CN107847566A - 释放过氧化氢的抗微生物组合物和制剂 - Google Patents

Abstract

本发明描述了用于产生抗微生物活性的组合物。该组合物包含：第一相；第二相；能够转化底物以释放过氧化氢的酶；和包含酶的底物的物质，其中所述第一相和所述第二相不混溶。该组合物可以配制成胶体、悬浮液或乳液，特别是配制为乳膏或喷雾剂。本发明还描述了制备组合物的方法以及其用于治疗抗微生物感染的用途。

Description

释放过氧化氢的抗微生物组合物和制剂

技术领域

本发明涉及抗微生物组合物和制剂，特别是胶体、悬浮液或乳液。所述组合物和制剂可以用于局部施用以治疗抗微生物感染，如病毒、细菌或真菌感染。

背景技术

唇疱疹是在嘴唇或嘴周围发展的小水泡。唇疱疹由单纯疱疹病毒(HSV)引起，并且通常未经治疗在7到10天内即消除。唇疱疹通常起始于嘴周围的刺痛、瘙痒或烧灼感。然后将出现小的充满流体的疮(sores)，最常见的是在下唇的边缘。局部产品，如乳膏(膏状物，乳剂，cream)或凝胶，可用于治疗唇疱疹。许多处方药可能会稍微缩短唇疱疹的持续时间，通常只缩短1至2天。

生殖器疱疹是由单纯疱疹病毒(HSV)引起的常见感染。它在生殖器和周围区域产生令人疼痛的水泡。疱疹可以用抗病毒试剂治疗。但是，这些试剂会产生副作用，如恶心和头痛。

仍然需要提供有效治疗HSV和其他病毒或微生物感染的局部制剂。

申请人已经发现能够在微生物感染部位释放过氧化氢的组合物在预防或抑制感染方面特别有效。

Surgihoney^TM是一种化学工程化的蜂蜜，其具有运送可变的和持续剂量的活性氧种类(ROS)的能力。体外和体内研究已经证明了Surgihoney在根除感染方面的功效。这包括耐药菌株，如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(S.aureus)(MRSA)和耐万古霉素的屎肠球菌(Enterococcus faecium)(Dryden,M.,Lockyer,G.,Saeed,K.,&Cooke,J.(2014)Engineered Honey:In Vitro Antimicrobial Activity of a Novel Topical WoundCare Treatment.Journal of Global Antimicrobial Resistance,2,168-172)。Surgihoney还显示出对真菌有效并防止或减少了生物膜的接种(Dryden,M.,Halstead,F.,&Cooke,J.(2015).Engineered Honey to Manage Bacterial Bioburden and Biofilmin Chronic Wounds.EWMA Free Paper Session:Infection and Antimicrobials)。在WO2015/166197A1中公开了化学工程化的蜂蜜，如具有添加的葡萄糖氧化酶的蜂蜜。

目前，Surgihoney^TM可以以小袋形式用于局部给药。然而，以此形式给药Surgihoney^TM可能不方便，使得难于以受控剂量施用并且可能在临床上并非最佳。

发明内容

根据本发明，提供了用于产生抗微生物活性的组合物，所述组合物包含：亲油相(亲脂相，lipophilic phase)；含水相；能够转化底物以释放过氧化氢的酶；和包含酶的底物的物质。本发明的组合物可以是胶体或悬浮液的形式。

术语“胶体”在本文中用于指均匀的非结晶物质，所述均匀的非结晶物质由一种物质的大分子或超微观颗粒分散于整个第二物质组成。胶体包括凝胶、溶胶和乳液。该颗粒不会沉淀，并且不像在悬浮液中那样，能够通过普通的过滤或离心分离出。

术语“悬浮液”在本文中用于指小颗粒物质分散在整个液体中的混合物。如果悬浮液不受干扰，则颗粒很可能沉降到底部。悬浮液中的颗粒大于胶体或溶液中的颗粒。

本发明的组合物可以是乳液形式。术语“乳液”在本文中用于指一种液体的微小液滴在另一种它不可溶或不可混溶的液体中细分散。本发明的乳液可以是油和水乳液，特别是水包油乳液或油包水乳液。该组合物可以是微乳液。

本发明的组合物可以包含第一相(或第一液体或第一组分)和第二相(或第二液体或第二组分)，能够转化底物以释放过氧化氢的酶；以及包含用于酶的底物的物质。第一相和第二相可以不混溶。例如，第一相可以比第二相的极性更小。第一相可以是非极性相，例如亲油相或疏含水相，例如油。第二相可以是极性相，如含水相。第二相可以包含非水溶剂。第二相的液滴或胶束可以分散在第一相中。

第二相可以包含水和/或非水溶剂。酶和组合物的物质可以溶解在水和/或非水溶剂中。

可以想到的是，在一些实施方式中，第二相可以不包含水，或者可以基本上不包含水。在这种情况下，第二相可描述为非水性。例如，酶和包含酶的底物的物质可以溶解在非水溶剂中。非水溶剂对于第一相(例如亲油相)可以是不混溶的。

在一些实施方式中，能够转化底物以释放过氧化氢的酶和包含酶的底物的物质可以包含在分散于第一相(例如亲油相)中的胶束内。

在一些组合物中，所述组合物可以是复乳液(双乳液，double emulsion)的形式。例如，含有能够转化底物以释放过氧化氢的酶和包含酶的底物的物质的液滴可以分散在亲油相的小球(例如油珠(oil golbule))内，而小球可以分散在含水相内。这种复乳液可被称为水包油包水型(W/O/W)乳液。

本发明的组合物可以进一步包含乳化剂(或乳化试剂)。乳液可以通过在乳液界面处的表面活性剂(乳化剂)的吸附来稳定。乳化剂降低界面张力以使液滴保持分散状态。乳化剂具有亲水部分和亲油部分。可能的是计算出所需的乳化剂的相对量以制备物理上最稳定的乳液用于特定制剂与水组合。这种方法被称为亲水-亲油平衡(HLB)法(“The HLBSYSTEM a time-saving guide to emulsifier selection”ICI Americas Inc.,Wlimington,Delaware 19897,1976,1980修订)。每种乳化剂分配一个HLB值，该HLB值表示分子的亲油部分和亲水部分的相对性质。高的数(理论值最高为20)表示乳化剂主要表现出亲水性或极性，而低数值表示亲油性或非极性特征。根据HLB体系，所有脂肪和油脂均具有要求的HLB。通过匹配HLB要求与乳化剂的HLB值，可以得到具有最佳性能的乳液。对于水包油乳液，油相的极性越大，则乳化剂的极性必须越大。例如，为了使大豆油(其具有要求的HLB为7)乳化，根据HLB体系，必须使用乳化剂或乳化剂的共混物，其HLB为7±1。乳化剂的HLB可以通过反复试验来计算或确定。

因此，本发明的组合物的亲油相可能需要具有特定HLB值的乳化剂，以确保稳定的产品。本发明的组合物的亲油相可以包含油或蜡。用于在本发明的组合物的亲油相中使用的油和蜡(以其国际化妆品成分命名法(INCI)命名)(及其各自要求的HLB)的实例包括以下：

在一些实施方式中，本发明的组合物的亲油相包含蜂蜡。

在一些实施方式中，亲油相是油。在一些实施方式中，油选自橄榄油、玉米油、菜油(vegetable oil)、葵花油或石蜡油。在一种优选的实施方式中，油可以是橄榄油。在另一种优选的实施方式中，油可以是石蜡油。

用于本发明的组合物中的油包水乳化剂可以具有3-6的HLB值。用于本发明的组合物中的水包油乳化剂可具有范围为8-18的HLB值。用于在本发明中使用的组合物的乳化剂(以其INCI命名)(以及其HLB值)的实例包括以下：

在一些实施方式所中，本发明的乳化剂包括卵磷脂。

乳化剂包括离子或非离子表面活性剂和亲油性脂肪族两亲物(例如脂肪醇或脂肪酸)。非离子表面活性剂可以是优选的，因为它们对皮肤的刺激性小于阴离子或阳离子表面活性剂。

合适的乳化剂的其他实例包括：表面活性剂：十二烷基硫酸钠、溴化十六烷基三甲基铵、西土马哥1000(Cetomacrogol 1000)、PEG 1000单硬脂酸酯、硬脂酸三乙醇胺、硬脂酸钠；脂肪族两亲物：鲸蜡硬脂醇、鲸蜡醇、硬脂醇、单硬脂酸甘油酯、硬脂酸、磷脂酰胆碱。

市售的乳化蜡的实例包括：乳化蜡BP(鲸蜡硬脂醇、十二烷基硫酸钠)、乳化蜡USNF(鲸蜡醇、聚山梨酸酯)、阳离子乳化蜡BPC(鲸蜡硬脂醇、溴化十六烷基三甲基铵)、单硬脂酸甘油酯S.E.(单硬脂酸甘油酯，硬脂酸钠)、西土马哥乳化蜡BPC(鲸蜡硬脂醇、西土马哥1000)、Polawax(十六醇，非离子表面活性剂)、卵磷脂(磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酸)。

用于在本发明的组合物中使用的表面活性剂可以包含TWEEN(例如TWEEN 80)、SPAN(例如SPAN 80)、泊洛沙姆(Poloxamer)(例如泊洛沙姆407)和聚甘油聚蓖麻油酸酯(聚甘油蓖麻醇酯，Polyglycerol polyricinoleate)(PGPR)中的一种或多种。优选的表面活性剂可以是泊洛沙姆，如泊洛沙姆407。另一种优选的表面活性剂可以是PGPR。

表面活性剂可以包括表面活性剂聚合物或共聚物。例如，合适的表面活性剂可以是由中央疏水性嵌段以及两侧的两个亲水性嵌段组成的三嵌段共聚物。

根据本发明，提供了用于产生抗微生物活性的组合物，其包含：油；乳化剂；能够转化底物以释放过氧化氢的酶；和包含酶的底物的物质。

本发明的组合物可以包含非水溶剂。非水溶剂可以是极性溶剂，如介电常数大于15的溶剂。非水溶剂可以是有机溶剂。例如，溶剂可以是或者可以包含甘油、二甲基亚砜、丙二醇或聚乙二醇。对于第一相(例如亲油相)，非水溶剂可以是不混溶的。

在一种优选的实施方式中，非水溶剂可以是甘油或者包含甘油。

在一些实施方式中，本发明的组合物可以包含胶束，优选反胶束。在每个胶束内可以是酶和所述物质(所述物质可以包括未精制的天然物质，如蜂蜜)，并且胶束的外部可以是第一相，例如亲油相(如油)。在每个反胶束内，还可以有水和/或非水溶剂。在每个胶束内，酶可能没有足够的水来转化底物。

本发明的组合物可以包含可有助于减少聚结的其他组分。聚结描述了两个或更多个液滴或胶束结合形成单个液滴或胶束的情况。为了减少或防止聚结，可以加强界面膜(即亲油相和含水相之间的界面)的强度。这可以通过，例如增加表面活性剂(包括两亲性聚合物)的浓度和/或通过添加醇(例如具有5-7个碳原子的脂族醇)来实现。

本发明的组合物可适合于局部施用，特别是局部施用于人类受试者。用于局部施用的组合物可以应用于身体表面，如皮肤或粘膜。用于局部施用的本发明的组合物可以是，例如乳膏、洗剂或唇膏的形式。

术语“乳膏”在本文中用于指局部使用的水包油或油包水的半固体乳液。水包油(o/w)乳膏由分散在连续含水相中的小油滴组成，而油包水(w/o)乳膏由分散在连续油相中的小水滴组成。水包油乳膏油脂较少，且更容易用水洗掉。油包水乳膏更加滋润，因为它们提供了一个油性屏障，其减少了皮肤最外层的水分流失。

术语“乳膏”还可以指其中第一相的液滴分散在连续的第二相中，或者其中第二相的液滴分散在连续的第一相中的半固体乳液。例如，第一相可能比第二相的极性小。第一相可以是非极性相，例如亲油相或疏含水相，例如油。第二相可以是极性相，如含水相。第二相可以包含非水溶剂。第二相可以包含水和/或非水溶剂。可以想到的是，在一些实施方式中，第二相可以不包含水或可以基本不包含水。在这种情况下，第二相可描述为非水性的。非水溶剂对于第一相(例如亲油相)可以是不混溶的。

术语“洗剂”在本文中用于指局部施用的液体悬浮液或乳液。洗剂可以包含通过悬浮试剂和/或表面活性剂保持在悬浮液中的细粉末、不溶性固体，或通过一种或多种表面活性剂稳定的乳液(特别是水包油乳液)。洗剂具有的粘度比乳膏低。

术语“唇膏”在本文中用于指局部施用于嘴唇以润湿和缓解干裂或干燥的嘴唇的蜡状物质。唇膏可以包括，例如蜂蜡或巴西棕榈蜡、樟脑、鲸蜡醇、羊毛脂、石蜡和凡士林以及其他成分。

有利地，本发明的组合物可以是可喷雾的。例如，这可以有助于克服以常规形式施用Surgihoney的一些困难。例如，在某些情况下，Surgihoney(其可能是黏稠的)可能难以应用于感染部位。因此，可以使用喷雾装置将本发明的组合物输送给患者。该装置可以是喷雾或雾化装置，例如泵式喷雾器或气溶胶喷雾器。因此本发明可以提供包含本发明的组合物的喷雾装置。

本发明的组合物可以适合内部给予至受试者。例如，该组合物可以适合给予至受试者的呼吸道中。常规形式的Surgihoney可能不容易给予至受试者的呼吸道。

本发明的组合物可以使用雾化器或吸入器给予至呼吸道。因此，本发明可以提供包含本发明的组合物的吸入器的雾化器。

雾化器是将液体转化成适合于吸入的气雾剂液滴的装置。喷雾器使用氧气、压缩空气或超声波来分散药物溶液，并将治疗剂量的气溶胶颗粒直接输送到肺部。可以使用各种雾化器。雾化器可以由压缩气体(喷射雾化器)或超声振荡晶体(超声雾化器)驱动。

为了在5-10分钟内由溶液制备足够小的颗粒，通常需要至少6L/分钟的气体流速。超声雾化器使用快速振荡的压电晶体来产生气溶胶颗粒。超声雾化器通常更小且更安静。

许多雾化器仅将处方药剂量的10％输送到肺部。大部分的药物卡在内部设备上，或者在呼气时被浪费掉。药物输送的效率取决于雾化室的类型和体积以及驱动的流速。一些腔室具有储液器和阀系统，以增加吸气期间的颗粒输送的效率并且减少呼气期间的环境损失。呼吸辅助开放式通气系统改善了药物输送，但依赖于患者呼气量充足。面罩或吹嘴可以用于给予气溶胶颗粒。

雾化器用于治疗多种呼吸系统疾病。使用雾化器的适应症包括慢性阻塞性肺疾病(COPD)的恶化管理和长期治疗、囊肿性纤维化的管理、支气管扩张、哮喘、HIV/AIDS以及姑息治疗中的症状缓解。

本发明的雾化组合物可以用于预防或治疗患有呼吸系统疾病，例如COPD、囊肿性纤维化、支气管扩张或哮喘或与HIV/AIDS相关的呼吸道感染或与晚期疾病(terminaldisease)有关的呼吸道感染的受试者中的微生物感染，例如包含生物膜或能够形成生物膜的微生物的微生物感染。

本发明的组合物可以用于预防或治疗包括生物膜或能够形成生物膜的微生物的微生物感染。生物膜可以包括形成生物膜的细菌、真菌或病毒。能够形成生物膜的微生物可以是细菌、真菌或病毒。

在一些实施方式中，用于预防或治疗微生物感染的组合物可以不包括本发明的雾化组合物。

对于可能存在于所述物质中的能够转化底物以释放过氧化氢的任何酶活性(即本文中称为“底物转化活性”)，本发明的组合物的酶可以是另外的(即，由于人为干预而添加的)，即组合物可以包含所述物质和添加的酶。在一些实施方式中，所述物质中可以不具有底物转化活性。

本发明的组合物可以是储存稳定的组合物，所述组合物不包含足够的游离水以允许酶转化底物。

例如，在一些实施方式中，酶和包含酶的底物的物质可以被包封或包含在胶束(例如反胶束)内，并且在胶束内可能没有足够的游离水以允许酶转化底物。非水溶剂可以存在于胶束中。

可替代地，本发明的组合物可以通过将能够转化底物以释放过氧化氢的酶和包含酶的底物的物质与组合物中的水分离(或分隔)而储存稳定。例如，组合物可以是复乳液。含有酶和所述物质(但没有足够的游离水以允许酶转化底物)的液滴可以分散在油珠内，而油珠可以分散在含水相(例如水)内。

在存在足够的水的情况下，储存稳定的组合物的酶能够使底物转化并释放过氧化氢。已知过氧化氢对多种不同的微生物有效。因此，在将本发明的储存稳定的组合物稀释之后产生了抗微生物活性。

如果使用储存稳定的组合物，则可以通过存在于给予部位的液体稀释，使得在给予部位释放过氧化氢。

不包含水或任何游离水的本发明的组合物可以提供特别稳定的本发明的组合物，因为酶将不能转化底物以释放过氧化氢，直到组合物与足够量的水接触。

过氧化氢酶是催化过氧化氢分解成水和氧气的酶。使用缺乏过氧化氢酶活性的物质意味着来自不同来源的类似物质或来自同一来源的不同收获物的类似物质之间的该活性量没有变化。这降低了可以由这些物质产生的抗微生物活性的可变性。可替代地，如果所述物质确实包含过氧化氢酶活性，并且在使所述物质与酶接触之前使所述物质中的过氧化氢酶活性失活是不可能或不期望的，则可以使用足够的酶，以使得过氧化氢酶活性对于可以由所述物质产生的过氧化氢的影响降低。这也降低了可以由所述物质产生的抗微生物活性的可变性。在一些实施方式中，所述物质可能缺乏过氧化氢酶活性。

过氧化氢酶存在于多种植物和动物中。过氧化氢酶活性可以在处理或提取所述物质期间被除去，或者在所述物质在组合物中使用之前使过氧化氢酶活性失活。过氧化氢酶活性可以通过，例如巴氏灭菌法热失活。过氧化氢酶活性热失活的合适温度为至少60℃、70℃或80℃，优选至少2分钟。

术语“储存稳定”在本文中用于表示组合物可以在环境温度下储存至少数天，合适地至少一周或至少一个或两个月，同时保持在组合物稀释后产生抗微生物活性的能力。储存温度可以低于37℃，优选20-25℃。优选将组合物在避免暴露于光下进行储存。

过氧化氢在环境温度下通常是不稳定的。在本发明的储存稳定的组合物中，缺乏足够的游离水防止了酶转化底物以释放过氧化氢，并且因此有助于维持组合物在环境温度下长时间的稳定性。本发明的储存稳定的组合物可以包含一些水，条件是没有足够的游离水使得酶转化底物。合适的水量将根据组合物的精确组分而变化。然而，典型地，本发明的储存稳定的组合物包含小于20％的总的水含量，例如10％-19％的水。

根据组合物中存在的底物的量以及酶的活性，在组合物稀释后，过氧化氢可以持续释放一段时间。应理解的是，可以选择组合物中的底物的量和/或酶的活性，以便在组合物稀释后提供在相对较短时间内的相对较高水平的过氧化氢释放，或者在较长时间内较低水平的过氧化氢释放。合适地，在组合物稀释后，组合物提供过氧化氢至少二十四小时、更优选至少四十八小时的时间的持续释放。合适地，在组合物稀释后，组合物提供过氧化氢以低于2mmol/L的水平至少二十四小时的时间的持续释放。

本发明的组合物可以包含足够的酶和底物以提供过氧化氢以至少0.1、0.5、1或1.5mmol/L持续释放至少24小时、更优选48小时的时间。

应理解的是，在本发明的储存稳定的组合物中应存在足够的酶，以在组合物稀释后根据需要转化底物并形成过氧化氢。

鉴于本发明的储存稳定的组合物在足够的水存在下产生过氧化氢的重要性，应该理解的是组合物不应含有任何添加的过氧化物酶。

在一些实施方式中，酶是纯化的酶。术语“纯化的酶”在本文中用于包括酶制剂，在该酶制剂中，酶已经与制备酶时最初存在的至少一些杂质分离。优选地，已经除去或减少的杂质包括那些会干扰酶转化底物以释放过氧化氢的能力的杂质。

如果酶能够转化底物以释放过氧化氢，则可能并不总是必须或期望纯化的酶处于高纯度水平。在一些情况下，可能期望使用相对粗制的酶制剂。合适的纯度水平的实例包括至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的纯度。

然而，优选的是，当制备酶时，最初可能存在的任何过氧化氢酶的量已经减少。酶可以通过重组或非重组的方式制备，并且可以是重组酶或非重组酶。酶可以由微生物来源、优选由非基因修饰的微生物纯化。

酶的纯度水平可以根据组合物的预期的用途进行适当的选择。例如，如果组合物旨在用于医疗用途，则应使用医疗级或医疗设备级的纯度。

因此，根据本发明，提供了用于产生抗微生物活性的储存稳定的组合物，其包含：亲油相；含水相；能够转化底物以释放过氧化氢的纯化的酶；和包含酶的底物的物质；其中所述组合物不包含足够的游离水以使得酶转化底物。

根据本发明，提供了用于产生抗微生物活性的储存稳定的组合物，所述组合物包含：第一相；第二相；能够转化底物以释放过氧化氢的酶；和包含酶的底物的物质，其中所述第一相和所述第二相是不混溶，并且其中所述组合物不包含足够的游离水以使得酶转化底物。

根据本发明，提供了一种用于产生抗微生物活性的储存稳定的组合物，其包含：油；乳化剂；能够转化底物以释放过氧化氢的酶；和包含酶的底物的物质，其中所述组合物不包含足够的游离水以使得酶转化底物。

在一些实施方式中，所述酶是氧化还原酶。可以转化底物以释放过氧化氢的氧化还原酶的实例包括葡萄糖氧化酶、己糖氧化酶、胆固醇氧化酶、半乳糖氧化酶、吡喃糖氧化酶、胆碱氧化酶、丙酮酸氧化酶、乙醇酸氧化酶和氨基酸氧化酶。这些氧化还原酶的相应底物分别是D-葡萄糖、己糖、胆固醇、D-半乳糖、吡喃糖、胆碱、丙酮酸、乙醇酸和氨基酸。

一种或多种氧化还原酶和一种或多种氧化还原酶的底物的混合物可以存在于本发明的组合物中。

氧化还原酶可以是葡萄糖氧化酶，而底物可以是D-葡萄糖。

所述物质可以是包含用于酶的底物的任何物质。在一些实施方式中，所述物质缺乏过氧化氢酶活性。

因此，根据本发明，还提供了用于产生抗微生物活性的储存稳定的组合物，其包含：亲油相；含水相；能够转化底物以释放过氧化氢的酶；和缺乏过氧化氢酶活性并包含用于酶的底物的物质；其中所述组合物不包含足够的游离水以使得酶转化底物。

根据本发明，还提供了用于产生抗微生物活性的储存稳定的组合物，其包含：第一相；第二相；能够转化底物以释放过氧化氢的酶；和缺乏过氧化氢酶活性并包含用于酶的底物的物质，其中所述第一相和所述第二相不混溶，并且其中所述组合物不包含足够的游离水以使得酶转化底物。

根据本发明，还提供了用于产生抗微生物活性的储存稳定的组合物，其包含：油；能够转化底物以释放过氧化氢的酶；和缺乏过氧化氢酶活性并包含用于酶的底物的物质，并且其中所述组合物不包含足够的游离水以使得酶转化底物。

所述物质可以是一种未精制的物质。术语“未精制的”在本文中用于指未被加工成纯化形式的物质。未精制的物质包括可能已经浓缩的物质，例如通过干燥或沸腾浓缩。

所述物质可以包括来自天然来源的一种或多种底物(本文中称为“天然物质”)。天然物质的实例包括来自植物来源的物质，包括来自树液、根、花蜜、花、种子、果实、叶子或枝条的物质。所述物质可以是未精制的天然物质。

合适地，所述物质包含一种或多种以下底物：D-葡萄糖、己糖、胆固醇、D-半乳糖、吡喃糖、胆碱、丙酮酸、乙醇酸或氨基酸。

所述物质可以是糖物质。术语“糖物质”在本文中用于表示包括一种或多种糖的任何物质。术语“糖”在本文中用于指具有通式C_m(H₂O)_n的碳水化合物。优选的糖包括单糖，如D-葡萄糖、己糖或D-半乳糖。糖物质可以包括来自天然来源的一种或多种糖(本文中称为“天然糖物质”)。天然糖物质可以是未精制的天然糖物质。所述未精制的天然糖物质可以是(或来源于)天然糖产品。在一些实施方式中，所述未精制的天然糖产品是蜂蜜。在一些实施方式中，所述蜂蜜是经过处理以使过氧化氢酶活性被除去或失活的蜂蜜。

如上所述，所述物质本身可以优选缺乏能够转化底物以释放过氧化氢的酶活性(称为“底物转化活性”)。没有来自所述物质的底物转化活性的优点是，来自不同来源的类似物质或来自同一来源的不同收获物之间的活性量没有变化。这进一步降低了抗微生物活性(其可以由这些物质产生)的可变性。然后仅通过与所述物质接触的酶来提供底物转化活性，因此可以控制组合物中存在的底物转化活性的量。

底物转化活性可以在所述物质加工或提取物质期间除去，或者在本发明得组合物中使用所述物质之前，使其失活。底物转化活性可以通过热失活而失活，例如通过巴氏灭菌。底物转化活性的热失活的合适温度为至少80℃，优选至少2分钟。热失活的优点是过氧化氢酶活性和底物转化活性都可以在单个热失活步骤中失活。

在本发明的一些实施方式中，所述物质是加工的、提取的或精制的物质(即其中杂质或不想要的元素已通过加工除去的物质)。优选地，已经除去或减少的杂质包括那些会干扰酶转化底物以释放过氧化氢的能力的杂质。

在本发明的一些实施方式中，所述物质包含酶的纯化底物。术语“纯化底物”在本文中用于包括底物制剂，其中当底物获得或产生时，底物已经与最初存在的至少一些杂质分离。纯化底物可以从天然来源获得或者可以合成制备。纯化底物可以是加工的、提取的或精制的底物(即其中杂质或不期望的元素已通过加工除去的底物)。

如果酶能够转化底物以释放过氧化氢，则并不总是必须或期望纯化底物处于高纯度水平。在一些情况下，可能期望使用相粗制的底物制剂。合适的纯度水平的实例包括至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的纯度。然而，在一些实施方式中，可能期望纯化底物是医疗级、医疗设备级或药物级的底物。

在特定的实施方式中，纯化底物是或包含纯化糖物质。所述纯化糖物质可以从天然来源获得(例如加工的、提取的或精制的天然糖物质)，或者可以合成制备。纯化糖物质可以是至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的纯度。纯化糖物质可以是医疗级、医疗设备级或药物级的糖物质。所述纯化糖物质可以包括一种或多种纯化糖物质，例如纯化的D-葡萄糖、己糖或D-半乳糖。例如，纯化糖物质可以是医疗级、医疗设备级或药物级的D-葡萄糖、己糖或D-半乳糖。

根据本发明，还提供了用于产生抗微生物活性的组合物，其中所述组合物包含：亲油相；含水相；能够转化底物以释放过氧化氢的酶；和包含酶的纯化底物的物质。

根据本发明，还提供了用于产生抗微生物活性的组合物，其包含：第一相；第二相；能够转化底物以释放过氧化氢的酶；和包含酶的纯化底物的物质，其中所述第一相和所述第二相不混溶。

根据本发明，还提供了用于产生抗微生物活性的组合物，其中所述组合物包含：油；能够转化底物以释放过氧化氢的酶；和包含酶的纯化底物的物质。

所述组合物可以是用于产生抗微生物活性的储存稳定的组合物，其包含：亲油相；含水相；能够转化底物以释放过氧化氢的酶；和包含酶的纯化底物的物质；其中所述组合物不包含足够的游离水以使得酶转化底物。

所述组合物可以是用于产生抗微生物活性的储存稳定的组合物，其包含：第一相；第二相；能够转化底物以释放过氧化氢的酶；和包含酶的纯化底物的物质，其中所述第一相和所述第二相不混溶，并且其中所述组合物不包含足够的游离水以使得酶转化底物。

所述组合物可以是用于产生抗微生物活性的储存稳定的组合物，其包含：油；能够转化底物以释放过氧化氢的酶；和包含酶的纯化底物的物质，并且其中所述组合物不包含足够的游离水以使得酶转化底物。

所述组合物可以是用于产生抗微生物活性的储存稳定的组合物，其包含：亲油相；含水相；能够转化底物以释放过氧化氢的酶；和缺乏过氧化氢酶活性并包含用于酶的纯化底物的物质；其中所述组合物不包含足够的游离水以使得酶转化底物。

所述组合物可以是用于产生抗微生物活性的储存稳定的组合物，其包含：第一相；第二相；能够转化底物以释放过氧化氢的酶；和缺乏过氧化氢酶活性并包含用于酶的底物的物质，其中所述第一相和所述第二相不混溶，并且其中，所述组合物不包含足够的游离水以使得酶转化底物。

所述组合物可以是用于产生抗微生物活性的储存稳定的组合物，其包含：油；能够转化底物以释放过氧化氢的酶；和缺乏过氧化氢酶活性并包含用于酶的纯化底物的物质；其中所述组合物不包含足够的游离水以使得酶转化底物。

在特定的实施方式中，所述酶和所述底物是纯化的，例如纯化的葡萄糖氧化酶和纯化的D-葡萄糖，合适的医疗级、医疗设备级或药物级的葡萄糖氧化酶和D-葡萄糖。

本发明的组合物中的亲油相与含水相的比例或第一相与第二相的比例可以为9:1至1:9、8:1至1:8、7:1至1:7、6:1至1:6、5:1至1:5、4:1至1:4、3:1至1:3或2:1至1:2(v/v)，例如4:1至1:4。

本发明的组合物可以包含5-95％、10-95％、15-95％、20-95％、25-95％、30-95％、35-95％、40-95％、45-95％、50-95％、55-95％、60-95％、65-95％、70-95％、75-95％、80-95％、85-95％或90-95％(v/v)的亲油相或第一相(包括存在的任何乳化剂)。

可替代地，本发明的组合物可以包含5-95％、5-90％、5-85％、5-80％、5-75％、5-70％、5-65％、5-60％、5-55％、5-50％、5-45％、5-40％、5-35％、5-30％、5-25％、5-20％、5-15％或5-10％(v/v)的亲油相或第一相(包括存在的任何乳化剂)。

本发明的组合物可以包含5-95％、10-95％、15-95％、20-95％、25-95％、30-95％、35-95％、40-95％、45-95％、50-95％、55-95％、60-95％、65-95％、70-95％、75-95％、80-95％、85-95％或90-95％(v/v)的含水相或第二相。

可替代地，本发明的组合物可以包含5-95％、5-90％、5-85％、5-80％、5-75％、5-70％、5-65％、5-60％、5-55％、5-50％、5-45％、5-40％、5-35％、5-30％、5-25％、5-20％、5-15％或5-10％(v/v)的含水相或第二相。

本发明的组合物可以包含1-60％、1-50％、1-40％、1-30％、1-20％或1-10％(w/v)的所述物质，例如蜂蜜。

本发明的组合物可以包含1-60％、5-60％、10-60％、15-60％、20-60％、25-60％、30-60％、35-60％、40-60％、45-60％或50-60％(w/v)的所述物质，例如蜂蜜。

本发明的组合物可以包含每克组合物1-1500单位、15-1500单位、30-1500单位、50-1500单位、100-1500单位、1-<685单位、15-<685单位、30-<685单位，50-<685单位、100-<685单位、500-1000单位、685-1000单位或100-500单位的酶，优选葡萄糖氧化酶。

本发明的组合物可包含不超过85％的水，例如不超过80％、70％、60％、50％、40％、30％或20％的水或小于20％的水，例如10-19％的水。本发明的组合物可以包含小于20％(w/w)。本发明的组合物可以包含小于15％(w/w)的水。本发明的组合物可以包含小于12％(w/w)的水。

本发明的组合物可以包含10-60％(w/w)的非水溶剂。在一些实施方式中，本发明的组合物可以包含20-50％(w/w)的非水溶剂。在一些实施方式中，本发明的组合物可以包含35-40％(w/w)的非水溶剂。

本发明的组合物可以包含10-40％(w/w)的第一相，例如亲油相(如油)。所述组合物可以包含20-30％(w/w)的第一相，例如亲油相(如油)。

本发明的组合物可以包含1-10％(w/w)的乳化剂。所述组合物可以包含1-5％(w/w)的乳化剂。乳化剂优选是表面活性剂。

本发明的组合物可以包含10-50％(w/w)的包含用于酶的底物的物质。所述组合物可以包含20-40％(w/w)的所述物质。在一些实施方式中，所述组合物可以包含25至35％(w/w)的所述物质。

本发明的组合物可以包含20-50％(w/w)的非水溶剂，20-30％(w/w)的第一相，例如亲油相(如油)，1-5％(w/w)的乳化剂和20-40％(w/w)的包含用于酶的底物的物质。

本发明的组合物可以包含10-60％(w/w)的非水溶剂，10-40％(w/w)的第一相，例如亲油相(如油)，1-10％(w/w)的乳化剂和10-50％(w/w)的包含用于酶的底物的物质。

本发明的组合物可以包含35-45％(w/w)的非水溶剂，20-30％(w/w)的第一相，例如亲油相(如油)，1-5％(w/w)的乳化剂和25-35％(w/w)的包含用于酶的底物的物质。

本发明的组合物可以包含30-60％(v/v)的溶剂，如非水极性溶剂。

本发明的组合物可以包含30-60％(v/v)的第一相，如亲油相(例如油)。

本发明的组合物可以包含1-10％(v/v)的乳化剂，例如表面活性剂。

本发明的组合物可以包含30-70％或40-60％(w/w)的包含用于酶的底物的物质，例如蜂蜜。

本发明的组合物中的第一相与第二相的比例可以≤1:1(v/v)，例如0.1-1:1(v/v)。在一些实施方式中，第一相与第二相的比例<0.6:1(v/v)，例如0.1-<0.6:1(v/v)。在一些实施方式中，第一相与第二相的比例≤0.4:1(v/v)，例如0.1-0.4:1(v/v)。

本发明的组合物中的第一相可以以小于组合物的60％(v/v)而存在。在一些实施方式中，第一相以组合物的10％至小于60％(v/v)而存在。在一些实施方式中，第一相以组合物的10％至小于50％(v/v)而存在。在一些实施方式中，第一相以组合物的10％至小于40％(v/v)而存在。在一些实施方式中，第一相以组合物的10％至小于30％(v/v)而存在。在一些实施方式中，第一相以组合物的10％至小于25％(v/v)而存在。

本发明的组合物可以包含乳化剂。在一些实施方式中，乳化剂以组合物的至多25％(v/v)而存在，例如组合物的1-25％(v/v)，组合物的5-25％(v/v)或组合物的10-25％(v/v)。

本发明的组合物中的包含用于酶的底物的物质的量与第二相的体积的比例可以为0.5:1至2:1，例如1:1。

本发明的组合物中的包含用于酶的底物的物质的量可以至多为组合物的70％(w/v)，例如5-70％(w/v)，10-70％(w/v)，20-70％(w/v)或30-70％(w/v)或至多为组合物的60％(w/v)，例如5-60％，10-60％(w/v)，20-60％(w/v)或30-60％(w/v)。

本发明的组合物可以是乳液。在特定的实施方式中，本发明的组合物为包含反胶束的乳液。反胶束可以由第二相形成。

在本发明的组合物的一些实施方式中，酶和包含酶的底物的物质溶解在第二相中。

在本发明的特定实施方式中，第一相是石蜡油或者包含石蜡油。

在本发明的特定实施方式中，第二相是甘油或者包含甘油。

在本发明的特定实施方式中，乳化剂是聚甘油聚蓖麻油酸酯(PGPR)或者包含聚甘油聚蓖麻油酸酯。

在本发明的特定的实施方式中，能够转化底物以释放过氧化氢的酶是纯化的葡萄糖氧化酶或包含纯化的葡萄糖氧化酶，并且包含用于酶的底物的物质是蜂蜜或者包含蜂蜜。

在本发明的其他特定的实施方式中，能够转化底物以释放过氧化氢的酶是纯化的葡萄糖氧化酶或者包含纯化的葡萄糖氧化酶，并且包含用于酶的底物的物质是纯化的葡萄糖或者包含纯化的葡萄糖。

在一些实施方式中，本发明的组合物是乳膏。典型地，用作乳膏的乳液的粘度将高于用作喷雾的乳液的粘度。可以通过在组合物中包含增粘剂，如增稠剂或胶凝剂(例如水解胶体)来形成乳膏。

水胶体(亲水胶体，hydrocolloid)是一种异质类的亲水的长链聚合物(多糖或蛋白质)，表征为当其分散于水中时形成粘性分散体和/或凝胶(Saha和Bhattacharya,J FoodSci Technol,2010,47(6):587-597)的能力。增稠的程度随着水解胶体的类型和性质而变化。一些在相当高的浓度下提供低粘度，但是大多数在低于1％的浓度下提供高粘度。水胶体分散体的粘度主要来自构象无序的聚合物链的非特定的缠结。可以用作增稠剂的水胶体(本文中称为水胶体增稠剂)包括淀粉、改性淀粉、黄原胶、半乳甘露聚糖(例如，瓜尔豆胶、刺槐豆胶和他拉胶(Tara gum))、阿拉伯胶(gum Arabic)或阿拉伯树胶(acacia gum)、刺梧桐树胶、黄蓍胶、魔芋胶(konjac maanan)和纤维素衍生物，如羧甲基纤维素、甲基纤维素和羟丙基甲基纤维素。

一些水胶体能够形成凝胶，其由交联以形成相互连接的分子网络(其浸入液体介质中)的聚合物分子组成。凝胶的流变学定义是其中“储能模量”(G′)大于“损耗模量”(G″)的粘弹性体系(de Vries 2004,Gums and stabilizers for the food industry,12卷RSCPubl,Oxford,第22–30页)。水胶体通过其聚合物链经由氢键、疏水缔合和阳离子介导的交联的物理缔合而形成凝胶。胶凝型水胶体(或水胶体胶凝剂)包括海藻酸盐(褐藻胶，alginate)、果胶、角叉菜胶、明胶、结冷胶、琼脂、改性淀粉、甲基纤维素和羟丙基甲基纤维素。

水胶体的凝胶化可以通过不同的机理发生：离子凝胶化、冷凝凝胶化(冷凝结凝胶，cold-set gelation)和热凝凝胶化(热凝结凝胶，heat-set gelation)(Burey等2008,Crit Rev Food Sci Nutr 48:361–377)。离子凝胶化通过水胶体链与离子的交联发生，典型地是带负电荷的多糖的阳离子介导的凝胶化过程。可以通过离子凝胶化形成凝胶的水胶体的实例包括海藻酸盐、角叉菜胶和果胶。离子凝胶化可以通过扩散凝结(diffusionsetting)或内部凝胶化进行。在冷凝凝胶化中，将水胶体粉末溶于温/沸水中以形成分散体，该分散体在冷却时形成凝胶。琼脂和明胶通过这种机理形成凝胶。热凝凝胶化需要加热凝胶(例如，凝胶多糖、魔芋葡甘露聚糖、甲基纤维素、淀粉和球状蛋白质)。

因此，在一些实施方式中，本发明的组合物包含增粘剂，如增稠剂或胶凝剂，例如水胶体。在特定的实施方式中，水胶体是多糖或蛋白质或者包含多糖或蛋白质。水胶体可以是水胶体增稠剂，如淀粉、改性淀粉、黄原胶，半乳甘露聚糖(如瓜尔豆胶、刺槐豆胶和他拉胶)、阿拉伯胶或阿拉伯树胶、刺梧桐树胶、黄蓍胶、魔芋胶或纤维素衍生物，如羧甲基纤维素、甲基纤维素或羟丙基甲基纤维素。

在其他实施方式中，水胶体是交联的水胶体或者包含交联的水胶体，例如交联的多糖，如交联的海藻酸盐、果胶、角叉菜胶、明胶、结冷胶、琼脂、琼脂糖、改性淀粉或纤维素衍生物，如甲基纤维素或羟丙基甲基纤维素。

可以通过任何合适的方法使水胶体交联，例如包括上述用于水胶体的凝胶化的方法：离子凝胶化、冷凝凝胶化和热凝凝胶化。在特定的实施方式中，由于水胶体胶凝剂的离子凝胶化作用，水胶体的分子通过阳离子(例如，钙离子)交联。可能在本发明的组合物中存在的通过阳离子交联的水胶体的实例包括海藻酸盐、角叉菜胶或果胶。

在特定的实施方式中，本发明的组合物包含交联的海藻酸盐，例如通过钙离子交联的海藻酸盐。由于海藻酸钠可以溶于冷水，所以海藻酸盐可以不经预先加热而形成凝胶。

交联的海藻酸盐可以由海藻酸钠和钙离子(例如由氯化钙提供)形成。在一些实施方式中，可以使用水作为溶剂来解离钙离子。然而，由于这可能会激活产生过氧化氢(通过酶和包含酶的底物的物质)，并且限制了组合物的稳定性，所以优选使用非水溶剂来解离钙离子，如乙醇或乙酸。

我们已经认识到甘油可以用来结合游离水。该性质使得水用于溶解海藻酸盐，条件是存在足够的甘油来防止由酶和包含酶的底物的物质过早地释放过氧化氢。

根据本发明，还提供了制备本发明的组合物的方法，其包括将亲油性组分、含水组分、能够转化底物以释放过氧化氢的酶和包含酶的底物的物质混合，以形成组合物。

根据本发明，还提供了制备本发明的组合物的方法，其包括将第一组分(或第一相的液体)、第二组分(或第二相的液体)、能够转化底物以释放过氧化氢的酶；和包含酶的底物的物质混合，以形成组合物，其中所述第一组分(或第一相的液体)和第二组分(或第二相的液体)不混溶。

根据本发明，还提供了制备本发明的组合物的方法，其包括将油、能够转化底物以释放过氧化氢的酶和包含酶的底物的物质混合，以形成组合物。

本发明的方法还可以包括混合非水溶剂，如极性有机溶剂。

本发明的方法可以使用流变仪来形成本发明的组合物。流变仪可以允许控制剪切速率和温度。

可以将酶和包含酶的底物的物质溶解在非水溶剂中以形成第一混合物。可以将乳化剂添加到第一相、亲油相或油中以形成第二混合物。然后可以将第一混合物逐滴加入到第二混合物中以形成乳液，同时使用例如流变仪或混合器进行混合。

为了形成乳液，可以在1500 1/s至2500 1/s，如2000 1/s的剪切速率下进行混合。混合可以在30至50℃下进行，例如约37℃。

根据本发明，还提供了制备本发明的组合物的方法，其包括将酶、包含用于酶的底物的物质、第二相的液体、第一相的液体和任选的乳化剂在高剪切速率下混合足够的时间，以形成乳液。

如果将乳液的成分在与乳化剂接触之前预混合，则可以形成更稳定的乳液。因此，在一些实施方式中，先将酶、包含用于酶的底物的物质、第二相的液体和第一相的液体在高剪切速率下预混合，然后再使预混合的成分与乳化剂接触，并且将包含预混合的成分和乳化剂的混合物在高剪切速率下混合。

在一些实施方式中，先将酶和包含酶的底物的物质溶解在第二相的液体中以形成溶液，然后再使溶液与第一相的液体接触。

高剪切速率可以为1000 1/s至4000 1/s。我们已经发现，当使用更高的剪切速率来形成乳液时，例如>2000 1/s至4000 1/s，>2000 1/s至3500 1/s，>2500 1/s至4000 1/s，或>2500 1/s至3500 1/s，使用本发明的方法制备的乳液更稳定。

酶、包含用于酶的底物的物质、第二相的液体、第一相的液体和乳化剂(如果存在的话)的混合可以在20℃至40℃，例如35℃至40℃的温度下进行。当酶、包含用于酶的底物的物质、第二相的液体、第一相的液体和乳化剂(如果存在的话)的混合在较高温度，例如>37.5℃至40℃或38℃至40℃下进行时，可以形成更稳定的乳液。

在本发明的方法的一些实施方式中，将酶、包含用于酶的底物的物质、第二相的液体、第一相的液体和乳化剂(如果存在的话)在高剪切速率下混合至少5分钟，例如5至30分钟。

本发明的方法可以用于形成乳膏，例如通过包含增粘剂(如增稠剂或胶凝剂，例如水胶体)来形成乳膏。

在一些实施方式中，本发明的方法进一步包括将增粘剂与酶、包含用于酶的底物的物质、第二相的液体、第一相的液体和乳化剂(如果存在的话)在高剪切速率下混合，以形成乳膏。

在一些实施方式中，增粘剂是或包含水胶体，例如多糖。

在一些实施方式中，水胶体是或包含水胶体增稠剂，如淀粉、改性淀粉、黄原胶、半乳甘露聚糖(如瓜尔豆胶、刺槐豆胶和他拉胶)、阿拉伯胶或阿拉伯树胶、刺梧桐树胶、黄蓍胶、魔芋胶或纤维素衍生物，如羧甲基纤维素、甲基纤维素或羟丙基甲基纤维素。

在一些实施方式中，水胶体是或包含水胶体胶凝剂，如海藻酸盐、果胶、角叉菜胶、明胶、结冷胶、琼脂、琼脂糖、改性淀粉或纤维素衍生物，如甲基纤维素或羟丙基甲基纤维素。

水胶体胶凝剂可以具有在阳离子存在下通过离子凝胶化形成凝胶的能力。在这类实施方式中，本发明的方法进一步包括将阳离子与水胶体胶凝剂、酶、包含用于酶的底物的物质、第二相的液体、第一相的液体和乳化剂(如果存在的话)在高剪切速率下混合，以形成乳膏。

在一些实施方式中，将能够通过离子凝胶化形成凝胶的水胶体胶凝剂、酶、包含用于酶的底物的物质、第二相的液体、第一相的液体和乳化剂(如果存在的话)混合以形成混合物，然后使阳离子与混合物接触。

在一些实施方式中，将能够通过离子凝胶化形成凝胶的水胶体胶凝剂在与第一相的液体接触之前，与第二相的液体、酶和包含酶的底物的物质接触。

在一些实施方式中，阳离子是钙离子或者包含钙离子。

在特定的实施方式中，在阳离子存在下能够通过离子凝胶化形成凝胶的水胶体胶凝剂是或者包含海藻酸盐、角叉菜胶或果胶，例如海藻酸盐。

在特定的实施方式中，水胶体胶凝剂以含水溶液提供，并且第二相为甘油，其中甘油的存在量足以结合组合物中的游离水，并且从而防止酶催化从包含用于酶的底物的物质中释放过氧化氢。

在一些实施方式中，将水胶体胶凝剂(其能够通过离子胶凝化形成凝胶)(例如海藻酸盐)与包含用于酶的底物的物质、第二相的液体和第一相的液体在高剪切速率下预混合，然后使预混合的成分与乳化剂(如果存在的话)和阳离子(例如钙离子)接触，并且将包含预混合的成分、乳化剂(如果存在的话)和阳离子的混合物在高剪切速率下混合。

可以使乳化剂(如果存在的话)在阳离子(例如钙离子)之前与预混合的成分接触。阳离子(例如钙离子)可以逐滴添加。

阳离子(例如钙离子)可以以含水溶液提供。或者，阳离子可以使用非水溶剂，如乙醇或乙酸以非含水溶液提供。

在特定的实施方式中，在乙醇中提供氯化钙，并且在含水溶液中提供海藻酸钠，并且第二相是甘油，并且甘油的存在量足以结合海藻酸盐溶液中的游离水，从而防止酶从包含用于酶的底物的物质中催化释放过氧化氢。这防止了过早地释放过氧化氢，直到组合物与水接触，从而提供稳定的组合物。

如上，本发明的方法可以使用流变仪来形成本发明的组合物。流变仪可以允许控制剪切速率和温度。可替代地，可以通过使用超声波探头或均化器来提供高剪切速率。

根据本发明，还提供了包含本发明的组合物和药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂的药物组合物。

根据本发明，还提供了用作药物的本发明的组合物。

根据本发明，进一步提供了用于在预防或治疗微生物感染中使用的本发明的组合物。

预防或治疗优选通过局部给予组合物来进行。预防或治疗可以通过给予至受试者的呼吸道来进行。预防或治疗可以通过给予至体腔来进行。预防或治疗可以通过内部给予至受试者来进行。

根据本发明，还提供了预防或治疗微生物感染的方法，其包括将有效量的本发明的组合物给予至需要这种治疗的受试者。

本发明还提供了本发明的组合物在制备用于预防或治疗微生物感染的药物中的用途。

微生物感染可以是病毒感染，例如单纯疱疹病毒(HSV)感染。在其他实施方式中，微生物感染可以是真菌感染或细菌感染。

微生物感染可以是：鼻腔感染，如窦炎(sinusitis)或鼻窦炎(rhinosinusitis)；呼吸道感染，如上呼吸道感染(例如扁桃体炎、喉炎或鼻窦炎)或下呼吸道感染(例如支气管炎、肺炎、细支气管炎或肺结核)；与慢性阻塞性肺病(COPD)、囊肿性纤维化、支气管扩张症、哮喘相关的呼吸道感染或与HIV/AIDS相关的呼吸道感染或与晚期疾病有关的呼吸道感染。

本发明的组合物可以用于预防或治疗微生物感染，其包含生物膜或能够形成生物膜的微生物。生物膜可以包括形成生物膜的细菌、真菌或病毒。能够形成生物膜的微生物可以是细菌、真菌或病毒。

本发明的组合物可用于抗微生物擦巾、消毒，例如医院消毒，或用作抗微生物喷雾，例如用作局部预防性抗微生物喷雾，以在手术之前对患者身体部位进行消毒。

本发明的组合物可以包含抗微生物剂。例如，过氧化氢可能存在，如果组合物通过以下形成：在含水溶液中，使酶与所述物质在酶转化底物的条件下接触，并且随后干燥组合物，以将组合物的水含量降低至其中没有足够的游离水使酶转化底物的水平。然而，优选组合物不包含任何可检测的过氧化氢。这样的组合物可以，例如通过在没有足够的游离水来使酶转化底物的情况下使酶与底物接触而形成。可以存在于本发明的储存稳定的组合物中的其他抗微生物剂的实例包括：抗生素、抗病毒剂或抗真菌剂。

所述组合物可以是医疗级或医疗设备级的组合物，或药物级的组合物。

组合物的每种组分可以是天然物质(即，每种组分衍生或纯化自天然来源)。根据本发明使用的仅含有天然成分的组合物为基于药物的抗微生物制剂提供了有吸引力的替代方案。

有利地，所述物质是蜂蜜。蜂蜜可以是医疗级或医疗设备级的蜂蜜。在一些实施方式中，蜂蜜是经过处理以除去或失活蜂蜜中最初存在的过氧化氢酶活性的蜂蜜。根据本发明的一种实施方式，所述物质是巴氏灭菌的蜂蜜，并且酶是葡萄糖氧化酶。根据一些实施方式，所述物质是医疗级或医疗设备级的蜂蜜，并且酶是医疗级或医疗设备级的酶，合适的是葡萄糖氧化酶。

蜂蜜是蜜蜂用来自花的花蜜制成的天然产品。其是一种饱和或超饱和的糖溶液。蜂蜜在食品法典国际食品标准(Codex Alimentarius international food standard)中被定义为“由蜜蜂从植物花蜜，或者从植物的活体部分的分泌物或植物活体部分上的吮吸植物的昆虫(plant sucking insect)的排出物而产生的天然甜味物质，蜜蜂将其收集，通过与其自身特定的物质结合而转化，沉积，脱水，储存并置于蜂巢中熟化和成熟”(修订的蜂蜜法典标准(Revised Codex Standard for Honey)，2001年)。

花蜜通常包含约14％的单糖(w/w)，1％的酚化合物和85％的水。酚化合物赋予蜂蜜口感、香味和颜色。在蜂箱的温暖条件下(通常是36℃)，花蜜会很快发酵。为了防止这种情况，将花蜜与觅食蜜蜂的唾液和下咽腺的含有酶的分泌物混合在一起。在蜂箱里，花蜜从蜜蜂传递到蜜蜂，并且花蜜在储存于蜂箱的空穴中之前加入更多的分泌物。存在的酶的量随着蜜蜂的年龄、食物和生理阶段(当蜜蜂是觅食者时，其腺体产生更多的消化酶)、菌落的强度、蜂箱的温度以及花蜜流和其糖含量而变化。

由蜜蜂添加至花蜜的酶包括催化淀粉转化成糊精和糖的淀粉酶，催化蔗糖转化为果糖和葡萄糖的转化酶，以及催化葡萄糖转化为过氧化氢和葡萄糖酸的葡萄糖氧化酶。低剂量的过氧化氢防止了酵母菌(其使得花蜜快速发酵)的生长。随着蜜蜂逐步使花蜜干燥而形成蜂蜜，葡萄糖酸使蜂蜜呈酸性(在pH 3.5至4.5)。水被有效地束缚在蜂蜜中的糖分子中，而不能用于进一步的化学反应。蜂蜜中的“游离”水的量以水活度(a_w)来衡量。已报道的蜂蜜中所发现的a_w范围为0.47-0.70，其中平均值为0.562至0.589(RCIEGG,M；BLANC,B,1981,The water activity of honey and related sugar solutions.Lebensmittel-Wissenschaft und Technologie 14:1-6)。成熟的蜂蜜的a_w太低而不足以支持任何物种的生长，如果水含量低于17.1％，则不会发酵(Molan,P.C.(1992).The antibacterialactivity of honey:1.The nature of the antibacterial activity.Bee World,73(1),5-28)。蜂蜜的酸度和游离水的缺乏防止了进一步发酵的风险，并终止了葡萄糖氧化酶的工作。蜂蜜还含有可变量的来自花蜜的过氧化氢酶。

花蜜(blossom honey)的典型化学组成为：

表1.典型的蜂蜜(honey)组成

此外，还有微量的花粉存在，其可以用来鉴别蜂蜜的植物来源，以及还有转化酶、淀粉酶、过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶。还有植物化学成分。这有所不同，但通常最高达约1％，这取决于蜂蜜的来源。

一旦稀释，天然蜂蜜中存在的葡萄糖氧化酶即能够转化稀释的蜂蜜中的葡萄糖底物以释放过氧化氢。然而，蜂蜜含量(尤其是葡萄糖氧化酶活性、葡萄糖和过氧化氢酶活性的含量)的变化意味着来自不同来源的蜂蜜或来自同一来源的不同蜂蜜收获物的抗微生物效力可能差别很大。

根据本发明的一种实施方式，蜂蜜可以经巴氏灭菌。蜂蜜的巴氏灭菌使蜂蜜中存在的过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶的活性失活。任选地，巴氏灭菌的蜂蜜可以经过过滤以除去可能在收获后的蜂蜜中的任何颗粒(例如，蜡颗粒和蜂翅)。为了形成本发明的储存稳定的组合物，一旦巴氏灭菌的蜂蜜已经冷却至这样的温度(该温度不会使所添加的葡萄糖氧化酶失活并且，在该温度下蜂蜜保持充分液态以促进与葡萄糖氧化酶的混合)(合适的为35-40℃)，则使葡萄糖氧化酶与巴氏灭菌的蜂蜜接触。

蜂蜜可以在足以热失活过氧化氢酶活性的温度下进行巴氏灭菌。合适的最小温度是60℃至80℃。该温度优选维持至少2分钟。

加热过程的控制可能是重要的，因为加热蜂蜜的副产品是形成HMF(羟基甲基糠醛)，其被用作蜂蜜中热量和储存变化的指标。HMF是在酸的存在下通过果糖的分解形成的。加热增加了该反应的速率。速率的增加与加热的增加呈指数关系。对于蜂蜜升高到40℃(接近正常的蜂箱的环境温度)以上的每一度，HMF均迅速增加。HMF不是有害产品。果酱、糖蜜、金糖浆等可以具有蜂蜜的10到100倍的HMF水平。然而，HMF水平被用作蜂蜜降解的指标，并且根据食品法典标准，40mg/l是欧盟对于蜂蜜的最高许可水平。

为了防止HMF的积聚，优选将蜂蜜迅速升高至使过氧化氢酶失活的温度水平，然后使用热交换机制将蜂蜜迅速降温至最大为40至45℃之间的温度。

在该优选的实施方式的过程中不加入水，因此所得组合物不包含足够的游离水以使得葡萄糖氧化酶转化存在的葡萄糖以释放过氧化氢。储存稳定的组合物包含：巴氏灭菌的蜂蜜和添加的葡萄糖氧化酶。没有可检测的过氧化氢存在。该组合物可以在环境温度下储存至少数天。

在本发明的其他实施方式中，蜂蜜可以未经巴氏灭菌。

根据一些优选的实施方式，蜂蜜(巴氏灭菌或未经巴氏灭菌的)是乳膏化蜂蜜。乳膏化蜂蜜是经过加工以控制结晶的蜂蜜。乳膏化蜂蜜含有大量的小晶体，其可以防止较大的晶体(其可以在未精制的蜂蜜中出现)的形成。美国专利1,987,893中记载了一种生产乳膏化蜂蜜的方法。在该方法中，首先将原料蜂蜜进行巴氏灭菌，然后将预先加工的乳膏化蜂蜜添加到巴氏灭菌的蜂蜜中，以制备10％的乳膏化蜂蜜和90％的巴氏灭菌的蜂蜜的混合物。然后使混合物在14℃的受控温度下静置。该方法在约一个星期内生产一批乳膏化蜂蜜。晶种批料(seed batch)可以通过使正常的蜂蜜结晶并将晶体压碎至所需尺寸来制造。大规模的生产商已经通过使用搅拌桨搅拌蜂蜜混合物同时将混合物保持在14℃来改进该方法。在替代的乳膏化方法中，可以省略巴氏灭菌步骤，替代地，将蜂蜜缓慢温热至37℃。

在本发明的其他实施方式中，蜂蜜(巴氏灭菌或未经巴氏灭菌的)是未乳膏化的蜂蜜。例如，蜂蜜可以是巴氏灭菌的未乳膏化的蜂蜜。

葡萄糖氧化酶可以是纯化的天然葡萄糖氧化酶制剂，其为用于医疗应用中的医疗级或医疗设备级。葡萄糖氧化酶的活性可以根据组合物稀释后所需的过氧化氢的产生速率来选择。多种葡萄糖氧化酶制剂是可商购的(葡萄糖氧化酶通过参考CAS：9001-37-0鉴定)。来自非基因修饰生物的葡萄糖氧化酶的常见微生物来源包括以下所选择的菌株：黑曲霉(Aspergillus niger)、阿加曲霉青霉(Penicillium amagasakiense)、变异青霉(Penicillium variabile)、特异青霉(Penicillium notatum)。来自GMO黑曲霉的医疗设备级的葡萄糖氧化酶可由Biozyme UK获得，其活性为240iu/mg。来自黑曲霉的食品标准的葡萄糖氧化酶可由BIO-CAT INC获得，其活性为15,000单位/g。非基因修饰的葡萄糖氧化酶可以由BIO-CAT INC获得，其活性为12,000/g。来自黑曲霉的葡萄糖氧化酶(GO3B2)可由BBIEnzymes Limited获得，其活性为360单位/毫克。污染物：α-淀粉酶不大于0.05％，蔗糖酶不大于0.05％，麦芽糖酶不大于0.05％，并且GO/Cat不小于2000。

酶活性(例如，葡萄糖氧化酶活性)的范围可以为，例如1-400IU/mg或1-300IU/mg，例如250-280IU/mg。所使用的酶的量可能取决于多个因素，包括组合物的期望用途、所述物质中存在的任何过氧化氢酶活性的量、所述物质中存在的底物的量、期望的过氧化氢释放水平以及期望的过氧化氢释放的时间长度。本领域普通技术人员可以容易地确定酶的合适的量(如果需要，使用孔扩散测试)，以测定对于不同量的酶的过氧化氢释放的程度。酶(例如，葡萄糖氧化酶)的合适的量可以为组合物的0.0001％至0.5％w/w。可以对所使用的酶的量进行选择，以制备组合物用于产生与选定的苯酚标准品(例如10％、20％或30％苯酚标准品)相当的抗微生物活性。

本发明的组合物(特别是其中所述物质为蜂蜜(例如，未经巴氏灭菌的蜂蜜)的组合物，并且酶是能够转化蜂蜜中的D-葡萄糖以释放过氧化氢的葡萄糖氧化酶)可以包含每克组合物至少1单位、并且优选最高达1500单位的葡萄糖氧化酶。葡萄糖氧化酶对于可能天然存在于所述物质中的任何葡萄糖氧化酶活性是另外的(即，由于人为干预而添加的)。

“单位”在本文中定义为在25摄氏度下，在pH 7.0下每分钟引起1微摩尔葡萄糖(或其他酶底物)氧化的酶的量。

申请人已发现，可以通过增加本发明的组合物中存在的葡萄糖氧化酶活性的量来简单地提高该组合物的抗微生物效力。

在本发明的一些实施方式中，本发明的组合物包含每克组合物多于15单位，例如至少30单位、至少50单位或至少100单位，并且合适地少于685单位，例如100-500单位的葡萄糖氧化酶。已发现这类组合物，比每克组合物具有最高达15单位的葡萄糖氧化酶的组合物，具有更优异的抗微生物性质。特别地，这类组合物对较宽范围的微生物均具有提高的功效，包括MSSA、MRSA、A族和B族链球菌(Streptococci)、肠球菌(Enterococcus)、大肠杆菌(E.coli)、大肠杆菌ESBL、液化沙雷氏菌Amp C(Serr.liquefaciens Amp C)、肺炎克雷伯氏菌(Kleb.pneumoniae)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)和白念珠菌(Candida albicans)。

在本发明的其他实施方式中，本发明的组合物包含每克组合物至少500单位，例如500-1000单位或685-1000单位的葡萄糖氧化酶。已发现这类组合物具有更优异的抗微生物性质。特别地，这类组合物对宽范围的微生物均具有提高的功效，包括金黄色葡萄球菌、MSSA、MRSA、A族和B族链球菌、肠球菌、大肠杆菌、大肠杆菌ESBL、液化沙雷氏菌Amp C、肺炎克雷伯氏菌、绿脓杆菌、鲍曼不动杆菌和白念珠菌。

本发明的组合物可以用于治疗可以用过氧化氢来治疗的任何微生物感染。实例包括由革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、耐酸细菌、病毒、酵母、寄生或病原微生物或真菌引起的感染。特别地，可以治疗由以下微生物引起的感染：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、白念珠菌、痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophytics)、β溶血性A或B族链球菌、大肠弯曲杆菌(Campylobacter coli)、空肠弯曲杆菌(Campylobacterjejuni)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)、灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、隐孢子虫(Cryptosporidium)、疟原虫(Plasmodium)和弓形体(Toxoplasma)。

巴氏灭菌过程使蜂蜜中存在的任何酶活性均失活，并且因此，来自不同来源的巴氏灭菌的蜂蜜之间或者来自相同来源的不同蜂蜜收获物之间的过氧化氢酶和底物转化活性没有变化。底物转化活性的量可以通过添加具有确定的量和酶活性的纯化的葡萄糖氧化酶制剂来控制。因此，不同类型之间和蜂蜜收获物的抗微生物特性的固有差异显著降低，并且具有低的抗微生物功效的蜂蜜的抗微生物特性得以改进。

本发明的组合物可以以合适的频率(由受试者或医疗保健提供者确定)给予。合适地，本发明的组合物可以以至少，每数天，例如每周，但优选一天、每天或每隔一天数次给予。

本发明的组合物的给予量将取决于多个因素，如组合物的抗微生物特性的强度，以及待治疗的受试者的年龄和状况。然而，对于多数给药而言，预计每次给药包含0.1-100g、0.5-100g、1-100g、2-100g、5-100g、0.1-10g、0.5-10或1-10g的本发明的组合物。

根据本发明的优选的实施方式，本发明的组合物是无菌的。

本发明的组合物可以通过任何合适的方式进行灭菌。申请人已经发现，包含葡萄糖氧化酶的组合物在暴露于γ辐射的灭菌之后，仍保持葡萄糖氧化酶活性(并且因此，在稀释时释放过氧化氢的能力)。合适的γ辐射水平为10-70kGy，优选25-70kGy，更优选35-70kGy。

本发明的组合物优选未通过臭氧化进行灭菌，并且不包含臭氧或者任何已经通过臭氧化进行灭菌的组分。特别地，本发明的组合物不应包含臭氧化的蜂蜜或臭氧化的油。

本发明的灭菌组合物(避免暴露于光下储存)预期稳定保持至少六个月。例如，这类组合物可以包装在高密度聚乙烯/低密度聚乙烯(HDPE/LDPE)管或聚酯-铝-聚乙烯(PET/Al/PE)袋中。

本发明的组合物优选是医疗级或医疗设备级的组合物。优选未精制的天然物质是蜂蜜，合适的是医疗级或医疗设备级的蜂蜜。

优选地，本发明的组合物包含乳膏化蜂蜜，更优选乳膏化的未经巴氏灭菌的蜂蜜。这类组合物可以容易地局部给予，因为通过乳膏化过程已经使存在的大晶体或其数量减至最少。

对于包含蜂蜜的本发明的组合物，可以理解的是，如果对组合物进行灭菌，则可能不需要在组合物中使用巴氏灭菌的蜂蜜。相反，可能优选使用未经巴氏灭菌的蜂蜜(优选乳膏化蜂蜜)或其他未精制的天然物质。在一些实施方式中，本发明的组合物包含未经巴氏灭菌的蜂蜜，以及添加的纯化的葡萄糖氧化酶。

因此，本发明的储存稳定的组合物可以包含未经巴氏灭菌的蜂蜜，以及添加的纯化的葡萄糖氧化酶，其在足够的游离水的存在下能够转化蜂蜜中的D-葡萄糖而释放过氧化氢，其中组合物不包含足够的游离水以使得葡萄糖氧化酶转化D-葡萄糖。

这类组合物可以包含每克组合物至少1单位，并且例如，至多1500单位的葡萄糖氧化酶。合适地，这类组合物包含每克组合物多于15单位的葡萄糖氧化酶，例如每克组合物至少100单位或100-500单位的葡萄糖氧化酶，或者每克组合物至少500单位或500-1000单位的葡萄糖氧化酶。

这类组合物的蜂蜜可以包含乳膏化的未经巴氏灭菌的蜂蜜。

本发明的组合物可以是包含药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂的药物组合物。

本发明的组合物可以是适合于向人或动物受试者给予的形式。合适的形式包括适用于局部给予的形式。适用于局部给予的形式包括局部软膏、乳膏、洗剂、油、搽剂、液体、凝胶或可溶解的条带。如果使用储存稳定的组合物，则可以通过存在于给予部位的液体(例如通过唾液)稀释，使得在给予部位释放过氧化氢。

本发明的组合物可以与以下各项一起存在：至少一种合适的抗微生物或免疫刺激组分、赋形剂或佐剂或任何其他合适的组分(期望提供产生抗微生物活性能力)。然而，优选地，组合物不包含任何抗生素。

本发明的组合物可以包含“Surgihoney”。Surgihoney是添加有纯化的葡萄糖氧化酶的未经巴氏灭菌的蜂蜜。Surgihoney的三种不同的制剂制备为具有三种不同的抗菌功效：

SH1Surgihoney：添加有0.1％(w/w)的葡萄糖氧化酶的未经巴氏灭菌的蜂蜜。所用的酶是来自BIO-CAT,INC的黑曲霉的食品级的葡萄糖氧化酶，活性为15,000单位/克。SH1Surgihoney的密封小袋以11/6-14.2kGy的目标剂量进行γ辐照。

SH2Surgihoney：添加有0.1％(w/w)的葡萄糖氧化酶的未经巴氏灭菌的蜂蜜。所用的酶是来自BBI Enzymes Limited的黑曲霉的葡萄糖氧化酶(GO3B2)，活性为274单位/毫克。单位定义：在25摄氏度，pH 7.0下，每分钟引起1微摩尔葡萄糖氧化的酶的量。污染物：α-淀粉酶不大于0.05％，蔗糖酶不大于0.05％，麦芽糖酶不大于0.05％，并且GO/Cat不小于2000。

SH3Surgihoney：添加有0.25％(w/w)的葡萄糖氧化酶的未经巴氏灭菌的蜂蜜。所用的酶是来自BBI Enzymes Limited的葡萄糖氧化酶(GO3B2)，活性为274单位/毫克。

因此，SH1Surgihoney含有每克组合物15单位的葡萄糖氧化酶，SH2Surgihoney含有每克组合物274单位的葡萄糖氧化酶，而SH3Surgihoney含有每克组合物685单位的葡萄糖氧化酶。

在一些实施方式中，本发明的组合物(特别地，包含蜂蜜和添加的葡萄糖氧化酶的本发明的组合物—以下称为“活性蜂蜜”)不是或不包括以下：

软膏(Pommade)

活性蜂蜜25％

白凡士林

轻质液体石蜡

滑石

高岭土

氧化锌

在一些实施方式中，本发明的组合物(特别地，包含蜂蜜和添加的葡萄糖氧化酶的本发明的组合物—以下称为“活性蜂蜜”)不是或不包括以下：

润唇膏

在一些实施方式中，本发明的组合物(特别地，包含蜂蜜和添加的葡萄糖氧化酶的本发明的组合物—以下称为“活性蜂蜜”)不是或不包括以下：

乳膏

在一些实施方式中，本发明的组合物不包括：

用以下成分制备的包含Surgihoney SH1的乳膏制剂：

蜂蜡(用于亲油相)；

大豆卵磷脂(作为乳化剂)；

水；和

SH1Surgihoney。

在一些实施方式中，本发明的组合物不包括包含以下成分的乳液：

溶于10ml甘油的10g Surgihoney；

10ml石蜡油；

1ml聚甘油聚蓖麻油酸酯(PGPR)。

在一些实施方式中，本发明的方法不包括如实施例7中所述的用于制备Surgihoney乳液的以下方法：

将10g Surgihoney溶于10ml甘油中。然后将10ml石蜡油添加到附接有Peltier夹套和几何形状叶片的流变仪(TA Instruments AR-G2)中。然后添加1ml PGPR(聚甘油聚蓖麻油酸酯)。然后在以下条件下启动流变仪；剪切速率2000 1/s，温度设定在37.5℃。2分钟后，滴加10ml Surgihoney-甘油溶液。总共10分钟过去后，将乳液从Peltier夹套转移至容器中。

附图说明

现参照附图仅以举例的方式描述本发明的实施方式，其中：

图1示出Surgihoney的细胞毒活性的测试结果；

图2A示出Surgihoney SH1、SH2和SH3的不同的过氧化氢产生率；

图2B示出Surgihoney SH1、SH2和SH3中的苯酚活性与最大过氧化氢活性之间的关系；

图3示出不同测试生物体的Surgihoney 1(S1)、Surgihoney 3(S3)和医疗级蜂蜜(Medihoney)(MH)的时间杀灭曲线：(a)金黄色葡萄球菌；(b)耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)；(c)大肠杆菌；(d)耐万古霉素肠球菌(VRE)；(e)绿脓杆菌；(f)克雷伯氏菌；(g)大肠杆菌ESBL；(h)粪肠球菌(Enterococcus faecalis)；以及

图4示出含有Surgihoney的乳液中的反胶束的光学显微图像。

具体实施方式

实施例1

Surgihoney乳膏制剂

用以下成分制备包含Surgihoney SH1的乳膏制剂：

蜂蜡(用于亲油相)；

大豆卵磷脂(作为乳化剂)；

水；和

SH1Surgihoney。

根据乳膏与水接触时产生过氧化氢的能力判断，乳膏保持稳定数年。

实施例2

Surgihoney的抗病毒活性

将SH1或SH2Surgihoney与1型或2型单纯疱疹病毒(HSV1或HSV2)在细胞培养基(蜂蜜和病毒在细胞培养基中的50％混合物)中混合，然后在37℃下培育1小时。然后由该混合物制备稀释系列，并将稀释液接种到Vero细胞上。SH1Surgihoney将病毒滴度降低1log。SH2Surgihoney对于HSV1和HSV2均具有杀病毒性(滴度>6log)。实验是可重复的。

实施例3

Surgihoney的抗病毒活性

将SH1或SH2Surgihoney与单纯疱疹病毒(HSV)混合(50μg蜂蜜和50μl病毒)，并在37℃下孵育1小时。然后由该混合物制备稀释系列(10^-2、10^-3、10^-4、10^-5)，并将稀释液用于空斑减数试验。还进行无蜂蜜的对照或有蜂蜜的对照试验。记录每个稀释液形成的病毒斑块的数量。结果示于下表中。

表2.Surgihoney的抗病毒效果

结果显示出SH1和SH2Surgihoney在两个实验中均对HSV具有强杀病毒性。

实施例4

Surgihoney的细胞毒性活力

将SH1或SH2Surgihoney(50μg蜂蜜，稀释为10^-2、10^-3、10^-4、10^-5)在细胞上孵育2天。计量活细胞数和细胞总数(百分比存活率＝活/总×100)。结果示于下表和图1中。

结果显示SH1Surgihoney在10^-2稀释度下具有细胞毒性，在10^-3和10^-4稀释度下具有细胞抑制性，而SH2Surgihoney在10^-2、10^-3和10^-4稀释度下均具有细胞抑制性。SH1和SH2Surgihoney在10^-5稀释度下没有细胞毒性或细胞抑制性。

从实施例3和4的结果可以得出结论，Surgihoney可以以具有杀病毒性但没有细胞毒性或细胞抑制性的剂量给予。

表3.Surgihoney的细胞毒性活性

实施例5

Surgihoney的抗微生物活性

对Surgihoney(SH)以及由意大利蜜蜂(Apis mellifera)(蜜蜂)制造的两种原型改性蜂蜜，针对金黄色葡萄球菌(NCIMB 9518)的抗微生物活性进行了测试。我们还研究了多种改性类型的Surgihoney改变由样品产生过氧化氢的水平的能力。

方法：采用生物测试法，针对金黄色葡萄球菌标准菌株，比较Surgihoney(SH)与两种改性蜂蜜(原型1(PT1)和原型2(PT2))。进一步的工作研究了由这些制剂产生过氧化氢的速率。

结果：显示出Surgihoney的抗微生物活性很大程度上归因于过氧化氢的产生。通过对Surgihoney进行改性，表明两种更有效的蜂蜜原型可以产生两至三倍高的抗细菌活性和高达十倍高的过氧化物活性。

结论：Surgihoney表现出良好的抗微生物活性。两种其他蜂蜜原型表现出具有抗微生物活性，由于显示过氧化物活性增加，抗微生物活性可能得以增强。

方法

1.通过生物测试法测定蜂蜜活性

使用金黄色葡萄球菌(NCIMB 9518)测量Surgihoney(S)和两种改性蜂蜜(原型1(PT1)和原型2(PT2))的抗微生物活性，并以当量百分比苯酚表示。计算所测试的三个重复样品的平均值，三天重复。

测试方法：所用的琼脂扩散方法根据新西兰乳品业微生物学标准方法手册(Microbiology Standard Methods Manual for the New Zealand Dairy Industry)(1982)[蜂产品标准委员会(Bee Products Standards Council):新西兰蜜蜂产品标准委员会提出的衡量蜂蜜非过氧化物活性的标准(Proposed standard for measuring thenon-peroxide activity of honey.In.New Zealand:Bee Products StandardsCouncil)；1982.]中所记载的对于抑制物质的冲孔板测定法(Punch Plate Assay)而改进。

接种物制备：使用无菌营养肉汤作为空白和稀释剂，并使用具有1cm通道的比色皿，将过夜培养物调整至在540nm处测量的吸光度0.5。

测定板制备：使用调整为0.5吸光度的100μl体积的培养物来接种150ml营养琼脂而制备测定板。搅拌琼脂以充分混合，并且倒入放置在水平表面上的大的皮氏培养皿中。琼脂凝固后，将板倒置过夜，然后在第二天使用。为了测定，将这些接种的板从4℃移出并在室温下静置15分钟，然后在琼脂表面钻7.0mm直径的孔。将250μl的测试物质(样品或标准品)放入每个孔中。

过氧化氢酶溶液：每天新制备200mg/ml来自牛肝的过氧化氢酶(Sigma C9322，2900单位/毫克)在蒸馏水中的溶液。

样品制备：通过将4g样品添加到4ml普通蒸馏水中并在37℃下放置30分钟以帮助混合来制备初级样品溶液。为了制备次级溶液，将2ml初级样品溶液添加到2ml普通蒸馏水中并混合用于进行总活性测试，并且将2ml初级样品溶液添加到2ml过氧化氢酶溶液中并混合用于进行非过氧化物活性测试。

苯酚标准品的制备：通过将苯酚溶于水中来制备标准品(w/v)10％、30％、50％的苯酚。在使用前将苯酚标准物在黑暗中置于室温并在添加至测试孔之前充分混合。将每个标准品放置在三个孔中测试，一式三份。标准品保持在4℃，有效期为一个月。

样品和标准品应用：通过向3个孔中的每个添加250μl来测试所有样品和标准品一式三份。

板孵育：在应用样品后，将板在37℃下孵育约18小时。记录抑制区的直径，包括孔的直径(7.0mm)。

计算样品的抗细菌活性：计算每个苯酚标准品周围清澈区的平均直径并取平方。以％苯酚相对于清澈区的平均直径的平方来绘制标准图。使用线性回归获得最佳拟合直线，并且使用该线的方程式，从透明区直径的平均测量值的平方来计算每个稀释的蜂蜜样品的活性。为了稀释液(假设Surgihoney的密度为1.35g/ml)，将该数字乘以4.69，然后将样品的活性表示为当量苯酚浓度(％w/v)。

总活性：所有的活性，包括由过氧化氢(H₂O₂)引起的活性。

非过氧化物活性：通过用过氧化氢酶处理样品来除去H₂O₂。

2.通过H₂O₂法测定蜂蜜的活性

活性使用1.10011.&1.10081进行测量。

过氧化物测试试剂盒：浓度以当量mg/L H₂O₂表示。

样品用纯水以1:10稀释。孵育5分钟后，在12小时内每小时测量所有样品的H₂O₂产量，然后测量24和48小时的时间点。

测定方法：过氧化物酶将氧从过氧化物转移至有机氧化还原指示剂，然后转化成蓝色氧化产物。过氧化物浓度通过目测比较测试条的反应区域和色标的区域来半定量地测量。将测试条的反应区浸入Surgihoney样品中1秒钟，使多余的液体从条上流到吸水纸巾上，并且在15秒钟后(目录号110011)、5秒钟后(目录号110081)，在反应区中所形成的颜色的测定更精确地符合色标。

结果

1.活性等级

PT1和PT2与单独使用Surgihoney相比，通过对蜂蜜样品进行改性产生的抗微生物活性分别使得苯酚活性分别导致了两倍和几乎三倍的增加。Surgihoney(SH)和两个改性原型PT1和PT2的三个样品的结果示于下表中。

表4.Surgihoney(SH)和两种改性原型PT1和PT2针对金黄色葡萄球菌(NCIMB 9518)的过氧化物和非过氧化物抗菌活性。

样品名称	批号	总活性(％苯酚)	非过氧化物活性(％苯酚)
				Surgihoney	2015-06-018B	32	0
Surgihoney PT1	HHI4110311	65	7
				Surgihoney PT2	HHI14110312	83	10

2.通过H₂O₂法测定蜂蜜的活性

观察到原型改性产生Surgihoney的高达7倍和10倍的过氧化氢活性。三个样品的结果示于图2A中。通过对三种蜂蜜原型中的每一种取最大水平的过氧化氢产量，并将其与总苯酚活性作图，观察到线性关系(图2B)。

讨论

这项工作的结果表明，Surgihoney和两个改性原型PT1和PT2的主要抗微生物活性是由过氧化氢引起。这是与从各种花卉来源的某些其他蜂蜜类似的发现。然而，不同于以前的工作，样品中的过氧化氢的可用性能够得到增强，并且在12小时内分别是单独使用Surgihoney的值的七倍和十倍。三种蜂蜜样品的抗微生物活性和过氧化氢的最大产量之间有着显著的线性关系。

这种过氧化物活性提供了有效的抗微生物活性，其非常适合于治疗或预防微生物感染。过氧化氢是一种有效的抗微生物剂，并且因其对营养细菌、酵母和孢子的有效活性已被用作杀生物剂。过氧化氢通过细胞组分的化学氧化产生其抗微生物效果。

过氧化氢的人体毒性是浓度依赖性的，并且一项研究声称抗微生物和人体毒性的差异浓度可能重叠。相反，通过随时间连续提供低浓度的过氧化氢而不是大量提供并没有这种毒性，某些蜂蜜制剂已被证明是一种有效的抗微生物剂。事实上，有令人信服的证据表明，在将生理水平的过氧化氢施加至哺乳动物细胞的情况下，刺激了这些细胞中的生物反应并且激活了特定的生物化学通路。

显然Surgihoney和两个改性原型PT1和PT2在至少24小时内提供了有效的过氧化氢释放。

结论

Surgihoney和两种改性原型PT1和PT2已经显示出对金黄色葡萄球菌标准菌株具有有效的抗微生物活性。已经表明这些抗微生物活性是由过氧化氢引起。活性是可标度的，并且可以用过氧化氢活性来描述。这些改性蜂蜜有效、无毒并且易于给予。

实施例6

Surgihoney的体外抗微生物活性

该实施例通过圆盘扩散法、最小抑制浓度(MIC)和最低杀灭浓度(MBC)测定以及时间杀灭测量(time bactericidal measurement)描述了一系列细菌分离株对Surgihoney的易感性测试。

概要

结果：Surgihoney表现出对广泛的革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌以及真菌的高度有效的抑制和杀灭活性。MIC/MBC显著低于局部临床使用中可能达到的浓度。Surgihoney 1对金黄色葡萄球菌的MIC/MBC为31和125gms/L，而Surgihoney 3的MIC/MBC为0.12和0.24gms/L。

杀灭速度取决于功效。在Surgihoney 1中(最低功效)，在48小时内对所有测试生物体均产生完整的杀灭活性。对于Surgihoney 3(最有功效的)杀灭活性在30分钟内产生。Surgihoney接种制剂维持长达一个星期表明完整的杀灭活性以及没有细菌持久性。

结论：Surgihoney作为高活性局部治疗，将蜂蜜的愈合性能作用与生物工程产品的有效抗微生物活性相结合，具有广泛的潜力。Surgihoney对多重耐药细菌具有高活性。Surgihoney比其他所测试蜂蜜更有活性，并且与化学防腐剂的抗微生物活性相当。

该项研究检验了Surgihoney的体外特性。Surgihoney保留了天然蜂蜜的所有已确定的愈合特性，但其抗微生物活性可以根据所需功效来设定。该项研究确定了Surgihoney1、2和3的最小抑制浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)以及时间杀灭曲线。

方法

Surgihoney以功效等级1、2和3来提供。其作为一种无菌药物级产品以半固体形式在小袋中提供。

从软组织微生物学样品收集临床分离物。用以下物种对Surgihoney进行测试：十八株金黄色葡萄球菌分离菌株(12株甲氧西林敏感的(MSSA)和6株耐甲氧西林(MRSA))，6株β溶血性链球菌分离菌株(兰斯菲尔德A族(2)、B族(2)、C族(1)、G族(1))，5株肠球菌属(包括耐万古霉素的屎肠球菌)，6株大肠杆菌(包括扩展的β内酰胺酶产生菌)，2株克雷伯菌属(Klebsiella spp.)，1株沙雷氏菌(Serratia Marcescens)AmpC产生菌，4株绿脓杆菌，1株鲁氏不动杆菌(Acinetobacter lwoffii)，1株痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)，1株脆弱类杆菌(Bacteroides fragilis)，以及2株白念珠菌，1株光滑念珠菌(Candidaglabrata)，1株曲霉菌(Aspergillus fumigates)。

琼脂扩散

在已经用一定浓度的测试生物体接种以得到半融合生长的Isosenitest琼脂中切出6mm的孔。将试验研究中的测试Surgihoney和其他蜂蜜添加到孔中。

首先进行一项试验研究，以将Surgihoney功效S1、S2、S3与来世界各地：欧洲、南美洲、新西兰、Yemani、苏丹的各种蜂蜜相比较，以及与医用蜂蜜Medihoney，以及与含有银的抗微生物敷料(Silver Aquacell)和含有碘的抗微生物敷料(Iodoflex)相比较。在接种金黄色葡萄球菌的板中切出孔并填满测试蜂蜜，或者在敷料的情况下，将它们切成2×2cm并放置在接种板的表面上。

在试验研究之后，单独针对来自皮肤损伤的一系列细菌分离株测试Surgihoney功效S1、S2、S3。将这些孔用约2gms的三种功效的纯的Sugihoney填充至表面，其在等体积的无菌水中稀释并乳化。在有氧孵育18-24小时后测量区域大小(对于念珠菌属和曲霉菌属更长，而对于丙酸杆菌和类杆菌属物种则厌氧)。

最低抑制浓度和最低灭菌浓度

将Surgihoney产品升温至37℃使其液化，并将5gms与10mL无菌去离子水混合。这种稀释被认为是连续稀释的“纯”物质。使用用于进行最小抑制浓度(MIC)和最低灭菌浓度(MBC's)的英国抗微生物化学疗法协会(British Society of AntimicrobialChemotherapy)(BSAC)的方法(Andrews JM.Determination of minimum inhibitoryconcentrations.J Antimicrob 372Chemother 2001；48(Supp 1):5-16)。将Surgihoney产品在微量滴定盘孔中由纯产品连续稀释到1/1024。将75μL的每种蜂蜜稀释液添加到微量滴定盘的条带中的每个孔中。纯产品浓度表示浓度为250gm/L，而1/2048的稀释液为约0.12gm/L。

通过对来自纯培养物的每种生物取四种形态相同的菌落来制备测试生物体，以产生0.5McFarland的密度。这是进一步以1:10稀释。

用75μL测试分离株制剂接种包括对照在内的所有孔。孔盘在37℃下孵育18小时。MIC被认为是最稀的孔，该孔没有表现出可检测的浊度。

将MIC和MIC孔周围的那些孔分别在血琼脂上进行传代培养，并在37℃孵育18小时以测定MBC。MBC是在孵育后未显示出增长的最稀的浓度。

时间杀灭曲线

测试生物体接种物通过取0.1mL的0.5Macarfarlane密度的测试生物体并将其接种于3mL营养肉汤中而制备。将测试接种物分成3个单独的试样(bijous)、一个对照和三个测试制剂，向其中添加0.5g的Surgihoney 1(S1)、Surgihoney 3(S3)或Medihoney(MH)。通过连续1:10稀释测定接种物的菌落进行计数，并在血琼脂板上铺0.1mL，重复3次。

将测试和对照接种物保持在30℃以模拟表面皮肤病变的温度。如上所述在0.5、2、4、24、48、72和168小时进行菌落计数，一式三份。

通过将0.1ml原始接种物接种到营养肉汤中进行末端培养(terminal culture)，以中和Surgihoney的任何残留效应，并在37℃下孵育72小时，然后铺在血琼脂上以确定测试生物体的存活。

结果

抑制区大小

试验比较研究表明，所有Surgihoney功效均比任何其他测试蜂蜜(包括医疗级蜂蜜，Medihoney)具有更大的抗微生物活性。S1的抑制区大于由其他蜂蜜产生的抑制区。银敷料(silver dressing)在敷料下产生一些抑制作用，但没有像Surgihoney那样的抑制作用。碘敷料对金黄色葡萄球菌产生大的抑制区(约70mm)，大于S1(36mm)而相当于S3(67mm)。

在定量区域大小测试中，所有功效的Surgihoney针对所有测试细菌均产生琼脂扩散的抑制区，既针对革兰氏阳性也针对革兰氏阴性细菌，包括多种耐抗生素细菌和真菌物种。每个物种的区域大小随着Surgihoney功效制剂的增加而增加。表5.Surgihoney的抑制作用不仅依赖于与带有银敷料的活性剂的直接接触，而是扩散到产生表5中所列出的扩展区域的孔之外。

MIC和MBC

Surgihoney对所有测试的分离株显示出显著的抗微生物活性。MIC和MBC在相同物种的分离株之间是非常一致的，无论该分离株是多重耐药的还是高度敏感的。表6列出了通过稀释比测试的分离株物种的MIC和MBC值，而表7列出了MIC和MBC，以克每升计。功效程度随着Surgihoney的等级升高。在大多数情况下，每个分离株的MBC在单一稀释度内接近MIC。

估计Surgihoney的局部浓度约为500gms/L。Surgihoney 1对金黄色葡萄球菌的MIC/MBC为31和125gms/L，Surgihoney 3的MIC/MBC为0.12和0.24gms/L。

时间杀灭曲线

Surgihoney迅速杀死细菌。从每毫升菌落形成单位(cfu/mL)为约105开始，对照的cfu/mL值稳步增加，而在Surgihoney接种菌中，cfu/mL在与两种功效的Surgihoney接触后迅速下降。在大多数情况下，对于S1和S3，cfu值在30分钟内减少了1000倍(图3)。对于S1，细菌生长在大多数情况下在2小时内检测不到，而对于S3则在30分钟内检测不到。肠球菌似乎更有恢复力，并且持续48小时。所有生物体的杀灭活性均作为营养肉汤中的末端培养物完成，随后铺在血液琼脂上未能检测到S1或S3接种物中的任何生物体。

讨论

Surgihoney是天然蜂蜜，其在当前意义上也是有机的，因为其没有农业添加剂或抗微生物残留物，不像许多商业蜂蜜一样供人食用。其不依赖于特定的花蜜来源，不像如麦卢卡(manuka)的蜂蜜，该蜂蜜依赖特定植物花蜜来源来提高活性。抗微生物活性可以在Surgihoney中通过制备过程来控制，从而使得产生具有一致的测量功效的不同等级。

这项研究已经清楚地证明了Surgihoney作为高度有效的抗微生物剂的功效，并且证明了Surgihoney对所有测试的细菌和真菌的活性。在比较Surgihoney与来自世界各地的蜂蜜和医疗级蜂蜜Medihoney的初步试验研究中，Surgihoney表现出显著更大的抗微生物功效。通过与常用的局部防腐剂银和碘的比较，Surgihoney 3产生了与碘敷料一样高的抗微生物效果，并且比银敷料(Aquacel Ag)的抗微生物效果更好，而Ag敷料只能有效抑制与敷料直接接触的细菌。

MIC和MBC测试表明，Surgihoney以比局部治疗中可能达到的浓度低10至1000倍的浓度(估计为500gms/L)，不仅能够抑制而且还能杀死微生物。Surgihoney的杀灭活性在接近其抑制活性的浓度下产生。因此，当局部施用时，Surgihoney具有在抑制和消除多细菌微生物方面的高度活性的潜能。

杀灭活性动的速度表现为时间杀灭曲线非常陡，对于Surgohoney 3在30分钟内，而对于Surgohoney 1则在2小时内。

这些体外研究已经证明，具有高的抗微生物活性的Surgihoney的潜能可以被控制。

结论

这些体外结果支持了Surgihoney作为有效且无毒的抗微生物剂的临床应用。

表5具有不同功效的Surgihoney的抑制区尺寸(S1、S2、S3)

表6示出最小抑制浓度(MIC)和最小灭菌浓度(MBC)的稀释的纯的Surgihoney(S1、 S2、S3)的系列双稀释液。

表7以克/升表示的Surgihoney的MIC和MBC值

实施例7

Surgihoney乳液

制备

将10g Surgihoney溶于10ml甘油中。然后将10ml石蜡油添加到附有Peltier夹套和几何形状叶片的流变仪(TA Instruments AR-G2)中。然后添加1ml PGPR(聚甘油聚蓖麻油酸酯)。然后在以下条件下启动流变仪；剪切速率2000 1/s，温度设定在37.5℃。2分钟后，滴加10ml Surgihoney-甘油溶液。在总计10分钟过去后，将乳液从Peltier夹套转移至容器中。

光学显微镜

光学显微镜显示该乳液含有包封了Surgihoney的反胶束。这类胶束可以在图4中观察到。发现平均胶束直径为178μm。

过氧化氢测试

使用过氧化氢棒测试(购自Sigma Aldrich来检测乳液中的过氧化氢。在添加水之前和之后进行测试，并且显示在添加水之前，乳液不产生过氧化氢，并且在添加水之后，乳液测试为对过氧化氢呈阳性。阳性测试表示为颜色变为蓝色。

稳定性测试

在环境条件下储存至少四周后，乳液保持其产生过氧化氢的能力。

喷雾测试

将乳液添加至泵作用(pump-action)喷雾瓶中，发现是可喷雾的。

实施例8

不同参数对Surgihoney乳液稳定性的影响

研究了改变实施例7中所描述的Surgihoney乳液制备方法的效果，一次改变一个参数。以下总结了这些变化及其影响。

i)油相与Surgihoney-甘油相的比例

对油体积大于10ml，以及小于10ml进行了测试。当与Surgihoney-甘油相的体积相比，使用较少体积的油时，发现乳剂更稳定。当油的体积小于6ml时，发现在72小时内乳液总体积分离小于3％。4ml的体积在72小时内使得总体积的仅1.3％的发生分离。这种稳定性远远大于实施例7中所述的方法，其在相同的时间段内提供了总体积的9.4％的分离的乳液。

ii)PGPR的体积

对PGPR的体积最高达4ml，以及少于1ml进行了测试。当使用更高量的PGPR时，乳液更稳定。在4ml的体积下，PGPR提供了比使用较低体积更大的稳定性，并且比实施例7中所描述的乳液稳定得多。

iii)剪切速率

对剪切速率从1000 1/s到3000 1/s进行了测试。当施加更高的剪切速率时，乳液更稳定。3000 1/s的剪切速率产生最稳定的乳液。对于在此剪切速率下制备的乳液，在72小时内观察到总体积的仅4.6％的分离，相比之下对于如实施例7中所述制备的乳液，在相同时间段内观察到总体积的9.4％的体积分离。

iv)温度

对20℃至40℃的温度进行了测试。在温度升高时，关于乳液的稳定性没有明显的趋势。然而，40℃的温度产生最稳定的乳液。对于该乳液在72小时内观察到总体积的仅3.1％的分离。

v)剪切时长

除了实施例7中所述的制备方法中使用的剪切时间之外，还对20分钟和30分钟的剪切时间进行了测试。但是，通过延长剪切时间没有产生显著差异。

vi)试剂添加顺序

对改变试剂加入流变仪的顺序的效果进行了测试。将启动流变仪前添加所有组分的效果与首先添加Surgihoney-甘油和油组分，然后在1-2分钟后添加PGPR的效果进行比较。当最后添加PGPR时，形成最稳定的乳液。所得乳液在120小时内提供了总体积的2.8％的分离体积。

vii)溶解在甘油中的Surgihoney的浓度

对Surgihoney(g)与甘油(ml)的以下比例进行了测试：1g:1ml；0.5g:1ml；2g:1ml。产生最稳定的乳液的比例为1g:1ml，其与实施例中7所述的制备方法中使用的比例相同。

viii)氯化钠

当氯化钠溶解在乳液的极性层中时，其增加了该层的极性。其还与乳液的脂质层形成静电相互作用。静电相互作用和极性的增加可以改善稳定性并减少聚结。然而，未发现添加氯化钠(1g，2g或4g)影响乳液的稳定性。

下表总结了这些变化的影响：

表8

*(120小时后)

实施例9

具有高稳定性的Surgihoney乳液

使用来自实施例8中所描述的变化的结果来设计制备Surgihoney乳液另外的方法。该方法在下面进行描述。

制备

将10g Surgihoney溶于10ml甘油中。然后将4、6、8或10ml石蜡油添加到附有Peltier夹套和几何形状叶片的流变仪(TA Instruments AR-G2)中。然后将10ml的Surgihoney-甘油溶液添加到流变仪中。然后在以下条件下启动流变仪；剪切速率3000 1/s，温度40℃，间隙4000μm，运行时间10分钟。1分钟后，添加4ml PGPR(聚甘油聚蓖麻油酸酯)。在总计10分钟过去后，将乳液从流变仪转移至容器中。

表9

发现所有制剂都是高度稳定的，随着所用石蜡油的体积增加，所观察到的稳定性略有增加。

实施例10

Surgihoney乳膏制剂

将1.5g Surgihoney溶于1.5ml甘油中。然后将1g海藻酸钠溶于Surgihoney-甘油溶液中。接下来，将10ml石蜡油添加到附有Peltier夹套和几何形状叶片的流变仪(TAInstruments AR-G2)中。然后添加1ml PGPR(聚甘油聚蓖麻油酸酯)。然后在以下条件下启动流变仪；剪切速率2000 1/s，温度设定在37.5℃，间隙4000μm，运行时间10分钟。2分钟后，将1.5ml Surgihoney-海藻酸钠和甘油的溶液添加到流变仪中。3分钟后，将8ml氯化钙溶液滴加到流变仪中。总共10分钟过去后，将乳液从Peltier夹套转移至容器中。

实施例11

非水Surgihoney乳膏制剂

实施例10中所描述的方法使用水将氯化钙解离成其离子。这可能会激活Surgihoney而产生过氧化氢，并限制了乳膏制剂的稳定性。然而，我们已经意识到，可以使用非水溶剂，如乙醇或乙酸来使氯化钙解离。我们还认识到甘油能够结合游离水。该特性使得水用于使海藻酸盐解离，条件是存在足够的甘油来防止过氧化氢的过早释放。

以下描述的方法使用乙醇作为氯化钙的溶剂，而甘油用于结合海藻酸盐溶液中的游离水。

将1g海藻酸钠溶于15ml水中。接下来，将30ml甘油添加到海藻酸盐溶液中并混合。然后将30g Surgihoney溶解在溶液中。然后将10ml石蜡油添加到附有Peltier夹套和几何形状叶片的流变仪(TA Instruments AR-G2)中。然后将10ml Surgihoney溶液添加到流变仪中。然后在以下条件下启动流变仪：剪切速率3000 1/s，温度40℃，间隙4000μm，运行时间10分钟。1分钟后，添加4ml PGPR(聚甘油聚蓖麻油酸酯)。2分钟后，将8ml非水氯化钙溶液(1M氯化钙的乙醇溶液)滴加到流变仪中。总共10分钟过去后，将乳液从流变仪转移至容器中。

实施例7-11中的乳液制剂的总结：

表10

Claims (154)

1.一种用于产生抗微生物活性的组合物，所述组合物包含：亲油相；含水相；能够转化底物以释放过氧化氢的酶；和包含酶的底物的物质。

2.根据权利要求1所述的组合物，所述组合物是胶体或悬浮液的形式。

3.根据权利要求1或2所述的组合物，所述组合物是乳液的形式。

4.根据前述权利要求中任意一项所述的组合物，其中所述亲脂相包含油或蜡。

5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述油或蜡选自以下各项：石栗(AleuritesMoluccana)种子油；葡萄(Vitis Vinifera)种子油；扁桃仁油NF；杂交红花(CarthamusTinctorius)油；无水羊毛脂USP；肉豆蔻酸异丙酯；杏仁油；棕榈酸异丙酯；鳄梨(PerseaGratissima)油；荷荷巴(Buxus Chinensis)油；巴巴苏油；羊毛脂；蜂蜡；澳洲坚果(Ternifolia)坚果油；琉璃苣(Borago Officinalis)种子油；芒果(Mangifera Indica)种子黄油；巴西坚果油；矿物油；苯甲酸C12-15烷基酯；肉豆蔻酸肉豆蔻酯；大麻种子油；橄榄(Olea Europaea))油；芥花油；水稻(Oryza Sativa)(米糠)油；辛酸/癸酸甘油三酯；花生油NF；胡萝卜(Daucus Carota Sativa)种子油；凡士林；蓖麻(Ricinus Communis)油；PPG-15硬脂醇醚；地蜡；棕榈酸视黄酯；鲸蜡硬脂醇；红花(Carthamus Tinctorius)油；鲸蜡醇；芝麻(Sesamum Indicum)油；鲸蜡醇酯；乳木果油(Butyrospermum Parkii)；棕榈酸鲸蜡醇酯；大豆(Glycine Soja)油；椰子油；硬脂酸；胡萝卜(Daucus Carota Sativa)根提取物；硬脂醇；己二酸二异丙酯；向日葵(Helianthus Annus)油；聚二甲基硅氧烷；甜杏仁(PrunusAmygdalus Dulcis)油；犬蔷薇(Rosa Canina)果油；可可(Theobroma Cacao)种子黄油；鸸鹋油；生育酚；月见草油。

6.根据权利要求4或5所述的组合物，其中所述油或蜡是蜂蜡。

7.根据前述权利要求中任意一项所述的组合物，所述组合物还包含一种或多种乳化剂。

8.根据权利要求7所述的组合物，其中所述乳化剂具有的亲水-亲油平衡(HLB)值，或者所述乳化剂具有的组合HLB值在3-6或8-18范围内。

9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述乳化剂选自以下各项：

硬脂酰乳酸钙；鲸蜡硬脂醇聚醚-20；鲸蜡硬脂基葡糖苷；鲸蜡醇聚醚-10；鲸蜡醇聚醚-2；鲸蜡醇聚醚-20；椰油酰胺MEA；月桂酸甘油酯；硬脂酸甘油酯；硬脂酸甘油酯(和)PEG-100硬脂酸酯；硬脂酸甘油酯SE；二硬脂酸乙二醇酯；硬脂酸乙二醇酯；异鲸蜡醇聚醚-20；异硬脂醇聚醚-20；月桂酰胺DEA；月桂醇聚醚-23；月桂醇聚醚-4；卵磷脂；亚油酰胺DEA；甲基葡萄糖倍半硬脂酸酯；油醇聚醚-10；油醇聚醚-10/聚乙二醇10油基醚NF；油醇聚醚-2；油醇聚醚-20；油醇聚醚-20；PEG-100硬脂酸酯；PEG-20杏仁甘油酯；PEG-20甲基葡萄糖倍半硬脂酸酯；PEG-25氢化蓖麻油；PEG-30二聚羟基硬脂酸酯；PEG-4二月桂酸酯；PEG-40脱水山梨糖醇过油酸酯；PEG-60杏仁甘油酯；PEG-8月桂酸酯；PEG-80脱水山梨糖醇月桂酸酯；聚山梨酸酯20；聚山梨酸酯60；聚山梨酸酯80；聚山梨酸酯85；硬脂酰乳酸钠；异硬脂酸脱水山梨糖醇酯；月桂酸脱水山梨糖醇酯；油酸脱水山梨糖醇酯；倍半油酸脱水山梨糖醇酯；硬脂酸脱水山梨糖醇酯；硬脂酸脱水山梨糖醇酯(和)蔗糖椰油酸脂；三油酸脱水山梨糖醇酯；硬脂酰胺MEA；硬脂醇聚醚-2；硬脂醇聚醚-21。

10.根据权利要求7至9中任意一项所述的组合物，其中所述乳化剂是卵磷脂。

11.根据前述权利要求中任意一项所述的组合物，所述组合物配制为用于局部施用。

12.根据前述权利要求中任意一项所述的组合物，所述组合物是乳膏或洗剂的形式。

13.根据前述权利要求中任意一项所述的组合物，其中所述酶对于可能存在于所述物质中的能够转化底物以释放过氧化氢的任何酶活性是附加的。

14.根据前述权利要求中任意一项所述的组合物，其中所述组合物是储存稳定的组合物，该组合物不包含足够的游离水以使得所述酶转化所述底物。

15.根据前述权利要求中任意一项所述的组合物，其中所述酶是纯化的酶。

16.根据前述权利要求中任意一项所述的组合物，其中所述酶是氧化还原酶。

17.根据权利要求16所述的组合物，其中所述氧化还原酶是葡萄糖氧化酶。

18.根据前述权利要求中任意一项所述的组合物，其中所述物质包含所述酶的纯化的底物。

19.根据权利要求18所述的组合物，其中所述纯化的底物包含纯化的糖。

20.根据权利要求19所述的组合物，其中所述纯化的糖包括D-葡萄糖、己糖或D-半乳糖。

21.据权利要求1至17中任意一项所述的组合物，其中所述物质是未精制的天然物质。

22.根据权利要求21所述的组合物，其中所述未精制的天然物质缺乏过氧化氢酶活性。

23.根据权利要求21或22所述的组合物，其中所述未精制的天然物质是未精制的天然糖物质。

24.根据权利要求23所述的组合物，其中所述未精制的天然糖物质是蜂蜜。

25.根据权利要求24所述的组合物，其中所述蜂蜜是未经巴氏灭菌的蜂蜜，优选乳膏化的未经巴氏灭菌的蜂蜜。

26.根据前述权利要求中任意一项所述的组合物，所述组合物不包含任何可检测的过氧化氢。

27.根据前述权利要求中任意一项所述的组合物，其中所述组合物是无菌组合物。

28.根据前述权利要求中任意一项所述的组合物，其中所述亲油相与所述含水相的比例为9:1至1:9、8:1至1:8、7:1至1:7、6:1至1:6、5:1至1:5、4:1至1:4、3:1至1:3或2:1至1:2(v/v)。

29.根据前述权利要求中任意一项所述的组合物，所述组合物包含5-95％、10-95％、15-95％、20-95％、25-95％、30-95％、35-95％、40-95％、45-95％、50-95％、55-95％、60-95％、65-95％、70-95％、75-95％、80-95％、85-95％或90-95％(v/v)的亲油相(包括存在的任何乳化剂)。

30.根据权利要求1至28中任意一项所述的组合物，所述组合物包含5-95％、5-90％、5-85％、5-80％、5-75％、5-70％、5-65％、5-60％、5-55％、5-50％、5-45％、5-40％、5-35％、5-30％、5-25％、5-20％、5-15％或5-10％(v/v)的亲油相(包括存在的任何乳化剂)。

31.根据前述权利要求中任意一项所述的组合物，所述组合物包含5-95％、10-95％、15-95％、20-95％、25-95％、30-95％、35-95％、40-95％、45-95％、50-95％、55-95％、60-95％、65-95％、70-95％、75-95％、80-95％、85-95％或90-95％(v/v)的含水相。

32.根据权利要求1至31中任意一项所述的组合物，所述组合物包含5-95％、5-90％、5-85％、5-80％、5-75％、5-70％、5-65％、5-60％、5-55％、5-50％、5-45％、5-40％、5-35％、5-30％、5-25％、5-20％、5-15％或5-10％(v/v)的含水相。

33.根据前述权利要求中任意一项所述的组合物，所述组合物包含1-60％、1-50％、1-40％、1-30％、1-20％或1-10％(w/v)的所述物质。

34.根据权利要求1至32中任意一项所述的组合物，所述组合物包含1-60％、5-60％、10-60％、15-60％、20-60％、25-60％、30-60％、35-60％、40-60％、45-60％或50-60％(w/v)的所述物质。

35.根据前述权利要求中任意一项所述的组合物，所述组合物包含小于20％的水，优选包含10-19％的水。

36.根据前述权利要求中任意一项所述的组合物，所述组合物包含每克组合物1-1500单位、15-1500单位、30-1500单位、50-1500单位、100-1500单位、1-<685单位、15-<685单位、30-<685单位，50-<685单位、100-<685单位、500-1000单位、685-1000单位或100-500单位的酶，优选葡萄糖氧化酶。

37.根据前述权利要求中任意一项所述的组合物，所述组合物包含足够的酶和底物以便在至少24小时的时间段提供0.1至小于2mmol/L的过氧化氢的持续释放。

38.一种根据前述权利要求中任意一项所述的组合物，用于作为药物的用途。

39.一种根据权利要求1至37中任意一项所述的组合物，用于在预防或治疗微生物感染中的用途。

40.根据权利要求1至37中任意一项所述的组合物在制备用于预防或治疗微生物感染的药物中的用途。

41.根据权利要求39或40所述的用途，其中所述预防或治疗通过局部给药所述组合物进行。

42.一种预防或治疗微生物感染的方法，所述方法包括将有效量的根据权利要求1至37中任意一项所述的组合物给药至需要这种治疗的受试者。

43.根据权利要求42所述的方法，其中所述组合物被局部给药至所述受试者。

44.根据权利要求39至41中任意一项所述的用途或根据权利要求42或43所述的方法，其中所述微生物感染是病毒感染，优选是单纯疱疹病毒(HSV)感染。

45.根据权利要求39至41中任意一项所述的用途或根据权利要求42或43所述的方法，其中所述微生物感染是真菌感染。

46.根据权利要求39至41中任意一项所述的用途或根据权利要求42或43所述的方法，其中所述微生物感染是细菌感染。

47.一种制备根据权利要求1至37中任意一项所述的组合物的方法，所述方法包括混合以下各项以形成组合物：亲油组分；含水组分；能够转化底物以释放过氧化氢的酶；和包含酶的底物的物质。

48.一种用于产生抗微生物活性的组合物，所述组合物包含：第一相；第二相；能够转化底物以释放过氧化氢的酶；和包含酶的底物的物质，其中所述第一相和所述第二相不混溶。

49.根据权利要求48所述的组合物，其中所述第一相比所述第二相极性更小。

50.一种根据权利要求48或权利要求49所述的组合物，其中所述第一相是非极性相，而所述第二相是极性相。

51.根据权利要求48至50中任意一项所述的组合物，其中所述第一相是亲油相，并且所述第二相是含水相。

52.根据权利要求48至51中任意一项所述的组合物，其中所述第二相包含非水溶剂，任选为甘油、二甲基亚砜、丙二醇或聚乙二醇。

53.一种根据权利要求48至52中任意一项所述的组合物，其中所述第一相是油或者包含油，任选地，油为橄榄油、玉米油、菜油、葵花油或石蜡油。

54.根据权利要求48至53中任意一项所述的组合物，包含乳化剂，优选表面活性剂，任选地，其中所述表面活性剂是以下各项或者包含以下各项：TWEEN、SPAN、泊洛沙姆或聚甘油聚蓖麻油酸酯。

55.一种用于产生抗微生物活性的组合物，包含：油；乳化剂；能够转化底物以释放过氧化氢的酶；和包含酶的底物的物质。

56.根据权利要求55所述的组合物，包含非水溶剂。

57.根据权利要求56所述的组合物，其中所述非水溶剂是极性溶剂。

58.根据权利要求56或权利要求57所述的组合物，其中所述非水溶剂是有机溶剂。

59.根据权利要求56至58中任意一项所述的组合物，其中所述非水溶剂是以下各项或者包含以下各项：甘油、二甲基亚砜、丙二醇或聚乙二醇。

60.根据权利要求55至59中任意一项所述的组合物，其中所述油是以下各项或者包含以下各项：橄榄油、玉米油、菜油、葵花油或石蜡油。

61.根据权利要求55至60中任意一项所述的组合物，其中所述乳化剂是表面活性剂或者包含表面活性剂。

62.根据权利要求61所述的组合物，其中所述表面活性剂是以下各项或者包含以下各项：TWEEN、SPAN、泊洛沙姆或聚甘油聚蓖麻油酸酯。

63.根据权利要求48至62中任意一项所述的组合物，其中所述酶对于可能存在于所述物质中的能够转化底物以释放过氧化氢的任何酶活性是附加的。

64.根据权利要求48至63中任意一项所述的组合物，所述组合物不包含足够的游离水以使得所述酶转化所述底物。

65.根据权利要求48至64中任意一项所述的组合物，所述组合物是储存稳定的。

66.根据权利要求48至65中任意一项所述的组合物，在稀释所述组合物之后，所述组合物在至少二十四小时的时间段提供小于2mmol/L的水平的过氧化氢的持续释放。

67.根据权利要求48至66中任意一项所述的组合物，所述组合物在至少24小时的时间段提供至少0.1、0.5、1或1.5mmol/L的过氧化氢的持续释放。

68.根据权利要求48至67中任意一项所述的组合物，其中所述酶是纯化的酶。

69.根据权利要求48至68中任意一项所述的组合物，其中所述酶是氧化还原酶，优选葡萄糖氧化酶。

70.根据权利要求48至69中任意一项所述的组合物，其中所述物质缺乏过氧化氢酶活性。

71.根据权利要求48至70中任意一项所述的组合物，其中所述物质是未精制的物质，如未精制的天然物质。

72.根据权利要求48至71中任意一项所述的组合物，其中所述物质是糖物质，优选包含葡萄糖。

73.根据权利要求48至72中任意一项所述的组合物，其中所述物质是蜂蜜或者包含蜂蜜。

74.根据权利要求48至70中任意一项所述的组合物，其中所述物质包含所述酶的纯化的底物，优选包含纯化的糖，如纯化的葡萄糖。

75.根据权利要求48至74中任意一项所述的组合物，包含10-60％，优选20-50％，更优选35-45％(w/w)的非水溶剂。

76.根据权利要求48至75中任意一项所述的组合物，包含10-40％，优选20-30％(w/w)的油。

77.根据权利要求48至76中任意一项所述的组合物，包含1-10％，优选1-5％(w/w)的乳化剂。

78.根据权利要求48至77中任意一项所述的组合物，包含10-50％，优选地，更优选20-40％(w/w)的物质，所述物质包含所述酶的底物。

79.根据权利要求48至74中任意一项所述的组合物，包含20-50％(w/w)的非水溶剂，20-30％(w/w)的油，1-5％(w/w)的乳化剂和20-40％(w/w)的包含所述酶的底物的物质。

80.根据权利要求48至74中任意一项所述的组合物，包含10-60％(w/w)的非水溶剂，10-40％(w/w)的油，1-10％(w/w)的乳化剂和10-50％(w/w)的包含所述酶的底物的物质。

81.根据权利要求48至74中任意一项所述的组合物，包含35-45％(w/w)的非水溶剂，20-30％(w/w)的油，1-5％(w/w)的乳化剂和25-35％(w/w)的包含所述酶的底物的物质。

82.根据权利要求48至74中任意一项所述的组合物，其中所述第一相与所述第二相的比例≤1:1(v/v)。

83.根据权利要求82所述的组合物，其中所述第一相与所述第二相的比例<0.6:1(v/v)。

84.根据权利要求82所述的组合物，其中所述第一相与所述第二相的比例≤0.4:1(v/v)。

85.根据权利要求48至74或82至84中任意一项所述的组合物，其中所述第一相以小于所述组合物的60％(v/v)存在。

86.根据权利要求85所述的组合物，其中所述第一相以所述组合物的10％至小于60％(v/v)存在。

87.根据权利要求85所述的组合物，其中所述第一相以所述组合物的10％至小于40％(v/v)存在。

88.根据权利要求85所述的组合物，其中所述第一相以所述组合物的10％至小于30％(v/v)存在。

89.根据权利要求85所述的组合物，其中所述第一相以所述组合物的10％至小于25％(v/v)存在。

90.根据权利要求48至74或82至89中任意一项所述的组合物，所述组合物包含乳化剂，其中所述乳化剂以所述组合物的最高至25％(v/v)存在。

91.根据权利要求90所述的组合物，其中所述乳化剂以所述组合物的1-25％(v/v)存在。

92.根据权利要求90所述的组合物，其中所述乳化剂以所述组合物的5-25％(v/v)存在。

93.根据权利要求90所述的组合物，其中所述乳化剂以所述组合物的10-25％(v/v)存在。

94.根据权利要求48至74或82至93中任意一项所述的组合物，其中包含酶的底物的所述物质的量与所述第二相的体积的比例为0.5:1至2:1。

95.根据权利要求94所述的组合物，其中包含酶的底物的所述物质的量与所述第二相的体积的比例是1:1。

96.根据权利要求48至74或82至95中任意一项所述的组合物，其中所述组合物中的包含酶的底物的所述物质的量占所述组合物的最高至70％(w/v)。

97.根据权利要求96所述的组合物，其中所述组合物中的包含酶的底物的所述物质的量占所述组合物的5-70％(w/v)。

98.根据权利要求96所述的组合物，其中所述组合物中的包含酶的底物的所述物质的量占所述组合物的10-70％(w/v)。

99.根据权利要求96所述的组合物，其中所述组合物中的包含酶的底物的所述物质的量占所述组合物的20-70％(w/v)。

100.根据权利要求96所述的组合物，其中所述组合物中的包含酶的底物的所述物质的量占所述组合物的30-70％(w/v)。

101.根据权利要求48至100中任意一项所述的组合物，所述组合物为乳液，优选地，其中所述乳液包含反胶束。

102.根据权利要求101所述的组合物，其中所述反胶束由所述第二相形成。

103.根据权利要求48至102中任意一项所述的组合物，其中所述酶和包含酶的底物的所述物质溶于所述第二相中。

104.根据权利要求48至103中任意一项所述的组合物，其中所述第一相是石蜡油或者包含石蜡油。

105.根据权利要求48至104中任意一项所述的组合物，其中所述第二相是甘油或者包含甘油。

106.根据权利要求48至105中任意一项所述的组合物，其中所述乳化剂是聚甘油聚蓖麻油酸酯(PGPR)或者包含聚甘油聚蓖麻油酸酯。

107.根据权利要求48至106中任意一项所述的组合物，其中能够转化底物以释放过氧化氢的所述酶是纯化的葡萄糖氧化酶或者包含纯化的葡萄糖氧化酶，并且包含酶的底物的所述物质是蜂蜜或者包含蜂蜜。

108.根据权利要求48至106中任意一项所述的组合物，其中能够转化底物以释放过氧化氢的所述酶是纯化的葡萄糖氧化酶或者包含纯化的葡萄糖氧化酶，并且包含酶的底物的所述物质是纯化的葡萄糖或者包含纯化的葡萄糖。

109.根据权利要求48至108中任意一项所述的组合物，所述组合物是乳膏。

110.根据权利要求48-109中任意一项所述的组合物，所述组合物还包含增粘剂。

111.根据权利要求110所述的组合物，其中所述增粘剂是水胶体或者包含水胶体。

112.根据权利要求111所述的组合物，其中所述水胶体是多糖或者包含多糖。

113.根据权利要求111或112所述的组合物，其中所述水胶体是水胶体增稠剂或者包含水胶体增稠剂。

114.根据权利要求113所述的组合物，其中所述水胶体增稠剂是淀粉、改性淀粉、黄原胶、半乳甘露聚糖(如瓜尔豆胶、刺槐豆胶和他拉胶)、阿拉伯胶或阿拉伯树胶、刺梧桐树胶、黄蓍胶、魔芋胶，或纤维素衍生物，如羧甲基纤维素、甲基纤维素或羟丙基甲基纤维素。

115.根据权利要求111或112所述的组合物，其中所述水胶体是交联的水胶体或者包含交联的水胶体。

116.根据权利要求115所述的组合物，其中所述交联的水胶体是交联的多糖。

117.根据权利要求116所述的组合物，其中所述交联的多糖是交联的海藻酸盐、果胶、角叉菜胶、明胶、结冷胶、琼脂、琼脂糖、改性淀粉或纤维素衍生物，如甲基纤维素或羟丙基甲基纤维素。

118.根据权利要求115或116所述的组合物，其中所述水胶体的分子通过阳离子交联。

119.根据权利要求118所述的组合物，其中所述水体是海藻酸盐、角叉菜胶或果胶。

120.根据权利要求119所述的组合物，其中所述水胶体是通过钙离子交联的海藻酸盐。

121.一种制备组合物的方法，所述方法包括混合以下各项以形成所述组合物：第一组分、第二组分、能够转化底物以释放过氧化氢的酶和包含酶的底物的物质，其中所述第一组分和第二组分不混溶。

122.一种制备组合物的方法，包括混合以下各项以形成所述组合物：油、能够转化底物以释放过氧化氢的酶和包含酶的底物的物质。

123.根据权利要求121或122所述的方法，包括混合非水溶剂。

124.一种制备权利要求48至120中任意一项所述的组合物的方法，所述方法包括将以下各项在高剪切速率下混合足够的时间以形成乳液：酶、包含酶的底物的物质、第二相的液体、第一相的液体和任选的乳化剂。

125.根据权利要求124所述的方法，其中先将所述酶、包含酶的底物的所述物质、所述第二相的液体和所述第一相的液体在高剪切速率下预混合，然后将预混合的成分与乳化剂接触，并且将包含所述预混合的成分和所述乳化剂的混合物在高剪切速率下混合。

126.根据权利要求124或125所述的方法，其中先将酶和包含酶的底物的物质溶解在所述第二相的液体中以形成溶液，然后使所述溶液与所述第一相的液体接触。

127.根据权利要求124至126中任意一项所述的方法，其中所述高剪切速率是1000 1/s至4000 1/s。

128.根据权利要求124至127中任意一项所述的方法，其中所述高剪切速率是>2500 1/s至3500 1/s。

129.根据权利要求124至128中任意一项所述的方法，其中所述混合在20℃至40℃下进行。

130.根据权利要求124至129中任意一项所述的方法，其中所述混合在35℃至40℃下进行。

131.根据权利要求124至130中任意一项所述的方法，其中所述混合在38℃至40℃下进行。

132.根据权利要求124至131中任意一项所述的方法，其中将所述酶、包含酶的底物的所述物质、所述第二相的液体、所述第一相的液体和所述乳化剂(如果存在的话)在高剪切速率下混合至少5分钟。

133.根据权利要求124至132中任意一项所述的方法，其中将所述酶、包含酶的底物的所述物质、所述第二相的液体、所述第一相的液体和所述乳化剂(如果存在的话)在高剪切速率下混合5至30分钟。

134.根据权利要求124至133中任意一项所述的方法，所述方法还包括将增粘剂与所述酶、包含酶的底物的所述物质、所述第二相的液体、所述第一相的液体和所述乳化剂(如果存在的话)在高剪切速率下混合，以形成乳膏。

135.根据权利要求134所述的方法，其中所述增粘剂是水胶体或者包含水胶体。

136.根据权利要求135所述的方法，其中所述水胶体是多糖或者包含多糖。

137.根据权利要求135或136所述的方法，其中所述水胶体是水胶体增稠剂或者包含水胶体增稠剂。

138.根据权利要求137所述的方法，其中所述水胶体增稠剂是淀粉、改性淀粉、黄原胶、半乳甘露聚糖(如瓜尔豆胶、刺槐豆胶和他拉胶)、阿拉伯胶或阿拉伯树胶、刺梧桐树胶、黄蓍胶、魔芋胶，或纤维素衍生物，如羧甲基纤维素、甲基纤维素或羟丙基甲基纤维素。

139.根据权利要求135或136所述的方法，其中所述水胶体是水胶体胶凝剂或者包含水胶体胶凝剂。

140.根据权利要求139所述的方法，其中所述水胶体胶凝剂包括海藻酸盐、果胶、角叉菜胶、明胶、结冷胶、琼脂、琼脂糖、改性淀粉或纤维素衍生物，如甲基纤维素或羟丙基甲基纤维素。

141.根据权利要求139或140所述的方法，其中所述水胶体胶凝剂能够在阳离子存在下，通过离子凝胶形成凝胶，并且其中，所述方法还包括将阳离子与以下各项在高剪切速率下混合以形成乳膏：所述水胶体胶凝剂、所述酶、包含酶的底物的所述物质、所述第二相的液体、所述第一相的液体和所述乳化剂(如果存在的话)。

142.根据权利要求141所述的方法，其中将所述水胶体胶凝剂、所述酶、包含酶的底物的所述物质、所述第二相的液体、所述第一相的液体和所述乳化剂(如果存在的话)混合以形成混合物，然后使阳离子与所述混合物接触。

143.根据权利要求142所述的方法，其中所述阳离子在非水溶液，如乙醇或乙酸中提供。

144.根据权利要求141至143中任意一项所述的方法，其中所述阳离子是钙离子或者包含钙离子。

145.根据权利要求141至144中任意一项所述的方法，其中所述水胶体胶凝剂在与所述第一相的液体接触之前，先与所述第二相的液体、所述酶和包含酶的底物的所述物质接触。

146.根据权利要求141至145中任意一项所述的方法，其中所述水胶体胶凝剂是海藻酸盐、角叉菜胶或果胶，或者包含海藻酸盐、角叉菜胶或果胶。

147.根据权利要求146所述的方法，其中所述水胶体胶凝剂是海藻酸盐或者包含海藻酸盐。

148.根据权利要求141至147中任意一项所述的方法，其中所述水胶体胶凝剂在含水溶液中提供，并且所述第二相为甘油，其中甘油的存在量足以结合所述组合物中的游离水，并且从而防止所述酶从包含酶的底物的所述物质中催化释放过氧化氢。

149.一种药物组合物，包含根据权利要求48至120中任意一项所述的组合物和药学上可接受的载体赋形剂或稀释剂。

150.根据权利要求48至120中任意一项所述的组合物或根据权利要求149所述的药物组合物，用于作为药物的用途。

151.根据权利要求48至120中任意一项所述的组合物或根据权利要求149所述的药物组合物，用于在预防或治疗微生物感染中的用途。

152.根据权利要求48至120中任意一项所述的组合物或根据权利要求149所述的药物组合物在制备用于预防或治疗微生物感染的药物中的用途。

153.一种预防或治疗微生物感染的方法，所述方法包括将有效量的根据权利要求48至120中任意一项所述的组合物或根据权利要求149所述的药物组合物给药至需要这种治疗的受试者。

154.根据权利要求151所述的组合物，根据权利要求152所述的用途或根据权利要求153所述的方法，其中所述微生物感染为：鼻腔感染，如窦炎或鼻窦炎；呼吸道感染，如上呼吸道感染(例如扁桃体炎、喉炎或窦炎)或下呼吸道感染(例如支气管炎、肺炎、细支气管炎或肺结核)；与慢性阻塞性肺病(COPD)、囊肿性纤维化、支气管扩张症、哮喘相关的感染或者与HIV/AIDS相关的呼吸道感染或者与晚期疾病相关的呼吸道感染。