CN107823645B - BET抑制剂联合NF-κB抑制剂治疗结直肠癌及药物组合物 - Google Patents

BET抑制剂联合NF-κB抑制剂治疗结直肠癌及药物组合物 Download PDF

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Abstract

已证实表观遗传调控蛋白BET通过与乙酰化组蛋白结合调节关键癌基因转录，靶向抑制BET具有抗肿瘤意义。但是BET抑制剂(BET inbihitor，BETi)对于部分结直肠癌细胞系具有耐药性，阻碍了BETi的临床转化应用。本发明公开了BETi和NF‑κB抑制剂联合用于制备治疗结直肠癌药物的应用。NF‑κB抑制剂可通过药物协同效应增强BETi对结直肠癌的治疗作用。其分子机制为：药物联合作用后，促进c‑myc基因的下调，从而增加GADD45基因的转录，介导细胞凋亡增加以及细胞周期阻滞。两种抑制剂联合给药具有明显药物协同抗肿瘤作用，可作为一种新型结直肠癌的治疗方法。

Description

BET抑制剂联合NF-κB抑制剂治疗结直肠癌及药物组合物
技术领域
本发明属于医药技术领域。更具体地，涉及一种治疗结直肠癌的联合用药及其药物组合物。
背景技术
目前人们已知结直肠肿瘤的发生发展除了来自于多个基因位点的突变，还与表观遗传的异常调控密切相关，异常的DNA甲基化与组蛋白修饰作为一种可逆的生物学过程，可以成为小分子抑制剂的靶点。目前已出现多种靶向异常表观遗传调控的小分子抑制剂，其中的修饰酶(Writer)、识别酶(Reader)和去修饰酶(Eraser)等多个关键蛋白均可作为小分子抑制剂的靶点，通过逆转异常表观遗传学改变，调控肿瘤细胞增殖与分化，展现出肿瘤临床治疗意义。目前已出现多种异常表观遗传调控的小分子靶向抑制剂，展现出优异的抗肿瘤疗效、良好的靶向性与低副作用。
研究发现，BET(Bromo and extra-C terminal domain)蛋白是一类重要的表观遗传调控蛋白，与乙酰化组蛋白结合，调节关键癌基因的转录表达，与肿瘤发生发展密切相关。近年来，靶向BET蛋白的特异性抑制剂已经成为抗癌药物研究热点。BET抑制剂(BETinbibitor，BETi)已证实在多种血液肿瘤中有较好的疗效，是目前表观遗传抑制剂研究中最具临床应用前景的药物之一。目前结直肠癌中相关研究发现，BET抑制剂JQ1可通过抑制c-myc基因杀伤结直肠癌细胞。
但在实体肿瘤中BETi药物反应性并不一致，实体肿瘤对BETi的耐药现象比较普遍，阻碍了该药的临床转化应用。针对个体肿瘤耐药内在机制，寻找通过协同效应增强BETi疗效的药物联用方案，成为后续研究关键。
硼替佐米(Bortezomib，BOR)是一种20S蛋白酶体抑制剂，是美国食品和药品管理局(FDA)批准的多发性骨髓瘤及套细胞淋巴瘤的一线治疗药物，主要通过阻止IκB出核及降解从而抑制NF-κB通路发挥抗肿瘤作用。
发明内容
因此，本发明针对现有技术中结直肠癌对BETi存在耐药现象，阻碍了BETi的临床转化应用的技术问题，提供一种新的联合用药方案。申请人通过研究发现，NF-κB抑制剂与BETi联用，能在所有结直肠癌细胞系中通过药物协同效应明显增强BETi的抗肿瘤作用，并在体外以及体内动物实验中进行了验证，因此提出BETi联合NF-κB抑制剂可作为结直肠癌的新型治疗方法。本发明通过联合NF-κB抑制剂阻断NF-κB通路，可通过抑制c-myc并上调下游的GADD45基因产生药物协同作用，从而增强BETi对结直肠癌的治疗效果。
本发明的目的之一在于提供BET抑制剂和NF-κB抑制剂联合用于制备治疗结直肠癌的药物中的应用。
具体地是，所述BET抑制剂选自：JQ1、OTX015和I-BET151中的一种或几种。所述NF-κB抑制剂选自：硼替佐米和BMS34541。
更具体地是，该应用为JQ1和硼替佐米联合用于制备治疗结直肠癌的药物中的应用。
本发明的目的之二在于提供一种治疗结直肠癌的药物组合物，该药物组合物包括BET抑制剂和NF-κB抑制剂。
具体地是，所述BET抑制剂选自：JQ1、OTX015和I-BET151中的一种或几种。所述NF-κB抑制剂选自：硼替佐米和BMS34541。
更具体地是，该药物组合物包括JQ1和硼替佐米。
本发明具有以下有益效果：NF-κB抑制剂可通过药物协同效应增强BETi对结直肠癌的治疗作用。其分子机制为：药物联合作用后，促进c-myc基因的下调，从而增加GADD45基因的转录，介导细胞凋亡增加以及细胞周期阻滞。两种抑制剂联合给药具有明显药物协同抗肿瘤作用，可作为一种新型结直肠癌的治疗方法。
附图说明
图1：JQ1与硼替佐米产生药物协同作用杀伤JQ1耐药细胞系。(图1A)CCK8法检测硼替佐米与JQ1联用对LoVo、SW620、HCT116细胞系中的细胞增殖的影响，CI值评估不同联合用药的协同作用程度；(图1B)CCK8法检测硼替佐米与不同BET抑制剂(OTX015，I-BET151)联用对HCT116细胞系中的细胞增殖抑制的改变，CI值评估不同联合用药的协同作用程度；(图1C)siRNA技术同时敲除BRD2/3/4基因，CCK8法检测不同浓度硼替佐米对细胞增殖的影响。
图2：JQ1联合硼替佐米促进细胞凋亡及周期阻滞。(图2A)硼替佐米(10nM)+JQ1(1μM)药物联合处理对HCT116和LoVo细胞系细胞形态的影响改变；(图2B)流式细胞技术检测硼替佐米(10nM)+JQ1(1μM)药物联合处理对细胞凋亡的改变；(图2C)Western blotting技术检测硼替佐米+JQ1药物联合处理对细胞凋亡的改变；(图2D)流式细胞技术检测硼替佐米(10nM)+JQ1(1μM)药物联合处理对细胞周期的改变。
图3：阻断NF-κB通路增强JQ1药物敏感性。(图3A)硼替佐米+JQ1处理HCT116及LoVo细胞系24小时，报告基因检测NF-κB通路活化情况的改变；(图3B)BMS345541与JQ1联用处理HCT116及LoVo细胞系，CCK8法检测细胞增殖率改变及药物协同效应；(图3C)CCK8法检测IKK1/2基因敲除后，HCT116细胞系对JQ1敏感性的改变；(图3D)siRNA敲除IκBα基因，报告基因检测NF-κB通路的活化情况；
图4：在HCT116级LoVo细胞系移植瘤中进行联合用药体内验证。(图4A)联合用药结束后称量四组裸鼠重量；(图4B，图4C)分别为联合用药治疗18天LoVo和HCT116移植瘤生长体积变化趋势。
图5：联合用药在PDX模型中进行验证。(图5A)JQ1+硼替佐米联合用药治疗四例PDX模型的肿瘤抑制率统计；(图5B)四例患者PDX模型肿瘤生长曲线图。
具体实施方式
1.细胞系培养
实验所用结直肠癌细胞系如表1所示，购于ATCC(American Type CultureCollection)，培养基为含10％FBS(胎牛血清)及1％的青霉素/链霉素的DMEM培养基，在37℃、5％浓度CO2细胞培养箱内培养。
表1细胞系的种类
Figure BDA0001465397610000031
2.CCK8细胞增殖实验检测细胞相对存活率
将目的细胞消化后制成单细胞悬液并计数，100μL培养基接种于96孔培养板中，每孔1000个细胞，不同处理组细胞不同时间点做5～6个复孔。第二天配置不同浓度药物至100μL培养基中，加入每孔后37度孵育72小时。每孔加入CCK8试剂10μL，37度孵育2～4小时，振荡5min，于酶标仪波长450nm处测定吸光度(OD)值。计算相对细胞存活率。细胞存活率＝(药物处理组OD值-空白处理组OD值)/空白处理组OD值×100％。
3.siRNA技术敲除BRD2、BRD3、BRD4基因表达
为排除BET抑制剂的脱靶效应，采用siRNA技术敲除BRD2/3/4的基因表达。将目的细胞消化后制成单细胞悬液并计数，2mL培养基接种于6孔培养板中。过夜培养贴壁。准备两个EP管，各加250μL opti-MEM。每管加入相应的siRNA，使其终浓度为100pM。另准备两个1.5mL EP管，各加250μL opti-MEM。每管加入7.5μL的脂质体Lipofectamine 2000。室温静置5min。将脂质体Lipofectamine 2000稀释液加到相应siRNA稀释液中。室温静置20分钟。将混合液加入相应培养孔中培养，48-72小时抽提RNA进行基因敲除效率检测以及后续细胞增殖实验。
4.流式细胞技术检测细胞凋亡
将细胞系铺板贴壁，过夜培养后加入不同浓度药物处理48小时。消化细胞成单细胞悬液，Binding Buffer洗涤2次，每次200～300×g离心5min。细胞染色：每个实验管内加入50μL 1×bingding buffer中含Annexin-V-FITC 2.5μL，7-AAD 0.05μL来配总管。去除离心后各流式管中的binding buffer，各加入50μL染色液，室温避光染色30分钟。
流式细胞技术分析凋亡：各管加入250μL 1×binding buffer后，以标准程序用流式细胞仪检测，收集1×104个细胞以上，软件分析不同药物处理组的凋亡比率。
5.Western Blotting实验检测细胞凋亡蛋白Cleaved PARP
1)样本准备：HCT116及LoVo细胞系铺于6孔板待贴壁，不同药物组合处理细胞24小时，Western Blotting实验检测凋亡蛋白Cleaved PARP变化。
2)蛋白裂解：每孔培养板加入200μL蛋白裂解液，4度摇床孵育30分钟进行蛋白裂解。反复吹打，吸入1.5mLEP管中，12000rpm离心15分钟。结束后吸取上清液。
3)蛋白定量：根据样品数量，按BCA(Bicinchoninic Acid)试剂盒中试剂A：试剂B＝50:1的比例配制适量BCA工作液，混匀，每孔200μL加入96孔板中。每孔加入1μL蛋白样本，并设2个复孔。37℃烘箱放置30分钟。用酶标仪在562nm波长处测定吸光度值，根据标准曲线计算样本蛋白的浓度。
3)聚丙烯酰胺凝胶的配制：按碧云天配胶试剂盒的说明书进行分离胶与积层胶的配制。
4)电泳：根据目的蛋白表达量决定上样量。各组上样总蛋白量要求相同，体积不同可用蛋白上样缓冲液补足。电泳时开始阶段，蛋白样品在积层胶中时电压设定为80V，至Marker分出条带后将电压调节至120V，电泳至溴酚兰指示剂刚到达凝胶的下端即可终止电泳，进行转膜反应。
5)转膜：电泳结束后，取出凝胶，附上NC膜及滤纸，转膜时电流设定为300mA，于冰浴中进行转膜1小时。
6)封闭：转膜结束后，取出NC膜，配置5％脱脂牛奶，用于封闭。室温封闭1小时。
7)一抗孵育：根据抗体说明书稀释WB一抗(Cleaved PARP)，4度摇床过夜孵育。
8)二抗孵育：TBST清洗三次，每次5分钟。配置二抗羊抗鼠孵育液，室温孵育30分钟。孵育结束后TBST清洗三次，每次5分钟。
9)发光：配置WB显色液，置于TANON发光仪进行发光显色。根据Marker条带的位置，观察目标蛋白的条带情况。
6.流式细胞技术检测细胞周期
将不同细胞系铺于6cm培养皿中，过夜培养贴壁。第二天加入不同浓度的药物处理，48小时后检测细胞周期。消化细胞后用PBS清洗2次，每次200～300×g离心5min。吸走PBS，加预冷的70％乙醇重悬细胞，于-20℃固定2小时。细胞染色：离心收集细胞，以1mL的PBS洗细胞一次，加入100μL含PI(50μg/mL)和RNase A(100μg/mL)的PBS重悬细胞，4℃避光孵育30min。流式细胞技术分析周期：加入200μL PBS后，以标准程序用流式细胞仪检测，收集2×104个细胞以上，结果用细胞周期拟合软件ModFit分析不同药物处理组的G1、G2/M、S期周期分布。
7.报告基因检测
将目的细胞消化后制成单细胞悬液并计数，2毫升培养基接种于6孔培养板中。过夜培养贴壁。配置转染报告基因质粒反应液(报告基因质粒100ng；Rellina质粒2ng；Opti-mem100ul；Lippofectamine2000 1ul)，混匀20分钟后加入每孔。报告基因荧光测定：PBS洗涤二次，加入稀释好的5×被动裂解液，室温裂解30min。蛋白裂解液转移至96孔白板中。配制荧光底物液体及Stop&Glo反应液，设置luminometer程序文件，检测各孔萤火虫荧光素酶及海肾荧光素酶的活性强度及比值。其比值高低反应启动子被激活的强度。
8.细胞系裸鼠移植瘤模型构建
在体外培养条件下扩增HCT116及LoVo细胞系，待细胞数量足够后消化成单细胞悬液，计数，PBS重悬细胞，按1×106个/只数量，针头注射细胞系于裸鼠皮下。10～14天后，裸鼠皮下可见黄豆大小细胞系移植瘤生长，可进行后续给药实验。
9.来源于患者原代肿瘤组织的肿瘤移植模型(Patient-Derived Xenograft，PDX)构建
收集术中切除的结直肠癌新鲜肿瘤组织，PBS反复冲洗。用消毒组织剪将组织剪成2×2×2mm的组织块，清除坏死、脂肪组织，麻醉下4周裸鼠两腋下各开3mm小口，分离出种植空间，将组织块埋于皮下，缝合。剩余肿瘤组织保存-80度冰箱以及石蜡包埋。每个肿瘤组织种植2个PDX裸鼠，共计4个瘤块。至少每周观察一次肿瘤生长情况，测量肿瘤体积。待肿瘤生长至直径1cm，用上述同样方法剪碎组织，进行传代培养以及鉴定实验。待组织样本传代至3～4代，冻存样本，纳入PDX标本保存库。本研究将使用已经成功建模的4个患者PDX模型，包括：CRC0005、CRC0006、CRC0008和CRC0014。
效果实施例1
不同浓度JQ1与硼替佐米(Bortezomib，BOR)联合处理三种JQ1耐药的结直肠癌细胞系LoVo、SW620与HCT116，根据第2条的CCK8细胞增殖实验，检测不同处理组的细胞存活率。为评价两种药物是否具有药物协同效应，通过Chou and Talalay公式计算联合用药指数(Combinational Index，CI<1表示两种药物具有协同作用效应，CI>1表示两种药物仅有药物叠加效应)。结果表明(图1A)，两种药物联合用药能够同时明显抑制三种结直肠癌细胞系细胞增殖。此外通过计算CI值发现，不同浓度药物组合的CI值<1，表明两种药物具有药物协同效应。此外，申请人选用另外两种BET抑制剂OTX015和I-BET151与硼替佐米联用，发现硼替佐米同样能够通过协同作用增强不同BET抑制剂的抗肿瘤作用(图1B)。为排除BET抑制剂的脱靶效应，申请人采用第3条的siRNA技术，同时敲除BRD2/3/4的基因表达，CCK8实验检测硼替佐米处理后细胞增殖率，结果发现硼替佐米在BET敲除细胞中具有更强的抗肿瘤效应(图1C)。
效果实施例2
用JQ1及硼替佐米单药或联合处理HCT116和LoVo细胞系，显微镜下观察单药及联合用药对细胞形态的改变。发现单药处理轻度减少细胞的增殖数量，但对细胞形态无明显影响。联合用药则显著抑制细胞增殖，并且细胞出现形态皱缩，表明大量凋亡开始产生(图2A)。采用第4条的流式细胞技术检测不同药物组合处理情况下细胞凋亡比率。结果表明(图2B)，单药处理引起少量细胞凋亡增加，但是联合用药明显促进大量细胞发生凋亡。为进一步检测细胞凋亡水平改变，申请人采用第5条的Western Blotting技术检测凋亡指标Cleaved PARP蛋白的表达变化。结果显示(图2C)，药物联合作用后，LoVo及HCT116细胞凋亡水平相对空白对照组以及单独用药组，凋亡水平明显增加。此外，申请人采用第6条的细胞周期检测技术检测联合用药后细胞周期的改变，发现联合用药处理LoVo及HCT116细胞后，细胞发生明显的G2/M细胞周期阻滞(图2D)。
效果实施例3
硼替佐米是一种20S蛋白酶体抑制剂，是美国食品和药品管理局(FDA)批准的多发性骨髓瘤及套细胞淋巴瘤的一线治疗药物，主要通过阻止IκB出核及降解从而抑制NF-κB通路发挥抗肿瘤作用。为了验证在联合用药中硼替佐米对NF-κB通路的抑制作用，申请人给予HCT116，LoVo细胞系JQ1+硼替佐米处理24小时，检测单药或联合用药时NF-κB通路活化情况的改变。报告基因检测结果显示(图3A)，相较于单药治疗，联合用药能够显著抑制NF-κB通路活化。为明确其他NF-κB抑制剂是否同样具有药物协同作用，申请人改用另一特异性NF-κB小分子抑制剂BMS345541与JQ1联用，同样发现具有药物联用具有协同杀伤效应(图3B)。
为了进一步验证抑制NF-κB通路能增强JQ1的治疗作用，采用siRNA技术联合敲除IKK1级IKK2基因。细胞增殖实验结果显示，NF-κB通路被靶向抑制后，HCT116细胞系中同样能够增强JQ1的抗肿瘤作用(图3C)。相反的，采用siRNA技术敲除IκBα基因，从而激活NF-κB通路，发现JQ1对BETi敏感细胞系RKO的抗肿瘤作用明显减弱(图3D)，进一步证实阻断NF-κB通路能够有效增强BET抑制剂对结直肠癌细胞系的治疗作用。
效果实施例4
为进一步确认联合用药对结直肠癌的治疗效果，采用第8条方法，利用JQ1抵抗细胞系LoVo和HCT116构建了裸鼠移植瘤模型，分别给予JQ1以及硼替佐米治疗，分为四组，每组8只裸鼠：(1)对照组：PBS处理组；(2)BETi单药处理组：JQ1单药处理(50mg/kg，腹腔注射，一天一次)；(3)硼替佐米处理组：硼替佐米单药处理(1mg/kg，腹腔注射，三天一次)；(4)联用药物组：JQ1(50mg/kg，腹腔注射，一天一次)+硼替佐米处理(1mg/kg，腹腔注射，三天一次)。治疗18天，比较JQ1与硼替佐米对肿瘤生长的影响，验证联用药物能否增强JQ1的抗肿瘤作用。治疗过程中裸鼠保持正常的生理活动，未见明显毒副作用，给药实验结束后称量体重。
结果显示：四组裸鼠体重未见明显差异(图4A)。给药过程中记录肿瘤生长曲线，结果显示单药治疗效果并不明显，但联合用药显著抑制LoVo和HCT116肿瘤生长(图4B，图4C)。
效果实施例5来源于患者原代肿瘤组织的肿瘤移植模型(Patient-DerivedXenograft，PDX)验证BETi与硼替佐米联合治疗结直肠癌疗效
根据第9条方法成功构建四例结直肠癌患者PDX模型：CRC0005、CRC0006、CRC0008、CRC0014。对4例PDX模型进行JQ1+硼替佐米给药实验。每例患者分为四组，每组6-8只裸鼠：(1)对照组：PBS处理组；(2)BETi单药处理组：JQ1单药处理(50mg/kg，腹腔注射，一天一次)；(3)硼替佐米处理组：硼替佐米单药处理(1mg/kg，腹腔注射，三天一次)；(4)联用药物组：JQ1(50mg/kg，腹腔注射，一天一次)+硼替佐米处理(1mg/kg，腹腔注射，三天一次)。治疗24～27天，比较JQ1与硼替佐米对肿瘤生长的影响，验证联用药物能否增强JQ1的抗肿瘤作用。
根据RICIST标准，JQ1单药治疗在模型CRC0005和CRC0006中(分别抑制33.6％和53.1％)显示部分有效(Partial Responsive，PR,+)，联合硼替佐米治疗后对肿瘤的抑制效果达到完全有效(Complete Responsive，CR,++)(分别抑制80.9％和82.7％)(图5A和5B)。JQ1单药治疗CRC0008 and CRC0014显示几乎没有抗肿瘤效果(分别抑制7.4％和26.2％)，但是联合硼替佐米治疗后，CRC0008达到PR(抑制64.1％)，而CRC0014达到CR(抑制73.4％)(图5A,5B)。
在本申请中，JQ1的结构如式Ⅰ所示，从Selleck公司购买得到，货号为S7110，也可以参考文献1(Filippakopoulos P,Qi J,Picaud S,et al.Selective inhibition of BETbromodomains.Nature 2010；468:1067)；
OTX015的结构如式Ⅱ所示，从Selleck公司购买得到，货号为S7360，也可以参考文献2(Noel JK,Iwata K,Ooike S,et al.Abstract C244:Development of the BETbromodomain inhibitor OTX015:AACR,2013)；
I-BET151的结构如式Ⅲ所示，从Selleck公司购买得到，货号为S2780，也可以参考文献3(Dawson MA,Prinjha R,Dittman A,et al.Inhibition of BET recruitment tochromatin as an effective treatment for MLL-fusion leukaemia:Am SocHematology,2011)；
硼替佐米的结构如式Ⅳ所示，从Selleck公司购买得到，货号为S1013，也可以参考文献4(Adams J,Palombella VJ,Sausville EA,et al.Proteasome inhibitors:a novelclass of potent and effective antitumor agents.Cancer research 1999；59:2615-2622)；
BMS345541的结构如式Ⅴ所示，从Selleck公司购买得到，货号为S8044，也可以参考文献5(Burke J R,Pattoli M A,Gregor K R,et al.BMS-345541 is a highlyselective inhibitor of IκB kinase that binds at an allosteric site of theenzyme and blocks NF-κB-dependent transcription in mice[J].Journal ofBiological Chemistry,2003,278(3):1450-1456.)；
以上实验中所有其他试剂也均为市售产品。
Figure BDA0001465397610000081
Figure BDA0001465397610000091

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1.BET抑制剂和NF-κB抑制剂联合用于制备治疗结直肠癌的药物中的应用，其特征在于，该应用为由JQ1和硼替佐米联合组成的活性成分用于制备治疗结直肠癌的药物中的应用。
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