CN107827905A - 一种从产毒藻类培养液中提取纯化贝类毒素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种从产毒藻类培养液中提取纯化贝类毒素的方法,包括滤膜过滤、吸附脱盐、萃取和柱层析四个步骤,萃取剂包括正己烷、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇,正相硅胶洗脱液包括乙酸乙酯、正己烷和氯仿,反相硅胶洗脱液包括水、正丁醇、乙腈和甲醇,高效液相色谱洗脱液包括乙腈和甲醇,通过优化工艺流程,合理选择萃取剂及洗脱剂,各步骤协同增效,综合提高了产物的产量和纯度,产量达到2.69g,纯度达到99%。该方法简洁高效,节省成本,产量和纯度较高,有利于工业上的大规模应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,主要涉及一种从产毒藻类培养液中提取纯化贝类毒素的方法。
背景技术
海洋毒素是由海洋中的有毒藻类通过食物链传递给藻食性的鱼、虾及贝类等生物,并在其体内蓄积形成的有毒高分子化合物。海洋毒素种类繁多,其中贝类毒素是危害较大者之一。贝类毒素包括麻痹性贝类毒素、腹泻性贝类毒素、神经性贝类毒素和健忘性贝类毒素。贝类毒素危害具有突发性和广泛性,具有强毒性和不可预见性等特点,由于其毒性大、反应快、无适宜解毒剂,给防治带来了许多困难,贝类毒素对消费者健康安全和近海生态带来严重威胁,是国际社会共同关注的生态灾害和重大海洋环境问题,因此,贝类毒素的研究具有重要意义。
目前,贝类毒素也是海洋生物活性物质中研究、开发进展最为迅速的领域之一,部分贝类毒素在开发抗癌、镇疼、麻醉、抗病毒、抗菌等各种治疗药物方面有着非常广阔的应用前景。但是,由于自然环境中的贝类毒素的密度非常低,其毒素主要是通过贝类或鱼类的摄食富集达到一定浓度而成,因而,毒素原材料的来源困难极大程度地制约了毒素的进一步深入研究。目前,获得大量贝类毒素的途径之一是从天然环境中分离产毒藻种,并在实验室进行纯系的大规模培养,从中提取贝类毒素。
CN 106119117 A公开了一种原多甲藻酸毒素的产毒藻及其标准样品的制备与应用,从培养的产毒藻、产毒藻培养液或摄食产毒藻之后的贝类阳性样品中提取原多甲藻酸毒素,获得粗提毒素提取液:(2)将步骤(1)所述粗提毒素提取液用硅胶柱和快速色谱柱进行净化(3)将步骤(2)净化后的样品过高效液相色谱柱,冷冻干燥,制得白色固体标准样品。CN 105237543 A提供了一种纯化制备N-磺酷氨甲酷基毒素的方法。该方法包括产毒藻的培养、毒素的提取、毒素的收集与纯化等步骤。CN 1629187 A涉及一种利用藻类湿细胞直接提取与纯化藻毒素的方法。该方法包括,在一定体积的产毒藻藻细胞浓缩液中连续搅拌条件下加入一定量的100%甲醇,调节pH值至2-7,用40-400W的超声处理5-30分钟破碎藻细胞使之完全释放毒素,在高速离心机上进行固液分离,分离出的沉淀再用少量50%甲醇水溶液超声提取两遍,合并二次离心分离所得的上清液,井在65-80℃水浴中直接蒸发或在35-40℃水浴条件下利用旋转蒸发器蒸发,使总体积减少50%,然后再加入适量高品质絮凝剂使残余的细微颗粒絮凝,并在高速离心机上进行固液分离,得到的上清液过滤膜,滤液即为含有较高浓度藻毒素的可以满足一般藻毒素实验要求的水溶液。
但是采用目前的提取纯化方法获得的贝类毒素的含量较低,纯度不高,而且步骤繁琐,收率差强人意。因此,对于贝类毒素的提取纯化工艺存在进一步的改进需求,这正是本发明得以完成的动力和出发点所在。
发明内容
针对现有技术的不足和市场的需求,本发明提供一种从产毒藻类培养液中提取纯化贝类毒素的方法,主要包括滤膜过滤、吸附柱脱盐、萃取和柱层析的步骤。该方法简洁高效,节省成本,产量较高,有利于工业上的大规模应用。
第一方面,本发明提供一种从产毒藻类培养液中提取纯化贝类毒素的方法,包括如下步骤:
(1)将产毒藻类的培养液用滤膜进行过滤,得到的滤液依次经吸附树脂和洗脱液洗脱;
(2)向洗脱后的溶液加入萃取剂,萃取静置,得到萃取物;
(3)收集萃取物,经柱层析后进行色谱分离纯化得到贝类毒素。
发明人在充分研究贝类毒素的特性及提取工艺的理论基础上,通过优化工艺流程,针对贝类毒素的理化特性,合理选择萃取剂及洗脱剂,各步骤协同增效,综合提高了产物的产量和纯度,产量达到2.69g,纯度达到99%。
优选地,步骤(1)所述滤膜的孔径为0.1-0.65μM,例如可以是0.1μM、0.22μM、0.45μM或0.65μM,优选为0.22μM。
优选地,步骤(1)所述的吸附树脂为HP20、HPD-100或D-101中的任一种,优选为HP20。
优选地,步骤(1)所述的洗脱液为乙醇、甲醇或丙酮中的任一种或至少两种的组合,例如可以是乙醇和甲醇的组合,乙醇和丙酮的组合或甲醇和丙酮的组合,优选为乙醇。
优选地,所述乙醇的用量为滤液体积的2-4倍,例如可以是2倍、3倍、或4倍,优选为3倍。
优选地,步骤(2)所述的萃取剂为正己烷、氯仿、乙酸乙酯或正丁醇中的任意一种或至少两种的组合,优选为正己烷、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇。
优选地,所述萃取具体包括如下步骤:向洗脱后溶液中加入第一种萃取剂混合后静置,再加入下一种萃取剂混合静置,依次加入所有萃取剂后最终得到萃取物。
优选地,所述静置时间为10-30min,例如可以是10min、15min、20min、25min或30min,优选为20min。
优选地,步骤(3)所述柱层析包括正相硅胶柱层析、反相硅胶柱层析、离子交换柱层析或吸附柱层析中任一种或至少两种的组合,优选为正相和反相硅胶柱层析的组合。
优选地,所述正相硅胶柱层析的洗脱液包括石油醚、乙酸乙酯、正己烷、氯仿、丙酮或甲醇中的任意一种或至少两种的组合,例如可以是石油醚和乙酸乙酯的组合,石油醚和正己烷的组合,石油醚和氯仿的组合,乙酸乙酯和氯仿的组合,正己烷和丙酮的组合或乙酸乙酯、正己烷和氯仿的组合,优选为乙酸乙酯、正己烷和氯仿。
优选地,步骤(3)所述的反相硅胶柱层析的洗脱液包括水、正丁醇、乙腈和甲醇的混合液。
优选地,步骤(3)所述的色谱分离为亲和色谱、电泳色谱、气相色谱或高效液相色谱分离中的任一种或至少两种的组合,例如可以是亲和色谱和电泳色谱的组合,气相色谱和高效液相色谱的组合,优选为高效液相色谱。
优选地,所述高效液相色谱的洗脱液为乙腈和甲醇的混合液。
优选地,所述乙腈和甲醇的体积比为9:1。
作为优选技术方案,本发明所述从产毒藻类培养液中提取纯化贝类毒素的方法,包括如下步骤:
(1)将产毒藻类的培养液用滤膜进行过滤,滤膜的孔径为0.1-0.65μM,得到的滤液经HP20、HPD-100或D-101中的任一种的吸附树脂脱盐,采用乙醇、甲醇或丙酮中的任一种或至少两种的组合的洗脱液进行洗脱,洗脱液的用量为滤液体积的2-4倍;
(2)向洗脱后的溶液加入第一种萃取剂混合后静置10-30min,再加入下一种萃取剂混合静置,依次加入正己烷、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇后最终得到萃取物;
(3)收集萃取物后,经正相硅胶柱层析和反相硅胶柱层析后进行高效液相色谱分离纯化得到贝类毒素;
其中,所述正相硅胶柱层析的洗脱液包括石油醚、乙酸乙酯、正己烷、氯仿、丙酮或甲醇中的任意一种或至少两种的组合;所述反相硅胶柱层析的洗脱液包括水、正丁醇、乙腈和甲醇的混合液;所述高效液相色谱的洗脱液为体积比为9:1的乙腈和甲醇的混合液。
第二方面,本发明提供一种如第一方面所述方法提取纯化的贝类毒素。
与现有技术相比,本发明的有益效果:
本发明所提供的提取纯化方法通过对产毒藻类培养液提取纯化条件的优化,如洗脱液、柱层析及色谱分离等条件的合理优化,不仅提高了产毒藻类培养液中贝类毒素的产量和纯度,产量达到2.69g,纯度达到99%,而且提取纯化步骤简单,成本低,节省人力物力,有利于工业上的大规模应用。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果,以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案,但本发明并非局限在实施例范围内。
实施例1
一种从产毒藻类培养液中提取纯化贝类毒素的方法,包括如下步骤:
(1)将产毒藻类按照湿重50g加入到2L天然海水培养液中,培养48h后得到的培养液用0.22μM孔径的滤膜进行过滤,得到的滤液经HP20吸附树脂脱盐,采用3倍滤液体积的乙醇进行洗脱;
(2)向洗脱后的溶液加入第一种萃取剂混合后静置20min,再加入下一种萃取剂混合静置,依次加入正己烷、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇后最终得到萃取物;
(3)收集萃取物后,经正相硅胶柱层析和反相硅胶柱层析后进行高效液相色谱分离纯化得到贝类毒素,收集目标色谱峰,冷冻干燥,制得白色固体;
所述正相硅胶柱层析的洗脱液包括乙酸乙酯、正己烷和氯仿,所述反相硅胶柱层析的洗脱液包括水、正丁醇、乙腈和甲醇,所述高效液相色谱的洗脱液为体积比为9:1的乙腈和甲醇混合液。
实施例2
一种从产毒藻类培养液中提取纯化贝类毒素的方法,包括如下步骤:
(1)将产毒藻类按照湿重50g加入到2L天然海水培养液中,培养48h后得到的培养液用0.1μM孔径的滤膜进行过滤,得到的滤液经HPD-100吸附树脂脱盐,采用2倍滤液体积的甲醇进行洗脱;
(2)向洗脱后的溶液加入第一种萃取剂混合后静置20min,再加入下一种萃取剂混合静置,依次加入正氯仿、乙酸乙酯和正丁醇后最终得到萃取物;
(3)收集萃取物后,经正相硅胶柱层析和反相硅胶柱层析后进行高效液相色谱分离纯化得到贝类毒素,收集目标色谱峰,冷冻干燥,制得白色固体;
所述正相硅胶柱层析的洗脱液包括石油醚和乙酸乙酯,所述反相硅胶柱层析的洗脱液包括水、正丁醇、乙腈和甲醇,所述高效液相色谱的洗脱液为体积比为9:1的乙腈和甲醇混合液。
实施例3
一种从产毒藻类培养液中提取纯化贝类毒素的方法,包括如下步骤:
(1)将产毒藻类按照湿重50g加入到2L天然海水培养液中,培养48h后得到的培养液用0.65μM孔径的滤膜进行过滤,得到的滤液经D-101吸附树脂脱盐,采用4倍滤液体积的丙酮进行洗脱;
(2)向洗脱后的溶液加入第一种萃取剂混合后静置20min,再加入下一种萃取剂混合静置,依次加入正己烷、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇后最终得到萃取物;
(3)收集萃取物后,经正相硅胶柱层析和反相硅胶柱层析后进行高效液相色谱分离纯化得到贝类毒素,收集目标色谱峰,冷冻干燥,制得白色固体;
所述正相硅胶柱层析的洗脱液包括乙酸乙酯和氯仿,所述反相硅胶柱层析的洗脱液包括水、正丁醇、乙腈和甲醇,所述高效液相色谱的洗脱液为体积比为9:1的乙腈和甲醇混合液。
实施例4
一种从产毒藻类培养液中提取纯化贝类毒素的方法,包括如下步骤:
(1)将产毒藻类按照湿重50g加入到2L天然海水培养液中,培养48h后得到的培养液用0.65μM孔径的滤膜进行过滤,得到的滤液经D-101吸附树脂脱盐,采用4倍滤液体积的丙酮进行洗脱;
(2)向洗脱后的溶液加入第一种萃取剂混合后静置10min,再加入下一种萃取剂混合静置,依次加入正己烷和氯仿后最终得到萃取物;
(3)收集萃取物后,经正相硅胶柱层析和反相硅胶柱层析后进行高效液相色谱分离纯化得到贝类毒素,收集目标色谱峰,冷冻干燥,制得白色固体;
所述正相硅胶柱层析的洗脱液包括乙酸乙酯和氯仿,所述反相硅胶柱层析的洗脱液包括水、正丁醇、乙腈和甲醇,所述高效液相色谱的洗脱液为体积比为9:1的乙腈和甲醇混合液。
实施例5
一种从产毒藻类培养液中提取纯化贝类毒素的方法,包括如下步骤:
(1)将产毒藻类按照湿重50g加入到2L天然海水培养液中,培养48h后得到的培养液用0.65μM孔径的滤膜进行过滤,得到的滤液经D-101吸附树脂脱盐,采用4倍滤液体积的丙酮进行洗脱;
(2)向洗脱后的溶液加入第一种萃取剂混合后静置30min,再加入下一种萃取剂混合静置,依次加入乙酸乙酯和正丁醇后最终得到萃取物;
(3)收集萃取物后,经正相硅胶柱层析和反相硅胶柱层析后进行高效液相色谱分离纯化得到贝类毒素,收集目标色谱峰,冷冻干燥,制得白色固体;
所述正相硅胶柱层析的洗脱液包括乙酸乙酯和氯仿,所述反相硅胶柱层析的洗脱液包括水、正丁醇、乙腈和甲醇,所述高效液相色谱的洗脱液为体积比为9:1的乙腈和甲醇混合液。
对比例1
与实施例1相比,除了步骤(1)所述的洗脱液改为水外,其他条件与实施例1相同。
对比例2
与实施例1相比,除了步骤(2)所述萃取剂改为甲醇和乙醚外,其他条件与实施例1相同。
对比例3
与实施例1相比,除了步骤(3)所述正相硅胶柱层析的洗脱液改为甲醇,反相硅胶柱层析的洗脱液改为乙酸乙酯和氯仿外,其他条件与实施例1相同。
样品检测
将实施例及对比例得到的白色固体称重,经过质谱和核磁鉴定分子量及光谱,结果如表1所示:
表1
由表1可知,实施例1-5均能有效提取得到高产高纯度的贝类毒素,其中,实施例所提供的方案提取纯化得到的贝类毒素的产量和纯度最高,产量达到2.69g,纯度达到99%,而在对比例1、2和3中,更换了洗脱液和萃取剂后,产量和纯度均下降严重,因此表明,只有根据本发明所提供的方案及范围内才能达到提取纯化高产量和高纯度的贝壳毒素的效果。
综上所述,本发明所提供的提取纯化方法通过对产毒藻类培养液提取纯化条件的优化,洗脱液、柱层析及色谱分离等条件的合理优化,不仅提高了产毒藻类培养液中贝类毒素的产量和纯度,而且提取纯化步骤简单,成本低,节省人力物力,有利于工业上的大规模应用。
申请人声明,本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法,但本发明并不局限于上述详细方法,即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了,对本发明的任何改进,对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等,均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种从产毒藻类培养液中提取纯化贝类毒素的方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)将产毒藻类的培养液用滤膜进行过滤,得到的滤液依次经吸附树脂和洗脱液洗脱;
(2)向洗脱后的溶液中加入萃取剂,萃取静置,得到萃取物;
(3)收集萃取物,经柱层析后进行色谱分离纯化得到贝类毒素。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(1)所述滤膜的孔径为0.1-0.65μM,优选为0.22μM。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,步骤(1)所述的吸附树脂为HP20、HPD-100或D-101中的任一种,优选为HP20。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法,其特征在于,步骤(1)所述的洗脱液为乙醇、甲醇或丙酮中的任一种或至少两种的组合,优选为乙醇;
优选地,所述乙醇的用量为滤液体积的2-4倍,优选为3倍。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法,其特征在于,步骤(2)所述的萃取剂为正己烷、氯仿、乙酸乙酯或正丁醇中的任意一种或至少两种的组合,优选为正己烷、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法,其特征在于,步骤(2)所述萃取具体包括如下步骤:向洗脱后溶液中加入第一种萃取剂混合后静置,再加入下一种萃取剂混合静置,依次加入所有萃取剂后最终得到萃取物;
优选地,所述静置时间为10-30min,优选为20min。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法,其特征在于,步骤(3)所述柱层析包括正相硅胶柱层析和反相硅胶柱层析、离子交换柱层析或吸附柱层析,优选为正相和反相硅胶柱层析;
优选地,步骤(3)所述正相硅胶柱层析的洗脱液包括石油醚、乙酸乙酯、正己烷、氯仿、丙酮或甲醇中的任意一种或至少两种的组合,优选为乙酸乙酯、正己烷和氯仿;
优选地,步骤(3)所述的反相硅胶柱层析的洗脱液包括水、正丁醇、乙腈和甲醇的混合液。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法,其特征在于,步骤(3)所述的色谱分离为亲和色谱、电泳色谱、气相色谱或高效液相色谱分离中的任一种或至少两种的组合,优选为高效液相色谱;
优选地,所述高效液相色谱的洗脱液为乙腈和甲醇的混合液;
优选地,所述乙腈和甲醇的体积比为9:1。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)将产毒藻类的培养液用滤膜进行过滤,滤膜的孔径为0.1-0.65μM,得到的滤液经HP20、HPD-100或D-101中的任一种的吸附树脂脱盐,采用乙醇、甲醇或丙酮中的任一种或至少两种的组合的洗脱液进行洗脱,洗脱液的用量为滤液体积的2-4倍;
(2)向洗脱后的溶液加入第一种萃取剂混合后静置10-30min,再加入下一种萃取剂混合静置,依次加入正己烷、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇后最终得到萃取物;
(3)收集萃取物后,经正相硅胶柱层析和反相硅胶柱层析后进行高效液相色谱分离,纯化得到贝类毒素;
其中,所述正相硅胶柱层析的洗脱液包括石油醚、乙酸乙酯、正己烷、氯仿、丙酮或甲醇中的任意一种或至少两种的组合;所述反相硅胶柱层析的洗脱液包括水、正丁醇、乙腈和甲醇的混合液;所述高效液相色谱的洗脱液为体积比为9:1的乙腈和甲醇的混合液。
10.一种根据权利要求1-9任一项所述方法提取纯化的贝类毒素。
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CN106119117A (zh) * | 2016-06-12 | 2016-11-16 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 一种原多甲藻酸毒素的产毒藻及其标准样品的制备与应用 |
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
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