CN103529182A - rbo/Efr3a/Efr3b基因或其蛋白在诊断和治疗阿尔茨海默病中的应用 - Google Patents

Abstract

rbo/Efr3a/Efr3b基因或其蛋白在诊断和治疗阿尔茨海默病中的应用。发明人发现RBO或Efr3a蛋白分别能与Aβ特异性相互作用，揭示了AD治疗干预的新靶点。在此基础上，本发明提供了一种复合物，所述复合物由以下部分组成：(a)rbo/Efr3a/Efr3b蛋白；和(b)Aβ或寡聚体形式的Aβ；还提供了筛选预防或治疗阿尔茨海默病的药物的方法；还提供了阿尔茨海默病的诊断试剂盒；还提供了用于治疗阿尔茨海默病的药物。

Description

rbo/Efr3a/Efr3b基因或其蛋白在诊断和治疗阿尔茨海默病中的应用

技术领域

本发明涉及阿尔茨海默病的诊断和治疗领域。更具体地说，本发明涉及rbo/Efr3a/Efr3b基因或其蛋白在诊断和治疗阿尔茨海默病中的应用、利用rbo/Efr3a/Efr3b基因或其蛋白诊断和治疗阿尔茨海默病的方法以及相关的试剂盒。

背景技术

阿尔茨海默病(AD)是老年人中最常见的神经退行性疾病，以进行性学习记忆能力丧失为特征。突触功能异常和丢失被广泛认为是AD学习记忆障碍的细胞机制[1-4]。Aβ积累在AD多种病理改变中起着重要作用，包括突触功能异常和丢失、线粒体异常、炎症和神经元死亡等[2，5-8]。但是，Aβ积累与这些病理改变之间的细胞分子机制还不清楚。

Aβ在AD病人和动物模型的脑内以散在沉淀和纤维状斑块形式积累。大量研究表明从AD病理改变早期起，神经元内就有Aβ积累，并可能在突触障碍、淀粉样肽斑块形成和神经元死亡中起重要作用[9-13]。此外，被认为对突触和认知功能最具破坏力的寡聚状Aβ[4、14、15]在细胞内形成[16]并在AD病人神经元内积累[17]。另外，与细胞膜偶联的Aβ单体和二聚体能在AD型痴呆病人大脑的颞叶和额叶检测到，而不能在非AD型痴呆病人和对照组的相应脑区检测到[18]。这些结果提示神经元内和神经元细胞膜上的Aβ在AD病理改变中起重要作用。

神经元内Aβ积累可由胞外的Aβ内吞（internalization）或胞内产生的Aβ滞留所致[10]。在培养细胞中，胞外Aβ内吞涉及到几个Aβ结合蛋白[10]，包括α7尼古丁型乙酰胆碱受体(α7nAChR)[19]、低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP1)、硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)[20、21]、晚期糖基化终产物受体(RAGE)[22]等。但是，这些蛋白在体内是否直接参与神经元内Aβ积累还不清楚。

果蝇是生物科学领域重要的模式生物之一，被用于研究多种人类疾病的机理，如癌症、心血管疾病以及多种神经系统疾病。在以果蝇为模型的生命科学研究中，果蝇的行为，尤其是运动能力是重要的检测指标之一。这一检测数据可被广泛用于评估基因型及环境对果蝇的影响。

果蝇作为具有自由运动能力的生物具有趋性，即对外部刺激的反应而引起运动。在单向的重力刺激下，果蝇会有逆向的行动反应，即负趋地性。利用果蝇这一特性，生物科学工作者找到了检测果蝇的爬管能力的方法，以比较不同基因型或者环境因子对果蝇运动能力的作用：轻敲果蝇，将其震落至管底部，随后果蝇由于负趋地性会向与重力相反的方向爬行。生物科学工作者通过记录固定时间内果蝇爬行的距离，从而可以比较其运动能力。

但是这种传统的果蝇爬管能力的检测方法具有一定的局限性。以人力震动果蝇所在的管，力度容易有差异，从而影响实验结果。如果需要大批量对果蝇运动能力进行评估，会占用生物科学工作者较长的时间，且实验后的数据分析同样会耗费较大的时间、精力。

因此，本领域还急需操作简便、实验差异性低，再现性高、精确的自动检测果蝇爬管能力的系统。

发明内容

本发明的目的是提供用于筛选诊断和治疗阿尔茨海默病的药物的物质以及筛选方法、诊断和治疗阿尔茨海默病的方法和相关的试剂盒。

本发明的目的还在于提供一种自动检测模型动物运动能力的系统。

在第一方面，本发明提供一种复合物，所述复合物由以下部分组成：

(a)rbo/Efrr3a/Efr3b蛋白；和

(b)Aβ或寡聚体形式的Aβ。

在第二方面，本发明提供本发明第一方面所述的复合物在筛选预防或治疗阿尔茨海默病的药物中的应用。

在第三方面，本发明提供一种筛选预防或治疗阿尔茨海默病的药物的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)将待测物质加入包含rbo/Efr3a/Efr3b蛋白和Aβ或寡聚体形式的Aβ的体系中；和

(b)检测本发明第一方面所述复合物的形成；

如果与未加入所述待测物质的包含rbo/Efr3a/Efr3b蛋白和Aβ或寡聚体形式的Aβ的对照体系相比，本发明第一方面所述复合物的形成减少，则所述待测物质为预防或治疗阿尔茨海默病的药物。

在第四方面，本发明提供一种筛选预防或治疗阿尔茨海默病的药物的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)构建过表达rbo/Efr3a/Efr3b蛋白的动物模型；

(b)将待测物质给予所述动物模型；和

(c)检测所述动物模型中本发明第一方面所述复合物的形成；

如果与未给予所述待测物质的对照动物模型相比，本发明第一方面所述复合物的形成减少，则所述待测物质为预防或治疗阿尔茨海默病的药物。

在第五方面，本发明提供rbo/Efr3a/Efr3b基因或其蛋白的用途，所述rbo/Efr3a/Efr3b基因或其蛋白用于筛选预防或治疗阿尔茨海默病的药物。

在第六方面，本发明提供一种预防或治疗阿尔茨海默病的药物的筛选方法，所述方法包括以下步骤：

(a)将待测物质施用于正常动物或rbo/Efr3a/Efr3b基因或其蛋白的表达或活性增强的动物；和

(b)检测所述动物中rbo/Efr3a/Efr3b基因或其蛋白的表达或活性情况；

如果与所述正常动物或rbo/Efr3a/Efr3b基因或其蛋白的表达或活性增强的动物相比，所述待测物质施用后，rbo/Efr3a/Efr3b基因或其蛋白的表达或活性降低，则所述待测物质是预防或治疗阿尔茨海默病的药物。

在一优选例中，所述动物是果蝇或小鼠。

在第七方面，本发明提供一种诊断试剂盒，所述试剂盒包括以下部分：

(a)用于检测rbo/Efr3a/Efr3b基因或其蛋白的表达或活性的试剂；

(b)用于盛放所述检测试剂的容器；和

(c)利用所述检测试剂检测rbo/Efr3a/Efr3b基因或其蛋白的表达或活性的使用说明书。

在第八方面，本发明提供rbo/Efr3a/Efr3b基因或其蛋白的抑制剂的用途，所述rbo/Efr3a/Efr3b基因或其蛋白的抑制剂用于制备预防或治疗阿尔茨海默病的药物。

在一优选例中，所述抑制剂包括所述rbo/Efr3a/Efr3b基因的反义RNA或miRNA，或所述rbo/Efr3a/Efr3b基因的蛋白的抗体。

在一优选例中，所述miRNA包括SEQ ID NO:1-4所示的miRNA寡聚片段，更优选SEQ ID NO:1所示的miRNA寡聚片段。

在一优选例中，所述抗体包括多克隆抗体、单克隆抗体、或抗血清。

在第九方面，本发明提供一种诊断阿尔茨海默病的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)检测待测对象中rbo/Efr3a/Efr3b基因或其蛋白的表达或活性；

如果与正常对照相比，所述rbo/Efr3a/Efr3b基因或其蛋白的表达或活性升高，则判断所述待测对象患有阿尔茨海默病。

在第十方面，本发明提供一种自动检测模型动物运动能力的系统，所述系统包括：a)固定有支撑杆的底座；b)开放式箱体；c)用于放置模型动物的两根或多根透明管；d)提升装置；e)监控装置；和f)处理器；

其中，所述透明管固定于箱体中；所述箱体与支撑杆滑动连接；所述提升装置使得所述箱体以一定位移和频率离开所述底座，随后落在所述底座上，从而使得模型动物处于所述透明管的底部；所述监控装置记录模型动物沿所述透明管管壁的爬行情况；和所述处理器用于测量各模型动物在开始爬管后任何时间点的所在高度。

在一优选例中，所述模型动物是啮齿类动物或昆虫；优选地，所述模型动物是果蝇。

在一优选例中，所述提升装置包括步进驱动器，和电机。

在进一步的优选例中，所述电机转动与其相连的杠杆将所述箱体提升离开所述底座一定距离，然后释放，所述箱体依重力落在所述底座上；而所述步进驱动器控制电机的运转时间、间隔时间，从而控制所述箱体的提升高度以及提升和释放的次数，以便确保所述透明管中的模型动物处于所述透明管的底部。

在一优选例中，所述箱体由不易破碎的硬质材料制成。在另一优选例中，所述硬质材料是金属。

在一优选例中，所述透明管由透明的硬质材料制成。在另一优选例中，所述透明的硬质材料是有机玻璃或塑料。在另一优选例中，所述透明的硬质材料是塑料。

在一优选例中，所述透明管中的模型动物数量为1-15只；优选地为5-12只；最优选8-10只。

在一优选例中，所述监控装置是摄像机，其可记录透明塑料管中果蝇的运动情况。在另一优选例中，所述摄像机是数码摄像机或磁带摄像机。

在一优选例中，所述处理器根据配套的电脑程序自动探索截图中果蝇的位置，以便进行数据分析。

在一优选例中，所述箱体的提升高度是3-10cm；在另一优选例中，所述箱体的提升高度是4-8cm；在另一优选例中，所述箱体的提升高度是5-6cm。

在一优选例中，所述箱体的提升和释放次数是2-5次；在另一优选例中，所述箱体的提升和释放次数是4次。

在第十一方面，本发明提供本发明第十方面所述系统在检测模型动物运动能力中的用途。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了rbo功能部分丧失在表达Aβ_arc的果蝇中抑制神经损伤的作用。

(A)rbo功能不全缓解了表达Aβ_arc的果蝇的日龄依赖的爬管能力衰退。“ctrl”是对照果蝇，只带有单拷贝的[Gal4]A307或[UAS]Aβ_arc转基因；“rbo^ts1”和“rbo²”代表突变体果蝇，分别带有[Gal4]A307或[UAS]Aβ_arc转基因以及杂合突变的“rbo^ts1”或“rbo²”。“Aβ_arc”代表[Gal4]A307/[UAS]Aβ_arc双转基因果蝇；“Aβ_arc-rbo^ts1”、“Aβ_arc-rbo²”、“Aβarc-rbo^ts1/rbo²”指分别带有杂合突变rbo^ts1或rbo²，或者rbo^ts1和rbo²的Aβ_arc果蝇。对于每个数据点来说，总计30只雄果蝇，平均分为三组，用每组平均爬管高度计算每个数据点的均值，故n＝3。p值通过T检验得到。

(B)rbo功能部分丧失延长了Aβ_arc果蝇的寿命。每个品系200只果蝇。p值通过Log Rank检验得到。

(C)rbo功能部分丧失抑制了arctic Aβ表达所导致的日龄依赖的突触传递功能损伤。羽化后第3-第7天取6~12只果蝇检测，羽化后第31-第35天取10~23只果蝇检测，p值通过Fisher’s LSD检验。

图中所有数据以及后续数据均以均值±标准误差(standard error of the mean,简称SEM)表示。“#”表示与对照组相比，p<0.05；“*”、“**”和“***”分别表示与Aβ_arc相比，p<0.05、0.01和0.001。

图2显示rbo功能部分丧失在表达Aβ₄₂的果蝇中抑制神经损伤的作用。

(A)rbo功能部分丧失在表达Aβ₄₂的果蝇中缓解了日龄依赖的爬管能力衰退。“ctrl”代表对照果蝇，只带有单拷贝的[Gal4]A307或者[UAS]Aβ₄₂转基因；“rbo^ts1”和“rbo²”代表带有单拷贝[Gal4]A307和[UAS]Aβ₄₂转基因并分别带有杂合突变“rbo^ts1”或“rbo²”的突变体果蝇。“Aβ₄₂”代表[Gal4]A307/[UAS]Aβ₄₂双转基因果蝇；“Aβ₄₂-rbo^ts1”、“Aβ₄₂-rbo²”、“Aβ₄₂-rbo^ts1/rbo²”指带有一个杂合突变rbo^ts1或者rbo²，或者rbo^ts1和rbo²的Aβ₄₂果蝇。p值通过T检验得到。

(B)rbo功能部分丧失延长了Aβ₄₂果蝇的寿命。每个品系总计200只果蝇。p值通过Log Rank检验得到。

(C)rbo功能部分丧失抑制了Aβ₄₂表达所导致的日龄依赖的突触传递功能损伤。羽化后第3-第5天取6~12只果蝇检测，羽化后第37-第39天取10~12只果蝇检测，p值通过Fisher’s LSD检验得到。

(D)rbo功能部分丧失减缓了视网膜中arctic Aβ表达导致的日龄依赖的光受体细胞死亡。从日龄30天的果蝇眼中得到的横向切片的代表图如左所示，每个单眼切片中存活的视杆数统计如右所示。Ctrl代表对照组果蝇，只带有[Gal4]GMR转基因；Aβ_arc代表[Gal4]GMR/[UAS]Aβ_arc双转基因果蝇；Aβ_arc-rbo²和Aβarc-rbo^ts1/rbo²指分别带有杂合突变rbo²或者rbo^ts1和rbo²的Aβ_arc转基因果蝇。每个品系2~3只果蝇，统计n>200单眼数。p值通过T检验得到。

“#”表示与对照组相比p<0.05；“**”和“***”表示分别与Aβ₄₂或者Aβ_arc相比，p<0.01和0.001。

图3显示了rbo过表达在表达Aβ_arc的果蝇中加重了神经元损伤。

(A)基于果蝇日龄的存活率统计。“ctrl”是对照组果蝇，只带有[Gal4]A307或者[UAS]Aβ_arc转基因；“rbo-gfpx2”是[Gal4]A307或[UAS]Aβ_arc转基因果蝇，带有双拷贝的基因组rbo-gfp转基因；“Aβ_arc”是[Gal4]A307/[UAS]Aβ_arc双转基因果蝇；“Aβ_arc;rbo-gfp×2”是带有双拷贝的基因组rbo-gfp转基因的Aβ_arc果蝇。每个品系果蝇数n=200。p值通过Log Rank检验得到。

(B)过表达rbo加重了arctic Aβ表达所引起的日龄依赖的突触传递功能损伤。羽化后第3-第7天取6~12只果蝇检测，羽化后第21-第25天取10~20只果蝇检测。p值通过T检验得到。

图4.(A)显示了产生慢病毒-Efr3a miRNA的DNA序列；(B)显示了转染后2天，利用实时PCR在过表达Efr3a的HEK293T细胞中检验的miRNA载体敲除效率。选择SR-1用于慢病毒包装。这由invitrogen在包装阶段进行。n=1；(C)显示了转染后4天，利用实时PCR在原代培养的神经元中检验的miRNA慢病毒敲除效率。n=5，p值从T-检验获得。此处的数据报道为平均值±平均值的标准偏差(SDM)。***p<0.001。

图5显示在APPswe/PresenilinΔE9转基因小鼠中沉默Efr3a的效果。

(A)海马全图与慢病毒转染的细胞全图（顶部以及底部一CA3区锥体细胞插图）。选取长度约30μm的树突切片（两箭头之间）采集图像进行统计。

(B)CA3区锥体神经元中沉默Efr3a表达的效果。CA3区树突切片代表图（顶部）和树突直径统计（底部，左方）以及切片中树突棘密度（底部，右方）。

(C)DG区颗粒神经元中沉默Efr3a表达的效果。DG区树突切片代表图（顶部）和切片中树突直径统计（底部）。

每个数据点取自3~4只动物，n≥25张切片。p值通过T检验得到。

图像用100×油镜拍摄，数值孔径=1.4，zoom值=3。

图6显示RBO蛋白与Aβ有物理相互作用。

(A)从表达Aβ_arc和RBO-GFP的果蝇中免疫共沉淀(co-IP)Aβ和RBO-eGFP。RBO-eGFP通过anti-GFP抗体检测。

(B)免疫共沉淀人工合成的Aβ和RBO_1-522-His。RBO_1-522-His通过anti-His抗体检测到。实验结果重复超过3次。

(C)使用NeutrAvidin和寡聚的人工合成的bio-Aβ从表达RBO-GFP和Efr3a-GFP的HEK293T细胞中拉下RBO-GFP和Efr3a-GFP。

(D)在表达GFP、RBO-GFP或者Efr3a-GFP的COS-7细胞中给予/不给予bio-Aβ，通过碱性磷酸酶染色bio-Aβ₄₂的代表图见左图和统计结果见右图。通过测量碱性磷酸酶染色(AP)反应产物沉积的光密度统计附着的Aβ₄₂量。每个数据点来自n=3~8幅图，每张图包含约10个细胞。数据以无Aβ处理、GFP转染的细胞均值为1，进行标准化得到。p值通过T检验得到。

图7显示了rbo功能部分丧失和过表达在神经元内Aβ积累中的作用。

(A)整体腹神经节Aβ染色。染色重复两次。图像用20×空气镜拍摄，数值孔径=0.75，zoom值=1。标有1、2、3的箭头分别对应第2纵列中逃跑通路里的“PSI”、“DLMn5”和“DLMn1-4”神经元。

(B)ELISA检测日龄31-35天的果蝇总Aβ水平，包括对照组、表达Aβ_arc、表达Aβ_arc并且带有rbo突变的果蝇。每个数据点重复n=3。

(C)ELISA检测日龄21-25天的果蝇总Aβ水平，包括表达Aβ、表达Aβ并且带有rbo过表达的果蝇。每个数据点重复n=6。p值通过T检验得到。

图8是本发明自动检测模型动物运动能力的系统的一个具体实施方式的正视图。如图所示，透明塑料管通过螺帽、垫片以及金属盒中的凹槽固定于金属盒上。当金属盒沿金属杆上下滑动时，其中的塑料管同样上下移动，使得果蝇滑落至管底。

图9是图8所示系统的侧视图，其是电机驱动金属盒上下滑动示意图。如图所示，电机运转，带动杠杆旋转，使得金属盒沿金属杆提升。当杠杆转至不接触金属盒时，金属盒受重力作用下落至原位置。从而将果蝇震落至管底。

图10是利用一种具体的本发明自动检测模型动物运动能力的系统来检测果蝇爬管能力的照片。从中可以看出，对照(Ctrl)组果蝇的运动能力正常，而Aβarc组的运动能力受损。

具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现在果蝇中，rbo基因的功能缺失突变显著减轻了AD果蝇的突触传递障碍和神经元死亡，减少了神经元内Aβ积累。而rbo过量表达加重AD果蝇的突触传递和增加神经元内Aβ积累。沉默小鼠的一个rbo同源基因（Efr3a）修复了APP/Ps1转基因小鼠海马神经元的树突和树突棘形态改变。发明人还发现RBO蛋白在体内外均与Aβ相互结合。在培养细胞中过量表达rbo增加了Aβ与细胞的结合。从而提示RBO是细胞膜上的Aβ受体，通过促进神经元内Aβ积累而介导Aβ引起的突触损伤。在此基础上完成了本发明。

在果蝇中，泛神经元过量表达Aβ₄₂导致神经元内Aβ积累和神经退行性改变，尽管Aβ的N端有分泌信号肽[23、24]。发明人在成虫果蝇的一个简单神经通路，即逃跑通路(giant fiber pathway，也称escape pathway)中过量表达含有分泌信号肽的Aβ₄₂，也发现Aβ在神经元内积累，且产生了一系列日龄依赖的(age-dependent)突触结构和功能改变，包括突触功能受损、突触前线粒体与突触小泡的丢失[25]。发明人以此AD果蝇为模型，遗传筛选影响Aβ在神经元内积累导致的突触异常的调控分子。rbo基因编码一个高度保守的膜整合蛋白，参与果蝇突触传递和光转导[26-28]，发明人发现rbo功能部分丢失就可以显著抑制日龄依赖的突触功能损伤，并且在AD果蝇模型中减少神经元内Aβ的积累。此外，发明人在APP/PS1转基因小鼠中沉默了rbo同源基因Efr3a，发现其海马神经元中树突和树突棘的萎缩得到缓解。进一步的免疫共沉淀等生化实验证实，RBO与Aβ有直接相互作用。这些结果提示，RBO与Aβ之间的相互作用可能促进神经元中Aβ的积累，导致Aβ诱导的突触功能丧失以及神经退行性变的发生。

rbo/Efr3a/Efr3b基因或其蛋白

本文所用的术语“rbo/Efr3a/Efr3b基因”指源自果蝇的rbo基因或源自小鼠的Efr3a或源自人的Efr3b基因。类似地，本文所用的术语“rbo/Efr3a/Efr3b蛋白”指源自果蝇的rbo基因或源自小鼠的Efr3a或源自人的Efr3b基因编码的蛋白。

Aβ

Aβ即β-淀粉样蛋白，由39-43个氨基酸组成。其是大脑皮质老年斑的主要成分。可溶性二聚体可以有效削弱突触结构和功能。这种二聚体是最小的突触毒性物质，是引起阿尔茨海默病的重要物质。Aβ最常见的残基亚型是Aβ40和Aβ42。两者之中，Aβ40更为常见，但是Aβ42更与病情有关。早发阿尔茨海默病被记录到Aβ42增加。

rbo/Efr3a/Efr3b基因或其蛋白的抑制剂

本领域普通技术人员应该知道，本发明所用的术语“rbo/Efr3a/Efr3b基因或其蛋白的抑制剂”指能够抑制、降低、减弱、消除rbo/Efr3a/Efr3b基因或其蛋白的表达或功能或活性的物质。

在一优选的实施方式中，所述抑制剂包括所述rbo/Efr3a/Efr3b基因的反义RNA或miRNA，或所述rbo/Efr3a/Efr3b基因的蛋白的抗体。

在进一步优选的实施方式中，所述miRNA的cDNA序列如以下SEQ ID NO:1-4所示，更优选SEQ ID NO:1所示：

TGCTGAACAGAACCTGAATGATACCTGTTTTGGCCACTGACTGACAGGTATCACAGGTTCTGTT(SEQ ID NO:1)；

TGCTGATAAGCTGCAACCAGGGCCATGTTTTGGCCACTGACTGACATGGCCCTTTGCAGCTTAT(SEQ ID NO:2)；

TGCTGATAAGAAGCTGGTCCAATGCCGTTTTGGCCACTGACTGACGGCATTGGCAGCTTCTTAT(SEQ ID NO:3)；

TGCTGTTCAAAGGTGATCTCCTCGGTGTTTTGGCCACTGACTGACACCGAGGATCACCTTTGAA(SEQ ID NO:4)。

在另一优选的实施方式中，所述抗体包括多克隆抗体、单克隆抗体、或抗血清。

自动检测模型动物运动能力的系统

本发明的自动检测模型动物运动能力的系统包括：a)固定有支撑杆的底座；b)开放式箱体；c)用于放置模型动物的两根或多根透明管；d)提升装置；e)监控装置；和f)处理器；

其中，所述透明管固定于箱体中；所述箱体与支撑杆滑动连接；所述提升装置使得所述箱体以一定位移和频率离开所述底座，随后落在所述底座上，从而使得模型动物处于所述透明管的底部；所述监控装置记录模型动物沿所述透明管管壁的爬行情况；和所述处理器用于测量各模型动物在开始爬管后任何时间点的所在高度。

在具体的实施方式中，所述模型动物是啮齿类动物或昆虫；优选地，所述模型动物是果蝇。

在具体的实施方式中，所述提升装置包括步进驱动器，和电机。

在进一步的实施方式中，所述电机转动与其相连的杠杆将所述箱体提升离开所述底座一定距离，然后释放，所述箱体依重力落在所述底座上；而所述步进驱动器控制电机的运转时间、间隔时间，从而控制所述箱体的提升高度以及提升和释放的次数，以便确保所述透明管中的模型动物处于所述透明管的底部。

在具体的实施方式中，所述箱体由不易破碎的硬质材料制成。在另一具体实施方式中，所述硬质材料是金属。

在具体的实施方式中，所述透明管由透明的硬质材料制成。在另一具体实施方式中，所述透明的硬质材料是有机玻璃或塑料。在另一具体实施方式中，所述透明的硬质材料是塑料。

在具体的实施方式中，所述透明管中的模型动物数量为1-15只；优选地为5-12只；最优选8-10只。

在具体的实施方式中，所述监控装置是摄像机，其可记录透明塑料管中果蝇的运动情况。在另一具体实施方式中，所述摄像机是数码摄像机或磁带摄像机。

在具体的实施方式中，所述处理器根据配套的电脑程序自动探索截图中果蝇的位置，以便进行数据分析。

在具体的实施方式中，所述箱体的提升高度是3-10cm；在另一具体实施方式中，所述箱体的提升高度是4-8cm；在另一具体实施方式中，所述箱体的提升高度是5-6cm。

在具体的实施方式中，所述箱体的提升和释放次数是2-5次；在另一具体实施方式中，所述箱体的提升和释放次数是4次。

以果蝇为例，本发明检测系统的工作过程如下所示：

每根透明塑料管中放置10只特定基因型的果蝇，管均匀分布并固定于金属盒中。金属盒可以沿着垂直固定在基座上的两根金属杆上下滑动。在爬管实验中，步进驱动器控制电机运转，将开放金属盒提升5.8cm然后释放，金属盒依重力下落到原位置。当金属盒停止运动时，果蝇由于惯性掉落到管底部。在金属盒3秒内被抬升下落4次后，所有果蝇都位于管底部。随后，电机暂停运转，金属盒静止，果蝇开始沿管壁逆重力方向向上爬行。整个过程被录像以进行后续分析。使用配套编写的电脑程序，测量每只果蝇在开始爬管后任何时间点的所在高度(参见图8-9)。

本发明的自动检测模型动物运动能力的系统的优点包括：

1.机械振动力度统一，差异小，实验可重复性高；

2.震动时间、间隔时间可控，精确；和

3.配套软件简化了数据统计及分析的过程，节约时间精力。

本发明具体采用的实验方法

遗传和筛选

果蝇在25℃恒温，12h/12h光照/黑暗循环的条件下，标准培养基中培养。[UAS]Aβ_arc和[UAS]Aβ₄₂转基因品系(英国剑桥大学Damian Crowther博士实验室)分别和[Gal4]A307品系杂交(英国剑桥大学Cahir O’Kane博士实验室)，生成在GF系统中表达arctic突变型Aβ的Aβ_arc果蝇和表达野生型Aβ₄₂的Aβ₄₂果蝇。[UAS]Aβ_arc品系也分别与[Gal4-ninaE.GMR]3([Gal4]GMR)和[Gal4-elav.L]3品系杂交(均为美国印地安那大学Bloomington果蝇品系中心)，分别在所有光受体细胞和神经元中表达Aβ_arc。Aβ_arc果蝇用于与候选基因突变体和转基因品系杂交。表达Aβ_arc和候选基因杂合突变/转基因的第一代(first generation，简称F1)子代被用于遗传筛选。F1代和Aβ_arc果蝇在羽化后25-30天进行爬管实验（见后文）。这一筛选基于比较F1代和Aβ_arc果蝇的爬管能力进行评估。rbo^ts1是错义突变的rbo等位基因，rbo²是缺失的rbo等位基因，而rbo-gfp是通过rbo的启动子驱动表达RBO-GFP的基因组DNA转基因品系。rbo-gfp转基因可以修复rbo^ts1中温度敏感瘫痪和光转导的丢失，以及rbo²胚胎致死，表明其具有rbo基因的全部功能[26、27]。

爬管和寿命检测

我们研发了一套自动检测果蝇爬管能力的系统。其中包括一个开放的金属盒(32x21x6cm)，10根透明塑料管（直径2.1cm，高19.0cm）。每管中放置10只特定基因型的果蝇，塑料管均匀分布并固定于金属盒中。金属盒可以沿着垂直固定在基座上的两根金属杆上下滑动。在爬管实验中，步进驱动器控制电机运转，电机将金属盒提升5.8cm然后释放，金属盒依重力下落到原位置。当金属盒停止运动时，果蝇由于惯性掉落到管底部。在金属盒3秒内被抬升下落4次后，所有果蝇都位于管底部。随后，果蝇沿管壁向上爬行。整个过程被录像以进行后续分析。我们编写了一个电脑程序，用于测量每只果蝇在开始爬管后任何时间点的所在高度。

在寿命检测中，每种基因型100只果蝇，平均分配到5个含标准果蝇食物和干酵母的管中，在25℃下培养。每3天将果蝇换到含新食物和干酵母的管中，并记录死亡果蝇数目。最终用SPSS11Kaplan-Meier软件统计存活率。

电生理检测

逃跑通路中记录细胞内的兴奋性突触后电位(EJP)方法如前所述[25]。利用低熔点蜡tackiwax(Boekel Scientific)将特定日龄的成年雌果蝇在解剖镜下固定在载玻片上，腹部向下。记录系统包括腹部一根参考电极，插入眼中的两根刺激电极和插入背部纵向肌肉细胞内的一根记录电极。双眼给予电刺激(100Hz,50pulses)。刺激强度5-20Volts，持续时间0.2ms，约阈值刺激强度的150%。电信号通过Axonal clamp900A(Molecular Devices)记录并放大，在频率10kHz下通过Digidata1440A(Molecular Devices)数字化。数据经由pClamp软件(version10.0;Molecular Devices)记录并分析。电极均为玻璃电极，其中灌注3M KCl溶液。记录的环境温度为25℃。

分子克隆，细胞培养，蛋白纯化和免疫共沉淀(co-immunoprecipitaion,简称co-IP)

果蝇rbo和小鼠Efr3a最长同工型的cDNA通过RT-PCR得到全长cDNA，分别插入到到pEGFP-N1质粒(clontech)的EcoRI/KpnI(rbo)酶切位点间或者XhoI/EcoRI(Efr3a)酶切位点间，表达羧基端带有GFP的融合蛋白。编码RBO蛋白第1-522位氨基酸的重组DNA插入到pET51b(Novagen)，用以表达RBO1_-522-His。构建的所有载体均通过测序验证。

COS-7和HEK293T细胞(中国科学院上海生命科学院细胞资源中心)培养于添加了10%FBS(Gibco)和青霉素-链霉素双抗的DMEM培养基(Hyclone)中。空质粒，插入rbo-或Efr3a-的pEGFP-N1重组质粒通过Lipofectamine^TM2000(invitrogen)瞬时转染到COS-7和HEK293T细胞中。转染后细胞培养两天用于后续实验。

RBO_1-522-His pET51b重组载体根据标准方法转化入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)(Novagen)表达。由于在可溶组分中检测不到RBO_1-522-His，因此我们使用bugbuster溶液(Novagen)提纯包涵体，然后用6M盐酸胍溶解包涵体。通过Ni-NAT琼脂糖凝胶柱(QIAGEN)将变性的RBO蛋白纯化，利用分步透析的方法将RBO蛋白复性。变性蛋白放入透析袋中以后，将透析袋放入第一步透析溶液中。透析溶液具体配方如下：6M脲，20mM HEPES pH8.0，300mM KCl，1%NP-40，5mM MgCl₂，10%甘油，1mM DTT。缓慢搅动透析液，在4℃下透析2小时。然后将透析袋放入含有5M脲的透析液中，透析液其他成分不变，缓慢搅动透析液，在4℃下透析2小时。以此类推，将透析袋分别放入含有4、3、2、1、0.5、0M脲的透析液中，操作步骤、透析条件与前面相同。最后将透析袋中的蛋白在4°C，16000g离心20分钟，收集上清。根据考马斯亮蓝染色得到RBO_1-522-His最终浓度。Aβ₄₂溶于PBS(1mg/ml)，实验组进行37℃热处理，对照组不温育。置于室温环境(RT)半小时。250μl RBO_1-522-His溶液与上述等量Aβ₄₂溶液混合，使用抗Aβ₄₂的抗体(6E10,SIG-39300,Covance)和invitrogen的Dynabeads Protein G IP Kit，根据其制造商的说明指导进行免疫共沉淀实验。蛋白印迹是使用兔源His多克隆抗体(CASB)完成的。

为检测果蝇中RBO和Aβ_arc的相互作用，取受[Gal4-elav.L]3驱动泛神经元表达Aβ_arc的rbo-gfp果蝇，以不表达Aβ_arc的rbo-gfp果蝇为对照，取200只果蝇头，在预冷的500μl Tris缓冲液中碾磨均匀。Tris缓冲液配方如下：50mM Tris，50mM KCl，1mM EDTA，1%混合蛋白酶抑制剂(cocktail protease inhibitor,Calbiochem)，调PH至7.4。裂解液10000g离心10分钟，取上清，使用约1μg anti-Aβ₄₂抗体进行免疫共沉淀实验(IP)，或使用anti-GFP(A11122,invitrogen)抗体进行蛋白印迹实验(WB)。

为检验人工合成Aβ₄₂与RBO-GFP或Efr3a-GFP之间的相互作用，根据以前的研究方法处理bio-Aβ₄₂(GLbiochem(Shanghai)Ltd)[40]。人工合成的bio-Aβ₄₂肽首先在20-23℃平衡30分钟，然后稀释溶解于1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇至终浓度1mM。蒸发2小时后，合成的bio-Aβ₄₂在真空泵中干燥，储存于-20℃。bio-Aβ₄₂水浴超声处理10分钟，溶解于二甲亚砜(DMSO)至终浓度1mM。1mM的DMSO溶液以预冷的PBS缓冲液稀释至100mM，涡旋振荡30秒，然后4℃孵育过夜。溶液使用前以13500g离心15分钟，取上清。表达GFP、RBO-GFP或Efr3a-GFP的HEK293T细胞每组细胞数约10⁷个，分别以2毫升裂解液处理。裂解液配方如下：200mM Tris-HCl，0.9%NaCl，1%NP40%，1%混合蛋白酶抑制剂(Calbiochem)以及1mM PMSF,调PH至7.4，于冰上混匀，以13500g离心15分钟。收集上清液，与寡聚bio-Aβ₄₂混合，4℃处理过夜。根据制造商的说明指导，使用High Capacity NeutrAvidin Agarose Resin(Pierce)进行拉下(Pull-down)实验，随后使用抗-GFP抗体(A11122,invitrogen)进行免疫印迹实验。

病毒构建包装及其在小鼠中的显微注射

实验遵照美国神经科学协会对动物使用的政策进行。慢病毒由invitrogen公司（上海）使用BLOCK-iT^TM HiPerform^TM Lentiviral Pol II miR RNAi ExpressionSystem with EmGFP这一表达系统制造。四个针对Efr3a的miRNAs寡聚片段(SEQID NO:1-4)被合成并插入pcDNA^TM6.2-GW/EmGFPmi载体，以检测其沉默效率(图4)。检测结果显示，其中一个载体在过表达Efr3a的HEK293T细胞中，对沉默Efr3a表达最有效。这一最有效的miRNA载体与pDONR^TM221及pLenti6/V5DEST重组，通过重组反应得到pLENT6/V5-GW/±EmGFP-miRNA载体。慢病毒通过共转染pLENT6/V5-GW/±EmGFP-miRNA载体和包装混合物(Packaging Mix)得到。病毒浓度经由在HEK293T细胞中连续稀释得到。随后每三天统计一次EGFP阳性的细胞。沉默效率进一步通过慢病毒转染原代培养的海马神经元得到。

雄性APP/PS1小鼠，B6C3-Tg(APPswe,PSEN1dE9)85Dbo/Mmjax(Jackson labstock034829-JAX)通过与(C57BL/6X C3H)F1小鼠杂交保种。在5月龄时，使用100mg/kg Ketamine加20mg/kg Xylazine麻醉小鼠，固定于立体定位仪，腹部向下置于电热毯上。清除头部毛发，切开皮肤，穿透颅骨打一小洞。使用注射泵(HarvardApparatus)通过套管系统(外径,0.29mm；内径,0.1mm,RWD Life Science Co.,Ltd)，在20分钟内注射2μl慢病毒溶液（病毒浓度：6x10^-7）至前囟门后2.1mm，旁开2.3mm和深1.9mm处。注射后5分钟，移除针头，缝合皮肤，小鼠移至25℃含充足食物和水的环境中培养。至12月龄时，再次麻醉小鼠，使用PBS配制的4%多聚甲醛(简称PFA)灌流。

染色与成像

甲苯胺蓝染色：使用pH7.4，浓度0.1M的磷酸缓冲液配制4%戊二醛。果蝇头除去口器后，于其中4℃固定过夜。随后，于同样磷酸缓冲液配置的2%OsO₄溶液中，4℃固定2小时。使用增高浓度的乙醇脱水，包埋于Epon812。使用Leica UC6ultramicrotone横向切果蝇眼，得到2μm厚的切片。使用甲苯胺蓝将切片染色，在NIKON E600FN Neurolucida光学显微镜下观察。使用Stereo Investigator软件(MBFBioscience)软件分析每个单眼中视杆的数目。

脑片中GFP染色：脑片(厚60μm)使用PBS-0.3%triton-5%BSA封闭1小时，使用兔源抗-GFP抗体(A11122,invitrogen,1:100稀释)于4℃孵育过夜。随后以PBS洗，并用生物素化羊源抗-兔IgG抗体(H+L)(AbboMax,Inc,1:100稀释)于4℃孵育过夜。再次以PBS洗，使用Cy3-链霉亲和素(Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc,1:1000稀释)，于室温下孵育2小时。使用Zeiss LSM511共聚焦显微镜采集图像，通过AutoQuant X2反卷积，再用NeuronStudio软件进行数据分析。脑片与采集到的树突图像所属基因型对于采集图像的人员和进行数据分析的人来说都分别是未知的。

碱性磷酸酶法对Aβ染色：根据(31)的方法进行。表达GFP、RBO-GFP或者Efr3a-GFP的COS-7细胞于37℃下，在500μl寡聚bio-Aβ(250nM)中孵育2小时，以4%PFA固定，在65℃下加热处理2小时，随后以PBS洗3次，其间间隔15分钟。用PBS-0.1%triton-3%BSA封闭，在4℃下，PBS-0.05%triton-1.5%BSA中使用碱性磷酸酶-偶联的链霉亲和素孵育16小时，与5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐和硝基蓝四唑鎓在室温下反应。当反应产物沉积可见但颜色不过深时，中止反应(约24-72小时)。使用Nikon Eclipse TE2000显微镜采集图像，每个处理的图中有30~70个独立转染的细胞，随机在20×放大倍率的视野中获取。根据前人研究[41]的方法，使用Image-ProPlus6.0软件，统计这些细胞中反应产物沉积量的平均光学密度，以分析结合的Aβ量。

果蝇中枢神经系统中Aβ染色：果蝇中枢神经系统(CNS)整体，包括脑和腹神经节，在预冷的PBS中解剖出，于PBS配置的4%PFA中固定约45分钟。以PBS洗30分钟，随后以甲酸(70%，水配制)处理45分钟，使抗原决定簇暴露，然后用PBS-0.25%Triton-5%BSA重复冲洗。一抗(6E10,1:100稀释)在4℃下孵育10-12小时。以PBS洗，其后在室温下，以cy3-偶联的二抗(Jackson ImmunoResearch,1:200稀释)孵育2小时。使用Nikon A1R-A1共聚焦显微镜采集图像，果蝇中枢神经系统的基因型对于采集图像的人员来说是未知的。

ELISA检测果蝇中枢神经系统中Aβ量

25只果蝇全脑在预冷的PBS中剖出，然后直接置于预冷的添加了混合蛋白酶抑制剂(Calbiochem)的ELISA样品缓冲液中。果蝇脑经充分碾磨，在室温下孵育4小时，储存于-20℃。使用Aβ42Human ELISA Kit(invitrogen)，根据其制造商的说明指导进行ELISA实验。

数据分析及统计

使用SPSS软件对动物及细胞培养实验得到的数据进行分析。如果未单独说明，使用one-way ANOVA及Fisher’s LSD方法分析统计显著性。如果未单独说明，数据以均值±标准误差的方式呈现。显著性差异评判标准为p<0.05。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(Cold Spring HarborLaboratory Press，2001)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1.遗传筛选鉴定RBO是Aβ产生作用的调控者

在逃跑通路(giant fiber pathway)神经元中表达野生型Aβ或者arctic突变Aβ的成年果蝇(Aβ₄₂以及Aβ_arc果蝇)具有日龄依赖的突触功能丧失，飞行能力衰退以及过早死亡的现象[25]。发明人发现这些果蝇也具有明显的日龄依赖的爬管能力衰退(见图1A和图2A)。为探寻抑制Aβ导致的突触异常的因子，发明人检测了一些选定基因的杂合突变（heterozygous mutation）、沉默（RNAi）或过量表达后对Aβ_arc果蝇的日龄依赖的爬管能力衰退的影响，通过这一筛选，我们得到了7个可能的抑制因子（suppressor）(见表1)。其中两个是rbo基因功能丧失的突变（loss-of-functionmutation），即rbo^ts1(点突变，misssense)和rbo²(缺失，null)。rbo基因在果蝇中对突触传递和光转导起重要作用[26-28]。

实施例2.rbo基因功能部分丧失可以抑制Aβ表达果蝇的突触障碍、神经元死亡等神经退行性变引起的异常

为明确rbo基因在Aβ积累引起的神经退行性改变中的作用，我们首先对四组果蝇的爬管能力、寿命以及突触传递进行了检测。这四组是：遗传对照组果蝇(ctrl)，rbo杂合突变体果蝇(rbo)，Aβ_arc果蝇和表达Aβ_arc的rbo杂合突变体果蝇(Aβ_arc-rbo)。每组又分别包含1-3个品系（品系基因型见图1A图例）。四组果蝇的爬管能力在羽化后第3天和第31天分别检测。羽化后第3天，Aβ_arc-rbo果蝇的爬管能力与Aβ_arc果蝇、对照组果蝇和rbo突变体果蝇相近(图1A)。但是在羽化后第31天，Aβ_arc-rbo果蝇的爬管能力显著高于Aβ_arc果蝇(图1A)，表明rbo部分功能缺失一定程度上改善了Aβ_arc的表型。因为纯和的rbo缺失突变引起胚胎致死[29]，所以，rbo完全功能缺失对Aβ_arc果蝇的作用无法检测。

对于寿命的研究证实，3个品系的Aβ_arc-rbo果蝇（见图1A图例）寿命显著长于Aβ_arc果蝇(Log Rank检测，p<0.001)。通过对比这四组果蝇的寿命均值可以得到相同的结论（见表2）。但rbo果蝇的2个品系与对照组在寿命上没有显著差别(p>0.05)，提示遗传背景不影响Aβ_arc-rbo果蝇寿命的延长。

为了检测rbo突变是否影响Aβ_arc表达果蝇的突触功能，我们通过重复给予细胞外的脑刺激(100Hz,50次脉冲)，在背部纵向肌肉纤维（dorsal longitudinal muscle,DLM）的细胞内记录诱发的兴奋性电位(excitatory junction potentials，简称EJPs)。记录时间分别在羽化后第3-7天和羽化后第31-35天。在羽化后第3-7天，Aβ_arc-rbo果蝇中诱发EJPs的成功率与同一时间其他组相比无显著差异，但是在羽化后第31-35天显著高于Aβ_arc果蝇的EJPs成功率，而低于对照组和rbo杂合突变体果蝇(图1C)。这些结果与我们在爬管和寿命检测中的发现一致，并且证实rbo部分功能丧失减缓了表达arctic Aβ而引发的日龄依赖的突触功能衰弱。

此外，我们发现rbo突变同样影响表达野生型Aβ的果蝇表型，在改善爬管能力、果蝇寿命和突触传递能力等方面有类似的保护作用(图2A-C)。而且，我们还发现rbo突变可以防止眼部特异性表达Aβ_arc所引发的日龄依赖的视网膜光受体丢失(图2D)。

实施例3.在Aβ_arc果蝇中过量表达rbo的反作用

为了检测rbo过表达对Aβ_arc所引发的日龄依赖的损害作用，我们在Aβ_arc果蝇中引入rbo-gfp转基因。与预料的一致，在表达Aβ_arc的果蝇中过表达rbo进一步缩短了寿命(P<0.001)，并加快了日龄依赖的突触功能丧失(图3)。有趣的是，单纯过表达rbo也会导致寿命缩短和日龄依赖的突触功能丧失(图3)。

实施例4.在APP/PS1转基因小鼠中沉默Efr3a可防止树突异常

小鼠与人类均含有两个rbo同源基因，分别是Efr3a（同源性59%）和Efr3b（同源性56%），两者在海马区和内嗅皮层高度表达(Allen Brain Atlas)，而这些脑区对AD非常易感。因为Efr3a蛋白比Efr3b蛋白对RBO蛋白有更高的同源性，因此发明人检测了Efr3a基因沉默（RNAi）是否对AD小鼠模型也有保护作用。在APP/PS1(APPswe/Presenilin△E9)（Jaxson lab stock034829-JAX）转基因小鼠和同窝野生型小鼠(C57/BL6)5月龄时，将空egfp-慢病毒(egfp-lentivirus)或者Efr3a-miRNA egfp-慢病毒(Invitrogen,Shanghai)注射入其海马区，此时淀粉样斑块尚未出现。构造的Efr3a-miRNA慢病毒在HEK293T细胞系中有约82%的沉默效率，在原代培养的海马神经元中有约50%的沉默效率(见图4)。在小鼠12月龄时，在APP/PS1转基因小鼠齿状回区（dentate gyrus，简称DG）有大量的树突棘丢失(30)，此时处死小鼠，以抗EGFP抗体进行免疫染色，检测海马神经元树突（dendrite）及树突棘(spine)的形态。共聚焦成像结果显示，表达EGFP的慢病毒感染了CA3和DG区的少数神经元(图5A)。在距离细胞体至少1个胞体长度的二阶顶端树突的近端部分(约30μm)统计树突直径和树突棘密度(图5A)。在注射了空egfp-lentivirus的小鼠中，APP/PS1小鼠海马CA3区和DG区神经元的树突直径和树突棘密度均值显著低于同窝野生型小鼠(图5B和C)，这与之前报道过的AD小鼠模型中树突萎缩变化相一致[30]。而且在这两个脑区中，Efr3a-miRNA感染的APP/PS1神经元的树突直径和树突棘密度均值显著高于空egfp-lentivirus感染的APP/PS1小鼠神经元对应数据，但是不显著的高于同窝对照组野生型小鼠感染了空egfp-lentivirus或者Efr3a-miRNA egfp-lentivirus神经元的对应数据(图5B和5C)，表明沉默Efr3a可以防止APP/PS1小鼠CA3区和齿状回区神经元树突和树突棘萎缩的发生。这些结果提示，小鼠中的rbo同源基因具有的生物功能也参与神经退行性变的某些方面。

实施例5.RBO/Efr3a蛋白与Aβ物理上相互作用

为了理解RBO如何影响Aβ导致的神经元损伤，我们探究了RBO是否与Aβ有物理上的相互作用。实验时使用抗Aβ抗体(6E10)从表达Aβ_arc和RBO-eGFP的果蝇脑中免疫沉淀arctic Aβ。我们发现RBO-eGFP与arctic Aβ_arc有特异性的免疫共沉淀，因为同一Aβ抗体不能从表达RBO-eGFP的果蝇中免疫沉淀RBO-eGFP(图6A)。为了进一步证实RBO是否与Aβ₄₂直接结合，我们在大肠杆菌(E.coli)中表达了带有His-标签标记的RBO片段，这一片段包含RBO蛋白高度保守的前522个氨基酸(RBO_1-522-His)[26]。等量的复性RBO_1-522-His分别与直接溶解的Aβ单体孵育或者与37°C热处理不同时间后的Aβ孵育，后者可以使合成的Aβ寡聚化。我们发现RBO_1-522-His与37°C热处理过的Aβ有特异性作用，但不与未经过热处理的Aβ相互作用(图6B)。进而我们在HEK293细胞系表达RBO-GFP或者Efr3a-GFP，检测Aβ与RBO-GF或Efr3a-GF的相互作用。我们在瞬时转染表达RBO-GFP或者Efr3a-GFP的HEK293细胞裂解液中，加入带有生物素标签的寡聚Aβ(寡聚生物素-Aβ的制备见实验方法)。通过NeutrAvidin珠进行拉下以及蛋白印迹实验，结果显示RBO-GFP或Efr3a-GFP分别与Aβ有特异性相互作用(图6C)。

以上实验结果说明，RBO在体内或体外可以直接并且特异地与Aβ₄₂相结合，对于寡聚Aβ起到类似于“受体”的作用。为了进一步验证这一机制，发明人在COS-7细胞系中过表达RBO-GFP或者Efr3a-GFP，在37°C下孵育寡聚生物素-Aβ两小时。然后根据以前的方法进行碱性磷酸酶染色，观察寡聚生物素-Aβ与COS-7细胞的结合情况[31]。我们发现无论是表达RBO-GFP还是Efr3a-GFP的COS-7细胞，生物素-Aβ与其的结合水平皆高于与只表达GFP的细胞的结合水平(图6D)。

实施例6.rbo突变和过表达对于神经元内Aβ积累的作用

以上实施例有关RBO和Aβ物理上相互作用的结果提示，RBO可能对于寡聚Aβ起到类似于“受体”的作用，参与AD果蝇模型[25]中Aβ在神经元内的积累。为检测这一可能性，发明人在AD果蝇模型中进一步确认了神经元内Aβ的积累情况。另一转基因UAS-mCD8-GFP(美国印地安那大学Bloomington果蝇品系中心)被引入到Aβ_arc果蝇中。发明人使用与Aβ_arc相同的驱动因子来驱动mCD8-GFP的表达，从而使得表达Aβ_arc的神经元被GFP标记。共聚焦成像结果显示，Aβ免疫染色信号与神经元内GFP的信号基本上共定位(图7A)，说明在这一果蝇模型中Aβ在神经元内积累。而且，我们发现Aβ_arc和Aβ_arc-rbo果蝇中GFP表达水平都与对照组果蝇相似(图7A)，表明驱动因子的转录活动不受Aβ_arc表达以及rbo突变的影响。

为了确定rbo如何影响神经元内Aβ的积累，我们通过免疫染色检测了对照组、Aβ_arc和Aβ_arc-rbo果蝇中Aβ_arc的水平。Aβ_arc-rbo果蝇中Aβ的信号明显弱于Aβ_arc果蝇中的信号(图7A)。通过ELISA定量分析，我们进一步确认了这一结果：与Aβ_arc果蝇相比，Aβ_arc-rbo果蝇中Aβ总量减少了70%或更多(图7B)。随后我们比较了Aβ_arc果蝇中Aβ_arc总量水平与rbo过表达的Aβ_arc果蝇中Aβ_arc总量水平，发现rbo过表达使得Aβ_arc水平增加60%(图7C)。因此，rbo功能丧失减少了神经元内Aβ_arc的积累，而过表达rbo则增加神经元内Aβ_arc的积累。与检测RBO-Aβ结合的相关实验结果共同分析，发明人认为RBO在神经元膜上作为Aβ受体与Aβ结合并使Aβ在神经元内积累。

表1.在表达Aβ_arc的果蝇中检测的候选基因及其突变、RNAi品系、过表达转基因。

“amor”和“hypo”分别表示全部或部分丧失功能。

“transposon”代表转座子插入；“UAS”和“EP”指过表达的品系；“RNAi”指沉默的品系。

表2.果蝇寿命均值及其比较

p值通过Fisher’s LSD检验得到。

结论：

rbo功能部分丧失可以减轻Aβ表达导致的寿命、运动能力、突触传递和神经元死亡几方面的损伤(图1和2)。与之对应的是过表达rbo加快了Aβ导致的损伤，包括进一步缩短寿命和削弱突触传递能力(图3)。这些结果表明，在表达Aβ的果蝇的神经退行性变过程中，rbo或者某一依赖于rbo的生物过程在Aβ下游发挥作用，或者与Aβ有共同的下游调控因子。机制方面，RBO很可能是通过与Aβ物理上相互作用发挥功能，增加细胞内Aβ的积累。这一构想得到以下证据的支持：1)RBO在体内或者体外都能与Aβ结合；2)在培养的细胞中过表达rbo导致Aβ附着/积累；3)rbo功能不全减少神经元内Aβ积累，反之过表达rbo增加神经元内Aβ积累。由于神经元内Aβ积累在AD发病中起重要作用[10、12]，发明人认为RBO通过与Aβ结合并且使Aβ在神经元内积累，加速神经退行性变。在APP/PS1转基因小鼠中沉默rbo同源基因Efr3a的表达可以避免海马区神经元树突和树突棘萎缩，并且小鼠Efr3a蛋白可以与Aβ物理上相互作用，这进一步提示Efr3a在小鼠AD模型中有类似作用。

在表达Aβ的果蝇中，野生型和arctic突变型Aβ以重组肽的形式表达（带有一段分泌信号肽），这使其在加工后可以在体内和体外形成低聚合水平的寡聚体[23]。有趣的是，加工后的Aβ主要在神经元内积累而不是在细胞外[23、25]。神经元内Aβ的积累可能是由于Aβ在分泌前后在细胞膜上与RBO相结合，随后发生内在化(internalization)。

以前的研究为RBO在神经元内积累Aβ提示了进一步的可能机制：RBO与Aβ的相互作用引发Aβ的内吞。果蝇中RBO蛋白是整合膜蛋白的一种，在磷脂酰肌醇4,5-双磷酸(PI4,5P₂)介导的信号通路和胞吞中起重要作用[26、28]。酵母中RBO(Efr3)与磷酸肌醇激酶3型α亚型(PI4KIIIα)在细胞膜上形成复合体，调控细胞膜上磷脂酰肌醇4-磷酸(PI4P)和PI_4,5P的产生[32]。PI4,5P₂对于依赖或者不依赖于网格蛋白（clathrin）的胞吞过程是必须的[33、34]，而两类胞吞过程都参与培养的细胞中Aβ的内在化[35、36]。发明人推测Aβ与RBO的结合可能促进RBO-PI4KIIIα复合体的形成或稳定性，加强RBO-PI4KIIIα，导致PI4P和PI4,5P₂的量增加，以及后续的胞吞过程发生。支持这一观点的是，在散发AD病人的神经元中胞吞活动增加，而且Aβ位于神经元中异常内涵体中[37、38]。此外，在一个酵母AD模型中，数个胞吞相关因子被证实与Aβ毒性有关[39]。其中包括磷脂酰肌醇结合网格蛋白组装蛋白(PICALM)，一个被高度确认的AD风险因子。

综上所述，RBO通过与Aβ尤其是寡聚体形式的Aβ结合，促进Aβ在神经元内积累，从而在果蝇AD模型中介导神经退行性变。在AD小鼠模型中沉默efr3a表达减少了树突和树突棘的萎缩。因此，本发明揭示了新的AD治疗干预靶点。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

参考文献

1.Selkoe DJ(2002)Alzheimer's disease is a synaptic failure.Science(New York,N.Y298(5594)：789-791.

2.Hardy J&Selkoe DJ(2002)The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease：progress and problems on the road totherapeutics.Science(New York,N.Y297(5580):353-356.

3.Small DH,Mok SS,&Bornstein JC(2001)Alzheimer's disease and Abeta toxicity：from top to bottom.(Translatedfrom eng)Nat Rev Neurosci2(8):595-598(in eng).

4.Selkoe DJ(2008)Soluble oligomers of the amyloid beta-protein impair synaptic plasticity and behavior.(Translatedfrom eng)Behav Brain Res192(1):106-113(in eng).

5.Selkoe DJ(2011)Alzheimer's disease.(Translated from eng)Cold Spring Harb Perspect Biol3(7)(in eng).

6.Palop JJ & Mucke L(2010)Amyloid-beta-induced neuronal dysfunction in Alzheimer's disease：from synapsestoward neural networks.(Translated from eng)Nature neuroscience13(7)：812-818(in eng).

7.Yankner BA & Lu T(2009)Amyloid beta-protein toxicity and the pathogenesis of Alzheimer disease.(Translatedfrom eng)The Journal of biological chemistry284(8):4755-4759(in eng).

8.Yan SD & Stern DM(2005)Mitochondrial dysfunction and Alzheimer's disease：role of amyloid-beta peptidealcohol dehydrogenase(ABAD).Int J Exp Pathol86(3):161-171.

9.Wirths O,Multhaup G,&Bayer TA(2004)A modified beta-amyloid hypothesis：intraneuronal accumulation of thebeta-amyloid peptide--the first step of a fatal cascade.(Translated from eng)Journal of neurochemistry91(3)：513-520(in eng).

10.Laferla FM,Green KN,& Oddo S(2007)Intracellular amyloid-beta in Alzheimer's disease.Nat Rev Neurosci.

11.Hu X,et al.(2009)Amyloid seeds formed by cellular uptake,concentration,and aggregation of the amyloid-betapeptide.(Translated from eng)Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America106(48):20324-20329(in eng).

12.Gouras GK,Tampellini D,Takahashi RH,& Capetillo-Zarate E(2010)Intraneuronal beta-amyloid accumulationand synapse pathology in Alzheimer's disease.(Translated from eng)Acta neuropathologica119(5)：523-541(in eng).

13.Friedrich RP,et al.(2010)Mechanism of amyloid plaque formation suggests an intracellular basis of Abetapathogenicity.(Translated from eng)Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America107(5):1942-1947(in eng).

14.Lambert MP,et al.(1998)Diffusible,nonfibrillar ligands derived from Abeta1-42are potent central nervous systemneurotoxins.(Translated from eng)Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America95(11):6448-6453(in eng).

15.Walsh DM & Selkoe DJ(2007)A beta oligomers-a decade of discovery.Journal of neurochemistry101(5):1172-1184.

16.Walsh DM,Tseng BP,Rydel RE,Podlisny MB,& Selkoe DJ(2000)The oligomerization of amyloid beta-proteinbegins intracellularly in cells derived from human brain(Translated from eng)Biochemistry39(35)：10831-10839(in eng).

17.Takahashi RH,et al.(2004)Oligomerization of Alzheimer's beta-amyloidwithin processes and synapses of culturedneurons and brain.(Translated from eng)J Neurosci24(14):3592-3599(in eng).

18.Mc Donald JM,et al.(2010)The presence of sodium dodecyl sulphate-stable Abeta dimers is strongly associatedwith Alzheimer-type dementia.(Translated from eng)Brain133(Pt5):1328-1341(in eng).

19.Nagele RG,D'Andrea MR,Anderson WJ,& Wang HY(2002)Intracellular accumulation of beta-amyloid(1-42)inneurons is facilitated by the alpha7nicotinic acetylcholine receptor in Alzheimer's disease.(Translated from eng)Neuroscience110(2):199-211(in eng).

20.Narita M,Holtzman DM,Schwartz AL,& Bu G(1997)Alpha2-macroglobulin complexes withand mediates theendocytosis of beta-amyloid peptide via cell surface low-density lipoprotein receptor-related protein.(Translated from eng)Journal of neurochemistry69(5):1904-1911(in eng).

21.Kanekiyo T,et al(2011)Heparan sulphate proteoglycan and the low-density lipoprotein receptor-related protein 1constitute major pathways for neuronal amyloid-beta uptake.(Translated from eng)J Neurosci31(5)：1644-1651(in eng).

22.Takuma K,et al.(2009)RAGE-mediated signaling contibutes to intraneuronal transport of amyloid-beta andneuronal dysfunction.(Translated from eng)Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America106(47):20021-20026(in eng).

23.Crowther DC,et al.(2005)Intraneuronal Abeta,non-amyloid aggregates and neurodegeneration in a Drosophilamodel of Alzheimer's disease.Neuroscience132(1):123-135.

24.Iijima-Ando K,et al.(2008)Overexpression of neprilysin reduces alzheimer amyloid-beta42(Abeta42)-inducedneuron loss and intraneuronal Abeta42deposits but causes a reduction in cAMP-responsive element-binding protein-mediatedtranscription,age-dependent axon pathology,and premature death in Drosophila.(Translated from eng)The Journal ofbiological chemistry283(27):19066-19076(in eng).

25.Zhao XL,et al.(2010)Expression of beta-amyloid Induced age-dependent presynaptic and axonal changes inDrosophila.(Translated from eng)J Neurosci30(4):1512-1522(in eng).

26.Huang FD,Matthies HJ,Speese SD,Smith MA,& Broadie K(2004)Rolling blackout,a newly identifiedPIP2-DAG pathway lipase required for Drosophila phototransduction.Nature neuroscience7(10)：1070-1078.

27.Huang FD,Woodruff E，Mohrmann R,& Broadie K(2006)Rolling blackout is required for synaptic vesicleexocytosis.J Neurosci26(9):2369-2379.

28.Vijayakrishnan N,Woodruff EA,3rd,& Broadie K(2009)Rolling blackout is required for bulk endocytosis innon-neuronal cells and neuronal synapses.(Translated from eng)Journal of cell science122(Pt1)：114-125(in eng).

29.Faulkner DL,Dockendorff TC,& Jongens TA(1998)Clonal analysis of cmp44E,which encodes a conservedputative transmembrane protein,indicates a requirement for cell viability in Drosophila.Dev Genet23(4)：264-274.

30.Knafo S,et al.(2009)Widespread changes in dendritic spines in a model of Alzheimer's disease.(Translated fromeng)Cereb Cortex19(3):586-592(in eng).

31.Lauren J,Gimbel DA,Nygaard HB,Gilbert JW,& Strittmatter SM(2009)Cellular prion protein mediatesimpairment of synaptic plasticity by amyloid-beta oligomers.(Translated from eng)Nature457(7233)：1128-1132(in eng).

32.Baird D,Stefan C,Audhya A,Weys S,& Emr SD(2008)Assembly of the PtdIns4-kinase Stt4 complex at theplasma membrane requires Ypp1 and Efr3.(Translated from eng)The Journal of cell biology183(6):1061-1074(in eng).

33.McMahon HT & Boucrot E(2011)Molecular mechanism and physiological functions of clathrin-mediatedendocytosis.(Translated from eng)Nat Rev Mol Cell Biol 12(8):517-533(in eng).

34.Kumari S,Mg S,& Mayor S(2010)Endocytosis unplugged:multiple ways to enter the cell.(Translated from eng)Cell Res20(3):256-275(in eng).

35.Mohamed A & Posse de Chaves E(2011)Abeta internalization by neurons and glia.(Translated from eng)Int JAlzheimers Dis2011:127984(in eng).

36.Lai AY & McLaurin J(2010)Mechanisms of amyloid-Beta Peptide uptake by neurons：the role of lipid rafts andlipid raft-associated proteins.(Translated from eng)Int J Alzheimers Dis2011：548380(in eng).

37.Cataldo AM,BarnettJL,Pieroni C,& Nixon RA(1997)Increased neuronal endocytosis and protease delivery toearly endosomes in sporadic Alzheimer's disease：neuropathologic evidence for a mechanism of increasedbeta-amyloidogenesis.(Translated from eng)JNeurosci17(16):6142-6151(in eng).

38.Cataldo AM,Hamilton DJ,Barnett JL,Paskevich PA,& Nixon RA(1996)Properties of the endosomal-lysosomalsystem in the human central nervous system:disturbances mark most neurons in populations at risk to degenerate inAlzheimer's disease.(Translated from eng)JNeurosci16(1):186-199(in eng).

39.Treusch S,et al.(2011)Functional Links Between Abeta Toxicity,Endocytic Trafficking,and Alzheimer's DiseaseRisk Factors in Yeast.(Translated from Eng)Science(New York,N Y(in Eng).

40.Berman DE,et al.(2008)Oligomeric amyloid-beta peptide disrupts phosphatidylinositol-4,5-bisphosphatemetabolism.(Translated from eng)Nature neuroscience11(5):547-554(in eng).

41.Takahashi T,Nakamura F,Jin Z,Kalb RG,&Strittmatter SM(1998)Semaphorins A and E act as antagonists ofneuropilin-1and agonists of neuropilin-2receptors.(Translated from eng)Nature neuroscience1(6):487-493(in eng).

Claims (11)

1.一种复合物，其特征在于，所述复合物由以下部分组成：

(a)rbo/Efr3a/Efr3b蛋白；和

(b)Aβ或寡聚体形式的Aβ。

2.权利要求1所述的复合物在筛选预防或治疗阿尔茨海默病的药物中的应用。

3.一种筛选预防或治疗阿尔茨海默病的药物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(a)将待测物质加入包含rbo/Efr3a/Efr3b蛋白和Aβ或寡聚体形式的Aβ的体系中；和

(b)检测权利要求1所述复合物的形成；

如果与未加入所述待测物质的包含rbo/Efr3a/Efr3b蛋白和Aβ或寡聚体形式的Aβ的对照体系相比，权利要求1所述复合物的形成减少，则所述待测物质为预防或治疗阿尔茨海默病的药物。

4.一种筛选预防或治疗阿尔茨海默病的药物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(a)构建过表达rbo/Efr3a/Efr3b蛋白的动物模型；

(b)将待测物质给予所述动物模型；和

(c)检测所述动物模型中权利要求1所述复合物的形成；

如果与未给予所述待测物质的对照动物模型相比，权利要求1所述复合物的形成减少，则所述待测物质为预防或治疗阿尔茨海默病的药物。

5.rbo/Efr3a/Efr3b基因或其蛋白的用途，其特征在于，所述rbo/Efr3a/Efr3b基因或其蛋白用于筛选预防或治疗阿尔茨海默病的药物。

6.一种预防或治疗阿尔茨海默病的药物的筛选方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(a)将待测物质施用于正常动物或rbo/Efr3a/Efr3b基因或其蛋白的表达或活性增强的动物；和

(b)检测所述动物中rbo/Efr3a/Efr3b基因或其蛋白的表达或活性情况；

如果与所述正常动物或rbo/Efr3a/Efr3b基因或其蛋白的表达或活性增强的动物相比，所述待测物质施用后，rbo/Efr3a/Efr3b基因或其蛋白的表达或活性降低，则所述待测物质是预防或治疗阿尔茨海默病的药物。

7.一种诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括以下部分：

(a)用于检测rbo/Efr3a/Efr3b基因或其蛋白的表达或活性的试剂；

(b)用于盛放所述检测试剂的容器；和

(c)利用所述检测试剂检测rbo/Efr3a/Efr3b基因或其蛋白的表达或活性的使用说明书。

8.rbo/Efr3a/Efr3b基因或其蛋白的抑制剂的用途，其特征在于，所述rbo/Efr3a/Efr3b基因或其蛋白的抑制剂用于制备预防或治疗阿尔茨海默病的药物。

9.一种诊断阿尔茨海默病的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(a)检测待测对象中rbo/Efr3a/Efr3b基因或其蛋白的表达或活性；

如果与正常对照相比，所述rbo/Efr3a/Efr3b基因或其蛋白的表达或活性升高，则判断所述待测对象患有阿尔茨海默病。

10.一种自动检测模型动物运动能力的系统，所述系统包括：a)固定有支撑杆的底座；b)开放式箱体；c)用于放置模型动物的两根或多根透明管；d)提升装置；e)监控装置；和f)处理器；

其中，所述透明管固定于箱体中；所述箱体与支撑杆滑动连接；所述提升装置使得所述箱体以一定位移和频率离开所述底座，随后落在所述底座上，从而使得模型动物处于所述透明管的底部；所述监控装置记录模型动物沿所述透明管管壁的爬行情况；和所述处理器用于测量各模型动物在开始爬管后任何时间点的所在高度。

11.权利要求10所述系统在检测模型动物运动能力中的用途。

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