。
筛选防治神经退行性疾病的药物的方法
在得知了NG2细胞能够被Aβ激活并且吞噬Aβ这一机制，可以基于该机制筛选促进NG2细胞吞噬Aβ的潜在物质。从而，可从所述的潜在物质中找到对于预防或治疗神经退行性疾病有用的物质。
因此，本发明提供一种筛选潜在的防治神经退行性疾病药物的方法，所述的方法包括：(1)用Aβ处理NG2细胞(包括NG2细胞系)，并确定细胞吞噬Aβ的程度(包括吞噬效率)；(2)在候选物质存在下，如(1)所述处理NG2细胞，再次确定细胞吞噬Aβ的程度；和(3)比较(1)和(2)中细胞吞噬Aβ的差异；其中，如果(2)中细胞吞噬Aβ的程度在统计学上高于(1)中细胞吞噬Aβ的程度，则所述候选物质是潜在的防治神经退行性疾病的药物。
进一步地，还可以通过(i)比较(1)和(2)中Aβ被转运到溶酶体中的量；(ii)比较(1)和(2)中Aβ被降解(或被清除)的效率；(iii)比较(1)和(2)中的自噬体数量；(iv)比较(1)和(2)中的lamp1、lamp2、LC3-II、P62或beclin1基因或它们编码的蛋白的表达情况；来确定候选物质的有效性。
所述的候选物质可以来源自现有的一些蛋白库或化合物库中。例如选自：肽、聚合肽、拟肽、非肽化合物、碳水化合物、脂、抗体或抗体片段、配体、有机小分子、无机小分子和核酸序列。通常本领域人员清楚如何获得这种用于筛选的库。有目的地选择细胞活性促进剂、细胞膜通透化试剂、对于促进细胞内吞或吞噬作用有用的试剂等，将提高筛选的效率。
确定存在或不存在候选物质的情况下Aβ的吞噬程度的差异可以采用任何本领域已知的方法。具体例如可通过荧光标记或染色的方法来进行定位或定量，此外免疫荧光标记结合流式细胞仪是有效定量Aβ定位的方法。也可以将细胞种在多孔板中，作相关候选物质处理后用荧光标记定位，然后用酶标仪读数，比较候选物质存在与不存在情况下的差异，来确定此候选物质是否可作为潜在的防治神经退行性疾病的药物。
如果在加入与不加入候选物质的情况下Aβ被吞噬或降解的差异是显著的或者超过了某个阈值，则候选试剂可能对于防治神经退行性疾病是有效的。如果差异不显著，则可以用另一候选物质重复所述步骤进行筛选。通常，本领域技术人员可同时试验多种候选物质，例如通过使用多孔板或其它高通量方法。
作为一种优选的方式，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，选择和确定对于防治神经退行性疾病有用的物质。
这些初步筛选出的物质可构成一个筛选库，以便于人们最终可以从中筛选出能够对于预防或治疗神经退行性疾病确定有用的物质。
基于本发明人的新发现，本发明还提供了一促进NG2细胞吞噬Aβ的物质，所述的物质可用于制备对于防治神经退行性疾病有用的药物。任何可促进NG2细胞吞噬Aβ的物质均可用于本发明，作为潜在的防治神经退行性疾病药物。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
I.材料和方法
1.免疫组化荧光双标
(1)脑组织切片(脑片)在0.1M磷酸缓冲液配制的0.3%TritonX-100中室温处理10分钟。
(2)在抗体封闭液(1%牛血清白蛋白，0.3%TritonX-100于0.1M磷酸缓冲液)中室温封闭1小时。
(3)脑片转入一抗中，4℃孵育过夜。第二天用PBS洗3次，每次20分钟。
(4)脑片转入二抗中，室温避光孵育2小时。PBS洗3次，每次20分钟。
(5)标记完第一个抗体的脑片接着进行第二个抗体的标记，进行荧光双标。第二个抗体的标记过程与第一个抗体的标记过程完全相同。
(6)两个抗体都标记完成后，进行细胞核的DAPI染色。脑片于1μg/mlDAPI溶液中孵育5分钟，然后用PBS洗3次，每次10分钟。
(7)染完色的脑片进行贴片，水分晾干后用抗淬灭封片剂封片。
(8)片子在双光子共聚焦激光显微镜下观察，拍照得到实验结果图片。
一抗用抗体封闭液按以下稀释倍数配制：NG2(兔，1:500)，6E10(小鼠，1:500)，IbaI(兔1:2000；山羊1:200)，GFAP(小鼠1:1000)，NeuN(兔，1:1000)。
二抗用抗体封闭液按以下稀释倍数配制：AlexaFluor488或HiLyteFluor555标记的羊抗鼠，羊抗兔，驴抗羊的二抗均为1:1000。
部分荧光双标染色为先进行Iba1，GFAP，NeuN和NG2免疫荧光染色然后再与硫磺素S染色结合，进行荧光双标。
| 抗体名称 | 来源 |
| Anti-NG2(兔，AB5320) | Chemicon |
| Anti-NeuN(小鼠，MAB377) | Chemicon |
| Anti-Beclin1(兔，3495s) | Cell Signaling |
| Anti-6E10(小鼠，sig-39320) | Signet |
| Anti-Iba1(兔，019-19741) | Wako Pure Chemical Industries |
| Anti-Iba1(山羊，ab5076) | Abcam |
| Anti-GFAP(小鼠，G3893) | Sigma |
| LC3B(兔，L7543) | Sigma |
| P62(兔，P0067) | Sigma |
| Anti-GAPDH抗体(kc-5G5) | Kangcheng Bio-tech Inc |
| Anti-Aβ(1-42)抗体(700254) | Invitrogen |
2.硫黄素S染色
硫磺素S染色方法：(1)脑片贴到预先经明胶包被的载玻片上。(2)贴好的脑片在50%酒精配制的0.05%硫磺素S中避光染色8分钟。(3)在80%酒精中放置10秒钟。(4)重复(3)。(5)用大量蒸馏水洗三遍。(6)脑片在高浓度的磷酸缓冲液中(411mMNaCl，8.1mMKCl，30mMNa2HPO4，5.2mMKH2PO4，pH7.2)4℃孵育30分钟以上。(7)用蒸馏水冲洗一下。(8)用荧光封片剂封片。(9)片子在双光子共聚焦激光显微镜下观察，拍照得到实验结果图片。
3.细胞免疫电镜
(1)Oli-neu细胞以6×105个/孔的密度接种于6孔板中，培养18小时。
(2)用400nMAβ孵育6小时。
(3)细胞用0.01%胰酶消化，离心收集沉淀。
(4)用2.5%戊二醛将细胞重悬得单细胞悬液，室温固定1小时。离心收集细胞沉淀。
(5)用0.1MPBS洗细胞，洗3次。离心收集细胞沉淀。
(6)将细胞沉淀用2%低熔点琼脂糖包埋起来，凝固后切成小块。
(7)将细胞块在1%锇酸中室温固定1小时。
(8)细胞样品用双蒸水洗3次，再用0.1MPBS洗3次。
(9)样品梯度脱水：细胞样品在30%，50%，70%，90%酒精中于冰上各处理15分钟，换到100%酒精中室温处理20分钟，重复一次100%酒精20分钟。
(10)渗透：细胞样品依次在以下比例的渗透液中室温浸润：环氧丙烷：Epon812=1:1，1小时；环氧丙烷：Epon812=1:2，1小时；环氧丙烷：Epon812=1:3，1小时；Epon812，1小时；Epon812，1小时。
(11)包埋：在包埋板的样品槽中滴加Epon812，将细胞样品块挑放在样品槽中适当位置，于37℃12小时，45℃12小时，60℃22小时进行聚合。
(12)超薄切片包埋好的样品于超薄切片机(LeicaUC7)切片。
(13)免疫金标记：①切片用1%高碘酸钠(用双蒸水配制)室温处理10分钟。②用双蒸水洗3次，每次10分钟。③用电镜稀释液封闭(2%FBS，用无钙镁的PBS配制，过滤)，室温，30分钟。④转入一抗中(用电镜稀释液配制，Aβ(1-42)(兔1：250))，室温放置1小时，4℃过夜。⑤无钙镁PBS洗10次，每次12分钟。⑥用电镜稀释液封闭，室温，30分钟。⑦转入金标二抗中(用电镜稀释液配制，1：20)，室温放置2小时。⑧无钙镁PBS洗10次，每次12分钟。⑨用双蒸水洗2次，每次5秒钟。⑩铅铀染色。
(14)切片观察：完成免疫标记的切片于JoelJEM-1230透射电子显微镜下观察。
4.细胞培养
原代NG2细胞和小胶质细胞的培养方法如下：
(1)大脑皮质取材于出生1-2天的SD大鼠，剪碎后在0.025%的胰酶溶液中37℃消化15-20分钟。
(2)中和胰酶，离心取沉淀。用含4U/mL脱氧核糖核酸酶I的缓冲液重悬，轻轻吹打成细胞悬液，离心。
(3)细胞沉淀用含10%胎牛血清，10%马血清，100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM培养基重悬，接种于用100ug/ml多聚赖氨酸包被的75cm2组织培养瓶中，在37℃，5%CO2的培养箱中培养7到10天。期间不换液。
(4)培养7-10天后，培养瓶口封上封口膜，230转/分在摇床上摇3小时。
(5)培养液内悬浮的细胞即为小胶质细胞。离心收集后以1.3×106个/孔的密度接种于6孔板中，以含有10%胎牛血清，10%马血清，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM培养基培养。
(6)培养瓶中重新加入10ml预热的含有10%胎牛血清，10%马血清，100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM培养基。
(7)将培养瓶口用封口膜封上，用260转/分钟的转速在摇床上摇20小时。
(8)将含有悬浮细胞的培养基转移到Petri培养皿中，在细胞培养箱中孵育30分钟。轻轻摇晃，收集非贴壁的细胞(即为NG2细胞)，以5×104个/孔的密度接种于24孔板中已预先包被多聚赖氨酸的玻片上，或6×105个/孔的密度接种于6孔板中，以含有1%马血清，10ng/ml血小板衍生生长因子和5ng/ml基本成纤维细胞生长因子的SATO培养基培养。
少突胶质细胞前体细胞系Oli-neu细胞获自德国美因茨大学(约翰内斯·古腾堡)，培养于多聚赖氨酸包被的培养皿中，用含1%马血清的SATO培养基培养。
5.细胞免疫荧光
5.1检测Aβ的吞噬
(1)原代NG2细胞和Oli-neu细胞分别以5×104个/孔和3×104个/孔的密度接种于24孔板中包被有多聚赖氨酸的玻片上，培养18小时。
(2)用2uMHiLyteFluor555或者AlexaFluor488标记的Aβ孵育24小时。
(3)用4%多聚甲醛固定30分钟后用0.1%Triton-X100室温处理10分钟。
(4)用磷酸盐缓冲液洗3次，每次15分钟。
(5)用抗体封闭液(含3%牛血清白蛋白，0.1%TritonX-100的磷酸缓冲液配制)封闭，室温1小时。
(6)细胞转入一抗，4℃孵育过夜。抗NG2的一抗用抗体封闭液按1：500的稀释倍数配制。第二天磷酸盐缓冲液洗3次，每次15分钟。
(7)细胞转入二抗，室温孵育2小时。AlexaFluor488或HiLyteFluor555标记的荧光二抗按1：1000的稀释倍数用抗体封闭液配制。磷酸盐缓冲液洗3次，每次15分钟。
(8)抗体标记完成后，进行细胞核的DAPI染色。细胞于1μg/mlDAPI溶液中孵育5分钟，然后用PBS洗3次，每次10分钟。
(9)标记完抗体的细胞玻片用抗淬灭封片剂封片。
(10)片子在双光子共聚焦激光显微镜下观察，拍照得到实验结果图片。
5.2检测吞噬Aβ的时程效应
(1)Oli-neu细胞以3×104个/孔的密度接种于24孔板中包被有多聚赖氨酸的玻片上，培养18小时。
(2)用400nMHiLyteFluor488标记的Aβ孵育不同时间点。
(3)用4%多聚甲醛固定30分钟后用0.1%Triton-X100室温处理10分钟。
(4)用磷酸盐缓冲液洗3次，每次15分钟。
(5)用抗体封闭液(含3%牛血清白蛋白，0.1%TritonX-100的磷酸缓冲液配制)封闭，室温1小时。
(6)细胞转入一抗，4℃孵育过夜。抗NG2的一抗用抗体封闭液按1：500的稀释倍数配制。第二天磷酸盐缓冲液洗3次，每次15分钟。
(7)细胞转入二抗，室温孵育2小时。Alexa555标记的荧光二抗按1：1000的稀释倍数用抗体封闭液配制。磷酸盐缓冲液洗3次，每次15分钟。
(8)抗体标记完成后，进行细胞核的DAPI染色。细胞于1μg/mlDAPI溶液中孵育5分钟，然后用PBS洗3次，每次10分钟。
(9)标记完抗体的细胞玻片用抗淬灭封片剂封片。
(10)片子在双光子共聚焦激光显微镜下观察，拍照得到实验结果图片。
5.3检测吞噬后Aβ的细胞内定位
5.3.1自噬体
(1)Oli-neu细胞以3×104个/孔的密度接种于24孔板中包被有多聚赖氨酸的玻片上，培养18小时。
(2)用400nMHiLyteFluor488标记的Aβ孵育24小时。
(3)用4%多聚甲醛固定30分钟后用0.1%Triton-X100室温处理10分钟。
(4)用磷酸盐缓冲液洗3次，每次15分钟。
(5)用抗体封闭液(含3%牛血清白蛋白，0.1%TritonX-100的磷酸缓冲液配制)封闭，室温1小时。
(6)细胞转入一抗，4℃孵育过夜。抗LC3的一抗用抗体封闭液按1：500的稀释倍数配制。第二天磷酸盐缓冲液洗3次，每次15分钟。
(7)细胞转入二抗，室温孵育2小时。Alexa555标记的荧光二抗按1：1000的稀释倍数用抗体封闭液配制。磷酸盐缓冲液洗3次，每次15分钟。
(8)抗体标记完成后，进行细胞核的DAPI染色。细胞于1μg/mlDAPI溶液中孵育5分钟，然后用PBS洗3次，每次10分钟。
(9)标记完抗体的细胞玻片用抗淬灭封片剂封片。
(10)片子在双光子共聚焦激光显微镜下观察，拍照。经Photoshop9.0软件编辑得到实验结果图片。
5.3.2溶酶体
(1)Oli-neu细胞以3×104个/孔的密度接种于24孔板中包被有多聚赖氨酸的玻片上，培养18小时。
(2)用400nMHiLyteFluor488标记的Aβ孵育24小时。
(3)将40nM溶酶体示踪剂加入细胞培养基孵育30分钟以标记溶酶体。
(4)用4%多聚甲醛固定30分钟后用0.1%Triton-X100室温处理10分钟。磷酸盐缓冲液洗3次，每次15分钟。
(5)进行细胞核的DAPI染色。细胞于1μg/mlDAPI溶液中孵育5分钟，然后用PBS洗3次，每次10分钟。
(6)细胞玻片用抗淬灭封片剂封片。
(7)片子在双光子共聚焦激光显微镜下观察，拍照得到实验结果图片。
6.流式细胞检测
(1)原代NG2细胞和Oli-neu细胞分别以6×105个/孔和2×105个/孔的密度接种于6孔板，培养过夜。
(2)给细胞换液并用400nMAlexaFluor488标记的Aβ孵育不同时间点。如果要同时检测抑制剂作用，则提前半小时用抑制剂处理细胞。
(3)细胞用PBS洗一遍后用0.01%胰酶将细胞消化下来，离心收集细胞沉淀。再用PBS重悬细胞，离心收集细胞沉淀。
(4)细胞用PBS再次重悬得单细胞悬液，用配有FITC信号检测器FL1(激发光488nM，绿色)的FACScan流式细胞仪(BD公司)进行检测。
7.检测Aβ降解
检测Oli-neu细胞中Aβ的降解方法如下：(1)Oli-neu细胞以5×105个/孔的密度接种于6孔板，用含有1%马血清的Sato培养基培养。(2)用400nMAβ孵育细胞。在不同时间点，收取细胞蛋白和培养基上清，分别进行免疫印迹分析，用抗体6E10检测细胞胞内和培养基上清中Aβ含量。(3)检测抑制剂作用时，细胞先与400nMAβ孵育6小时，然后再分别将抑制剂亮肽素(leupeptin，20μM)，胃酶抑素A(pepstatinA，20μM)，渥曼青霉素(wortmannin)，MG132(1nM)或巴佛洛霉素A1(bafilomycinA1，0.2nM)加入细胞培养基中孵育18小时，使400nMAβ孵育时间一共为24小时。然后再收取细胞蛋白和培养基上清，分别进行免疫印迹分析，用抗体6E10检测细胞胞内和培养基上清中Aβ含量。(4)检测小胶质细胞中抑制剂对Aβ降解的影响作用。原代小胶质细胞以1.3×106个/孔的密度接种于6孔板中，以含有10%胎牛血清，10%马血清，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM培养基培养，然后用400nMAβ分别与0.2%DMSO，wortmannin(700nM)，bafilomycin(4nM)，leupeptin(20μM)或者MG132(200nM)处理12小时。收取细胞蛋白进行免疫印迹分析，用抗体6E10检测细胞胞内Aβ含量。
8.Aβ免疫印迹分析
8.1Tricine-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
Aβ免疫印迹分析方法如下：(1)细胞蛋白提取：细胞用胰酶消化后离心收集细胞沉淀，用含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液裂解，在冰上放置30min。加入上样缓冲液，于100℃煮7分钟，可存放与-80℃或直接上样电泳。
(2)电泳：Tricine-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳槽内为阴极缓冲液，外为阳极缓冲液。以恒流10mA/0.75mm跑胶，使前端溴芬蓝到达分离胶上部，增加电流至20mA/0.75mm，直到溴芬蓝到达分离胶下部。
(3)转膜：孔径为0.2μm的硝酸纤维素膜(购自Schleicher&Schuell公司)，湿转，380mA，一小时。
(4)膜用PBS-T(PBS+0.02%Tween20)充分洗涤，5%脱脂奶粉(溶于PBS-T)室温下封闭1小时。PBS-T洗涤5分钟。
(5)转入一抗溶液，用含5%牛血清白蛋白的PBS-T溶液稀释抗体。6E10的单克隆抗体按1:1000稀释。4℃孵育过夜。
(6)PBS-T洗涤3次，每次洗15分钟。
(7)膜转入辣根过氧化物耦连的相应二抗溶液，室温孵育1小时。
(8)PBS-T洗涤3次，每次洗15分钟。
(9)ECL溶液(购自GEhealthcare公司)显色，暗室中X光胶片显色。
(10)利用QuantityOne软件(购自Bio-Rad公司)对胶片条带的密度进行定量测定。
8.2常规免疫印迹分析方法
(1)细胞蛋白提取：细胞用胰酶消化后离心收集细胞沉淀，用含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液裂解，在冰上放置30min。加入上样缓冲液，于100℃煮7分钟，可存放于-80℃或上样电泳。
(2)电泳：配制15%的聚丙烯酰胺凝胶，以20mA恒流电泳，至前端溴酚蓝到达胶底部。
(3)转膜：孔径为0.2μm的硝酸纤维素膜(购自Schleicher&Schuell公司)，湿转，100V，80分钟。
(4)膜用PBS-T(PBS+0.02%Tween20)充分洗涤，5%脱脂奶粉(溶于PBS-T)室温下封闭2小时。PBS-T洗涤5分钟。
(5)转入一抗溶液，用含5%牛血清白蛋白的PBS-T溶液稀释抗体。一抗按以下稀释度稀释：LC3-1:2000，Beclin1-1:2000，P62-1:2000，GAPDH-1:10000。4℃孵育过夜。
(6)PBS-T洗涤3次，每次洗15分钟。
(7)膜转入辣根过氧化物耦连的相应二抗溶液，室温孵育1小时。
(8)PBS-T洗涤3次，每次洗15分钟。
(9)ECL溶液(购自GEhealthcare公司)显色，暗室中X光胶片显色。
(10)利用QuantityOne软件(购自Bio-Rad公司)对胶片条带的密度进行定量测定。
9.实时定量PCR
RNA定量后每样品取1μg用于逆转录，按照Takara公司提供的说明书进行逆转录，得到的cDNA用于realtime-PCR检测。实时定量PCR用ABI公司7900仪器完成，PCR体系及引物如下：
| SYBR Green | 5μl |
| cDNA模板 | 0.45μl |
| 顺式引物 | 1μl |
| 反式引物 | 1μl |
| 水 | 2.55μl |
| 基因 | SEQ ID NO: | Realtime-PCR引物 |
| Mouse-LAMP1-顺式 | 1 | CAGCACTCTTTGAGGTGAAAAAC |
| Mouse-LAMP1-反式 | 2 | ACGATCTGAGAACCATTCGCA |
| Mouse-LAMP2-顺式 | 3 | ATATGTGCAACAAAGAGCAGGT |
| Mouse-LAMP2-反式 | 4 | TGCCAATTAGGTAAGCAATCACT |
| Mouse-Actin-顺式 | 5 | CAACGAGCGGTTCCGAT |
| Mouse-Actin-反式 | 6 | GCCACAGGATTCCATACCCA |
10.质粒构建
人源微管相关蛋白1轻链3beta(MAP1LC3B，GeneID:81631)克隆自HEK-293细胞(ATCC，CRL-1573)，克隆正向引物为(5′-CAACAAGCTTCCATGCCGTCGGAGAAGACC-3′(SEQIDNO:13))，反向引物为(5′-CGCGGATCCTTACACTGACAATTTCATCCCG-3′(SEQIDNO:14))，将其克隆于载体mCherry-C1(购自Clontech公司)，酶切位点为HindIII和BamHI。质粒序列经Invitrogen公司测序验证。
11.质粒的转化及保存
(1)取100μl感受态细胞，冰上融化。在无菌条件下加入100ng质粒，轻弹混匀置于冰上30min。(2)42℃水浴，热击细胞90秒，立即置于冰上不少于2分钟，每管加1mlLB液体培养基，200rpm，37℃培养45分钟。(3)取100μl培养液涂于相应抗性平板，37℃培养过夜。(4)挑取单克隆细菌培养于5ml培养基中37℃，300rpm摇床过夜。(5)取过夜培养的细菌500μl与等体积甘油混合，保存于-80℃超低温冰箱中。
12.细胞转染和RNA干扰
设计小分子干扰核糖核酸降低自噬过程中关键蛋白beclin1的表达。针对鼠源beclin1一共合成两对小分子干扰核糖核酸，序列分别为：
siRNA-1：正向序列5’-GAGGAGCCAUUUAUUGAAACUCG-3’(SEQIDNO:7)；
反向序列5’-CGAGUUUCAAUAAAUGGCUCCUC-3’(SEQIDNO:8)；
siRNA-2：正向序列5’-GGACAACAAGUUUGACCAUGC-3’(SEQIDNO:9)；
反向序列5’-GCAUGGUCAAACUUGUUGUCC-3’(SEQIDNO:10)。
同时，与GenBank中的序列不能匹配的寡核苷酸被用作对照组小分子核糖核酸，siRNAcontrol：正向序列5’-GCGACGAUCUGCCUAAGAU-3’(SEQIDNO:11)；反向序列5’-AUCUUAGGCAGAUCGUCGC-3’(SEQIDNO:12)。
以上三组小分子核糖核酸依照公司提供的操作方法配制为20μM贮液，保存于-20℃。转染前24小时将细胞以合适密度接种，用无抗生素生长培养基培养。转染试剂为LipofectamineTM2000或RNAiMAX(Invitrogen)，转染过程依据公司的指示。转染后，细胞再培养24小时，然后再做相应的实验检测。
13.定量mCherry-LC3点状点
(1)质粒mCherry-LC3用Lipofectamine2000瞬转入Oli-neu细胞，6小时后，细胞用400nMAlexaFluor488标记的Aβ孵育18小时。
(2)细胞用4%多聚甲醛固定30分钟，用0.1%Triton-X100室温处理10分钟。
(3)细胞用磷酸盐缓冲液洗3次，每次15分钟。
(4)进行细胞核的DAPI染色。细胞于1μg/mlDAPI溶液中孵育5分钟，然后用PBS洗3次，每次10分钟。
(5)细胞玻片用抗淬灭封片剂封片。
(6)片子在荧光显微镜下观察。荧光显微镜为奥林巴斯BX51显微镜系统，配备一台数码相机(奥林巴斯DP72数码相机系统)。
(7)定量mCherry-LC3点状点数量。将细胞分为以下两类：第一类为细胞胞体内是mCherry-LC3的弥散红色荧光；另一类细胞胞体内有mCherry-LC3红色荧光形成的点状点(大于20个点每个细胞)，代表自噬的形成。每个样品选取至少200个细胞进行定量，并且进行了三次独立的实验。结果显示的是胞体内有mCherry-LC3点状点的细胞占用来计数的所有细胞数的百分比。
14.统计分析
实验数据用GraphpadPrism4.0软件分析。三次独立实验的数据用one-wayANOVA中的Newman-Keuls分析实现。两组数值比较用student’sT检验(bafilomycinA1和MG132处理)。数据以“均值±标准差”表示。当P值小于0.05时认为有统计学差异。*P<0.05，**P<0.01。
II.具体实施例
实施例1、NG2细胞在淀粉样蛋白斑周围被激活
获得14月龄APPswe/PS1转基因鼠(JacksonLab，克隆号004462)和没有APPswe/PS1转基因的对照鼠(C57BL/6J*C3H/HeJ)的脑组织切片(脑片)，对大脑皮质的NG2细胞进行免疫组织化学染色和斑块硫黄素-S染色。NG2阳性细胞在对照鼠的大脑皮质中呈均匀分布，在APPswe/PS1转基因鼠中则聚集在淀粉样蛋白斑周围，如图1A-B所示。
实施例2、NG2细胞是一种新的聚集在淀粉样蛋白斑周围的细胞类型
对APPswe/PS1转基因鼠大脑皮质进行免疫组织化学染色。如图2，硫黄素-S染色显示淀粉样蛋白斑，Iba1显示小胶质细胞，GFAP显示星形胶质细胞，NeuN显示神经元。结果表明，Iba1阳性的小胶质细胞和GFAP阳性的星形胶质细胞聚集在淀粉样蛋白斑周围，而在淀粉样蛋白斑所在位置不存在NeuN阳性的神经元。
对APPswe/PS1转基因鼠大脑皮质进行免疫组织化学双标。将大脑皮质进行NG2和GFAP、NeuN或Iba1双标。结果如图3，表明NG2阳性细胞与GFAP阳性的星形胶质细胞，NeuN阳性的神经元和Iba1阳性的小胶质细胞没有共定位。结果证明，NG2细胞是一种新的聚集在淀粉样蛋白斑周围的细胞类型，其在淀粉样蛋白斑周围被激活。
实施例3、原代NG2细胞和oli-neu细胞系能吞噬Aβ
将原代NG2细胞和Oli-neu细胞接种于24孔板的玻片上，培养18小时后用2μM的荧光标记(HiLyteFluor488标记)的Aβ孵育24小时。细胞固定后进行NG2抗体的细胞免疫荧光染色。结果如图4A-B，表明Aβ能被吞噬到原代NG2细胞和Oli-neu细胞胞体中。
实施例4、外源Aβ能被NG2细胞吞噬到细胞胞质内
细胞免疫荧光检测Aβ吞噬过程。NG2细胞用400nM荧光标记(HiLyteFluor488标记)的Aβ处理不同时间点，固定后用NG2抗体进行细胞免疫荧光染色。结果如图6A，表明3小时Aβ能进入到NG2阳性细胞，6小时有增加趋势，可见Aβ吞噬过程具有时间依赖性。
流式细胞术检测NG2阳性细胞吞噬Aβ的过程。Oli-neu细胞和原代NG2细胞用400nM荧光标记(HiLyteFluor488标记)的Aβ处理不同时间点。细胞所吞噬的Aβ含量通过流式细胞仪检测胞内荧光强度来定量。结果如图6B-C，可见荧光强度逐渐增强，表明了被吞噬的Aβ的递增。
实施例5、Oli-neu细胞和原代NG2细胞对Aβ的吞噬呈时间依赖性
利用透射免疫电镜显示NG2细胞中的Aβ。Oli-neu细胞用Aβ处理6小时后用于免疫电镜实验，超薄切片用抗Aβ的一抗和结合18nm胶体金颗粒二抗标记。结果如图5，图中所嵌高倍图像为方框区域所示，证实了外源Aβ能被NG2细胞吞噬到细胞胞质内。
实施例6、肌动蛋白参与oli-neu细胞对Aβ的吞噬过程
现有技术中有认为称微管蛋白解聚和肌动蛋白聚合对巨胞饮的形成是必需的。为了加以验证，本发明人将Oli-neu细胞用细胞松弛素D(5μg/mlcytochalasinD，CytoD，为肌动蛋白聚集形式抑制剂)和噻氨酯哒唑(150nMnocodazole，NCDZ，已知能破坏微管蛋白动态变化)预处理30分钟，对照组加入等量DMSO，然后各组再用400nM荧光标记Aβ处理不同时间点。细胞所吞噬的Aβ含量通过流式细胞仪检测胞内荧光强度来定量。结果如图7，用CytochalasinD处理细胞后，通过流式检测发现细胞吞噬Aβ的量与对照组相比明显减少(A)。然而，用微管蛋白解聚的抑制剂Nocodazole处理的细胞其Aβ的吞噬量与对照组相比并没有减少(B)。从以上结果得知，Oli-neu细胞吞噬Aβ是依赖于肌动蛋白的动态变化，而不依赖于微管蛋白。
实施例7、Oli-neu能将外源的Aβ吞进胞体并将其降解
Oli-neu细胞用400nM荧光标记的Aβ处理，在不同时间点裂解细胞，进行免疫印迹实验检测NG2细胞胞内和细胞培养基中的Aβ含量，结果如图8。实验结果显示，用Aβ孵育Oli-neu细胞6小时内，胞体内的Aβ含量明显增加，说明在这段时间内细胞将胞外的Aβ吞噬进入胞体内。而6小时后，细胞胞体内的Aβ含量逐渐减少，到36小时的时候，胞体内几乎检测不到Aβ含量。同时，细胞培养基上清中的Aβ含量随时间增加逐渐减少(图10)。这些实验结果说明，Oli-neu能将外源的Aβ吞进胞体，并被转运到溶酶体中，激活了溶酶体功能，将Aβ降解。
实施例8、吞噬进入Oli-neu胞体中的Aβ能与溶酶体示踪剂共定位
NG2细胞用400nM荧光标记Aβ处理24小时，然后在细胞培养基中直接加入40nM溶酶体示踪剂，再孵育30分钟。DAPI染色用于细胞核定位。结果如图9，表明Aβ能与溶酶体示踪剂共定位，表明吞噬到NG2细胞中的Aβ被转运到溶酶体。
实施例9、Oli-neu细胞中溶酶体的两个标志基因lamp1和lamp2的表达随与Aβ孵育时间的延长而增加
NG2细胞用Aβ处理不同时间点后收集RNA，用于实时定量PCR检测lamp1和lamp2的表达，结果如图10，可见Aβ吞噬引起NG2细胞中lamp1和lamp2基因表达增强，且呈时间依赖性。
实施例10、亮肽素和胃酶抑素A都能抑制Oli-neu细胞对外源Aβ的降解
NG2细胞用Aβ孵育6小时后，加溶酶体抑制剂亮肽素(leupeptin(Leu)，20μM)和/或胃酶抑素A(pepstatinA(Pep)，20μM)处理18小时，进行蛋白免疫印迹实验。Ct为未用亮肽素和胃酶抑素A处理的细胞。结果如图11，表明与对照组相比，溶酶体抑制剂使NG2胞体内的Aβ含量增加，同时自噬相关蛋白LC3，P62，和beclin1的蛋白水平也呈上升趋势。因此，溶酶体抑制剂可以抑制NG2细胞中Aβ的降解，表明溶酶体在Aβ降解过程中发挥了作用。
NG2细胞与Aβ孵育后，在不同时间点进行蛋白免疫印迹试验，如图12，与自噬相关的LC3-II，P62和beclin1的蛋白表达增加，且随着Aβ孵育时间的延长而上升，有时间依赖性。
实施例11、外源Aβ能被转运到自噬体内
NG2细胞与400nM荧光标记的Aβ孵育24小时，再用LC3-II抗体进行细胞免疫荧光标记。DAPI染色用于细胞核定位。结果如图13，Aβ与LC3-II阳性的自噬体发生共定位，可见外源Aβ能被转运到自噬体内。
NG2细胞瞬时转染mCherry-LC3质粒后再与Aβ孵育，通过计量mCherry-LC3荧光斑点阳性细胞数量来定量自噬体形成水平。对照组（Ct）细胞转染mCherry-LC3质粒后不用Aβ孵育。结果显示mCherry-LC3荧光斑点阳性细胞百分比，如图14，可见细胞与Aβ孵育后激活了自噬过程，自噬体数量增加。
实施例12、渥曼青霉素和巴佛洛霉素A1能明显抑制Aβ的降解
NG2细胞与Aβ孵育6小时后，加浓度梯度的细胞自噬抑制剂渥曼青霉素(wortmannin，左)和巴佛洛霉素A1(bafilomycinA1(Baf)，0.2nM，右)再孵育18小时。免疫印迹实验检测Aβ，LC3，P62和beclin1蛋白水平。Ct表示不加入渥曼青霉素和巴佛洛霉素A1。
结果如图15，自噬抑制剂能抑制NG2细胞中Aβ降解，且使得LC3-II，P62蛋白水平增加。
实施例13、Aβ降解随beclin1蛋白水平的下调而降低
NG2细胞与Aβ孵育6小时后，加蛋白酶体活性抑制剂MG132(1nM)再孵育18小时。以不加入MG132为对照(Con)。免疫印迹实验检测Aβ，LC3，P62和beclin1蛋白水平。
结果如图16，可见蛋白酶体活性抑制剂能抑制NG2细胞中Aβ降解。
实施例14、药物筛选方法
测试组中，以约20种化合物为一次筛选，将原代NG2细胞种于24孔板，培养18小时后，加入候选物质处理细胞1小时。之后加入2μM的荧光标记(HiLyteFluor488标记)的Aβ孵育。同时设置对照组，条件基本同测试组，不同点在于不加入候选物质处理。
在Aβ孵育的同时，通过荧光测定，来确定细胞吞噬Aβ的效率以及细胞内Aβ的增加及降解情况。若是与对照组相比，测试组的细胞吞噬Aβ效率提高20%以上，细胞内Aβ的降解速度加快20%以上，则该候选物质是对于吞噬及降解Aβ有良好效果的物质，可以作为潜在的防治神经退行性疾病的药物。
以CytochalasinD、Nocodazole作为候选物质处理细胞后，通过流式检测发现，CytochalasinD处理后细胞吞噬Aβ的量与对照组相比发生减少；Nocodazole处理后Aβ的吞噬量与对照组相比没有显著变化。因此，CytochalasinD、Nocodazole不是对于防治神经退行性疾病有效的药物。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (11)
1.一种筛选潜在的防治神经退行性疾病的药物的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)用β淀粉样多肽处理NG2细胞，并确定细胞吞噬β淀粉样多肽的程度；
(2)在候选物质存在下，如(1)所述处理NG2细胞，再次确定细胞吞噬β淀粉样多肽的程度；和
(3)比较(1)和(2)中细胞吞噬β淀粉样多肽的差异；
其中，如果(2)中细胞吞噬β淀粉样多肽的程度在统计学上高于(1)中细胞吞噬β淀粉样多肽的程度，则所述候选物质是潜在的防治神经退行性疾病的药物；
其中，所述的神经退行性疾病是阿尔兹海默症。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(1)和(2)中，还包括：确定NG2细胞中β淀粉样多肽被转运到溶酶体中的量；并且，
(3)中，还包括：比较(1)和(2)中β淀粉样多肽被转运到溶酶体中的量；
其中，如果(2)中β淀粉样多肽被转运到溶酶体中的量在统计学上高于(1)中β淀粉样多肽被转运到溶酶体中的量，则所述候选物质是潜在的防治神经退行性疾病的药物。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(1)和(2)中，还包括：确定细胞中β淀粉样多肽被降解的效率；并且，
(3)中，还包括：比较(1)和(2)中β淀粉样多肽被降解的效率；
其中，如果(2)中β淀粉样多肽被降解的效率在统计学上高于(1)中β淀粉样多肽被降解的效率，则所述候选物质是潜在的防治神经退行性疾病的药物。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(1)和(2)中，还包括：确定细胞中自噬体数量；并且，
(3)中，还包括：比较(1)和(2)中的自噬体数量；
其中，如果(2)中自噬体数量在统计学上高于(1)中自噬体数量，则所述候选物质是潜在的防治神经退行性疾病的药物。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(1)和(2)中，还包括：确定细胞中lamp1、lamp2、LC3-II、P62或beclin1基因或它们编码的蛋白的表达情况；并且，
(3)中，还包括：比较(1)和(2)中的lamp1、lamp2、LC3-II、P62或beclin1基因或它们编码的蛋白的表达情况；
其中，如果(2)中lamp1、lamp2、LC3-II、P62或beclin1基因或它们编码的蛋白的表达在统计学上高于(1)中相应基因或蛋白的表达，则所述候选物质是潜在的防治神经退行性疾病的药物。
6.如权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于，所述的β淀粉样多肽、溶酶体或自噬体标记有可检测信号。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的可检测信号是荧光信号。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，通过鉴定β淀粉样多肽上可检测信号的定位来确定β淀粉样多肽的定位，进而确定β淀粉样多肽的吞噬程度或降解情况。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(1)或(2)中，所述的NG2细胞以50nM～50μMβ淀粉样多肽处理。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的神经退行性疾病是脑中β淀粉样多肽过量导致的神经退行性疾病。
11.一种NG2细胞的用途，其特征在于，用于制备防治神经退行性疾病的药物；所述的神经退行性疾病是阿尔兹海默症。
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