CN104975063B

CN104975063B - 抗肿瘤药物生物标志物的筛选方法及其应用

Info

Publication number: CN104975063B
Application number: CN201410130154.2A
Authority: CN
Inventors: 熊磊
Original assignee: Aitisi Biotechnology Shanghai Co ltd
Current assignee: Aitisi Biotechnology Shanghai Co ltd
Priority date: 2014-04-01
Filing date: 2014-04-01
Publication date: 2020-04-03
Anticipated expiration: 2034-04-01
Also published as: CN104975063A

Abstract

本发明公开了一种抗肿瘤药物生物标志物的筛选方法及其应用。具体地，所述的方法包括步骤：(a)提供肿瘤细胞作为起始细胞，其中所述的肿瘤细胞来自相同对象的相同肿瘤组织；(b)对所述的起始细胞进行传代和建系，并对获得的细胞系进行进行基因组信息检测，从而获得至少5株存在基因组差异且高度同源的肿瘤细胞系；(c)对(b)中获得的肿瘤细胞系，进行抗肿瘤药物敏感性测试，并基于对所述抗肿瘤药物的敏感性对所述肿瘤细胞系进行分型；和(d)基于分型结果，对所述肿瘤细胞系的基因组信息进行分析，从而确定所述抗肿瘤药物生物标志物。本发明方法可最大程度的降低不同肿瘤细胞系之间的背景噪音，以助于高效地、准确地筛选出抗肿瘤药物的生物标志物。

Description

抗肿瘤药物生物标志物的筛选方法及其应用

技术领域

本发明涉及肿瘤治疗领域。具体地，涉及一种筛选抗肿瘤药物生物标志物的方法。

背景技术

抗肿瘤药物的疗效主要由其基因组的异常表达决定，因肿瘤基因组的不稳定性及肿瘤间的异质性，抗肿瘤药物往往仅在某一群病人身上有效。例如靶向BCR-Abl的格列卫在BCR-ABL融合表达的慢性粒细胞白血病病人中五年生存率可达90%以上，靶向EGFR的易瑞沙成功用于EGFR突变的非小细胞肺癌，ALK抑制剂Crizotinib也仅批准用于ALK阳性的病人。在生物标志物如BCR-ABL的融合，EGFR突变,ALK融合的指征下，可以有效地判断出“有效人群”和“无效人群”，从而提高疗效、降低毒副作用。2011年8月美国FDA出台文件，建议申请新药临床研究时，同时提交选择敏感病人的分子诊断试剂盒，目前正在审批的候选药物中，25%附有个体化药物特征的生物标志物。然而，仍有大量的抗肿瘤药物未寻找到用来有效指征预测其疗效的生物标志物。如能在药物开发早期体外阶段筛选出其生物标志物，可以大大降低整个药物开发的成本，加速药物的上市及临床应用。

目前，筛选生物标志物主要有效手段是基于体外病人来源的肿瘤细胞系，如NCI60（The US National Cancer Institute60）细胞系平台、CMT1000（Center for MolecularTherapeutics）细胞系平台，CCLE(Cancer Cell Line Encyclopedia)细胞系平台等，通过关联药物反应与细胞基因组差异表达，分析二者相关性来寻找可特异性预测药物反应的标志物。而在此类研究开展时，面临的一大问题是对同一种药物敏感性不同的细胞中，基因组上往往也存在着大量的差异，这些差异中有些可能与药物反应相关，然而更多的则是与药物反应不相关的差异，这些差异给相关性分析带来了无法消除的噪音，使得标志物分析变得困难。此外，现有商用的细胞系很多都是全世界实验室相互多次交换使用，基本上不记录代数，代数不明确。而且也有多篇研究报道这些商用细胞系已有大量相互之间交叉污染。

因此，本领域迫切需要开发一种能够高效、准确甄别药物反应相关标志物的方法，从而降低抗肿瘤药物生物标志物分析的难度和成本。

发明内容

本发明提供了一种来自单个病人的肿瘤细胞系集合，其不同细胞系间基因组差异小，大大降低了噪音的影响，提高了甄别出药物反应相关标志物的效率和能力。

本发明的第一方面，提供了一种筛选抗肿瘤药物生物标志物的方法，包括步骤：

(a)提供肿瘤细胞作为起始细胞，其中所述的肿瘤细胞是来自相同对象的相同肿瘤组织；

(b)对所述的起始细胞进行传代和建系，并对获得的细胞系进行细胞特征信息检测，从而获得至少5株存在细胞特征差异且基因组高度同源的肿瘤细胞系；

(c)对(b)中获得的肿瘤细胞系，进行抗肿瘤药物敏感性测试，并基于对所述抗肿瘤药物的敏感性对所述肿瘤细胞系进行分型；和

(d)基于分型结果，对所述肿瘤细胞系的细胞特征信息进行分析，从而确定与所述抗肿瘤药物敏感性相关的差异性标志物，所得的差异性标志物即所述抗肿瘤药物生物标志物。

在一个优选例中，所述的细胞特征信息包括：

1)人类基因组DNA或RNA的序列、高级结构、以及修饰；

2)蛋白质序列、结构、以及修饰；

3)生物大分子的相互作用信息，包括物理及化学层面作用；

4)细胞代谢物相关信息；

5)生物图像信息等。

在另一优选例中，所述细胞特征信息检测是基因组信息检测；和/或

所述细胞特征差异是基因组差异。

在另一优选例中，在步骤(b)中，获得5-1000株；较佳地10-500株，更佳地，20-100株所述的肿瘤细胞系。

在另一优选例中，步骤(c)中用于药物敏感性测试的肿瘤细胞系传代代数小于以起始细胞系起算的50代，较佳地，小于20代，更佳地，小于10代。

在另一优选例中，所述的差异性标志物包括某一基因或基因区域，或其编码蛋白。

在另一优选例中，所述的抗肿瘤药物生物标志物包括：

(1)导致肿瘤细胞对抗肿瘤药物敏感度上升的标志物；

(2)导致肿瘤细胞对抗肿瘤药物敏感度下降的标志物。

在另一优选例中，所述的细胞特征差异包括：单个或多个基因甲基化水平的差异、单个或多个基因组区域甲基化水平的差异。

在另一优选例中，所述的基因组差异包括：单个或多个基因的差异（缺失、突变或插入）、单个或多个基因组区域的差异。

在另一优选例中，所述的基因组差异由任意两株细胞之间的差异性距离(d)表示。

在另一优选例中，所述的差异性距离包括(但不限于)皮尔逊距离、欧氏距离、曼哈顿距离、切比雪夫距离、闵可夫斯基距离、标准化欧氏距离、马氏距离、夹角余弦、汉明距离、杰卡德距离、信息熵等。

在另一优选例中，当差异性距离为皮尔逊距离时，OPP组中任意两株细胞的平均差异性距离d>0,且显著小于CCLE组内任意两株细胞的平均距离(P<0.05)。

在另一优选例中，所述的差异性距离d满足0＜d≤0.9，较佳地，0＜d≤0.6，更佳地，0＜d≤0.3。

在另一优选例中，所述高度同源指任何2种肿瘤细胞系之间的基因组相同性≥80%，较佳地≥90%，更佳地≥95%，最佳地≥99%，且所述的同源性＜100%。

在另一优选例中，所述的分型包括将所述肿瘤细胞划分为选自下组的类型：

(i)敏感型，所述敏感型肿瘤细胞系的药物敏感性与对照细胞相比显著上升；

(ii)普通型，所述敏感型肿瘤细胞系的药物敏感性与对照细胞相比无显著差异；在有些实施例中普通型也称为中度敏感型；

(iii)耐药型，所述耐药型肿瘤细胞系的药物敏感性与对照细胞相比显著下降。

在另一优选例中，所述的药物敏感性用下式所示敏感度差异值D表示：

D＝A0/A1

式中，

A0是所述测试物对所述对照细胞的生长产生50%抑制时的浓度；

A1是所述测试物对某一肿瘤细胞系的生长产生50%抑制时的浓度。

在另一优选例中，对敏感型而言，所述的“显著上升”指与对照细胞相比，敏感度差异值D≥2，较佳地D≥5，更佳地D≥8，最佳地D≥10。

在另一优选例中，对普通型而言，敏感度差异值D满足0.5＜D＜2，较佳地0.75＜D＜1.5。

在另一优选例中，对耐药型而言，所述的“显著下降”指与对照细胞相比，敏感度差异值D≤1/2，较佳地D≤1/5，更佳地D≤1/8，最佳地D≤1/10。

在另一优选例中，所述的对照细胞包括一种或多种来源于不同对象的同类型的肿瘤细胞。

在另一优选例中，所述的肿瘤细胞系还具有选自下组的一个或多个特征：

（1）细胞代数明确；

（2）基因组信息保留患者本身的基因组特征。

在另一优选例中，所述的肿瘤组织细胞包括来自实体肿瘤或非实体肿瘤的细胞。

在另一优选例中，所述的肿瘤包括：皮肤癌，白血病，肾上腺皮质癌，胆管癌，膀胱癌，骨癌，脑癌，乳腺癌，气管及支气管肿瘤，淋巴瘤，神经系统肿瘤，宫颈癌，肠癌，肛门癌，子宫内膜癌、食管癌，鼻咽癌，卵巢癌，肉瘤，眼癌，恶性纤维组织细胞癌，胆囊癌，胃癌，结直肠癌、胃肠道类癌瘤，胃肠道间质瘤，胚细胞瘤，头颈癌，肝癌，下咽癌，黑色素瘤，胰腺癌，肾癌，喉癌，唇癌，口腔癌，口咽癌，肺癌，间皮瘤，骨髓瘤，甲状旁腺癌，阴茎癌，嗜络细胞瘤，垂体瘤，前列腺癌，视网膜母细胞瘤，涎腺癌，皮肤癌，睾丸癌，喉癌，胸腺瘤，甲状腺癌，尿道癌，阴道癌，外阴癌。

在另一优选例中，所述的肿瘤组织细胞来自肝癌细胞。

在另一优选例中，所述的相同肿瘤组织包括相同病理分型来源的原位肿瘤组织、转移肿瘤组织（包括腹水中的肿瘤组织或细胞）。

在另一优选例中，所述建系方法包括以下步骤：

(i)分离肿瘤组织并剪碎平铺于培养器皿中，并加入培养液培养5-10天，从而获得粗培养体系；

(ii)去除(i)中的粗培养体系中的成纤维细胞，获得所述的肿瘤细胞即建系获得的细胞系。

在另一优选例中，所述建系方法还可以包括：将分离得到的肿瘤组织划分为不同区域，对每个区域进行取样并分别放入不同的培养器皿中培养获得肿瘤细胞系。

在另一优选例中，所述肿瘤细胞具备持续生长与传代能力。

在另一优选例中，所述的肿瘤细胞系还可以通过人工突变技术形成肿瘤细胞亚系。

在另一优选例中，所述的基因组信息检测包括：外显子检测、基因表达谱检测、CNVs检测、全基因组测序、或其组合。

在另一优选例中，所述的步骤(d)还包括基于分型结果，对所述肿瘤细胞系的细胞特征信息进行分析，其中，所述的细胞特征信息包括：

1)人类基因组DNA或RNA的序列、高级结构、以及修饰；

2)蛋白质序列、结构、以及修饰；

3)生物大分子的相互作用信息，包括物理（无化学变化）及化学（有化学变化）层面作用；

4)细胞代谢物相关信息；

5)生物图像信息等。

在另一优选例中，所述的抗肿瘤药物包括目前经过FDA批准的所有抗肿瘤药。

在另一优选例中，所述的抗肿瘤药包括经FDA批准的药物或未批准的药物。

在另一优选例中，所述的抗肿瘤药包括已知靶向抗肿瘤药与未知靶向抗肿瘤药。

在另一优选例中，所述的抗肿瘤药还包括任意的化疗药或化合物。

在另一优选例中，所述的抗肿瘤药还包括RNA药物、蛋白或多肽药物、抗体药物、基因治疗药物。

在另一优选例中，所述的靶向抗肿瘤药包括(但不限于)17-AAG、2-deoxyglucose、阿比特龙(Abiraterone)、ABT-263、AC-220、AT-406、AZD4547、AZD5363、AZD7762、BI-2536、Birinapant、BMS-754807、硼替佐米(Bortezomib)、BX-795、卡博替尼(Cabozantinib)、CAL-101、卡非佐米(Carfilzomib)、克唑替尼(crizotinib)、danusertib、达沙替尼(Dasatinib)、Dovitinib、Elesclomol、Embelin、恩替诺特(Entinostat)(MS-275)、Enzastaurin、依维莫司(Everolimus)、Foretinib、氟维司群(Fulvestrant)、Ganetespib、GDC0941、GSK429286A、JQ1、KU-55933、KX2-391、Lenvatinib、Linifanib、Linsitinib、LY2157299、Masitinib、MK-1775、MK-2206、MLN-4924、Neratinib、NU7441、Nutlin-3、NVP-BEZ235、NVP-BKM120、Orantinib、PCI-32765、PD-0325901、PD-0332991、PD-173074、PH-797804、PRT062607、R-406、Refametinib、瑞戈非尼(Regorafenib)、SCH900776、sgi-1776、索拉非尼(Sorafenib)、舒尼替尼(Sunitinib)、TAE684、替西莫司(Temsirolimus)、TG-101348、Tideglusib、Tipifarnib、Tivantinib、Toremifene、Tozasertib、曲美替尼(Trametinib)、维甲酸(Tretinoin)、Triptolide、伐地考昔(Valdecoxib)、维莫德吉(Vismodegib)、Volasertib、伏立诺他(Vorinostat)、YM-155、CHIR-99021、NVP-BGJ398、LY2090314。

在另一优选例中，所述的化疗药包括(但不限于)六甲蜜胺、氨鲁米特、阿那罗唑、阿扎胞苷、苯达莫司汀、白消安、卡巴他赛、卡培他滨、卡铂、顺铂、克拉曲滨、氯法拉宾、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、柔红霉素、地西他滨、多西他赛、多柔比星、表柔比星、依托泊甙、伊西美坦、氟尿苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、依达比星、异环磷酰胺、伊立替康、来那度胺、来曲唑、亚叶酸、洛莫司丁、6-巯基嘌呤、美司钠、甲胺喋呤、米托坦、米托蒽醌、奥沙利铂、紫杉醇、奈拉滨、培美曲塞、喷司他汀、普拉曲沙、甲苄肼、雷替曲噻、链脲霉素、替莫唑胺、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、拓扑替康、长春花碱、长春瑞滨、唑来膦酸。

在另一优选例中，在步骤(b)中，基因组信息检测结果相同的肿瘤细胞系视为一株。

在另一优选例中，还包括步骤：

(f)提供其他对象的相同肿瘤组织细胞，并重复步骤(b)-(d)。

(g)将(f)中所获得的结果与步骤(d)中所获得的结果进行合并。

在另一优选例中，所述的其他对象包括额外的1-10个对象，较佳地，为3-8个对象，更佳地为5-6个对象。

本发明第二方面，提供了一种构建肿瘤细胞系集合(set)的方法，包括步骤：

(a)提供肿瘤细胞作为起始细胞，其中所述的肿瘤细胞是来自相同对象的相同病理来源肿瘤组织；

(b)对所述的起始细胞进行传代和建系，并对获得的细胞系进行细胞特征信息检测，从而获得至少5株存在细胞特征差异且高度同源的肿瘤细胞系，并将所述肿瘤细胞系进行组合从而构成肿瘤细胞系集合；

优选地，对获得的细胞系进行基因组信息检测，从而获得至少5株存在基因组差异且基因组高度同源的肿瘤细胞系，并将所述肿瘤细胞系进行组合从而构成肿瘤细胞系集合。

在另一优选例中，所述肿瘤细胞系集合是panel形式。

在另一优选例中，所述肿瘤细胞系集合包括一多孔板，以及分别位于各孔中的所述肿瘤细胞系。

在另一优选例中，所述方法还包括：

(c)对(b)中获得的肿瘤细胞系，进行抗肿瘤药物敏感性测试，并基于对所述抗肿瘤药物的敏感性对所述肿瘤细胞系进行分型。

本发明第三方面，提供了一种肿瘤细胞系集合，所述的肿瘤细胞系集合是用本发明第二方面所述的方法构建的。

在另一优选例中，所述的肿瘤细胞系集合中含有5-1000株肿瘤细胞系，较佳地，为10-500株，更佳地，为20-100株。

在另一优选例中，所述的肿瘤细胞系之间的基因组信息检测结果不相同。

在另一优选例中，所述的肿瘤细胞系之间的抗肿瘤药物敏感性差异5倍以上。

本发明第四方面，提供了一种肿瘤细胞系文库，所述的文库含有一个或多个本发明第三方面所述的肿瘤细胞系集合。

在另一优选例中，所述的肿瘤细胞系文库包括各自来自于相同或不同对象的肿瘤细胞系集合。

在另一优选例中，所述的文库还含有一个或多个来源于不同对象的同类型的肿瘤细胞系。

本发明第五方面，提供了一种筛选抗肿瘤药物生物标志物平台，所述的平台含有本发明第三方面所述肿瘤细胞系集合或本发明第四方面所述的肿瘤细胞系文库；和

一信息存储装置，所述存储装置中存储有所述肿瘤细胞系的基因组、代谢或蛋白信息；和任选的抗肿瘤药物敏感性数据。

在另一优选例中，所述的平台还包括：

一数据采集装置，用于在抗肿瘤药物敏感性测试中采集抗肿瘤药物敏感性数据；和

一数据处理装置，用于处理抗肿瘤药物敏感性数据与所述肿瘤细胞系的基因组信息，从而确定与所述抗肿瘤药物敏感性相关的差异性标志物。

本发明第六方面，提供了本发明第三方面所述的肿瘤细胞系集合、本发明第四方面所述的肿瘤细胞系文库，或本发明第五方面筛选抗肿瘤药物生物标志物平台的用途，其特征在于，用于筛选抗肿瘤药物生物标志物。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了CNV检测分析的流程图。

图2显示了26株细胞的其中一株细胞呈上皮形态。

图3显示了采用gene-based CNV数据对不同来源的细胞系（包括26株OPP-HCC307细胞系以及来自于CCLE的27株肝癌细胞系）中的任意两株之间距离进行评价；其中图3A显示的是（1-距离）的热图；图3B显示距离在两类不同来源细胞中的直方分布图，可以清楚的观察到HCC307的26个细胞任意两株之间的距离基本分布在小于0.6的区间，反之，来自于CCLE的27个肝癌细胞系的任意两株之间的距离基本分布在大于0.6的区间。两种细胞分布上有显著性差异（P=1.0953e-260）；图3C对所有53株细胞系在gene-based CNV数据上进行聚类的结果。

图4显示了测试药物在不同细胞中的敏感性差异，将药物反应敏感性在X和Y轴上进行排序。绿色表示耐受，红色表示敏感，黑色表示中度敏感，灰色表示未检测；其中图4A显示了55个化疗药在OPP细胞中的敏感性；图4B显示了79个靶向药在OPP细胞中的敏感性。

图5显示了外显子数据分析流程图。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，首次从同一患者、同一肿瘤组织中分离出数十株存在微小基因组学差异的肿瘤细胞株。基因测序证明，同一患者、同一肿瘤组织中的分离的细胞系在基因背景上具有极其微小的差异，因此可以用于进行抗肿瘤药物敏感性测试，从而筛选出对特定药物敏感或抵抗的不同肿瘤分子标记物。利用本发明方法制备的肿瘤细胞系合并为集合，可以建立来自不同病人的同种肿瘤细胞株系集合文库，或也利用各种集合文库建立一个用于筛选抗肿瘤药物分子标记的平台。这样的文库或平台可用于筛选新药的靶点，或用于不同肿瘤患者的个体化治疗。在此基础上，完成了本发明。

术语

生物标志物（Biomarker）

如本文所用，术语“生物标志物”、“标志物”可以互换使用，均指可用来预测药物的疗效、或可用来区分出药物治疗的“有效人群”和“无效人群”的生物学特征，如BCR-ABL基因融合用于格列卫，HER2基因扩增用于赫赛汀。生物标志物包括但不限于：

1)人类基因组DNA或RNA的序列、高级结构、以及修饰；

2)蛋白质序列、结构、以及修饰；

4)细胞代谢物相关信息；

5)生物图像信息等。

具体地，生物标志物可以指某些基因、蛋白或染色质的存在或改变，所述改变包括但不限于：染色体的缺失、插入、重复、倒位、异位、重组、数量改变；基因、染色质或蛋白的突变、缺失、融合、扩增、重排、甲基化、去甲基化、乙酰化、去乙酰化、磷酸化、糖基化，或其他转录、翻译或翻译后修饰的改变。

相同肿瘤组织

如本文所用，术语“相同肿瘤组织”指的是：

1）取自于同一对象(如肝癌患者)、同一组织部位(如肝癌)、同一进展期或不同进展期的肿瘤组织；或

2）取自于同一对象(如肝癌患者)、同一病理分型来源的原位癌或转移癌（包括腹水中的肿瘤组织或细胞）。

差异性距离

如本文所用，术语“差异性距离”、“相关系数”、“差异性相关系数”、“d”可以互换使用，均指OPP细胞系任意两株细胞之间的差异大小。通常，d值可以根据统计学常规计算方法获得，例如计算任意两株细胞之间的皮尔逊距离。

可用于本发明的d值标准的确定可以用CCLE（Cancer Cell Line Encyclopedia）细胞平台中同种细胞株的平均距离d计算，其中，d值范围在[0,2]，其中[0,1]表示正相关，值越小越相关。[1,2]为负相关。例如，CCLE肝癌细胞系(900多株)的平均d值约为0.9。因此，本发明中，OPP的d值要求通常≤0.9，优选的≤0.6，更佳地≤0.3。

本领域技术人员可以根据本发明的启示以及方法，建立来源于同一患者的OPP细胞系(集合)，并根据CCLE或其他细胞数据库平台中同种肿瘤细胞株的差异性距离(d₀)值，来确定本发明肿瘤细胞系集合之间的距离(d)。

肿瘤细胞系集合（set）

在本发明中，“肿瘤细胞系集合”、“OPP（One Patient Panel）细胞(系)”可互换使用，指的是来自于同一患者、相同肿瘤组织细胞经分离培养后，所形成的至少5株，较佳地5-1000株，更佳地10-500株，最佳地20-100株的肿瘤细胞培养株系。

在这些肿瘤细胞系集合中的肿瘤细胞系，遗传背景往往非常相似。分离培养这些肿瘤细胞系的目的在于进一步降低不同细胞系之间的差异性，例如不同的肿瘤细胞系之间的差异可能仅仅是数个基因或基因区域的差异，或其编码蛋白的差异。

肿瘤细胞系集合中肿瘤细胞系之间的差异性可以通过细胞传代培养获得，而差异的变异率根据不同的肿瘤细胞肿瘤或分期有所不同，本领域技术人员可以结合基因测序手段明确不同培养阶段的肿瘤细胞株系是否能够达到同源性以及差异性距离的标准。一般来说，从相同组织来源的肿瘤细胞分离出5-10个细胞株后，就已经能够明显降低分子标记物数据分析过程中的背景噪音，而当细胞株少于5株时数据分析的可信度降低。当然，对这些细胞株进行进一步的分离培养之后，可以继续细化分子标记物的区别，使得其背景噪音得到大幅降低。

出于有效性和经济性的平衡考量，优选地，可分离培养出10-250株，较佳地为20-100株，更佳地为20-50株的肿瘤细胞系合并形成集合，并用于本发明筛选方法。实验证明，本发明方法在分离培养了数十株肿瘤细胞系后就可以获得较佳的抗肿瘤药物分子标记物筛选结果。

OPP细胞从建系开始到后续培养，均明确记录其代数，且在使用时一般也会控制在一定的代数内，如只使用50代以内(优选为20-30代以内)的细胞用于药物筛选。

此外，肿瘤细胞系集合中的细胞系还可以通过人工诱导突变(例如基因敲除)等人为制造仅1-2个生物标志物不同的新的人工细胞系，这些人工细胞系则作为肿瘤细胞亚系也是本发明肿瘤细胞系集合的一部分。

肿瘤细胞系文库

在本发明中，所述的肿瘤细胞系文库指的是将来源于不同对象(肿瘤患者)的上述肿瘤细胞系集合进行合并，从而获得的含有肿瘤细胞系基因组信息、抗肿瘤药物敏感性测试信息的文库。

当基因组学信息显示，文库中的肿瘤细胞系存在相同的肿瘤细胞系，则可将相同的肿瘤细胞系进行信息的合并和整理。文库还可以含有现有技术中涉及的抗肿瘤药物对不同肿瘤细胞系靶点的耐药记录。

用于筛选抗肿瘤药物的生物标志物平台

可以利用本发明方法建立不同肿瘤各自的肿瘤细胞系集合或文库，以及这些文库中对于抗肿瘤药物敏感性测试的结果，可以形成一个用于筛选抗肿瘤药物生物标志物的平台。

例如，在开发新药时，可将新的化合物或药物制剂施用于这些遗传背景具有微小差异的细胞系中，就可以筛选出敏感型或抵抗型的细胞，并根据已知的基因测序结果和比对，则可快速地获得新药的作用靶点。

而在肿瘤患者的个性化治疗中，则可利用对患者的基因测序结果，筛选出在肿瘤细胞中表达量和/或活性与药物敏感性相关的基因或分子标记物，并根据这些特殊的分子标记物选择合适的靶向用药。

来源于相同对象、相同肿瘤组织的不同肿瘤细胞株系的培养

可用于本发明的建立细胞系的方法没有特殊限制。通常，所述的建系方法如下：取术前未经任何治疗的病人肿瘤样本，手术切除后在肿瘤实体组织的不同区域进行取样，并将不同采样区域使用序号标记。分离好的新鲜肝癌组织，无菌超净台中PBS洗净后，使用眼科镊子、剪刀等器械在培养皿中剪碎分离成0.5-1mm³的小块平铺于皿底，并向培养皿中加入含10ml的10%FBS(GIBCO公司)，1%双抗DMEM细胞培养基(GIBCO公司），放入37℃5%CO₂的培养箱中进行培养，次日在倒置显微镜下观察到细胞从组织块四周游出，然后逐渐延伸，长成肉眼可以观察到的生长晕。5～7天后组织块中央的组织细胞逐渐坏死脱落和发生漂浮，此漂浮小块可随换液而弃去，由组织块周围延伸的贴壁细胞也逐渐形成层片。传代培养时，利用成纤维细胞与肿瘤细胞消化能力的不同，不断去除成纤维细胞。直到培养皿中肉眼已无法观察到成纤维细胞，并能持续生长传代时，即可用于药物筛选和基因组检测。

抗肿瘤药物生物标志物鉴定技术及方法

在本文中，所述的抗肿瘤药物生物标志物指的是用来预测抗肿瘤药物治疗效果的标志物，用以区分出药物治疗的“有效人群”和“无效人群”.如BCR-ABL基因融合用于格列卫，HER2基因扩增用于赫赛汀。本领域技术人员知晓，大量的不同技术或不同样本类型都可以用于生成不同类型的生物标志物，并且这些技术可以是测量单一特征数据，也可以通过组学或其他高通量技术同时测量大量的特征数据从而生成生物标志物（PharmaceuticalStatistics,2011,Volume10,Issue6,pages494–507）。因此，本发明抗肿瘤药物的生物标志物可以采用不同技术在不同生物层面上进行筛选及鉴定，如蛋白水平，基因水平，代谢水平及细胞水平等，包括蛋白质序列、结构、以及修饰；生物大分子的相互作用信息，含物理（无化学变化）及化学（有化学变化）层面作用；基因组DNA、RNA序列、高级结构以及修饰；细胞代谢物相关信息；生物图像信息。检测技术可以是单分子分析，也可以通过高通量技术得以同时获取大量的分子特征(基因、蛋白或代谢产物)。基因组学分析有基因芯片检测基因表达谱，全基因组测序检测基因组突变或缺失等，SNP（Single nucleotide polymorphism）芯片检测染色体片段扩增或缺失等，甲基化芯片检测DNA甲基化等。蛋白组学可以用来分析蛋白丰度，定位，修饰及蛋白和蛋白相互作用。代谢组学通过核磁共振、液相色谱、质谱等方法检测组织或生物分子及功能性影像液体中的代谢表型。分子及功能性影像技术可以用来分析细胞增殖（如18F-FLT,18F-fluoro-Lthymidine显像）、凋亡（如99mTc-Annexin显像）、细胞代谢（如18F氟脱氧葡萄糖正电子发射断层扫描）等。

应用

应理解，本发明筛选抗肿瘤药物生物标志物的方法对于肿瘤的种类并没有特殊的限制，任何实体、非实体，恶性或良性肿瘤均可以采用本发明方法进行生物标志物的筛选。优选的，所述的肿瘤包括(但不限于)皮肤癌，白血病，肾上腺皮质癌，胆管癌，膀胱癌，骨癌，脑癌，乳腺癌，气管及支气管肿瘤，淋巴瘤，神经系统肿瘤，宫颈癌，肠癌，肛门癌，子宫内膜癌、食管癌，鼻咽癌，卵巢癌，肉瘤，眼癌，恶性纤维组织细胞癌，胆囊癌，胃癌，结直肠癌、胃肠道类癌瘤，胃肠道间质瘤，胚细胞瘤，头颈癌，肝癌，下咽癌，黑色素瘤，胰腺癌，肾癌，喉癌，唇癌，口腔癌，口咽癌，肺癌，间皮瘤，骨髓瘤，甲状旁腺癌，阴茎癌，嗜络细胞瘤，垂体瘤，前列腺癌，视网膜母细胞瘤，涎腺癌，皮肤癌，睾丸癌，喉癌，胸腺瘤，甲状腺癌，尿道癌，阴道癌，外阴癌。

应理解，本发明筛选抗肿瘤药物生物标志物的方法对于可筛选药物的种类也没有特殊的限制，任何药物，无论其是否已知为靶向药物，均可以采用本发明方法进行生物标志物的筛选。优选的，所述的药物包括(但不限于)：已知靶向药物、未知靶向药物、化疗药物或化合物、RNA药物、蛋白或多肽药物、抗体药物、基因治疗药物。

本发明有益效果

利用本发明方法制备的肿瘤细胞系合并为集合，可以建立来自不同病人的同种肿瘤细胞株系集合文库，或也利用各种集合文库建立一个用于筛选抗肿瘤药物分子标记的平台。本发明方法建立的细胞系之间的差异小，背景噪音少，且细胞代数确定，所建立的文库或平台可用于筛选新药的靶点，或用于不同肿瘤患者的个体化治疗。且本发明方法应用的范围不受肿瘤种类或药物种类限制，可以广泛应用于筛选各种肿瘤的各种生物标志物。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

通用方法

1.肿瘤细胞原代培养

取术前未经任何治疗的病人肿瘤样本，手术切除后在肿瘤实体组织的不同区域进行取样，并将不同采样区域使用序号标记。分离好的新鲜肝癌组织，无菌超净台中PBS洗净后，使用眼科镊子、剪刀等器械在培养皿中剪碎分离成0.5-1mm³的小块平铺于皿底，并向培养皿中加入含10ml的10%FBS(GIBCO公司)，1%双抗DMEM细胞培养基(GIBCO公司），放入37℃5%CO₂的培养箱中进行培养，次日在倒置显微镜下观察到细胞从组织块四周游出，然后逐渐延伸，长成肉眼可以观察到的生长晕。5～7天后组织块中央的组织细胞逐渐坏死脱落和发生漂浮，此漂浮小块可随换液而弃去，由组织块周围延伸的贴壁细胞也逐渐形成层片。传代培养时，利用成纤维细胞与肿瘤细胞消化能力的不同，不断去除成纤维细胞。多次传代后，培养皿中肉眼已无法观察到成纤维细胞，并能持续生长传代时，即可用于药物筛选和基因组检测。

2.核型鉴定

六孔板中，0.01mg/ml的秋水仙素处理细胞16小时，镜检观察M期细胞比例为50%以上时，收集M期细胞。KCl低渗液低渗处理M期细胞15～20分钟，于3：1甲醇/冰醋酸固定液室温固定后玻片上制片。将玻片置于0.02%胰酶溶液中消化30～60s,经PBS漂洗，Giemsa染色，晾干，完成制片。于显微镜下观察，计算每个细胞中染色体数目，每种细胞系随机选取20个细胞进行计算。

3.Alamar blue测试原代细胞药物敏感性

1）细胞接种：将处于对数生长期的原代肿瘤细胞经PBS清洗、0.25%胰酶消化及计数板计数后，以500-2000个细胞每孔的密度配制细胞悬液，使用Multidrop（Thermo公司）细胞接种仪将细胞悬液以90μl每孔接种至96孔板中，室温放置15-20min后转入37℃5%CO₂培养箱中。

2）加药：用DMSO配置每个药物最高浓度(Cmax)的200×母液,将Cmax的200X母液进行3.16倍梯度稀释，共9个药物浓度点。使用DMEM培养基将9个浓度梯度的200X母液稀释10倍，配制出药物培养基中间板（intermedium plate）。细胞接种3个小时后，每个药物浓度点取10μl培养基中间板药物加入细胞板中，放入37℃5%CO₂培养箱培养。

3）检测：药物处理6天后，每孔加入10μl0.03%Alamar blue溶液，37℃培养0.5-2小时后，使用荧光酶标仪(Thermo公司)于激发波长560nM,发射波长590nM的条件下进行检测。

4）数据处理：在Sigmoid软件中，使用

（y为荧光检测值，X为药物浓度）公式拟合出药物反应曲线，并计算出每个细胞对应每个药物的IC50值。

4.基因组信息检测

1）癌组织、血样及原代细胞基因组抽提：将处于对数生长期的细胞胰酶消化离心后（癌旁组织及肿瘤组织先打碎处理成细胞悬液），PBS洗一遍，10000rpm离心1min,弃上清。使用细胞基因组提取试剂盒（天根公司）抽提出基因组DNA，用于外显子测序和CNVs检测。血样加入抗凝剂后，基因提取方法同细胞。

2）癌组织原代细胞RNA抽提和质检：贴壁的细胞PBS清洗后，加入Trizol室温放置5min，使其充分裂解。12,000rpm离心5min，弃沉淀。按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿，振荡混匀后室温放置15min。4℃12,000g离心15min。吸取上层水相，至另一离心管中。按0.5ml异丙醇/ml Trizol加入异丙醇混匀，室温放置5～10min。4℃12,000g离心10min，弃上清，RNA沉于管底。按1ml75%乙醇/ml Trizol加入75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。4℃8,000g离心5min，尽量弃上清。室温晾干5～10min。50ul H2O，溶解RNA样品，55-60℃,5～10min。每个样品吸取400-700ng的total RNA，用1.5%的甲醛变性凝胶电泳（120V）15min，在凝胶成像仪下检测总RNA中28s和18s的完整性。抽提好的RNA存于-80℃，用于基因表达谱芯片检测。

3）外显子测序及分析：

将血样、癌旁组织、肿瘤组织以及细胞系中基因组中DNA抽提出来，利用AgilentSureSelect exon捕获系统，对样本中的遗传物质基因组DNA中的外显子区域进行捕获并扩增，之后进行测序。最终得到样本的全外显子区域的数据文件（Fastq）。在获取外显子测序后原始数据（raw reads）的第一步分析中，采用软件Picards对数据进行过滤以去除其中人工拼接接头和测序过程中产生的污染。之后，使用相应的比对（Mapping）软件包（如MAQ、BWA等）将测序中读取的片段（reads）定位到一个作为参照基因组（reference genome）的人类基因组版本(hg19)上，同时，我们还要对数据进行质控检测，包括测序深度、覆盖度均一性等指标的检测。经过上述过程，我们获得了已经比对到基因组上的原始比对数据（rawmapped reads）。我们在其中可以发现，某些reads包含有不同于参照基因组的变异，包括SNP和Indel等信息。接下来，我们采用分析软件如GATK对上述获得reads数据进一步处理如局部区域重比对、去重、质量校准等，得到可用于下一步定量分析的可用数据（analysisready reads）。

根据不同的算法如MuTect等，可以统计（call）出所有可能的变异体（variants），并对这些变异体进行质量评估以及相关统计，之后可以确定一个选定的符合统计显著性的变异体集合。之后，利用注释软件如ANNOVAR对这些变异进行功能性注释，并再次筛选出真正符合需求的变异。例如，基于dbSNPs数据库可以将集合中在人类基因组中存在的正常SNPs筛掉。之后可以根据对变异体的注释进行分类，例如synonymous variant,non-synonymous variant,premature termination,splicing site,indels等等。这些变异体的数目和基本信息可以进一步进行统计归类并采取后续分析，如功能实验验证、药物功能关联分析以及病人预后分析等。(图5)

4）CNV（Copy number variation）检测及分析：

采用Affymetrix CytoHD芯片平台，获取了血样、癌旁组织、肿瘤组织以及细胞系中基因组DNA上的SNP捕获信号并保存在原始数据文件中。根据Affymetrix提供的样本库建立了参考基因组序列以及注释文件，并采用Nexus Copy Number软件获得归一化后的SNP/CN探针的信号值和分段得到的片段。之后，采用R TAPS软件包推断上述SNP RankSegmentation得到的每个片段的绝对拷贝数（包括total CN,minor CN），并根据片段和对应的拷贝数计算对每个基因拷贝数进行估值。质量控制方面，在载入数据到AFFY软件平台的同时，平台会自动检测每个样本的多个参数，从而使我们可以评估每个样本整体的质量。图1显示了CNV检测分析的流程图。

5）基因表达谱检测及分析：

利用Affymetrix HG-U1332.0基因表达谱芯片检测了肿瘤组织以及细胞系中的基因表达情况，并使用基因芯片的显著性分析（Significance Analysis of Microarrays，SAM）对基因表达差异进行分析。在此方法中，以t检验为基础，考虑芯片数据噪音大小与表达峰度相关的特点进行修正，SAM方法使用的统计量称为相对差异系数（relativedifference），例如，在处理两类样本问题时此统计量可以表示为，

其中

与

为第i个基因表达量在两类不同样本中的均数，s(i)为样本数据的类内方差之和，

其中，Σm和Σn分别是两类不同样本测量的表达量的总和；a=(1/n₁+1/n₂)/(n₁+n₂-2),n₁和n₂分别是两类不同样本的测量数；s₀为该修正项，用来防止s(i)接近于0时导致d(i)过大。s₀主要与s(i)的分布有关，其数值大小可由使用者根据经验自定。

选取特征基因的过程是：首先，对数据进行N次无替换的重抽样，记第k次重抽样时的d(i)值为

k=1,2,...,N；计算d(i)的期望值，

设定△值是样本统计量d(i)与期望统计量

的差值。一旦为△设定阈值，d(i)与期望统计量

的差值大于△的基因就作为显著差异表达的特征基因而被选中。评价筛选效果的指标为错误发现率FDR（q value），其定义为：“筛检出差异表达基因中的假阳性基因个数”与“筛检出差异表达基因的个数”之百分比。

6）不同样本间相关性计算方法

采用计算皮尔逊相关系数（r）或皮尔逊距离(d)描述不同细胞样本间的相关性。

X_n、Y_n分别是两个样本（细胞）的数据集，n代表某类数据有n个特征，比如n个基因的基因表达值或者n个基因的拷贝数。

假如X_i,Y_i分别代表样本X和Y第i个特征，则X和Y两个样本之间的皮尔逊相关系数的计算公式如下：

其中

σ_X、σ_Y分别是样本平均值和样本标准差。

该两个样本的皮尔逊距离

d_XY＝1-r

皮尔逊相关系数落在[-1,1]，而皮尔逊距离落在[0,2]。

假如有m个样本，通过公式（1-1），可以计算所有样本两两之间的相关性。

在该专利中直方图以及聚类图中采用的是皮尔逊距离(d)来描述其相关性，

在热图中（HeatMap）采用皮尔逊相关系数(r)来描述其相关性。

实施例1肝癌肿瘤细胞系集合的建立及染色体鉴定

从一个肝癌患者原位肿瘤组织多个区域分离实体瘤后，经多次去纤维化处理，传代培养，成功建立了一个包含26株可稳定传代的肝癌原代细胞系OPP。细胞名称编号分别为HCC307 2-1#、HCC307 2-2#、HCC307 2-3#、HCC307 2-4#、HCC307 2-5#、HCC307 5-1#、HCC307 5-3#、HCC307 7-2#、HCC307 7-3#、HCC307 7-4#、HCC307 7-7#、HCC307 7-9#、HCC307 11-5#、HCC307 11-8#、HCC307 12-1#、HCC307 12-2#、HCC307 12-3#、HCC307 12-4#、HCC307 12-5#、HCC307 12-6#、CC307 12-7#、HCC307 13-1#、HCC307 13-4#、HCC307 13-6#、HCC307 14-1#、HCC307 14-2#。

从细胞形态上观察26株细胞均呈上皮形态（其中有代表性的1株细胞外形如图2所示）。经核型分析鉴定，每个细胞系随机选取20个处于M期的细胞，计算其染色体数目。结果显示，26株细胞的染色体均异常，染色体数目基本上在60-80条之间（如表1所示），而去除的成纤维细胞染色数目均为46条，说明26株细胞均为肿瘤细胞。

表1显示了26株细胞系核型鉴定结果

表1

实施例2基因组测序

对实施例1中建立的26株细胞系的基因表达谱、CNV拷贝数及外显子测序。数据结果显示，这些来源于同一对象的细胞系之间基因组具有高度同源性，同时在基因表达、CNV拷贝数变异及外显子变异均也存在一定的差异。如图显示，通过比较细胞系之间的CNV差异，OPP-HCC307中26株细胞系之间的CNV拷贝数均不完全一致，存在着差异，但其之间的差异显著小于来源于不同对象的肝癌细胞系（P=1.0953e-260，图3）。

图3显示了采用gene-based CNV数据对不同来源的细胞系（包括26株OPP-HCC307细胞系以及来自于CCLE的27株肝癌细胞系）中的任意两株之间距离进行评价。

其中图3A显示的是（1-距离）的热图；图3B显示距离在两类不同来源细胞中的直方分布图，可以清楚的观察到HCC307的26个细胞任意两株之间的距离基本分布在小于0.6的区间，反之，来自于CCLE的27个肝癌细胞系的任意两株之间的距离基本分布在大于0.6的区间。两种细胞分布上有显著性差异（P=1.0953e-260）；图3C对所有53株细胞系在gene-basedCNV数据上进行聚类的结果。

实施例3抗肿瘤药物敏感性测试

对实施例1中获得的细胞系集合进行抗肿瘤药物敏感性测试。在本实施例中，所采用的抗肿瘤药物如下：

靶向药：17-AAG、2-deoxyglucose、阿比特龙(Abiraterone)、ABT-263、AC-220、AT-406、AZD4547、AZD5363、AZD7762、BI-2536、Birinapant、BMS-754807、硼替佐米(Bortezomib)、BX-795、卡博替尼(Cabozantinib)、CAL-101、卡非佐米(Carfilzomib)、克唑替尼(crizotinib)、danusertib、达沙替尼(Dasatinib)、Dovitinib、Elesclomol、Embelin、恩替诺特(Entinostat)(MS-275)、Enzastaurin、依维莫司(Everolimus)、Foretinib、氟维司群(Fulvestrant)、Ganetespib、GDC0941、GSK429286A、JQ1、KU-55933、KX2-391、Lenvatinib、Linifanib、Linsitinib、LY2157299、Masitinib、MK-1775、MK-2206、MLN-4924、Neratinib、NU7441、Nutlin-3、NVP-BEZ235、NVP-BKM120、Orantinib、PCI-32765、PD-0325901、PD-0332991、PD-173074、PH-797804、PRT062607、R-406、Refametinib、瑞戈非尼(Regorafenib)、SCH900776、sgi-1776、索拉非尼(Sorafenib)、舒尼替尼(Sunitinib)、TAE684、替西莫司(Temsirolimus)、TG-101348、Tideglusib、Tipifarnib、Tivantinib、Toremifene、Tozasertib、曲美替尼(Trametinib)、维甲酸(Tretinoin)、Triptolide、伐地考昔(Valdecoxib)、维莫德吉(Vismodegib)、Volasertib、伏立诺他(Vorinostat)、YM-155、CHIR-99021、NVP-BGJ398、LY2090314。

化疗药：六甲蜜胺、氨鲁米特、阿那罗唑、阿扎胞苷、苯达莫司汀、白消安、卡巴他赛、卡培他滨、卡铂、顺铂、克拉曲滨、氯法拉宾、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、柔红霉素、地西他滨、多西他赛、多柔比星、表柔比星、依托泊甙、伊西美坦、氟尿苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、依达比星、异环磷酰胺、伊立替康、来那度胺、来曲唑、亚叶酸、洛莫司丁、6-巯基嘌呤、美司钠、甲胺喋呤、米托坦、米托蒽醌、奥沙利铂、紫杉醇、奈拉滨、培美曲塞、喷司他汀、普拉曲沙、甲苄肼、雷替曲噻、链脲霉素、替莫唑胺、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、拓扑替康、长春花碱、长春瑞滨、唑来膦酸。

共测试了OPP-HCC307中26株细胞对134个抗肿瘤药物（79个靶向药，55个化疗药）的敏感性，如图4显示这些细胞对122个化合物的反应敏感性一致，在12个化合物测试中表现出了敏感性差异，即可以根据药物敏感性将细胞分为敏感型，中度敏感型及耐药型。OPP-HCC307的细胞对已测试的90%以上药物反应敏感性一致，仅对约9%的药物反应不同，此药物反应结果与基因组高度同源性的结果相符。(图4)

实施例43株肿瘤细胞系用于标志物分析

根据实施例1的方法，对来自同一患者同一肿瘤组织的细胞系培育建立了3株肝癌细胞系，对这3株细胞系的差异性距离测试并分析药物敏感性与基因组表达的相关性，

结果表明，仅存3株细胞系时，药物敏感性出现了假阴性。此外，分析标志物时会计算基因组信息与药物敏感性的相关性，为了与基因组信息整合后分析标志物，因此，计算相关性运用到的模型至少需要5个点，少于5个点时相关性差，无法得到结果。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种筛选抗肿瘤药物生物标志物的方法，其特征在于，包括步骤：

(a)提供肿瘤细胞作为起始细胞，其中所述的肿瘤细胞来自相同对象的相同肿瘤组织；

(b)对所述的起始细胞进行传代和建系，并对获得的细胞系进行细胞特征信息检测，从而获得至少5株存在细胞特征差异、且基因组高度同源的肿瘤细胞系；

(d)基于分型结果，对所述肿瘤细胞系的细胞特征信息进行分析，从而确定与所述抗肿瘤药物敏感性相关的差异性标志物，所得的差异性标志物即所述抗肿瘤药物生物标志物，并且在步骤(b)中，获得10-500株所述的肿瘤细胞系，所述细胞特征信息检测是基因组信息检测；和/或所述细胞特征差异是基因组差异，并且所述的基因组差异包括：单个或多个基因的差异、单个或多个基因组区域的差异，所述的细胞特征差异包括：单个或多个基因甲基化水平的差异、单个或多个基因组区域甲基化水平的差异。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的基因组差异由任意两株细胞之间的差异性距离(d)表示。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的差异性距离包括选自下组：皮尔逊距离、欧氏距离、曼哈顿距离、切比雪夫距离、闵可夫斯基距离、标准化欧氏距离、马氏距离、夹角余弦、汉明距离、杰卡德距离、信息熵、或其组合。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，当差异性距离为皮尔逊距离时，OPP组中任意两株细胞的平均差异性距离d>0,且显著小于CCLE组内任意两株细胞的平均距离(P<0.05)。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的分型包括将所述肿瘤细胞划分为选自下组的类型：

(ii)普通型，所述敏感型肿瘤细胞系的药物敏感性与对照细胞相比无显著差异：

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的肿瘤细胞包括来自实体肿瘤或非实体肿瘤的细胞。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述建系方法包括以下步骤：

(ii)去除(i)中的粗培养体系中的成纤维细胞，获得所述的肿瘤细胞并进行分离，并分别继续培养为不同的细胞群落，即建系获得的细胞系。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的细胞特征信息包括：

1)人类基因组DNA或RNA的序列、高级结构、以及修饰；

2)蛋白质序列、结构、以及修饰；

3)生物大分子的相互作用信息，包括物理及化学层面作用；

4)细胞代谢物相关信息；

5)生物图像信息等。

9.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的差异性距离d满足0＜d≤0.9。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的基因组信息检测包括：外显子检测、基因表达谱检测、CNVs检测、全基因组测序、或其组合。

11.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的差异性距离d满足0＜d≤0.6。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述的差异性距离d满足0＜d≤0.3。

13.一种构建肿瘤细胞系集合的方法，其特征在于，包括步骤：

(b)对所述的起始细胞进行传代和建系，并对获得的细胞系进行细胞特征信息检测，从而获得至少5株存在细胞特征差异、且基因组高度同源的肿瘤细胞系，并将所述肿瘤细胞系进行组合从而构成肿瘤细胞系集合，并且在步骤(b)中，获得10-500株所述的肿瘤细胞系，所述的细胞特征差异包括：单个或多个基因甲基化水平的差异、单个或多个基因组区域甲基化水平的差异。

14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：

15.一种肿瘤细胞系集合，其特征在于，所述的肿瘤细胞系集合是用权利要求13所述的方法构建的。

16.一种肿瘤细胞系文库，其特征在于，所述的文库含有一个或多个权利要求15所述的肿瘤细胞系集合。

17.一种筛选抗肿瘤药物的生物标志物平台，其特征在于，所述的平台含有权利要求15所述肿瘤细胞系集合或权利要求16所述的肿瘤细胞系文库；和

18.权利要求15所述的肿瘤细胞系集合、权利要求16所述的肿瘤细胞系文库，或权利要求17筛选抗肿瘤药物生物标志物平台的用途，其特征在于，用于筛选抗肿瘤药物生物标志物。