CN107841525B - 注射用骨肽对类风湿关节炎的生物活性的质控方法及质控标准 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种注射用骨肽对类风湿关节炎的生物活性的质控方法及质控标准，涉及药物质量控制领域。其包括：采用MTT法检测注射用骨肽对类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞的抑制活性；采用CCK‑8法检测注射用骨肽对单核巨噬细胞的抑制活性；以及采用量反应平行线法，评估注射用骨肽对类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞以及对单核巨噬细胞的生物效价、可信限率。该方法的可重复性高、且操作简单，检测迅速、准确，不仅补充了注射用骨肽的质量控制方法，而且能够更加直观地反映出药物的生物效应及质量。利用该方法形成的注射用骨肽的质控标准，有助于更加全面综合地保证药品的安全性、有效性和质量可控性。

Description

注射用骨肽对类风湿关节炎的生物活性的质控方法及质控 标准

技术领域

本发明涉及药物质量控制领域，具体而言，涉及一种注射用骨肽对类风湿关节炎的生物活性的质控方法及质控标准。

背景技术

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是临床常见的慢性炎性自身免疫性疾病，以多关节炎症、滑膜增生和骨侵蚀为基本特征，表现为对称性周围性多关节炎，最终导致关节破坏、功能残疾。受累关节成纤维样滑膜细胞的异常增殖是RA区别于其他关节炎症的特征性改变。研究表明骨肽能够调节骨代谢，抑制炎症侵蚀，并能有效缓解疼痛、僵硬等症状。

注射用骨肽属于多肽类药物，从其成产到临床应用的过程中，常用的质控方法主要为理化鉴定方法。目前还没有对其生物活性进行有效评价的方法，尤其对于骨肽“类风湿关节炎”这一适应症的生物活性更是缺乏质量控制。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种注射用骨肽对类风湿关节炎的生物活性的质控方法，该方法的可重复性高、且操作简单，检测迅速、准确，不仅补充了注射用骨肽的质量控制方法，而且能够更加直观地反映出药物的生物效应及质量。

本发明的第二目的在于提供一种注射用骨肽对类风湿关节炎的生物活性的质控标准，使用该质控标准，有助于更加全面综合地保证药品的安全性、有效性和质量可控性。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种注射用骨肽对类风湿关节炎的生物活性的质控方法，其包括：

采用MTT法检测注射用骨肽对类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞的抑制活性；

采用量反应平行线法，评估注射用骨肽对类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞的生物效价、可信限率。

一种注射用骨肽对类风湿关节炎的生物活性的质控标准，其包括：注射用骨肽对类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞的生物效价在88～109U·mL^-1，可信限率小于10％为合格。

一种注射用骨肽对类风湿关节炎的生物活性的质控方法，其包括：

采用CCK-8法检测注射用骨肽对单核巨噬细胞的抑制活性；以及

采用量反应平行线法，评估注射用骨肽对单核巨噬细胞的生物效价、可信限率。

一种注射用骨肽对类风湿关节炎的生物活性的质控标准，其包括：注射用骨肽对单核巨噬细胞的生物效价在67～115U·mL^-1，可信限率小于20％为合格。

与现有技术相比，本发明的有益效果例如包括：

本发明提供的这种注射用骨肽对类风湿关节炎的生物活性的质控方法，通过测定注射用骨肽对类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞(MH7A)、单核巨噬细胞(THP-1)的抑制活性，得到注射用骨肽的生物效价，能够更加直观地反映出药物的生物效应及质量，且该方法的可重复性高、操作简单，可用于作为注射用骨肽的质控标准，有助于更加全面综合地保证药品的安全性、有效性和质量可控性。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

注射用骨肽属于多肽类药物，从其成产到临床应用的过程中，常用的质控方法主要为理化鉴定方法，而没有对其生物活性进行有效控制，仅通过理化鉴定方法，难以较为准确的反应该多肽药物的生物活性。因此，本实施方式提供一种注射用骨肽对类风湿关节炎的生物活性的质控标准及质控方法，以注射用骨肽对类风湿关节炎的生物效应为基础，从而达到控制注射用骨肽质量的作用。

该质控方法为MH7A法，其包括：

采用MTT法检测注射用骨肽对类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞(MH7A)的抑制活性；然后再采用量反应平行线法，评估所述注射用骨肽对所述类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞的生物效价、可信限率。

MH7A细胞，为风湿性关节炎滑膜成纤维细胞，此细胞系是由RA患者的滑膜成纤维细胞经SV40T抗原基因转染转化而成的不死性细胞系。针对注射用骨肽对类风湿性关节炎的治疗作用，本实施方式以注射用骨肽对MH7A增殖作用的抑制作用来评价其生物效应。

注射用骨肽对类风湿关节炎的生物活性的质控标准为：注射用骨肽对MH7A的生物效价在88～109U·mL^-1，可信限率小于10％为合格。该生物效价、可信限率是按照《中国药典》量反应平行线测定(2.2)法计算得到的，准确度高。

进一步地，采用MTT法检测注射用骨肽对类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞的抑制活性的方法包括：

a.取对数生长期的类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞，胰蛋白酶消化后，调整细胞悬液浓度为1×10⁵～1×10⁶个/mL，或者为1×10⁵个/mL，接种；

可选的，所述对数生长期的类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞的培养方法包括：将类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞培养于含7～13％(或者含8～12％、或者含10％)的胎牛血清、80～120U·mL^-1(或者为90～110U·mL^-1，或者为100U·mL^-1)的抗生素的培养液中。可选的，所述抗生素包括青霉素、链霉素。

b.在接种后的所述细胞悬液中加入浓度为3～6g/L(或者为4～5g/L，或者为4g/L)的注射用骨肽溶液，培养45～50h，或者培养48h。

进一步地，还包括：将所述细胞悬液与所述注射用骨肽溶液混合培养结束后的培养液，与MTT溶液混合，染色3～5h，或者染色4h后，检测波长为480～500nm处、或者490nm处的吸光度值。

该质控标准包括：

注射用骨肽对MH7A的生物效价在88～109U·mL^-1，可信限率小于10％为合格。

该质控方法为THP-1法，其包括：

采用CCK-8法检测所述注射用骨肽对单核巨噬细胞的抑制活性；然后再采用量反应平行线法，评估所述注射用骨肽对所述单核巨噬细胞的生物效价、可信限率。

单核巨噬细胞(THP-1)的异常的过度活化在强直性脊柱炎、类风湿关节炎以及系统性红斑狼疮等自身免疫系统疾病的发生与发展的过程中扮演着重要的角色。炎性反应是机体的重要防御机制。在炎性反应发生初期，巨噬细胞受到刺激会被激活，分泌MCP-1和IL-6，MCP-1和IL-6可特异性地作用于单核细胞及细胞信号传导激活核因子-κB(NuclearFactor，NF-κB)，造成单核细胞的进一步募集和活化，进而释放更多的炎性介质，导致炎症的进一步发展。本实施方式以注射用骨肽对MH7A增殖作用的抑制作用来评价其生物效应。

注射用骨肽对类风湿关节炎的生物活性的质控标准为：注射用骨肽对THP-1的生物效价在67～115U·mL^-1，可信限率小于20％为合格。该生物效价、可信限率是按照《中国药典》量反应平行线测定(2.2)法计算得到的，准确度高。

进一步地，采用CCK-8法检测所述注射用骨肽对单核巨噬细胞的抑制活性包括：

a.取对数生长期的单核巨噬细胞，胰蛋白酶消化后，调整细胞悬液浓度为4×10⁵～4×10⁶个/mL，或者为4×10⁵个/mL，接种；

可选的，所述对数生长期的单核巨噬细胞的培养方法包括：将单核巨噬细胞培养于含7～13％(或者含8～12％、或者含10％)的胎牛血清、80～120U·mL^-1(或者为90～110U·mL^-1，或者为100U·mL^-1)抗生素的培养液中。

b.在接种后的所述细胞悬液中加入浓度为2～4g/L(或者为3g/L)的注射用骨肽溶液，培养20～30h，或者培养24h。

进一步地，还包括：将所述细胞悬液与所述注射用骨肽溶液混合培养结束后的培养液，与CCK-8溶液混合，染色1～1.5h，或者染色1.25h后，检测波长为440～460nm、620～640nm，或者检测波长为450nm、630nm处的吸光度值。

该质控标准包括：

注射用骨肽对THP-1的生物效价在67～115U·mL^-1，可信限率小于20％为合格。

本实施方式提供的这种注射用骨肽对类风湿关节炎的生物活性的质控标准，有助于更加全面综合地保证药品的安全性、有效性和质量可控性。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述：

实施例1

本实施例提供注射用骨肽对类风湿关节炎的生物活性的质控方法，其包括：

采用MTT法检测注射用骨肽对类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞(MH7A)的抑制活性：

1.试剂及药液的配制

噻唑蓝(MTT)溶液：精密称取250mg MTT，以50mL PBS(0.01mol·L-1，pH7.4)溶解，0.22μm微孔滤膜过滤除菌后，分装，4℃避光保存。两周内有效。

注射用骨肽溶液：取注射用骨肽冻干粉1支(10mg)，加入1640完全培养液500μL溶解，配成20g·L-1的注射用骨肽母液，再用1640完全培养基稀释至工作浓度。每次实验现用现配。

2.细胞培养

MH7A细胞培养于10％FBS 1640完全培养液(含10％胎牛血清，100U·mL-1青/链霉素)中，置于37℃、5％CO2及饱和湿度的培养箱中培养，取对数生长期细胞进行实验。

3.注射用骨肽对MH7A增殖的抑制作用测定

取对数生长期的MH7A细胞，胰蛋白酶消化后，调整细胞悬液浓度为1×10⁵个/mL，接种于96孔培养板中，药物组与细胞对照组每孔加入100μL细胞悬液，空白对照组每孔加入100μL1640完全培养液，每组4孔。置于37℃、5％CO2及饱和湿度的培养箱中培养48h。药物组每孔加入含药培养液100μL，达到所需药物终浓度，空白对照组与细胞对照组每孔加入100μL的培养液，置于培养箱中继续培养。培养结束后，毎孔加入MTT溶液20μL，使其终浓度达0.5g·L-1。染色4小时后弃去孔中培养液，毎孔加入150μLDMSO，振荡混匀，在酶标仪490nm的波长处测定其吸光度值，计算抑制指数。

采用刺激指数来评价注射用骨肽对细胞增殖的影响。细胞对照组的抑制指数为1.00，故规定药物对细胞抑增殖作用的抑制指数不得小于1.00。

4.注射用骨肽生物活性测定

(1)注射用骨肽抑制MH7A增殖的量效关系考察

分别将不同浓度的注射用骨肽溶液100μL与MH7A细胞在37℃共孵育48h，检测吸光度值，考察药物抑制MH7A增殖的生物活性。

(2)标准对照物质的确定

经过测算，选用活性较强批次的药物作为标准对照组，参与注射用骨肽效价的测定。取标准对照组注射用骨肽溶液，以1640完全培养液精确稀释为含注射用骨肽浓度为2.8,4.0g·L^-1的2个稀释液，剂间比0.7，作为对照品组(S)。

注射用骨肽溶液，用1640完全培养液精确稀释为2.8,4.0g·L-1的2个不同质量分数稀释液，剂间比0.7，作为供试品组(T)。

依第3项下方法，平行测定3次，分别测定两组OD值。按《中国药典》(2010版)生物检定统计法中量反应平行线(2·2)法，使用统计软件BS2000进行统计学处理，S效价设为100U·mL-1，计算T组的效价(PT)和可信限率(FL％)并对结果可靠性进行统计学检验。

5.结果分析：

采用A01160406批次注射用骨肽作为标准对照物质，根据药典要求，选取3个不同批次注射用骨肽，每个批次重复测定5次，使用BS2000软件对5次结果合并计算，结果如表1所示：

表1.注射用骨肽对MH7A的抑制活性

由此，可将注射用骨肽对类风湿关节炎的生物活性的质控标准定为：注射用骨肽对MH7A的生物效价在88～109U·mL^-1，可信限率小于10％为合格。

实施例2

本实施例提供注射用骨肽对类风湿关节炎的生物活性的质控方法，其包括：

采用CCK-8法检测注射用骨肽对人单核巨噬细胞(THP-1)的抑制活性：

1.试剂及药液的配制

注射用骨肽溶液：取注射用骨肽冻干粉1支(10mg)，加入1640完全培养液500μL溶解，配成20mg·mL-1的注射用骨肽母液，再用1640完全培养基稀释至工作浓度。每次实验现用现配。

2.细胞培养

THP-1细胞培养于1640完全培养液(含10％胎牛血清，100U·mL-1青/链霉素)中，置于37℃、5％CO2及饱和湿度的培养箱中培养，取对数生长期细胞进行后续实验。

3.注射用骨肽对LPS诱导的THP-1增殖的抑制作用测定

取对数生长期的THP-1，调整细胞浓度为4×10⁵个/mL，接种于96孔培养板中，每孔加入100μL细胞悬液，100μL注射用骨肽药液，达到所需药物终浓度，每个浓度设置4个复孔。在37℃、5％CO2培养箱中培养24h后，每孔加入10μL CCK-8，CCK-8作用1.25h后，在酶标仪450nm、630nm波长处测定其吸收度值，计算抑制指数。

采用抑制指数来评价注射用骨肽对细胞增殖的影响。细胞对照组的抑制指数为1.00，故规定药物对细胞抑增殖作用的抑制指数不得小于1.00。

4.注射用骨肽生物活性测定

(1)注射用骨肽抑制THP-1增殖的量效关系考察

分别将不同浓度的注射用骨肽溶液100μL与THP-1细胞在37℃共孵育24h，检测吸光度值，考察药物抑制THP-1增殖的生物活性。

(2)标准对照物质的确定

经过测算，选用活性较强批次的药物作为标准对照组，参与注射用骨肽效价的测定。取标准对照组注射用骨肽溶液，以1640完全培养液精确稀释为含注射用骨肽浓度为2.1,3.0g·L-1的2个稀释液，剂间比0.7，作为对照品组(S)。

注射用骨肽溶液，用1640完全培养液精确稀释为2.1,3.0g·L-1的2个不同质量分数稀释液，剂间比0.7，作为供试品组(T)。

依第3项下方法，平行测定4次，分别测定两组OD值。按《中国药典》(2010版)生物检定统计法中量反应平行线(2·2)法，使用统计软件BS2000进行统计学处理，S效价设为100U·mL-1，计算T组的效价(PT)和可信限率(FL％)并对结果可靠性进行统计学检验。

5.结果分析：

选择A01160410批次注射用骨肽作为标准对照品，根据药典要求，选取3个不同批次注射用骨肽，每个批次重复测定4次，使用BS2000软件对4次结果合并计算，结果如表2所示：

表2.注射用骨肽对THP-1的抑制活性

由此，可将注射用骨肽对类风湿关节炎的生物活性的质控标准定为：注射用骨肽对THP-1的生物效价在67～115U·mL^-1，可信限率小于20％为合格。

综上所述，本发明提供的这种注射用骨肽对类风湿关节炎的生物活性的质控方法，通过测定注射用骨肽对类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞(MH7A)、单核巨噬细胞(THP-1)的抑制活性，得到注射用骨肽的生物效价，能够更加直观地反映出药物的生物效应及质量，且该方法的可重复性高、操作简单，可用于作为注射用骨肽的质控标准，有助于更加全面综合地保证药品的安全性、有效性和质量可控性。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (10)

1.一种检测注射用骨肽对类风湿关节炎的生物活性的方法，所述方法以非疾病的诊断为目的，其特征在于，其包括：

采用MTT法检测注射用骨肽对类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞的抑制活性；

采用量反应平行线法，评估所述注射用骨肽对所述类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞的生物效价、可信限率。

2.根据权利要求1所述的检测注射用骨肽对类风湿关节炎的生物活性的方法，其特征在于，采用MTT法检测注射用骨肽对类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞的抑制活性的方法包括：

取对数生长期的类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞，胰蛋白酶消化后，调整细胞悬液浓度为1×10⁵~1×10⁶个/mL，接种；

在接种后的所述细胞悬液中加入浓度为3~6g/L的注射用骨肽溶液，培养45~50 h。

3.根据权利要求2所述的检测注射用骨肽对类风湿关节炎的生物活性的方法，其特征在于，所述对数生长期的类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞的培养方法包括：将类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞培养于含7~13%的胎牛血清、80~120 U•mL^-1抗生素的培养液中。

4.根据权利要求2所述的检测注射用骨肽对类风湿关节炎的生物活性的方法，其特征在于，采用MTT法检测注射用骨肽对类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞的抑制活性的方法还包括：将所述细胞悬液与所述注射用骨肽溶液混合培养结束后的培养液，与MTT溶液混合，染色3~5h后，检测波长为480~500nm处吸光度值。

5.根据权利要求1-4任一项所述的检测注射用骨肽对类风湿关节炎的生物活性的方法，其特征在于，其包括：注射用骨肽对类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞的生物效价在88~109U•mL^-1，可信限率小于10%为合格。

6.一种检测注射用骨肽对类风湿关节炎的生物活性的方法，其特征在于，所述方法以非疾病的诊断为目的，其包括：

采用CCK-8法检测所述注射用骨肽对单核巨噬细胞的抑制活性；以及

采用量反应平行线法，评估所述注射用骨肽对所述单核巨噬细胞的生物效价、可信限率。

7.根据权利要求6所述的检测注射用骨肽对类风湿关节炎的生物活性的方法，其特征在于，采用CCK-8法检测所述注射用骨肽对单核巨噬细胞的抑制活性包括：

取对数生长期的单核巨噬细胞，胰蛋白酶消化后，调整细胞悬液浓度为4×10⁵~4×10⁶个/mL，接种；

在接种后的所述细胞悬液中加入浓度为2~4g/L的注射用骨肽溶液，培养20~30 h。

8.根据权利要求7所述的检测注射用骨肽对类风湿关节炎的生物活性的方法，其特征在于，所述对数生长期的单核巨噬细胞的培养方法包括：将单核巨噬细胞培养于含7~13%的胎牛血清、80~120 U•mL^-1抗生素的培养液中。

9.根据权利要求7所述的检测注射用骨肽对类风湿关节炎的生物活性的质控方法，其特征在于，将所述细胞悬液与所述注射用骨肽溶液混合培养结束后的培养液，与CCK-8溶液混合，染色1~1.5h后，检测波长为440~460nm和620~640nm处吸光度值。

10.根据权利要求6-9任一项所述的检测注射用骨肽对类风湿关节炎的生物活性的方法，其包括：注射用骨肽对单核巨噬细胞的生物效价在67~115U•mL^-1，可信限率小于20%为合格。