CN114601928B - 一种钙超载介导神经元死亡的标志物及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种钙超载介导神经元死亡的标志物在制备多种老龄相关神经退行性疾病治疗药物及检测疾病方法中的应用，疾病包括但不限于老年痴呆症、帕金森病、渐冻症或青光眼。本发明采用上述的一种钙超载介导神经元死亡的标志物及应用，对治疗老年痴呆症、帕金森病、渐冻症及青光眼，具有疗效。并且，钙超载、TLK2超磷酸化可作为新型分子标志物预测疾病发生进程或检验治疗效果。

Description

一种钙超载介导神经元死亡的标志物及应用
技术领域
本发明涉及生物标志物技术领域，尤其是涉及一种钙超载介导神经元死 亡的标志物及应用。
背景技术
老年痴呆症(AD)、帕金森病(PD)是老年人最为常见的神经退行性疾 病。目前，中国有老年痴呆患者500万人之多，占世界总病例数的25％，每 年新发病例近30万，呈显著增长趋势。75岁以上人群发病率达8％，80岁以 上高达11％。老年痴呆的患者女性多于男性，60岁以上女性患老年痴呆高于 男性2-3倍。在60岁以上人群中，帕金森病的发病率为1-2％；80岁以上的 人群中，发病率可达4％，是继AD之后第二大神经退行性疾病。
渐冻症属于罕见病，人群发病率为十万分之一，全球每年新增近6千例 患者。中国有近20万例患者。青光眼45岁以上发病率为2％。全球拥有7000 万青光眼患者，中国近1000万青光眼患者。
根据现有研究发现，钙超载在相关神经退行性疾病中有一定的作用，特 别是在神经元中，钙离子可以调控神经递质的释放、神经元的可塑性及基因 表达等。在老年痴呆症中，β淀粉样蛋白在细胞内富集可直接导致钙离子稳态 失衡，也可影响小胶质细胞和星形胶质细胞间接产生钙超载。神经元钙超载 导致的细胞损伤与AD的发生发展密切相关。在渐冻症(ALS)中，由钙通透 性AMPA型谷氨酸受体介导的慢性兴奋性毒性可导致细胞内钙离子失调，并 伴随着内质网钙离子耗竭及线粒体钙离子超载。而脑干和脊髓的一些运动神 经元亚群只表达少量钙结合蛋白，特别容易受到钙超载的伤害。
在青光眼患者的筛板细胞(lamina cribrosa cells)及小梁网细胞(trabecularmeshwork cells)中，出现钙超载及调控钙离子平衡的通道表达改变。在大鼠 青光眼模型中，视神经节细胞(Retina ganglian cells)出现钙超载。
在帕金森病中，多巴胺能神经元的异常放电是由其特有的Cav1.3 L型钙 离子通道维持的。Cav1.3 L型钙离子通道需要相对超极化电位开启，使钙离 子进入细胞，造成多巴胺能神经元出现钙超载，最终导致钙依赖性神经元细 胞死亡。在帕金森病患者大脑中，α-突触核蛋白的异常堆积导致的路易小体 (Lewy bodies，LBs)的形成，α-突触核蛋白的聚集会与细胞膜相互作用形成 孔道，使钙离子平衡失调，导致钙依赖性细胞死亡。
细胞内钙超载会导致多种细胞功能障碍，包括增加细胞氧化应激、细胞 核通透性改变、水解酶活性变化、ATP水平降低、线粒体功能损伤、DNA内 切酶活性增加、自噬功能降低等，最终导致细胞死亡。此外，α-突触核蛋白聚 集也会导致钙超载及自噬功能降低。自噬功能损伤也是导致AD、PD等神经 退行性疾病的重要原因。大量研究表明，帕金森病相关的遗传因素(如LRRK2、 GBA、SMPD1、SNCA、PARK2、PINK1、PARK7、SCARB2)，及老年痴呆 症的相关遗传因素(如ApoE)都参与了自噬-溶酶体途径(Autophagy-lysosome pathway)。这些基因参与编码溶酶体酶、溶酶体转运和线粒体自噬等相关功能。 自噬功能受损可以直接导致α-突触核蛋白、β淀粉样蛋白等异常堆积。因此， 维持细胞自噬功能也是钙超载参与的神经退行性疾病的共同靶点。
发明内容
本发明的目的是提供一种钙超载介导神经元死亡的标志物及应用，对治 疗老年痴呆症、帕金森病、渐冻症及青光眼，具有疗效。并且，钙超载、TLK2 超磷酸化可作为新型分子标志物预测疾病发生进程或检验治疗效果。
为实现上述目的，本发明提供了一种钙超载介导神经元死亡的标志物在 制备多种老龄相关神经退行性疾病治疗药物及检测疾病方法中的应用。
优选的，疾病包括但不限于老年痴呆症、帕金森病、渐冻症或青光眼。
一种钙超载介导神经元死亡的标志物，标志物为超磷酸化TLK2。
优选的，还包括抑制TLK2药物、TLK2的RNA干扰因子、敲除TLK2 因子或敲除TLK2的RNA干扰因子。
优选的，抑制TLK2药物包括但不限于哌迷清、硫利达嗪或三氟拉嗪。
优选的，TLK2的RNA干扰因子是小核酸干扰、反义RNA或其它抑制 TLK2 mRNA转录及蛋白翻译的因子。
优选的，TLK2的RNA干扰序列为具有如SEQ ID NO.1-33所示的核苷 酸序列。
因此，本发明采用上述一种钙超载介导神经元死亡的标志物及应用，其 中，钙超载、TLK2超磷酸化作为新型分子标志物预测疾病发生进程或检验治 疗效果，对老年痴呆症、帕金森病、渐冻症及青光眼的快速预警作用，并且， 在制备治疗上述病症的药物过程中起主要疗效作用。
在神经元及非神经元细胞中，钙超载被缺氧条件诱发，导致TLK2超磷 酸化。在细胞出现钙超载时，TLK2发生超磷酸化(hyperphospherylation)、 导致其磷酸酶活性增强。TLK2的磷酸化底物包括CREBRF(一个转录因子、 具有调控溶酶体基因转录的功能)及未知蛋白导致线粒体碎片化。基因敲除 TLK2、RNA干扰TLK2转录及蛋白翻译、小分子抑制剂，皆可抑制钙超载的 下游损伤。
下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
图1是果蝇翅膀表型示意图；
图2是MC16果蝇肌纤维中荧光蛋白分布示意图；
图3是MC16果蝇的钙超载现象示意图；
图4是TLK RNAi抑制钙超载导致的肌肉损伤示意图；
图5是TLK RNAi挽救MC16果蝇的肌肉损伤示意图；
图6是TLK RNAi挽救钙超载导致的细胞死亡示意图；
图7是TLK RNAi挽救MC16果蝇线粒体功能缺陷示意图；
图8是TLK RNAi不影响MC16果蝇中钙超载的水平示意图；
图9是TLK RNAi提高钙超载导致的自噬-溶酶体功能示意图；
图10是TLK RNAi拯救过表达α-突触核蛋白导致的多巴胺神经元示意 图；
图11是TLK RNAi恢复DaGS>SNCA果蝇中的线粒体功能示意图；
图12是TLK RNAi恢复α-突触核蛋白过表达导致的自噬-溶酶体功能示 意图；
图13是基因敲除TLK2导致自噬流激活示意图；
图14是基因敲除TLK2导致自噬标志性蛋白示意图；
图15是TLK2抑制剂(PMZ)拯救过表达α-突触核蛋白产生的自噬示意 图；
图16是已知的TLK抑制剂化学结构示意图；
图17是TLK2抑制剂(PMZ)拯救过表达α-突触核蛋白产生的自噬示意图；
图18是TLK2蛋白经过钙超载细胞裂解液处理后示意图；
图19是TLK2蛋白经过钙超载细胞裂解液处理后超磷酸化示意图；
图20是钙超载增加TLK2激酶活性示意图；
图21是诱导钙超载模型小鼠实验流程图示意图；
图22是TLK2敲除缓解钙超载小鼠死亡时间示意图；
图23是TLK2基因敲除拯救钙超载导致的多巴胺神经元死亡示意图；
图24是TLK2基因敲除改善钙超载导致的自噬功能降低示意图；
图25是TLK2基因敲除拯救α-突触核蛋白过表达模型小鼠流程示意图；
图26是TLK2基因敲除可拯救α-突触核蛋白过表达导致的行为异常示意 图；
图27是TLK2基因敲除可改善α-突触核蛋白过表达导致的自噬降低示意 图；
图28是TLK2基因敲除可减少α-突触核蛋白过表达导致的多巴胺神经元 死亡示意图；
图29是在α-突触核蛋白过表达及钙超载的病理条件下，TLK2出现了超 磷酸化示意图；
图30是低氧条件下人源视网膜表皮细胞出现钙超载示意图；
图31是发现新型小分子具有抑制钙超载损伤活性示意图；
图32是小鼠TLK2基因敲除具有拮抗青光眼损伤的作用示意图；
图33是PMZ具有拮抗青光眼损伤的作用示意图；
图34是多个人源TLK2 RNAi序列可降低TLK2蛋白水平示意图；
图35是敲低TLK2(shRNA)可降低细胞内tau蛋白水平示意图；
图36是敲低TLK2(shRNA)可降低细胞内FUS蛋白水平、提高细胞自噬 水平示意图。
具体实施方式
以下通过附图和实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
除非另外定义，本发明使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属 领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节， 而且在不背离本发明的主旨或基本特征的情况下，能够以其它的具体形式实 现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且 是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨 在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内， 不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实 施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起 见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也 可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其它实施方式。这些其它 实施方式也涵盖在本发明的保护范围内。
还应当理解，以上所述的具体实施例仅用于解释本发明，本发明的保护 范围并不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围 内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在 本发明/发明的保护范围之内。
本发明中使用的“包括”或者“包含”等类似的词语意指在该词前的要 素涵盖在该词后列举的要素，并不排除也涵盖其它要素的可能。术语“内”、 “外”、“上”、“下”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置 关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置 或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对 本发明的限制，当被描述对象的绝对位置改变后，则该相对位置关系也可能 相应地改变。在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“附着”等术 语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体； 可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连 通或两个元件的相互作用关系。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据 具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。本发明中使用的术语“约” 具有本领域技术人员公知的含义，优选指该术语所修饰的数值在其±50％， ±40％，±30％，±20％，±10％，±5％或±1％范围内。
本公开使用的所有术语(包括技术术语或者科学术语)与本公开所属领 域的普通技术人员理解的含义相同，除非另外特别定义。还应当理解，在诸 如通用词典中定义的术语应当被理解为具有与它们在相关技术的上下文中的 含义相一致的含义，而不应用理想化或极度形式化的意义来解释，除非本文 有明确地这样定义。
对于相关领域普通技术人员已知的技术、方法和设备可能不作为详细讨 论，但在适当情况下，所述技术、方法和设备应当被视为说明书的一部分。
本发明说明书中引用的现有技术文献所公开的内容整体均通过引用并入 本发明中，并且因此是本发明公开内容的一部分。
以下内容中，采用的药物和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。 另外，表1和表2中列出了本实施例中涉及到的抗体和化学试剂信息。
表1 使用的抗体信息
抗体名称 公司 货号 种属
Anti-α-synuclein BD Biosciences 610787 mouse
Anti-TH Millipore AB152 rabbit
Anti-Ref(2)p Abcam ab178440 rabbit
Anti-GABARAP Cell Signaling Technology 13733S rabbit
Anti-p62 Abcam ab56416 mouse
Anti-LC3A/B Cell Signaling Technology 12741S rabbit
Anti-TLK2 Proteintech 13979-1-AP rabbit
Anti-FLAG Proteintech 20543-1-AP rabbit
Anti-P-S129-α-Syn Biolegend 825701 mouse
Anti-TLK1 Cell Signaling Technology 4125S rabbit
Normal IgG Invitrogen 10500C rabbit
表2 涉及到的化学试剂信息
Figure BDA0003580683060000071
Figure BDA0003580683060000081
以下内容中，本发明的数据在进行均值比较时，t检验和方差检验基于以 下假设：样本整体服从正态分布；样本之间方差齐性。两组间的比较使用未 配对t检验进行统计学分析。对于超过两组的比较，使用one-way ANOVA with Tukey’s post hoc检验来确定显著性。Log-rank算法下使用Kaplan-Meier检验 进行生存分析。使用GraphPad Prism软件进行统计分析。P<0.05被认为是有 统计学意义的(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****p<0.0001)。
试验测试一
一、构建果蝇慢性钙超载模型
通过给果蝇转基因表达人BNC1a第430的甘氨酸突变成半胱氨酸的突变 体，该突变的表达会造成细胞质钙离子浓度缓慢上升，称这个转基因果蝇为 UAS-C16(意为表达的G430C突变体，转基因果蝇第16号)。
在帕金森病过程中，肌肉组织也会出现钙超载的现象。并且，肌肉组织 和神经元一样都是兴奋性组织，分子通路基本一致，而且果蝇肌肉组织非常 庞大，有利于观察表型进行遗传筛选。其中，最大的肌肉组织是控制果蝇翅 膀飞行的飞行肌。当飞行肌出现损伤时，翅膀会出现相应的表型。所以采用 肌肉启动子Myosin heavy chain(Mhc)Promoter来介导Gal4蛋白的表达 (Mhc-Gal4将hBNC1 G430C连接在UAS下游)。Gal4作为一个转录激活蛋白， 可以结合到UAS的DNA序列上，强烈激活UAS序列下游基因片段的表达。
本发明通过构建果蝇组织特异启动子驱动的Gal4表达品系以及UAS相 连的转基因片段的果蝇品系，将这两种果蝇品系进行杂交，后代果蝇就可以 在组织特异的细胞内表达UAS后连接的基因。利用果蝇Gal4/UAS系统，构 建出果蝇肌肉慢性钙超载模型，其基因型为Mhc-gal4>UAS-C16，以下将这个 果蝇简称为MC16。
二、MC16果蝇表型
所用果蝇均以果蝇标准玉米面食物饲养在25℃恒温培养箱中。培养箱湿 度维持在60％，设置为昼夜交替模式即白天9:00-21:00，2000-3000lux；黑夜 21:00-次日9:00，0lux。在果蝇7天左右的时间，直接观察果蝇翅膀的表型。
如图1，正常Mhc-Gal4果蝇翅膀表现为与地面平行，并且可以正常飞行。 而MC16钙超载果蝇翅膀表现为持续向下或者向上竖起的异常肌肉状态，并 且失去了飞行能力，提示肌肉内存在损伤。统计第七天MC16钙超载果蝇的 翅膀表型，发现约有80％的果蝇翅膀表现为持续向下耷拉或者向上竖起，说 明MC16果蝇可以出现相应的表型。
在图1中，a图为正常对照Mhc-gal4果蝇翅膀平行排列，b为钙超载果蝇 翅膀位置向上或向下，说明控制翅膀的肌肉出现了损伤。
三、飞行肌的肌纤维
将果蝇飞行肌(IFM)置于HL3缓冲液中解剖，由于果蝇带有绿色荧光 蛋白(GFP)，可以直接利用徕卡SP8共聚焦显微镜进行成像。
由于控制果蝇翅膀飞行的肌纤维长在第二胸节的部位，所以选择胸节部 位的飞行肌来观察肌纤维的形态。并且，绿色荧光蛋白(GFP)可以正常均匀 分布在细胞质中。
将表达绿色荧光蛋白的果蝇分别与Mhc-Gal4果蝇和MC16钙超载果蝇进 行杂交，子一代果蝇可以观察肌纤维组织的形态变化。如图2，a图为正常对 照Mhc-gal4果蝇肌纤维，呈平行排列，绿色荧光蛋白信号分布均匀和规则； 图b中MC16果蝇肌纤维分布杂乱无章，绿色荧光蛋白信号分布极其不规则， 表明MC16果蝇出现肌肉损伤。
四、检测MC16果蝇是否出现钙超载
在HL3缓冲液中解剖果蝇飞行肌，并在室温下5μM Fluo4-AM和0.02％ PluronicF-127中避光孵育30分钟。然后用HL3缓冲液洗涤3次，每次10分 钟。使用徕卡SP8共聚焦显微镜成像并测量荧光强度。
Fluo4是一种钙离子指示剂，它的荧光强度会随着钙离子浓度升高而增 加。本试验利用Fluo4去验证钙离子的水平，在图3中，F代表荧光强度，用 F/F0分析相对荧光强度。两组间采用未配对t检验，差异有统计学意义。结 果显示MC16果蝇中Fluo4的荧光强度明显比正常对照Mhc-Gal4果蝇荧光强 度高，表明MC16果蝇真的出现了钙超载的现象。并且，MC16果蝇钙超载的 信号聚集在线粒体中，因为线粒体是代谢钙离子的主要细胞器之一，所以出 现了线粒体钙超载的现象。
五、TLK RNAi能够明显挽救MC16果蝇翅膀的表型
将UAS-RNAi果蝇品系与MC16果蝇杂交，取子一代果蝇。在果蝇7天 左右的时间，直接观察果蝇翅膀的表型。每次试验约100只果蝇，重复三次。
如图4中，a是MC16果蝇遗传筛选的示意图，将MC16果蝇与UAS-RNAi 果蝇品系进行杂交，观察MC16果蝇翅膀的表型，发现TLK RNAi可以挽救 MC16果蝇翅膀的表型。b是MC16/+和MC16/TLK RNAi果蝇的翅膀正常率， 分别对5～7天的雄蝇和雌蝇进行比较。MC16/TLKRNAi果蝇翅膀正常率比 MC16/+果蝇高。
六、TLK RNAi作用的验证
(1)TLK RNAi可以挽救MC16果蝇的肌肉损伤和线粒体缺陷
果蝇肌肉在2.5％戊二醛(0.1M PB缓冲液稀释)中4℃固定4小时。用 0.1M PB缓冲液冲洗3次，每次10分钟。然后根据标准方案制备样品进行成 像，并使用透射电子显微镜(HT7700)观察。
如图5，通过透射电镜来观察MC16钙超载果蝇肌纤维和线粒体的损伤， 透射电镜结果显示，在正常的Mhc-Gal4果蝇中，肌纤维呈长条致密状，线粒 体呈圆形致密状，而在MC16钙超载果蝇中，肌纤维呈溶解状，线粒体呈空 泡状，表明MC16钙超载果蝇肌纤维和线粒体出现损伤，TLK RNAi可以挽救 MC16果蝇的肌肉损伤和线粒体缺陷。
(2)TLK RNAi可以明显减少TUNEL染色信号
果蝇飞行肌(IFM)置于HL3缓冲液中解剖，4％PFA室温固定15分钟， 然后0.2％PBST打孔三次，每次5分钟。10ug/mL蛋白酶K(PBS溶液稀释) 56℃孵育10分钟。0.2％PBST冲洗3次，每次5分钟。罗氏TUNEL反应混 合液按照说明书配置，在37℃下避光孵育2小时。0.2％PBST冲洗3次，每 次5分钟。将F-actin粉末溶解于DMSO中制成1000倍原液，将原液1:1000 在PBS中稀释，室温下避光染色1小时，PBS冲洗3次，每次5分钟。利用 徕卡SP8共聚焦显微镜获取图像。
由于MC16钙超载果蝇肌纤维和线粒体都出现了损伤，这些损伤会导致 细胞死亡。通过原位末端转移酶标记技术(TUNEL)检测细胞凋亡，来确定 MC16果蝇的细胞死亡方式。如图6，结果表明，对照果蝇无明显TUNEL染 色信号，MC16果蝇有明显的TUNEL信号，TLKRNAi可以明显减少TUNEL 染色信号，挽救MC16果蝇细胞死亡。
(3)TLK RNAi可以恢复钙超载导致的线粒体功能缺陷
将果蝇飞行肌(IFM)置于HL3缓冲液中解剖，1μM TMRM染色，室温 避光孵育10分钟。然后用HL3缓冲液洗涤3次，每次10分钟。
TMRM(Tetramethylrhodamin)是一种标记活细胞线粒体的染料，常用于 测量线粒体膜电位。图7中，红色代表四甲基罗丹明甲酯(TMRM)， Mhc-gal4/+、MC16和MC16/TLK RNAi果蝇飞行肌TMRM荧光染色，与 Mhc-gal4/+果蝇相比，MC16果蝇的TMRM荧光强度显著降低，而TLK RNAi 可以明显恢复TMRM的荧光强度，恢复钙超载导致的线粒体功能缺陷。
(4)TLK RNAi可以影响钙超载的水平
在HL3缓冲液中解剖果蝇大脑或者肌肉，并在室温下5μM Fluo4-AM和 0.02％Pluronic F-127中避光孵育30分钟。然后用HL3缓冲液洗涤3次，每 次10分钟。使用徕卡SP8共聚焦显微镜成像并测量荧光强度。
如图8，通过Fluo4-AM钙离子指示剂染色，它的荧光强度会随着钙离子 浓度升高而增加。MC16/TLK RNAi果蝇Fluo4-AM的荧光强度与MC16/+果 蝇相比，差异无统计学意义，表明TLK RNAi不影响钙超载的水平。
(5)TLK RNAi可以降低在MC16果蝇中升高的Ref(2)P蛋白水平
收集果蝇飞行肌，在添加蛋白酶抑制剂和PMSF的RIPA裂解液(50mM Tris、150mMNaCl、1％Triton X-100、1％sodium deoxycholate和0.1％SDS) 中，冰上裂解30分钟。随后在冰上40w 3sec on/3sec off下超声1分钟，在4℃ 离心机中12000rpm离心15分钟，收集上清液，用SDS上样缓冲液稀释，在 95℃下煮5分钟。取20-30μg蛋白上样，80V恒压下跑胶。当溴酚蓝跑到底 部，130mA恒流下过夜转膜，将蛋白从凝胶转到PVDF膜上。5％脱脂牛奶室 温封闭1小时，TBST洗三次，每次5分钟。适当稀释的一抗4℃孵育过夜， TBST洗三次，每次5分钟。HRP二抗1:10000稀释，室温孵育1小时，TBST 洗三次，每次5分钟。利用ECL化学发光显影蛋白质免疫印迹。
溶酶体是细胞内的消化器官，可以降解细胞内大多数的物质。自噬是一 种主要的胞质蛋白降解途径，自噬小体可以与溶酶体融合形成自噬溶酶体。 当溶酶体功能受损时，自噬过程也会受到影响。LC3蛋白复合物是自噬的标 志物，参与了自噬膜的延伸过程，GABARAP蛋白与LC3蛋白功能类似，是 自噬小体成熟所必需的。
此外，Ref(2)P是哺乳动物P62的果蝇同源物，作为自噬的底物，将泛素 化蛋白传递到自噬小体。P62的积累一般代表自噬活性降低。Mhc-gal4/+与 Mhc-gal4/TLK RNAi果蝇蛋白水平无明显差别。如图9，MC16/+果蝇与 Mhc-gal4/+果蝇相比，Ref(2)P蛋白水平升高，GABARAP水平未发生明显改 变，表明自噬小体过程正常，而自噬溶酶体功能可能下降。重要的是，而TLK RNAi可以降低在MC16果蝇中升高的Ref(2)P蛋白水平。
综上可知，TLK RNAi可以挽救钙超载诱导的细胞死亡、线粒体损伤和自 噬-溶酶体降低，是钙超载介导细胞损伤的关键分子。
试验测试二
一、构建过表达α-synuclein的果蝇
Gaughterless-Gal4(DaGS)启动子诱导UAS-SNCA的表达，该果蝇简称为 DaGS>SNCA。DaGS>SNCA果蝇可以被米非司酮(RU486,Mifepristone)来驱动 全身广泛性地表达α-synuclein。由于RU486对果蝇的健康没有影响，因此将 喂养了RU486的DaGS>SNCA果蝇与未喂养的果蝇进行比较。同样通过 Fluo4-AM染色来检测钙超载的水平，结果验证α-synuclein的过表达增加了果 蝇大脑和肌肉细胞内钙离子的水平，α-synuclein的过表达会导致钙超载。
二、TLK是α-突触核蛋白堆积损伤的关键蛋白
收集果蝇全身组织，在添加蛋白酶抑制剂和PMSF的RIPA裂解液(50mM Tris、150mMNaCl、1％Triton X-100、1％sodium deoxycholate和0.1％SDS) 中，冰上裂解30分钟。随后在冰上40w 3sec on/3sec off下超声1分钟，在4℃ 离心机中12000rpm离心15分钟，收集上清液，用SDS上样缓冲液稀释，在 95℃下煮5分钟。取20-30μg蛋白上样，80V恒压下跑胶。当溴酚蓝跑到底部， 130mA恒流下过夜转膜，将蛋白从凝胶转到PVDF膜上。5％脱脂牛奶室温封 闭1小时，TBST洗三次，每次5分钟。适当稀释的一抗4℃孵育过夜，TBST 洗三次，每次5分钟。HRP二抗1:10000稀释，室温孵育1小时，TBST洗三 次，每次5分钟。利用ECL化学发光显影蛋白质免疫印迹。每次试验约20 只果蝇，重复三次得到相似结果。
如图10，酪氨酸羟化酶(TH)是多巴胺能神经元的标志物，TH水平的减少 一般代表着多巴胺能神经元的死亡。DaGS>SNCA果蝇与对照果蝇相比， α-synuclein蛋白水平明显增高，TH蛋白水平明显降低。而TLK可以降低 DaGS>SNCA果蝇中α-synuclein蛋白的水平，并且恢复一部分TH蛋白水平。 说明TLK RNAi对α-synuclein过表达的果蝇也具有保护作用。
三、TLK在α-synuclein过表达或钙超载诱导的细胞死亡中起关键作用
将果蝇脑组织置于HL3缓冲液中解剖，1μM TMRM染色，室温避光孵 育10分钟。然后用HL3缓冲液洗涤3次，每次10分钟。
如图11，红色代表四甲基罗丹明甲酯(TMRM)，通过TMRM测量线粒体 膜电位，与对照果蝇相比，DaGS>SNCA果蝇的TMRM荧光强度显著降低， 而TLK RNAi可以明显恢复TMRM的荧光强度。验证TLK RNAi可以恢复 DaGS>SNCA果蝇中的线粒体功能缺陷，说明TLK在α-synuclein过表达或钙 超载诱导的细胞死亡中起关键作用。
四、TLK RNAi可以挽救果蝇钙超载或α-synuclein过表达导致的自噬-溶 酶体功能障碍
收集果蝇全身组织，在添加蛋白酶抑制剂和PMSF的RIPA裂解液(50mM Tris、150mMNaCl、1％Triton X-100、1％sodium deoxycholate和0.1％SDS) 中，冰上裂解30分钟。随后在冰上40w 3sec on/3sec off下超声1分钟，在4℃ 离心机中12000rpm离心15分钟，收集上清液，用SDS上样缓冲液稀释， 在95℃下煮5分钟。取20-30μg蛋白上样，80V恒压下跑胶。当溴酚蓝跑到 底部，130mA恒流下过夜转膜，将蛋白从凝胶转到PVDF膜上。5％脱脂牛奶 室温封闭1小时，TBST洗三次，每次5分钟。适当稀释的一抗4℃孵育过夜， TBST洗三次，每次5分钟。HRP二抗1:10000稀释，室温孵育1小时，TBST 洗三次，每次5分钟。利用ECL化学发光显影蛋白质免疫印迹。
如图12，与正常对照果蝇相比，RU486喂养的DaGS>SNCA果蝇， GABARAP水平未发生明显改变，Ref(2)P蛋白水平升高，而TLK RNAi可以 降低在α-synuclein过表达果蝇中升高的Ref(2)P蛋白水平。
试验测试三TLK2介导钙超载损伤的作用
(一)TLK2基因敲除可激活自噬
Hela细胞在添加10％胎牛血清、1％链霉素和青霉素的DMEM培养基中 培养。将5万左右数量的细胞种在共聚焦培养皿中，当细胞密度在50％-70％ 之间时，向1mL培养基中添加LC3-mRFP-GFP腺病毒(汉恒生物)，按照 MOI＝10的标准加入腺病毒的量。转染6-8小时后，更换培养基，进一步培养 24小时后，用徕卡SP8共聚焦显微镜对活细胞进行成像。
检测TLK2 KO对自噬的影响，常用的评估自噬流的方法是利用 LC3-mRFP-GFP腺病毒去标记自噬小体和自噬溶酶体。溶酶体内的低pH值可 以导致LC3-mRFP-GFP腺病毒中GFP荧光信号淬灭；相反，RFP在酸性pH 中表现出更稳定的荧光信号。如果自噬流通畅，黄色和红色斑点都会增加， 分别代表着自噬小体和自噬溶酶体数量增加。图13中，转染LC3-mRFP-GFP 腺病毒48小时后，Hela WT和TLK2 KO的活细胞成像。黄色斑点代表自噬 小体，红色斑点代表自噬溶酶体。与野生型细胞相比，TLK2 KO细胞中的黄 色和红色斑点都增加了，即TLK2 KO增加自噬小体和自噬溶酶体的数量。
(二)分析TLK2 KO细胞中自噬情况
收集Hela细胞，在添加蛋白酶抑制剂和PMSF的RIPA裂解液(50mM Tris、150mMNaCl、1％Triton X-100、1％sodium deoxycholate和0.1％SDS) 中，冰上裂解30分钟。随后在冰上40w 3sec on/3sec off下超声1分钟，在 4℃离心机中12000rpm离心15分钟，收集上清液，用SDS上样缓冲液稀释， 在95℃下煮5分钟。取20-30μg蛋白上样，80V恒压下跑胶。当溴酚蓝跑到 底部，130mA恒流下过夜转膜，将蛋白从凝胶转到PVDF膜上。5％脱脂牛奶 室温封闭1小时,TBST洗三次，每次5分钟。适当稀释的一抗4℃孵育过夜， TBST洗三次，每次5分钟。HRP二抗1:10000稀释，室温孵育1小时，TBST 洗三次，每次5分钟。利用ECL化学发光显影蛋白质免疫印迹。
在TLK2 KO细胞中，LC3-II/LC3-I比值增加，P62蛋白水平降低(图14)。 说明TLK2KO可以激活自噬。自噬作为一个动态过程，更准确的方法是通过 检测自噬流的过程，来评估自噬的水平。通过药物来激活或者阻断自噬通路， 可以评估自噬流的通畅。
通过利用雷帕霉素(Rapa)来激活自噬，巴佛洛霉素A1(Baf A1)来抑制自 噬。利用雷帕霉素(Rapa,40nM)和巴佛洛霉素A1(BafA1,100nM)分别处理细 胞6小时。Western blot结果显示，在野生型Hela细胞中，Rapa处理提高了 LC3-II/LC3-I比值，降低了P62蛋白水平；Baf A1处理升高了LC3-II/LC3-I 比值和P62蛋白水平。在TLK2 KO细胞中，Rapa处理可以进一步降低P62 蛋白水平，Baf A1处理阻断了TLK2 KO激活的自噬。说明TLK2 KO细胞中，自噬流通畅。
(三)TLK2抑制剂可改善α-突触核蛋白过表达对自噬的抑制作用
收集SKN细胞，在添加蛋白酶抑制剂和PMSF的RIPA裂解液(50mM Tris、150mMNaCl、1％Triton X-100、1％sodium deoxycholate和0.1％SDS) 中，冰上裂解30分钟。随后在冰上40w 3sec on/3sec off下超声1分钟，在4 ℃离心机中12000rpm离心15分钟，收集上清液，用SDS上样缓冲液稀释， 在95℃下煮5分钟。取20-30μg蛋白上样，80V恒压下跑胶。当溴酚蓝跑到 底部，130mA恒流下过夜转膜，将蛋白从凝胶转到PVDF膜上。5％脱脂牛奶 室温封闭1小时，TBST洗三次，每次5分钟。适当稀释的一抗4℃孵育过夜， TBST洗三次，每次5分钟。HRP二抗1:10000稀释，室温孵育1小时，TBST 洗三次，每次5分钟。利用ECL化学发光显影蛋白质免疫印迹。
如图15，在神经母细胞瘤(SKN-SH)细胞中过表达α-synuclein的慢病毒， 与正常对照细胞相比，过表达α-synuclein的细胞LC3-II水平较低，P62水平 较高，表明过表达α-synuclein降低了自噬功能。当加入一种已知的TLK2激 酶抑制剂(Pimozide或PMZ)，可以上调LC3-II蛋白水平，下调P62蛋白水平。
(四)TLK2激酶抑制剂与降表达TLK类似，可以挽救α-synuclein过表 达导致的自噬-溶酶体缺陷
SKN细胞用PBS洗涤3次，1μM LysoTracker室温避光孵育10分钟。然 后再用PBS缓冲液洗涤3次，每次10分钟。利用徕卡SP8共聚焦显微镜获取 图像。
如图17，红色代表LysoTracker信号，在神经母细胞瘤(SKN-SH)细胞中 过表达α-synuclein的慢病毒48小时，与正常对照细胞相比，过表达α-synuclein 的细胞LysoTracker信号降低，而PMZ可以恢复LysoTracker信号。表明TLK2 激酶抑制剂与降表达TLK类似，可以挽救α-synuclein过表达导致的自噬-溶 酶体缺陷，PMZ可以恢复α-突触核蛋白过表达降低的自噬水平。这些结果提 示在α-突触核蛋白过表达或者钙超载的情况下，TLK2可能被激活，从而导致 了自噬-溶酶体的功能下降。所以，敲除TLK2或者加入TLK2激酶抑制剂的 情况下，可以激活自噬-溶酶体功能。
(五)钙超载导致TLK2超磷酸化、激活其激酶活性
将TLK2 cDNA克隆到含有GST标签的PGEX-6P-1载体中，将重组质粒 表达到BL21化学感受态细胞中，诱导条件为0.5mM IPTG，在20℃下180rpm 诱导表达20小时。GST-TLK2按照碧云天GST标签蛋白纯化试剂盒标准步骤 进行纯化。17μM ionomycin处理Hela细胞3小时，当细胞密度达到70％时， 收集细胞。在裂解缓冲液(10mM Tris,150mM NaCl,2mM EDTA,0.5％ TritonX-100)中裂解。4℃，12000rpm离心15分钟，收集上清。将3μg GST-TLK2纯化蛋白与200μg细胞裂解液混合，4℃垂直摇床过夜。之后加入 Glutathione Sepharose 4B凝珠，室温继续旋转1小时。用WB及IP裂解液洗 涤6次，每次4℃离心机，2000rpm，5分钟。用SDS上样缓冲液稀释，在 95℃下煮5分钟，或TLK2蛋白经PreScission Protease在4℃下切割过夜。最 终结果经考马斯染色得到。
如图18，为了检测钙超载时TLK2是否被激活，构建了GST-TLK2质粒， 并通过GSTpull down纯化出TLK2蛋白。将纯化出的TLK2蛋白与离子霉素 (ionomycin)处理过的细胞裂解液(诱导钙超载)或正常细胞裂解液进行孵育。通 过考马斯亮蓝染色发现，GST-TLK2与离子霉素处理过的细胞裂解液孵育后蛋 白条带上移，表明TLK2蛋白可能被修饰。与离子霉素处理过的TLK2 KO细 胞裂解液孵育后，也出现了类似的变化。
(六)在离子霉素处理后，正常细胞裂解液和TLK2 KO细胞裂解液，都 可以增加TLK2的磷酸化
将TLK2 cDNA克隆到含有GST标签的PGEX-6P-1载体中，将重组质粒 表达到BL21化学感受态细胞中，诱导条件为0.5mM IPTG，在20℃下180rpm 诱导表达20小时。GST-TLK2按照碧云天GST标签蛋白纯化试剂盒标准步骤 进行纯化。17μM ionomycin处理Hela细胞3小时，当细胞密度达到70％时， 收集细胞。在裂解缓冲液(10mM Tris、150mM NaCl、2mM EDTA、0.5％ TritonX-100)中裂解。4℃，12000rpm离心15分钟，收集上清。将3μg GST-TLK2纯化蛋白与200μg细胞裂解液混合，4℃垂直摇床过夜。之后加入 Glutathione Sepharose 4B凝珠，室温继续旋转1小时。用WB及IP裂解液洗 涤6次，每次4℃离心机，2000rpm，5分钟。用SDS上样缓冲液稀释，在 95℃下煮5分钟，或TLK2蛋白经PreScission Protease在4℃下切割过夜。最 终结果经phos-tag SDS-PAGE得到。
如图19，通过phos-tag SDS-PAGE方法，进一步检测GST-TLK2蛋白条 带上移是不是磷酸化修饰。Phos-tag是一种能与磷酸离子特异性结合的功能性 分子。它可用于磷酸化蛋白的分离。在正常的蛋白免疫印迹中，加入Mn2+和 Phos-tag，用蛋白非磷酸化抗体就可以进行检测。在Phos-tag SDS-PAGE中， 非磷酸化蛋白迁移速度较快，磷酸化蛋白迁移速度变慢。通过迁移率的变化， 可以分析磷酸化蛋白的含量。将纯化出的TLK2蛋白与离子霉素处理过的细 胞裂解液(诱导钙超载)或正常细胞裂解液进行孵育。结果显示在离子霉素处理后，正常细胞裂解液和TLK2 KO细胞裂解液，都可以增加TLK2的磷酸化。
(七)钙超载可以增加TLK2的磷酸化
将TLK2 cDNA克隆到含有GST标签的PGEX-6P-1载体中，将重组质粒 表达到BL21化学感受态细胞中，诱导条件为0.5mM IPTG，在20℃下180rpm 诱导表达20小时。GST-TLK2按照碧云天GST标签蛋白纯化试剂盒标准步骤 进行纯化。17μM ionomycin处理Hela细胞3小时，当细胞密度达到70％时， 收集细胞。在裂解缓冲液(10mM Tris、150mM NaCl、2mM EDTA、0.5％ TritonX-100)中裂解。4℃，12000rpm离心15分钟，收集上清。将3μg GST-TLK2纯化蛋白与200μg细胞裂解液混合，4℃垂直摇床过夜。之后加入 Glutathione Sepharose 4B凝珠，室温继续旋转1小时。用WB及IP裂解液洗 涤6次，每次4℃离心机，2000rpm，5分钟。用SDS上样缓冲液稀释，在 95℃下煮5分钟，或TLK2蛋白经PreScission Protease在4℃下切割过夜。最 终结果经质谱分析得到。
通过质谱鉴定TLK2所有的丝氨酸/苏氨酸磷酸化位点。在正常情况下(未 使用离子霉素处理)，有12个位点被磷酸化，其中对照组和离子霉素处理组共 有10个相同的磷酸化位点(S102、S114、S116、S133、T160、S222、S329、 S375、S392和S449)，对照组中有2个独特的磷酸化位点(S225和S376)。与 对照组相比，离子霉素处理组多15个磷酸化位点(S25、S72、S109、S110、 T207、S209、T212、S217、S277、T299、T300、T366、S616、S751和S752)， 少2个磷酸化位点(S225和S376)(见表3)，表明钙超载可以增加TLK2的 磷酸化。
表3 TLK2磷酸化位点
Figure BDA0003580683060000201
(八)钙超载可以通过增加TLK2的磷酸化来激活TLK2
在50μL反应体系中加入1μL ATP(0.2mM)，1μg TLK2纯化蛋白和20μg 底物，剩下体积用激酶缓冲液(10mM Tris pH 7.5、50mM KCl、10mM MgCl2、 1mM DTT)补齐，室温下反应15分钟。MBP蛋白做阳性对照底物，PGK1 蛋白做阴性对照底物。加入50ul Kinase-LumiTM超强型化学发光法激酶检测试 剂，混匀室温避光反应10分钟。然后用多功能酶标仪进行化学发光检测。
如图20，通过体外激酶实验去验证TLK2激酶的活性。在体外的激酶实 验中，髓鞘碱性蛋白(MBP)可作为多种激酶的底物，将没有加入TLK2(No TLK2)蛋白作为对照，在正常处理组(TLK2+Control)和离子霉素处理组(TLK2+Ionomycin)中，将同样量的TLK2蛋白与同样量的MBP蛋白反应。通 过减少的ATP水平来反映TLK2激酶的活性。与正常对照相比，正常处理组 和离子霉素处理组都会消耗ATP。与正常处理组相比，离子霉素处理组可以 消耗更多的ATP。表明钙超载可以增加TLK2激酶活性。以上结果表明，钙 超载可以通过增加TLK2的磷酸化来激活TLK2。
试验测试四
一、构建TLK2基因敲除可拯救钙超载模型小鼠
谷氨酸受体1Lurcher突变体(GluR1Lc)可以形成组成性开放的阳离子通 道。构建一个条件性表达GluR1Lc的转基因小鼠(GluR1Lc m/m，“m”表示 GluR1Lc)。与多西环素(dox)诱导的启动子(rtTA)杂交后，GluR1Lc m/+；rtTA+/-小鼠在提供多西环素时可以全身广泛表达GluR1Lc。发现，在小鼠饮用水中提 供正常浓度(2mg/mL)的多西环素可在一天内诱导小鼠死亡。而把多西环素稀 释200倍(0.01mg/mL)后，GluR1Lc小鼠可存活3天以上。所以在小鼠的饮用 水中提供0.01mg/mL的多西环素来缓慢诱导GluR1Lc的表达。另外，还构建 了条件性TLK2敲除小鼠(TLK2flox/flox；UBC-CreERT2/+)。将条件性表达GluR1Lc的转基因小鼠和条件性TLK2敲除小鼠杂交，获得了所需的基因型(GluR1Lc m/+；rtTA+/-；TLK2flox/-；UBC-CreERT2/+)。
所有小鼠均饲养在首都医科大学动物中心。动物实验获得首都医科大学 动物伦理委员会批准(批准号：AEEI-2015-156)。GluR1Lc小鼠购自上海南方 模式生物科技有限公司。本项目利用同源重组原理，采用ES细胞打靶的方式， 在Rosa26(ENSMUSG00000086429)基因位点定点插入 SA-polyA-Insulator-Insulator-TRE-miniCMVpromoter-Gria1(Mut)-wpre-pA-Insul ator-Insulator-FRT-PGK-Neo-pA-FRT表达框。
简要过程如下：通过In-Fusion cloning的方法构建ES细胞打靶载体，该 载体包含3.3 kb 5’同源臂、 SA-polyA-Insulator-Insulator-TRE-miniCMVpromoter-Gria1(Mut)-wpre-pA-Insul ator-Insulator-FRT-PGK-Neo-pA-FRT、3.2kb 3’同源臂和MC1-TK-polyA负 筛选标记。该载体经线性化后，电转转染C57BL/6ES细胞。经G418和Ganc 药物筛选后，共获得144个抗性ES细胞克隆；经长片段PCR鉴定，共获得9 个正确同源重组的阳性克隆。阳性ES细胞克隆经扩增后，注射入C57BL/6J 小鼠的囊胚中，获得嵌合鼠。高比例嵌合小鼠与flp小鼠交配获得3只阳性 F1代flp基因阳性且去Neo小鼠。将GluR1Lc m/m(ENSG00000155511)转基因 小鼠与rtTA+/+小鼠杂交，当小鼠8-10周左右，饮用水中加入多西环素诱导 GluR1Lc表达。
试验设计如图21，8-10周龄小鼠连续腹腔注射它莫昔芬(以玉米油为对 照)5天，以诱导TLK2敲除。1个月后，饮用水中加入多西环素(0.01mg/mL) 以诱导GluR1Lc表达，从而诱导钙超载的发生。
TLK2基因敲除小鼠购自上海南方模式生物科技有限公司。TLK2基因(ENSG00000146872)的缺失采用Cre-lox系统。利用同源重组原理，采用受精 卵同源重组的方式，对TLK2基因进行flox修饰。简要过程如下：通过体外 转录的方式，获得Cas9 mRNA和gRNA；通过In-Fusion cloning的方法构建 同源重组载体(donor vector)，该载体包含2kb5’同源臂、0.7kb的flox区域 和2.8kb 3’同源臂。将Cas9 mRNA、gRNA和donor vector显微注射到 C57BL/6J小鼠的受精卵中，获得F0代小鼠。经长片段PCR鉴定，共获得1 只正确同源重组的F0代小鼠；F0代小鼠与C57BL/6J小鼠交配获得4只阳性 F1代小鼠。TLK2flox/flox小鼠采用靶向外显子4的CRISPR-Cas9技术。将其与 UBC-CreERT2/+小鼠配对后，当小鼠8-10周左右，开始腹腔注射他莫昔芬(75 mg/kg)，每天一次，连续5天，从而导致全身组织TLK2基因的敲除。
如图21，8-10周龄GluR1Lc m/+；rtTA+/-；TLK2flox/-；UBC-CreERT2/+小鼠， 连续腹腔注射它莫昔芬(以玉米油为对照)5天，以诱导TLK2敲除。1个月后， 饮用水中加入多西环素(0.01mg/mL)以诱导GluR1Lc表达，直至小鼠死亡。
发现没有TLK2 KO的小鼠，只表达GluR1Lc的小鼠在多西环素处理第3 天后开始死亡，而有杂合子TLK2 KO的小鼠，GluR1Lc小鼠存活时间更长， 表明TLK2 KO可以延长钙超载小鼠的寿命。
二、TLK2 KO可以延长钙超载小鼠寿命
用戊巴比妥钠(80mg/kg)将小鼠麻醉，随后将小鼠腹部和胸腔剖开，注 射器插入左心室，剪开右心耳，0.9％生理盐水快速灌流直到肝脏完全变白， 4％多聚甲醛(PFA)缓慢灌流以固定组织。取出脑组织并放置在4％PFA中 过夜，然后用10％，20％和30％的蔗糖梯度脱水。随后用OCT包埋，冻于 负八十冰箱。利用冰冻切片机将脑组织切成10μm厚的冠状切片。脑组织切 片在4％PFA室温下固定15分钟，然后用0.2％PBST(PBS包含0.2％Triton X –100)打孔三次，每次5分钟，然后用5％BSA在室温下封闭30分钟。用封 闭液将一抗稀释至适宜的浓度，在4℃孵育过夜。用PBS洗涤三次，每次5 分钟。二抗1:200稀释，室温避光孵育1小时，用PBS洗涤三次，每次5分 钟。DAPI稀释液染色5分钟，PBS洗涤三次，每次5分钟。利用徕卡SP8共 聚焦显微镜获取图像。
如图22，无多西环素诱导的Control小鼠，无小鼠死亡；只有多西环素无 它莫昔芬诱导的GluR1小鼠，从第三天开始死亡，最长能存活6天；既有多 西环素又有它莫昔芬诱导的GluR1+TLK2 CKO小鼠，从第四天开始死亡，最 长能存活9天。
如图23，红色代表TH阳性神经元，蓝色代表细胞核(DAPI)。免疫荧光 染色结果显示GluR1小鼠TH阳性神经元的数量减少，而TLK2 CKO可以部 分恢复TH阳性神经元的数量。
三、TLK2 KO在钙超载的小鼠模型中的保护作用
取小鼠脑组织在添加蛋白酶抑制剂和PMSF的RIPA裂解液(50mM Tris、 150mMNaCl、1％Triton X-100、1％sodium deoxycholate和0.1％SDS)中匀浆， 冰上裂解30分钟。随后在冰上40w 3 sec on/3 sec off下超声1分钟，在4℃离 心机中12000rpm离心15分钟，收集上清液，用SDS上样缓冲液稀释，在 95℃下煮5分钟。取20-30μg蛋白上样，80V恒压下跑胶。当溴酚蓝跑到底 部，130mA恒流下过夜转膜，将蛋白从凝胶转到PVDF膜上。5％脱脂牛奶室 温封闭1小时，TBST洗三次，每次5分钟。适当稀释的一抗4℃孵育过夜， TBST洗三次，每次5分钟。HRP二抗1:10000稀释，室温孵育1小时，TBST 洗三次，每次5分钟。利用ECL化学发光显影蛋白质免疫印迹。
如图24，Western blot结果显示，发现钙超载小鼠TH蛋白水平以及TH 阳性神经元的数量均降低。而TLK2 KO可以部分恢复TH的蛋白水平和TH 阳性神经元的数量。与钙超载果蝇相似，GluR1Lc小鼠的P62蛋白水平也升 高，LC3-II/I的比值无明显变化，而TLK2 KO可降低升高的P62蛋白水平。
四、TLK2基因敲除可拯救α-突触核蛋白过表达模型小鼠
取8-10周左右C57BL/6雄性小鼠，用戊巴比妥钠(80mg/kg)麻醉，对 称固定于小鼠脑立体定位仪上。将AAV9-CMV-h-α-synuclein(汉恒生物)病 毒注射于右侧黑质部位(AP:-3.0mm；ML:-1.3mm；DV:-4.5mm)。用10μL Hamilton注射器以0.1μL/min的速度，注射1μLAAV9-CMV-h-α-synuclein(1.5 x1012 vg/mL)病毒或者PBS。注射后将针停留5分钟，之后缓慢将针旋出。 手术后，小鼠放在电热毯上进行恢复。
如图25，8-10周龄纯合TLK2 KO小鼠(TLK2flox/flox；UBC-CreERT2/+)连续 5天腹腔注射它莫昔芬(以玉米油为对照)，1周后，在小鼠右侧黑质致密部(SNc) 注射AAV9-CMV-human-α-synuclein病毒或PBS，一个月后，对小鼠进行行为 学检测并处死。
五、TLK2 KO小鼠可以恢复α-synuclein过表达小鼠的行为学异常
在旷场试验中，小鼠在饲养笼中适应实验室环境约30分钟，然后将小鼠 放入50×50×50cm的场地中。经过1分钟的适应后，继续让小鼠在旷场中 探索5分钟。用SMART 3.0软件(RWD,china)记录自由探索的5分钟后， 将小鼠放回饲养笼，用70％乙醇清洁场地。
在转棒试验中，小鼠在饲养笼中适应实验室环境约30分钟，然后被放在 一个转速在5-45转/分的加速旋转杆上，最长持续5分钟。每天进行2次试 验，连续3天，记录小鼠从转棒上掉下来的时间，并对第3天的最后2次试 验进行运动能力分析。
如图26，左边图为转棒实验结果，中间和右边图是旷场实验结果。在转 棒实验中，比较control(注射PBS组)，AAV-syn(注射α-synuclein病毒组)和 AAV-syn-TLK2 CKO(在TLK2 CKO小鼠中注射α-synuclein病毒组)小鼠从转 棒上掉落的时间。在旷场实验中，比较control(注射PBS组)，AAV-syn(注射 α-synuclein病毒组)和AAV-syn-TLK2 CKO(在TLK2CKO小鼠中注射 α-synuclein病毒组)小鼠5分钟自由活动的总距离和平均速度。与注射PBS的 对照组相比，α-synuclein过表达的小鼠行为学均表现较差。而TLK2 KO小鼠 可以恢复α-synuclein过表达小鼠的行为学异常。
六、TLK2 KO可以减轻这些缺陷
取小鼠脑组织在添加蛋白酶抑制剂和PMSF的RIPA裂解液(50mM Tris、 150mMNaCl、1％Triton X-100、1％sodium deoxycholate和0.1％SDS)中匀浆， 冰上裂解30分钟。随后在冰上40w 3sec on/3sec off下超声1分钟，在4℃离 心机中12000rpm离心15分钟，收集上清液，用SDS上样缓冲液稀释，在 95℃下煮5分钟。取20-30μg蛋白上样，80V恒压下跑胶。当溴酚蓝跑到底 部，130mA恒流下过夜转膜，将蛋白从凝胶转到PVDF膜上。5％脱脂牛奶室温封闭1小时，TBST洗三次，每次5分钟。适当稀释的一抗4℃孵育过 夜，TBST洗三次，每次5分钟。HRP二抗1:10000稀释，室温孵育1小时， TBST洗三次，每次5分钟。利用ECL化学发光显影蛋白质免疫印迹。
如图27，Western blot结果显示，与左脑(对照组)相比，右脑TH蛋白水 平降低，并且α-synuclein蛋白水平升高，而TLK2 KO可以恢复α-synuclein 过表达小鼠减少的TH蛋白水平，降低升高的α-synuclein蛋白水平。此外， α-synuclein过表达小鼠的P62蛋白水平也升高，LC3-II/I的比值无明显变化， 而TLK2 KO可降低升高的P62蛋白水平，TLK2基因敲除可改善α-突触核蛋 白过表达导致的自噬降低。
七、TLK2 KO可以挽救α-synuclein过表达减少的TH阳性神经元数量
用戊巴比妥钠(80mg/kg)将小鼠麻醉，随后将小鼠腹部和胸腔剖开，注射 器插入左心室，剪开右心耳，0.9％生理盐水快速灌流直到肝脏完全变白，4％ 多聚甲醛(PFA)缓慢灌流以固定组织。取出脑组织并放置在4％PFA中过夜， 然后用10％、20％和30％的蔗糖梯度脱水。随后用OCT包埋，冻于负八十冰 箱。利用冰冻切片机将脑组织切成10μm厚的冠状切片。
脑组织切片在4％PFA室温下固定15分钟，然后用0.2％PBST(PBS包 含0.2％Triton X–100)打孔三次，每次5分钟，然后用5％BSA在室温下封闭 30分钟。用封闭液将一抗稀释至适宜的浓度，在4℃孵育过夜。用PBS洗涤 三次，每次5分钟。二抗1:200稀释，室温避光孵育1小时，用PBS洗涤三 次，每次5分钟。DAPI稀释液染色5分钟，PBS洗涤三次，每次5分钟。利 用徕卡SP8共聚焦显微镜获取图像。
如图28，红色代表TH阳性神经元，绿色代表α-synuclein，蓝色代表细 胞核(DAPI)。左边白色虚线框进一步放大，是右侧的图像。小鼠大脑冠状切 片免疫荧光染色显示，病变侧α-synuclein堆积增加，TH阳性神经元数量减少， 而TLK2 KO可以挽救α-synuclein过表达减少的TH阳性神经元数量。
八、TLK2在这些病理条件下被激活
小鼠脑组织在添加蛋白酶抑制剂，PMSF和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液 中快速匀浆，在冰上裂解30分钟。4℃，12000rpm离心15分钟，收集上清， 部分上清液经碱性磷酸酶处理，用SDS上样缓冲液稀释，在95℃下煮5分钟。 向8％SDS-PAGE凝胶中加入40μmol/L MnCl2和20μmol/L phos-tag。电泳后， 用含有5mM EDTA的转膜缓冲液清洗凝胶2次，每次20分钟，以去除二价 阳离子。再用正常的转膜缓冲液冲洗10分钟。然后将蛋白质从凝胶转移到PVDF膜上。剩下步骤与正常的western blot程序相同。
如图29，在α-突触核蛋白过表达及钙超载的病理条件下，TLK2出现了 超磷酸化。通过phos-tag SDS-PAGE方法检测TLK2的磷酸化。用碱性磷酸酶 (ALP)对丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基进行去磷酸化处理。在GluR1Lc和 α-synuclein过表达小鼠的大脑中检测到TLK2磷酸化增加。这表明TLK2在这 些病理条件下被激活。
九、TLK2基因敲除可拯救青光眼细胞模型及动物模型
PBS洗涤RGC-5细胞3次，在室温下5μM Fluo4-AM和0.02％Pluronic F-127中避光孵育30分钟。然后用PBS洗涤3次，每次10分钟。使用徕卡 SP8共聚焦显微镜成像并测量荧光强度。
与青光眼相关的多种细胞类型皆出现钙超载现象，这是因为高眼压会导 致血液流动受阻、细胞缺氧。细胞缺氧会导致线粒体功能降低、无法维持细 胞ATP水平、导致钙超载。
如图30，低氧条件下人源视网膜表皮细胞出现钙超载。1％氧气饲养24 小时后，细胞内相对钙离子浓度可被Fluo-4AM荧光强度指示出来。低氧导致 钙超载。在TLK2基因敲除的细胞中，低氧诱导的细胞死亡(LDH assay测量) 可被抑制。
根据细胞的大小和生长速度将适量细胞接种到96孔细胞培养板中，使待 检测时细胞密度不超过80-90％满。吸去培养液，用PBS液洗涤一次。换新鲜 培养液(推荐使用含1％血清的低血清培养液或适当的无血清培养液)，将各培 养孔分成如下几组：包括无细胞的培养液孔(背景空白对照孔)，未经药物处理 的对照细胞孔(样品对照孔)，未经药物处理的用于后续裂解的细胞孔(样品最 大酶活性对照孔)，以及药物处理的细胞孔(药物处理样品孔)，并做好标记。
按照实验需要给予适当药物处理如加入0-10μL左右特定的药物刺激，可 设置不同浓度，不同处理时间，对照孔中需加入适当的药物溶剂对照)，继续 按常规培养。到预定的检测时间点前1小时，从细胞培养箱里取出细胞培养 板，在“样品最大酶活性对照孔”中加入试剂盒提供的LDH释放试剂，加入 量为原有培养液体积的10％。加入LDH释放试剂后，反复吹打数次混匀，然 后继续在细胞培养箱中孵育。
到达预定时间后，将细胞培养板用多孔板离心机400g离心5min。分别取 各孔的上清液120μL，加入到一新的96孔板相应孔中，随即进行样品测定。 各孔分别加入60μL LDH检测工作液。混匀，室温(约25℃)避光孵育30min(可 用铝箔包裹后置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动)。然后在490nm处测定吸 光度。使用600nm或大于600nm的任一波长作为参考波长进行双波长测定。 计算(测得的各组吸光度均应减去背景空白对照孔吸光度)。
如图31，发现新型小分子具有抑制钙超载损伤活性。利用细胞钙超载模 型进行了小分子库(超过2000种活性小分子)药物筛选，drug1(PMZ)为阳性对 照。Drug2-4分别代表Volasertib、Epigallocatechin Gallate及XL413。
给予玻璃体注射生理盐水，建立急性高眼压青光眼模型，用眼压仪测小 鼠眼压在50-70mmHg。48小时后，获得视网膜。进行免疫组化染色，分别标 记RGC细胞核、RGC神经树、细胞死亡标记物。与野生型同代小鼠比较细胞 死亡。
如图32，小鼠TLK2基因敲除具有拮抗青光眼损伤的作用。WB图显示 TLK2杂合子敲除确实降低了TLK2蛋白水平。β-actin标记蛋白上样量。右图 位小鼠视网膜荧光免疫结果。Sham是未给与处理的正常小鼠视网膜。β3 tubulin抗体染色标记神经元中的微管蛋白(绿色)、RBPMS抗体标记视神经 的胞体(红色)、DAPI标记DNA(既细胞核、蓝色)。青光眼模型为急性高 眼压模型。图中结果显示，青光眼模型导致神经微管染色减少、断裂；视神 经节细胞数量降低。在TLK2基因敲除背景下，上述损伤显著降低。
给予玻璃体注射生理盐水，建立急性高眼压青光眼模型，用眼压仪测小 鼠眼压在50-70mmHg。6小时后，腹腔注射药物。48小时后，获得视网膜。 或眼底注射AAV2病毒表达TLK2 sh RNA两周后，给与高眼压处理，48小时 后取视网膜。
如图33，PMZ具有拮抗青光眼损伤的作用。倪氏染色，标记视网膜中的 神经元。箭头指示视神经节层。control是未给与处理的正常小鼠视网膜。No drug为青光眼造模后未给与药物治疗。10mg/kg至30mg/kg是给与PMZ腹腔 注射的剂量(每天一次)。图中结果显示，青光眼模型导致视神经节层的神经 元数量减少；而高剂量PMZ(30mg/kg)产生保护作用。同样方法检验了 Epigallocatechin Gallate、AAV2病毒表达TLK2 sh RNA的序列(GACCGCTTGAGACTGGGCCACTTTA；CCATTATCATGCAGATTGT； GTCGGATCCTTGAGTGATA)也具有类似药效。
十、TLK2 siRNA及AAV病毒表达的shRNA如人工合成核苷酸序列1-33， 验证TLK2RNAi的敲低效率。
收集SKN组织，在添加蛋白酶抑制剂和PMSF的RIPA裂解液(50mM Tris,150mMNaCl,1％Triton X-100,1％sodium deoxycholate和0.1％SDS) 中，冰上裂解30分钟。随后在冰上40w 3sec on/3sec off下超声1分钟，在 4℃离心机中12000rpm离心15分钟，收集上清液，用SDS上样缓冲液稀释， 在95℃下煮5分钟。取20-30μg蛋白上样，80V恒压下跑胶。当溴酚蓝跑到 底部，130mA恒流下过夜转膜，将蛋白从凝胶转到PVDF膜上。5％脱脂牛 奶室温封闭1小时，TBST洗三次，每次5分钟。适当稀释的一抗4℃孵育 过夜，TBST洗三次，每次5分钟。HRP二抗1:10000稀释，室温孵育1小时， TBST洗三次，每次5分钟。利用ECL化学发光显影蛋白质免疫印迹。
如图34，多个人源TLK2 RNAi序列可降低TLK2蛋白水平。在人源SKN 细胞中转染不同TLK2 siRNA。列出的7条序列是从上述33个序列里随机合 成的，皆可不同程度降低TLK2蛋白水平。
十一、TLK2 shRNA可减少老年痴呆症相关tau蛋白堆积
在人源神经瘤细胞系(SKN)中侵染慢病毒表达的人源tau蛋白，建立稳定 表达细胞系。然后使用慢病毒侵染TLK2 shRNA。培养72小时后裂解细胞、 收集蛋白。做Westernblots，β-actin是蛋白上样量对照。实验重复三次。
如图35，敲低TLK2(shRNA)可降低细胞内tau蛋白水平，在人源神经瘤 细胞系(SKN)中过表达tau，TLK2 shRNA使用慢病毒侵染。
十二、TLK2 shRNA可减少渐冻症相关FUS蛋白堆积
在小鼠原代培养神经元中侵染慢病毒表达FUS，该蛋白为人体突变的致 病性蛋白FUS(P525L)。建立稳定表达FUS(P525L)细胞系后，慢病毒侵 染表达TLK2 shRNA。培养72小时后，裂解细胞、收集蛋白。做Western blots， β-actin是蛋白上样量对照。LC3II/I比值高代表自噬活跃。实验重复三次。
如图36，敲低TLK2(shRNA)可降低细胞内FUS蛋白水平、提高细胞自 噬水平。在小鼠原代培养神经元中过表达FUS(致病性FUS突变体、该突变导 致患者渐冻症)。TLK2 shRNA使用慢病毒侵染。
因此，本发明采用上述一种钙超载介导神经元死亡的标志物及应用，其 中，钙超载、TLK2超磷酸化作为新型分子标志物预测疾病发生进程或检验治 疗效果，对老年痴呆症、帕金森病、渐冻症及青光眼的快速预警作用，并且， 在制备治疗上述病症的药物过程中起主要疗效作用。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进 行限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技 术人员应当理解：其依然可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换， 而这些修改或者等同替换亦不能使修改后的技术方案脱离本发明技术方案的 精神和范围。
序列表
<110> 首都医科大学
<120> 一种钙超载介导神经元死亡的标志物及应用
<160> 33
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial series)
<400> 1
taggtgttag taagggacca cttaa 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial series)
<400> 2
cgtcggatcc ttgagtgata aagaa 25
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial series)
<400> 3
gaccgcttga gactgggcca cttta 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial series)
<400> 4
gaggaggttt cagtgaagtt tacaa 25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial series)
<400> 5
cagagcaaag atacgtagct gtgaa 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial series)
<400> 6
catgtaggga ataccggatt cataa 25
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial series)
<400> 7
ggaaatgatc tggacttcta cctga 25
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial series)
<400> 8
cccggtccat tatcatgcag attgt 25
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial series)
<400> 9
ggtccattat catgcagatt gtgaa 25
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial series)
<400> 10
tgatgtccag cagctggcct gtgat 25
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial series)
<400> 11
cctcttctgg gaatacagag ctaaa 25
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial series)
<400> 12
taggagccca cagtttactt aggtt 25
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial series)
<400> 13
ccacagttta cttaggttaa cgtta 25
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial series)
<400> 14
gtcggatcct tgagtgata 19
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial series)
<400> 15
ccattatcat gcagattgt 19
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial series)
<400> 16
cgacacggag cctcattta 19
<210> 17
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial series)
<400> 17
cgaagatcat ggatgatga 19
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial series)
<400> 18
ggagctgcta ttgcatcaa 19
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial series)
<400> 19
agcagaatac catgaacaa 19
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial series)
<400> 20
gagctggaga gactagaaa 19
<210> 21
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial series)
<400> 21
ccaacgctaa atgacagat 19
<210> 22
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial series)
<400> 22
agagcaaaga tacgtagct 19
<210> 23
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial series)
<400> 23
gcaagtacgt ggcaatgtt 19
<210> 24
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial series)
<400> 24
ggttagaaga ctgcagctt 19
<210> 25
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial series)
<400> 25
ggaagatgga gtgtttcaa 19
<210> 26
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial series)
<400> 26
gcacatataa acgtgtgca 19
<210> 27
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial series)
<400> 27
gctggatcat cccagaata 19
<210> 28
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial series)
<400> 28
gcagattgtg aatgcttta 19
<210> 29
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial series)
<400> 29
cctcaaacca ggtaatatt 19
<210> 30
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial series)
<400> 30
gctggtactt attggtatt 19
<210> 31
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial series)
<400> 31
gccagtagta acacctgaa 19
<210> 32
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial series)
<400> 32
gcgtccaata acagttctt 19
<210> 33
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial series)
<400> 33
gccagtgaaa tcactaagt 19

Claims (6)

1.一种钙超载介导神经元死亡的标志物在制备老龄神经退行性疾病检测试剂盒中的应用；
所述标志物为超磷酸化TLK2，其磷酸化位点为S102、S114、S116、S133、T160、S222、S329、S375、S392、S449、S25、S72、S109、S110、T207、S209、T212、S217、S277、T299、T300、T366、S616、S751和S752。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：疾病包括老年痴呆症、帕金森病、渐冻症、青光眼。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：试剂盒还包括抑制TLK2药物、TLK2的RNA干扰因子、敲除TLK2因子或敲除TLK2的RNA干扰因子。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：抑制TLK2药物包括哌迷清、硫利达嗪或三氟拉嗪。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：TLK2的RNA干扰因子是小核酸干扰、反义RNA或其它抑制TLK2 mRNA转录及蛋白翻译的因子。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：TLK2的RNA干扰因子的序列为具有如SEQID NO. 1-33所示的核苷酸序列。
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